JPS62115286A - 酵素不溶化方法、不溶化酵素、酵素用新規支持体、その製法及び不溶化酵素の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、有機アルミナ−ホスフェート複合体」−へ固
定することにより酵素を不溶化する方法、該方法により
得られた不溶化酵素に関する。又、本発明は、新規不溶
性酵素支持体及びその製法にも関し、更に、こうして得
られた不溶化酵素の応用にも関する。

従来の技術及びその問題点 酵素を不溶性支持体（１ｎｓｏｌｕｂｌｅ　５ｕｐｐｏ
ｒｔｓ）に固定化することは、酵素工学の多くの生化学
的変換方法に於ける重要な工程である。

不溶化酵素及び酵素固定法は、多くのパラメーター、例
えば生成物の化学的安定性、機械的性質、耐生物分解性
、面積／体積比、単位面積当りの酵素分子の密度、支持
体のコスト、支持体の再生の可能性等の間で最良の結果
が得られるように選択される。

一般に使用される不溶性支持体は、次の２つの主要な群
に分類することができる。

ａ）ポリオシト類（ｐｏｌｙｏｓｉｄｅｓ、セルロース
及びその誘導体、デキストラン類及びアガロース、澱粉
等）、蛋白質（コラーゲン）、合成ポリマー（ポリアミ
ノ酸、ポリアクリル樹脂、ポリアミド等）を包含する有
機支持体。

ｂ）無機支持体（多孔性ガラス、金属酸化物、アルミノ
−シリケート等）。

有機支持体は、各種方法により化学的に活性化すること
ができ、これがその主な利点の１つとなっている。なぜ
なら、酵素を各種の方法（細胞内含有（１ｎｃｌｕｓｌ
ｏｎ　）　、吸着、共有結合等）により固定化できるか
らである。

無機支持体は、有機支持体に比し、一般に、機械的及び
環境的により安定（磨耗、化学物質、及び細菌に対する
耐性）であり、経済的に有利である。

他方、無機支持体を化学的に活性化することは、有機支
持体の場合に比し、より困難且つより複雑で効率的な操
作ができない。従って、酵素を無機支持体に固定化する
のは、吸着法により行うのが好ましい。全ての酵素は吸
着され得るが、酵素と支持体との新和性は非常にばらつ
きがあるので、全般的な適用が可能な訳ではない。

本発明の目的は、無機支持体の安定性と有機支持体の活
性化の容易さとを併せ持ち、他の単純な又は複雑な分子
を固定化し得る反応性官能基を備え、その反応性官能基
で共有結合により酵素を固定化することにより、固定化
酵素の周知の利点を有すると共に水中及び水性媒体中の
みならず、水に非混和性の有機溶媒中においても活性を
示し、連続反応及び間歇的反応のいずれにも触媒として
使用できる不溶化酵素を形成し得る新規不溶性支持体を
提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明は、少なくとも１つのホスフェート官能基及び蛋
白質様分子、特に酵素と共有結合を形成し得る少なくと
も１つの化学的反応性基を含有する二官能性又は多官能
性化合物の少なくとも１つのホスフェート官能基に結合
したアルミナから形成されていることを特徴とする新規
固体複合体（ｓｏｌｉｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ　）を提供す
るものである。

本発明の複合体の好ましい実施態様によれば、アルミナ
に結合した二官能性又は多官能性化合物は、一般式 ％式％ 〔式中、Ｒは、少なくとも１つの化学的な反応性を有す
る基、例えば、第一アミン基、アルデヒド基、又は酸基
を含有する脂肪族又は芳香族有機基を示す。〕 で表わされる有機ホスフェートである。

更に本発明は、」−２本発明の有機アルミナ−ホスフェ
ート複合体の製造法をも提供するものである。該製造法
は、アル入すと上記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の有機ホ
スフェートとを、適当な時間、水性媒体中、実質上常温
に於て、ｐＨ２，Ｏ〜８．５の条件下、接触させること
により、上記一般式（Ｉ）又は（ｎ）の有機ホスフェー
トをアルミナ上に固定化することを特徴とするものであ
る。

上記本発明の有機アルミナ−ホスフェート複合体の製造
法の好ましい実施態様によれば、複合体化（ｅｏｌｌｌ
）ＩＣ３ＸａｔｌＯｎ）が行われる媒体は、高いイオン
力（ｔｏｎ　ｆｏｒｃｅ　、イオン濃度）の媒体である
。

本発明者の研究によれば、」二記一般式（１）及び（Ｉ
Ｉ）の有機ホスフェートは、水中にてｐＨ２〜８．５に
おいてアルミナに非常に強く結合し、こうして得られる
複合体は、高イオン力の媒体、例えば、２ＭＮ　ａ　Ｃ
Ｑ　１２Ｍ　（ＮＨ４）　２８０４等において安定であ
り、水−混和性又は水−非混和性の有機溶媒の作用に関
しても安定であり、一般式（Ｉ）及び（ｎ）の有機ホス
フェートは、他の有機ホスフェート溶液で又はｐＨ２〜
８．５に平衡化（ｂａｌａｎｃｅｄＳｅｑｕｆ１１ｂｒ
６ｅｓ　）されたリン酸溶液で置換することによりアル
ミナから分離できることが見出た′された。

本発明は、」−２本発明の有機アルミナ−ホスフェート
複合体を、蛋白質様分子、特に酵素を固定化するための
支持体として使用する用途にも関する。

更に、本発明は、本発明の有機アルミナ−ホスフェート
複合体を、生物学的媒体中に含まれる有機ホスフェート
、例えばモノヌクレオチド類、ホスホグルシド類（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｇｌｕｃｉｄｅｓ　）　、リン蛋白質、リン
−アミノ酸（ｐｈｏｓｐｈｏ−ａｍｌｎｏ　ａｃｌｄｓ
　）、ピリドキサル　ホスフェート等を単離及び／又は
分析するための手段として使用する用途にも関する。即
ち、上記有機ホスフェートとアルミナとを、水性媒体中
、ｐＨ２〜８．５にて結合させ、生じる複合体から該有
機ホスフェートを、ｐＨ２〜８．５に平衡化したリン酸
又は他の有機ホスフェートの溶液の作用により遊離させ
るものである。

更に、本発明は、不溶化酵素の製造法にも関するもので
ある。該製造法は、一般式 ％式％ 〔式中、Ｒは前記に同じ。〕 で表わされる固体支持体に共有結合で結合した酵素から
なる複合物質を、脂肪族又は芳香族有機基Ｒ中に含有さ
れ必要に応じ適当な活性化剤により活性化されていても
よい化学的反応性基と、固定化されるべき酵素の反応性
基とを反応させることにより、形成することを特徴とす
るものである。

本発明方法の好ましい実施態様によれば、上記不溶性複
合物質が、有機ホスフェートにより導入されたアルデヒ
ド基等の反応性カルボニル基を含有する場合、該反応性
基は、固定化されるべき酵素のアミン基と直接反応して
シッフ塩基を形成する。

この実施態様の好ましい一側面に於ては、得られるシッ
フ塩基は、適当な還元剤、特に、ナトリウム　シアノボ
ロハイドライドで還元することにより安定化される。

不溶化酵素の製造法の他の実施態様においては、上記不
溶性複合物質がアミン基により形成された反応性基を含
有する場合、これらアミン基は適当な活性化剤、例えば
、グルタールアルデヒド、ジイソシアネート類、ジイソ
チオシアネート類等の第−アミンの二官能性試薬等によ
り活性化され、これにより上２アミン基は固定化される
べき酵素のアミン基との反応が可能となる。

本発明は、また、本発明により得られた有機アルミナ−
ホスフェート複合体に結合させることにより不溶化され
た酵素にも関する。

更に、本発明は、上記不溶化された酵素を用いてペプチ
ド合成を触媒する方法にも関するものであり、該ペプチ
ド合成は、アミノ酸の誘導体であるカルボキシル成分と
アミノ成分との間でアミド及びペプチド結合を合成する
ことにより行われる。

上記方法の好ましい実施態様によれば、上記ペプチド合
成は、常温〜約４５℃の温度において行われる。

本発明のペプチド合成の触媒方法の好ましい実施態様に
よれば、反応媒体中には、ホスフェートイオンが存在し
ない。ホスフェートイオンが存在すると、アルミナに結
合している有機ホスフェ−トが分離し、従って酵素が不
溶性支持体から分離することになるからである。

本発明のペプチド合成の触媒方法の他の好ましい実施態
様によれば、ブロックされたアミン基及び遊離の又はエ
ステル化されたカルボキシル基を有する下記一般式（ｍ
）のアミノ酸誘導体と、遊離のアミン基及びブロックさ
れたカルボキシル基を有する下記一般式（ＴＶ）のアミ
ノ酸誘導体との間のアミド及びペプチド結合の合成が触
媒される。

Ｚ−ＮＨ−ＣＨＣＯＯＸ　　　　　　（ＩＩＩ）■ Ｘ 〔式中、′Ｚはアミン基の保護基又はペプチドセグメン
トを示し、Ｘは水素原子又はアルキル基を示し、Ｒｘは
α−アミノ酸の側鎖を示す。〕〕Ｈ２Ｎ−ＣＨ−Ｃ０Ｙ
　　　　　　（ＩＶ）Ｒｘ 〔式中、Ｙはアルコキシ又はアルキルアミン基又はペプ
チドセグメントを示し、Ｒｘはα−アミ）酸の側鎖を示
す。〕 特に、本発明は、上記特徴を有する新規有機アルミナ−
ホスフェート複合体、新規酵素及び有機アルミナ−ホス
フェート複合体構造及びその用途、その製造法並びにそ
の製造及び適用に用いられる手段に関するものである。

上記特徴とは別に、本発明は他の特徴をも有しており、
これらは以下の記載から明らかとなろう。

実施例 本発明をより具体的に示すべく、本発明の有機アルミナ
−ホスフェート複合体及び不溶化酵素の製造法を示す実
施例並びにこれらの使用例を示す実施例を以下に掲げる
。

これら実施例は、本発明の例示であって、本発明を限定
するものではない。

実施例１〜７ 有機アルミナ−ホスフェート複合体の製造適当な溶媒（
複合体の関与する以下の反応において使用されるものと
同一の溶媒）で平衡化（ｂａｌａｎｃｅｄ）された１ｇ
のアルミナ（粉末状又は多孔質マイクロボールの形態の
いずれでもよい）を、有機ホスフェートの１０−２モル
水溶液２ｍＧに添加し、得られた懸濁液を常温にて１０
分間攪拌した。−に清層に存在するホスフェートを高圧
液体クロマトグラフィ、ＵＶ分光光度法、比色定量法、
その他により定量的に分析し、アルミナに対する固定化
度を測定した。実験は、各ホスフェートについて塩の存
在下及び無機ホスフェートの存在下で種々のｐＨ条件に
於て行なった。

下記第１表において、第２欄には使用した有機ホスフェ
ートを、第３欄には各ホスフェートのアルミナ」−への
固定化率（％）を、第４欄には無機ホスフェートの存在
下でアルミナ上に固定された有機ホスフェートの百分率
を示す。

アルミナ−ホスフェート相互反応の特異的性質が、カル
ボン酸生成物又はスルホン酸生成物に関する比較実験に
より明らかにされた（第２表）。

−　２１　　一 実施例８及び９ １）　水１０ｍ０に０−ホスホコラミン６０ｍｇを溶解
させ、ｐＨ７に平衡化して得られた溶液に、３ｇのアル
ミナを添加した。懸濁液を若干攪拌してｐＨ７に保った
。３０分後、ホスホコラミンはアルミナに完全に固定化
された。生成物は濾過又は遠心分離により回収された。

２）　」二記アルミナーホスホコラミン複合体を、水１
０ｍＧに懸濁させ、２５％グルタールアルデヒド水溶液
４ｍＱで処理した。懸濁液を水中でｐＨ７に平衡化し、
３０分間弱く攪拌した。こうして活性化されたアルミナ
を、単離し、水洗した。

３）　水１０ｍＧに５０ｍｇの酵素を溶解させ、これに
上記２）で活性化したアルミナーホスホコラミン複合体
を添加した。懸濁液を３０分間弱く攪拌しｐＨ７に保っ
た。不溶化酵素を乾燥により回収し、洗液の酵素活性が
認められなくなるまで水洗した。　上記全ての操作は、
常温にて行なった。

こうして、４．５ｇの固定化酵素を得た（即ち、原料ア
ルミナ１ｇ当り０．５ｇの水）。第３表に示すように上
記固定化酵素の活性を、特異基質を用いて測定した。

生成物の１／３をＮａＣＱ　　ＩＭ溶液２０ｍ（？に懸
濁させ、ｐＨ７で２４時間攪拌した。固体を乾燥により
回収し、水洗し、酵素活性を再度測定した。

−　２４　　一 実施例１０ １）　水１０ｍ（ｌに２０ｍｇのピリドキサル　５′−
ホスフェートを溶解させた溶液に、３ｇのアルミナを添
加し、懸濁液をｐＨ７にて弱く攪拌した。ピリドキサル
　５′−ホスフェートがアルミナ上に完全に固定化され
た後、固体層（これは黄色となった）を乾燥により分離
し、水洗した。

２）　水１０１１１０に６０ｍｇのトリプシンを溶解さ
せた溶液を、上記アルミナーピリドキサル　５′−ホス
フェート複合体に添加し、懸濁液をｐＨ７にて常温で攪
拌した。３０分後、ナトリウムシアノボロハイドライド
３０ＩＩＩｇを懸濁液に添加し、ｐＨ７にて更に３０分
間攪拌した。この間、懸濁液の色は、黄色から白色へと
変化した。

固定化トリプシンを乾燥により回収し、多量の水で洗浄
した。こうして４．５ｇの固定化トリプシンを得た。酵
素活性を測定後、生成物の一部を、ＮａＣＱ　　１Ｍ水
溶液の過剰量に懸濁させ、２４時間弱く攪拌した。濾過
により分離され、水洗された固体の酵素活性を測定した
。

＝　２６− −２７一 実施例１１〜１７ 酵素触媒によるペプチド合成 典型的実験として、実施例９と同様にして固定化された
キモトリプシン１ｇを、カルボキシル成分として１０−
４モルのアセチル　Ｌ−）リプトファン　メチルエステ
ルを、アミノ成分として１０−３モルのグリシンメチル
エステルを含有する有機溶媒（第５表参照）２ｍＱに懸
濁させた。懸濁液を２０℃にて２時間弱く攪拌した。生
成したアセチルし一トリプトファニルグリジンエステル
を、高圧液体クロマトグラフィーにより、化学合成され
た標品を用いて、定量分析した。他のカルボキシル成分
とアミノ成分とを、同様にキモトリプシン触媒により縮
合させた。上記実験は、第５表記載の２種の溶媒を用い
て行なった。収率を第５表に示す。

　２８　一 実施例１８ １相におけるα−キモトリプシンの代表的用途実施例９
と同様にして固定化されたα−キモトリプシン１ｇを、
１０−４モルのＡｃ、　　Ｌ。

ＴｒｐＯＭｅ及び１０−３モルのベンジルアミンを含有
する１、２−ジクロロエタン２ｍＧに懸濁させた。懸濁
液を、水循環ジャケットを有し、フィルター及びタップ
を備えた２つのプラグにより上部及び底部を閉じられた
ガラス製反応器に入れた。

２０℃にて２時間反応を行なった後、溶媒を窒素圧を利
用して濾過により分離した。生成したアセチルＬ−Ｔｒ
ｐベンジルアミドを、アリコートについて、高圧液体ク
ロマトグラフィーにより定量分析した。

上記固定化酵素を、水５％を含有するジクロロエタンで
洗浄し、第１のサイクルと同一条件下、第２以降のサイ
クルに使用した。各サイクルにおける合成収率を第６表
に示す。

第　　　６　　　表 実施　サイク　１２３４５６７８ 例　　ルＮ０゜ １８　合成％　５８　５９　５８　５８　６０　６２　
６５　６５収率がいくぶんか上昇しているのは、最初の
サイクルで吸着された生成物が回収されたものと思われ
る。

実施例１９及び２０ ペプチド合成における固定化サーモリシン１）　上記実
施例８及び９と同様にして、３ｇのアルミナをＯ−ホス
ホコラミンで複合体化し、グルタールアルデヒドで活性
化し、５０　ｍｇのサーモリシンを含有する３Ｘ１０’
−２Ｍ酢酸カルシウム溶液１０ＩＩＩＱに添加した。懸
濁液を、常温でｐＨ７にて３０分間弱く攪拌した。上清
層のスペクトル分析の結果、全ての酵素が固定化された
ことを確認した。こうして固定化したサーモリシンを、
３Ｘ１０−２Ｍの酢酸カルシウム溶液で洗浄し、乾燥に
より回収した。こうして、４．５ｇの固定化サーモリシ
ンを得た。

２）　　４Ｘ１０−４モルのＮ−カルボベンズオキシ　
し−アスパラギン酸（Ｚ、Ｌ−Ａｓｐ）及び０．８Ｘ１
０−３モルのし一フェニルアラニンメチルエステル（Ｌ
−ＰｈｅＯＭｅ）を、ｐＨ８にて４ｍＱの水に溶解させ
、この溶液に１ｇの固定化サーモリシンを添加した。懸
濁液をｐＨ８，４０℃にて１０時間弱く攪拌した。固体
生成物が沈澱し、上記固定化酵素と混合した。

酢酸でｐＨ５に酸性化した後、４１ｒｌＧのｎ−ブタノ
ールを懸濁液に添加した。上記反応中に生成した固体生
成物は溶解した。固定化酵素を濾過により分離し、３ｘ
１０”　２Ｍ酢酸カルシウム溶液中で再度ｐＨ８に平衡
化させ、引き続くサイクルに使用した。２つの液相を分
離し有機相のアリコートを高圧液体クロマトグラフィー
で分析した。Ｚ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−ＰｈｅＯＭｅの収率
を、化学合成した標品を用いて測定した。

同様にしてＺ、Ｌ−ＴｒｐとＬ−ＬｅｕＯＭｅとの縮合
を行なった。

一　　３４　− 実施例２１及び２２ 有機ホスフェートのクロマトグラフィー的分離１）　ガ
ラスカラム（Ｑ＝３Ｃｍ１φ＝０．　７ｃＩＩｌ）に、
アルミナ粉末を充填し、ＨＣＱでｐＨ３に調整された０
、２Ｍ　　ＮａＣＱ水溶液で平衡化させた。

２）　アデノシン（１０−”モル）及びアデノシン−５
′−ホスフェ−）−（１０−５モル）の混合物を上記カ
ラムの頂部に置き、ｐＨ３の０゜２ＭＮａＣＱ溶液で溶
離した。流速は、１８ｍＱ１時であり、流出液は０．６
ｍＱのフラクションとして集められた。

３）　１８ＩｒｌＱの量溶離後、リン酸を溶離液に添加
して２％濃度とし、ＮＨ，ＯＨを用いてｐＨ３に平衡化
させた。溶離及び分画化を継続した。

各フラクションを分析した結果を第８表に示す。

また、セリン、セリン−〇−スルフェート及びセリン−
Ｏ−ホスフェートの混合物についても同一　３５　＝ 様にしてクロマトグラフィーにより分離した。結果を第
９表に示す。

一　　３７　　一 本発明に従い固定化された酵素は、間欠的方法（バッチ
式反応器又はカラム）においても、また、連続法におい
ても、ペプチド合成を触媒するのに使用することができ
る。

本発明の固定化酵素は、粉末状であるので、取扱が容易
であり、その使用条件も単純であり、医薬分野において
有利さが上昇しつつあり、場合によっては化学的合成法
よりも酵素的方法による方が合成し易いペプチド類等の
化合物を、その活性に悪影響を及ぼす可能性のあるラセ
ミ化のおそれなく、高収率で製造することを可能とする
。

上記に記載した通り、本発明は、上記した実施態様、方
法及び用途に限定されるものではなく、当業者であれば
本発明の要旨を逸脱することなく想起し得る各種の変更
態様をも包含するものである。

（以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］少なくとも１つのホスフェート官能基及び酵素等
   の蛋白質様分子と共有結合を形成し得る少なくとも１つ
   の化学的反応性基を含有する二官能性又は多官能性化合
   物の少なくとも１つのホスフェート官能基に結合したア
   ルミナから形成されていることを特徴とする固体複合体
   。 ［２］アルミナに結合した二官能性又は多官能性化合物
   が、一般式 Ｒ−Ｏ−ＰＯ＿３Ｈ＿２（ I ）又はＲ−ＰＯ＿３Ｈ＿
   ２（II）〔式中、Ｒは、第一アミン基、アルデヒド基又
   は酸基等の化学的反応性基を少なくとも１個含有する脂
   肪族又は芳香族有機基を示す。〕で表わされる有機ホス
   フェートである特許請求の範囲１項記載の複合体。 ［３］アルミナと一般式 Ｒ−Ｏ−ＰＯ＿３Ｈ＿２（ I ）又はＲ−ＰＯ＿３Ｈ＿
   ２（II）〔式中、Ｒは、第一アミン基、アルデヒド基又
   は酸基等の化学的反応性基を少なくとも１個含有する脂
   肪族又は芳香族有機基を示す。〕で表わされる有機ホス
   フェートとを、水性媒体中、実質的に常温に於て、ｐＨ
   ２．０〜８．５にて接触させることにより、上記有機ホ
   スフェートをアルミナ上に固定化することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の複合体の製造法。 ［４］複合体化の行われる媒体が、高イオン力の媒体で
   ある特許請求の範囲第３項記載の製造法。 ［５］少なくとも１つのホスフェート官能基及び酵素等
   の蛋白質様分子と共有結合を形成し得る少なくとも１つ
   の化学的反応性基を含有する二官能性又は多官能性化合
   物の少なくとも１つのホスフェート官能基に結合してい
   るアルミナから形成されている固体複合体からなること
   を特徴とする酵素等の蛋白質様分子の固定化用支持体。 ［６］特許請求の範囲第１項の固体複合体を、モノヌク
   レオチド類、ホスホグルシド類、リン蛋白質、ホスホア
   ミノ酸、ピリドキサールホスフェート等の生物学的媒体
   中に含まれる有機ホスフェートの単離及び／又は分析に
   使用する方法であって、上記有機ホスフェートとアルミ
   ナとを、水性媒体中、ｐＨ２〜８．５にて結合させ、生
   じる複合体から該有機ホスフェートを、ｐＨ２〜８．５
   に平衡化したリン酸又は有機ホスフェートの溶液の作用
   により遊離させることを特徴とする方法。 ［７］一般式 Ａｌ＿２Ｏ＿３……Ｒ−Ｏ−ＰＯ＿３Ｈ＿２（ I ａ）
   又はＡｌ＿２Ｏ＿３……Ｒ−ＰＯ＿３Ｈ＿２（IIａ）〔
   式中、Ｒは、第一アミン基、アルデヒド基又は酸基等の
   化学的反応性基を少なくとも１個含有する脂肪族または
   芳香族有機基を示す。〕で表わされる固体支持体に共有
   結合で結合した酵素から成る不溶性複合物質を、脂肪族
   又は芳香族有機基Ｒ中に含有され、必要に応じ適当な活
   性化剤に依り活性化されていてもよい化学的反応性基と
   、固定化されるべき酵素の反応性基との反応により形成
   することを特徴とする不溶化酵素の製造法。 ［８］不溶性複合物質が、有機ホスフェートにより導入
   されたアルデヒド基等の反応性カルボニル基を含有する
   場合に、該反応性基と固定化されるべき酵素のアミン基
   とを直接反応させてシッフ塩基を形成する特許請求の範
   囲第７項記載の製造法。 ［９］シッフ塩基が、ナトリウムシアノボロハイドライ
   ド等の還元剤を用いて還元することにより安定化される
   特許請求の範囲第８項記載の製造法。 ［１０］不溶性複合物質が、アミン基により形成された
   反応性基を含有する場合、これらアミン基をグルタール
   アルデヒド、ジイソシアネート類、ジイソチオシアネー
   ト類等の第一アミンの二官能性試薬等の活性化剤により
   活性化し、こうして上記アミン基と、固定化されるべき
   酵素のアミン基とが反応できるようにする特許請求の範
   囲第７項記載の製造法。 ［１１］特許請求の範囲第７項記載の製造法により、有
   機アルミナ−ホスフェート複合体を用いて不溶化された
   酵素。 ［１２］特許請求の範囲第１１項の不溶化酵素の少なく
   とも１種を、酵素触媒として用いることを特徴とするペ
   プチド合成を触媒する方法。 ［１３］ペプチド合成を、常温〜約４５℃の温度におい
   て行う特許請求の範囲第１２項記載の方法。 ［１４］反応媒体が、酵素とその支持体の分離を惹起す
   るおそれのあるホスフェートイオンを含有しないもので
   ある特許請求の範囲第１２項記載の方法。 ［１５］不溶化酵素が、ブロックされたアミン基及び遊
   離の又はエステル化されたカルボキシル基を有する下記
   一般式（III）のアミノ酸誘導体と、遊離アミン基及び
   ブロックされたカルボキシル基を有する下記一般式（I
   V）のアミノ酸誘導体とのアミド及びペプチド結合の合
   成を触媒する特許請求の範囲第１２項記載の製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 〔式中、Ｚはアミン基の保護基又はペプチドセグメント
   を示し、Ｘは水素原子又はアルキル基を示し、Ｒｘはα
   −アミノ酸の側鎖を示す。〕▲数式、化学式、表等があ
   ります▼（IV） 〔式中、Ｙはアルコキシ又はアルキルアミン基又はペプ
   チドセグメントを示し、Ｒｘはα−アミノ酸の側鎖を示
   す。〕