JPH03502836A - 固定人工膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固　　定　　人　　工　　膜 本発明は生物学的活性物質の研究及び精製のために特異に適応せる新規のクロマ トグラフィー支持体に関するものである。より詳しく述べるならば、本発明はク ロマトグラフィー系の固定相として生物学的膜の両親媒性構成成分を使用するこ とに関する。膜構成成分は市販のクロマトグラフィー支持物質の表面に固定され 、天然の生物学的膜の関連特性にそっくり似るように設計された人工膜を形成す る。クロマトグラフィー系、特に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に用 いる場合、本発明の支持物質は、化学物質の分離並びに新しい薬物のリードの確 認のための有力な道具となる。

発明の背景及び概要 バイオテクノロジー分野における研究開発の急速な進歩と共に、バイオテクノロ ジー研究を効率的に行うために必要な新しい方法並びに材料の必要性がますます 増大しっ〜ある。

実際、新しい工業が全体的に発達してバイオテクノロジー革命を支えてきた。バ イオチク工業の必要性に対して有用であるという点で非常に注目されている一つ の技術的分野はクロマトグラフィー系のそれである。生物分子（ｂｉｏ■ｏｌｅ ｃｕｌｅ）の分離及び精製は、予備的クローニング実験を行う分子生物学者のみ ならず、高純度製品の商業的生産に責任をもつ生物化学技術者にとっても極めて 重要である。伝統的クロマトグラフィー技術及び系を、バイオテクノロジー工業 の多くの特殊な精製問題に合うように適応させることが非常に重要視されてきた 。文献には、生物分子の分離又は精製のためのクロマトグラフィー理論、技術及 び材料の開示が豊富にある。

生物分子、すなわち生物学的ソースから誘導される分子の精製に使用されるクロ マトグラフィーの種類としては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換ク ロマトグラフィー。

バイオアフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相 互作用クロマトグラフィーなどがある。

これらの種類のクロマトグラフィーの各々の応用及び効率は、クロマトグラフィ ー系の溶質分子及び固定相（これらは両方共移動液体相と相互作用する）間の面 −面相互作用の選択性によって定まる。非常に種々様々の固定相クロマトグラフ ィー支持物質が市販されている。

本発明は、表面が生物学的細胞膜の構造及び面−面相互作用性にそっくり似るよ うに設計された新しい固定相クロマトグラフィー支持物質に向けられている。し たがって、本発明の固定人工膜支持体を用いるクロマトグラフィー系による生物 分子の分離は、１ｎ　ｖｌｖｏにおける上記生物分子と生物学的膜との相互作用 に類似の分子相互作用の結果である。より詳細に述べるならば、この支持体の使 用により、金人気のある逆相クロマトグラフ系に一般に用いられている蛋白質変 性性溶媒を加えずに（又はごくわずかの量を使用して）水性移動相を用いて非常 に種々様々のペプチド／蛋白質を分離することができる。多くのペプチドが％　 ｉｎ　ＶＩＶＯで細胞膜と相互作用したときに見られるのと同じ未変性の形で分 離できる。

共有結合で結合した人工膜構造をもつこの粒状組成物は、極性の非常に大きい、 又は無極性の移動相を用いるクロマトグラフィー系に用いることができる。それ らは伝統的クロマトグラフィー分離に用いられるだけでなく、生物学的活性化合 物の重要な膜結合特性、たとえばハンシュＰｉ値及びアミノ酸ヒトロバシースケ ール（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　５ｃａｌｅ）を評価するためにも用いられる。こ うして−例では、共有結合で結合したホスファチジルコリンから成る人工膜をも つ本発明のクロマトグラフィー基質を用いて、オリゴヌクレオチットが中性膜表 面に最大に結合するための溶液条件を調べて、リポソーム中へのオリゴヌクレオ チット捕獲を最適にした。それらは、化学反応のための表面、抗原を与えるため の表面、薬物分配貯蔵所、凍結乾燥蛋白質の安定貯蔵のための賦形剤表面、及び 膜に似た機能が所望されるその他の用途にも使用される。

本発明の固定人工膜担持クロマトグラフィー支持体は、遺伝子工学微生物によっ て表現されるハイブリッド蛋白質のための新規の一般的蛋白質精製法にも応用さ れる。生物学的活性蛋白質は、選択的に切断可能のペプチド結合により膜結合ペ プチドに共有結合しているハイブリッド蛋白質として表現される。ハイブリッド ペプチドは先づ最初に、本発明による固定膜クロマトグラフィー支持体を用いて 精製され、その後ハイブリッドペプチドは、活性蛋白質と膜結合ペプチドとの間 の切断部位で選択的に切断するためのあらかじめ定められた条件に曝露される。

生物分子の分離及び精製のための手段としてこのクロマトグラフィー支持体を使 用することよりも多分もっと重要なことは、移動相中の溶質分子と、固定膜を構 成成分とする固定相−これはレセプター、酵素、抗体などを含み得るー　との間 の相互作用を研究するための高性能クロマトグラフィー系にこの支持体を使用す ることによって得られる可能性である。こうしてこのクロマトグラフィー支持体 は薬剤膜／膜構成成分相互作用の評価及び研究のための有力な手段として役立つ 、そしてそれらは、可能性のある又はあり得る薬物活性のｉｎ　ｖ１ｔｒｏイン ジケーターとしての用途を見出す。その上本発明の人工膜担持支持体は生物学的 又は人工膜（リポソーム）環境下であられれることが知られている。触媒反応及 びキラル合成にも用いられる。この支持体は、ウィルスホモジネートの膜結合フ ラクシヨンの分離及び精製を可能にするため、ワクチン製造にも用いられる。

本発明によって、クロマトグラフィー系に使用する大きさの機械的に安定な粒状 支持体構造と、上記支持体材料の表面の人工膜構造と、膜構造を上記表面に固定 する手段とから成る物質組成物が提供される。膜構造は親水性頭部基部分と疎水 性部分とをもつ両親媒性化合物から成る。両親媒性化合物の分子が集合して支持 体物質の表面の膜構造を定め、そこで膜構造は、好ましい実施例において、疎水 性内側部分と親水性外側頭部基部分とを有する。

このクロマトグラフィー支持体の表面上の膜構造を説明するのに使われる“固定 （又は固定された）”という言蔭は、移動相に対して使われていると考えるべき である。こうして、両親媒性化合物の分子は共有結合により固定され得る一方、 それらは、上記両親媒性化合物の疎水性部分と粒状支持体構造上の疎水性表面と の疎水性相互作用によって、親水性極性（水性）液相に対しても“固定され得る °。固定された膜構造を形成する好ましい両親媒性化合物は、人工膜（リポソー ム）及び生物学的細胞膜に出現するそれらである。燐脂質が最も好ましい。固定 された膜構造は、主要膜形成燐脂質として用いられる以外の燐脂質、ペプチド／ 蛋白質、糖類などを含むその他の生物学的膜構成成分、たとえば脂質の吸着によ って変形することができる。

本発明による好ましい共有結合固定膜クロマトグラフィー支持体の製造は、Ｃ１ ，ＯＣＩ６環状ジカルボン酸無水物と、グリセロホスファチット及びリソ燐脂″ 質との反応によ一コて誘導される新規の燐脂質カルボキシレートを用いて実現す る。

図面の簡単な説明 第１図は生物学的膜の構造を説明する。

第２（ａ）図及び第２（ｂ）図は、本発明のクロマトグラフィー支持体粒子の断 面図である。

第３（ａ）図及び第３（ｂ）図は本発明のクロマトグラフィー支持体粒子の部分 断面図である。

第４図及び第５図は、共有結合せる燐脂質及びリソ燐脂質をそれぞれ有する本発 明のクロマトグラフィー支持体粒子の部分断面図である。

第６図はいくつかの中間体化合物及びそれらの混合物の赤外吸収スペクトルを説 明する。

第７図はレシチンカルボン酸及び本発明のクロマトグラフィー支持体の＋３０固 体状磁気共鳴スペクトルを示す。

第８図は、ヌクレオシル−３００（７８Ｈ２）の表面に結合したレシチンのマイ クロモルと、支持体表面上のレシチン１分子あたりの面積（平方オングストロー ム）との間の関係を示すグラフである。

第９図は、本発明の固定膜担持支持体の反射率ＩＲスペクトルである。

第１０図、第１１図、第１２図は、本発明の支持体物質を用いるＨＰＬＣカラム における化合物の分離を示すクロマトグラムである。

第１３図、第１４図、第１５図は、本発明による粒状支持体組成物のためのいく つかの固定膜表面の分子構造を示す。

第１６図は、本発明の支持体組成物を用いるＲＰＬＣカラムにおける２−デオキ シヌクレオチドの分離を示すクロマト本発明によって、天然の生物学的膜の構造 的及び物理化学的特性を真似るように設計された表面をもつクロマトグラフィー 支持体物質がつくられる。

生物学的膜は、はとんどあらゆる種類の生物分子に対して親和性をあられす。生 物学的膜又は−系のあらゆる溶質−薬物、糖、脂質、核酸、アミノ酸、ペプチド 及び蛋白質を含む−は生物学的細胞膜と相互作用する。実際、生物分子と細胞膜 との間のこのような相互作用は細胞の機能及び生存能力の基礎である。

本発明によるクロマトグラフィー支持体は生物分子と生物学的膜との選択的相互 作用を利用する；それらは生物学的膜の構造に似た固定両親媒性表面をもつよう に設計されている。

膜構造及び膜構成要素の配列に関する文献には多くの例が挙げられている。この ような一つの例は第１図に示される。

これは最初にシンガー（Ｓｌｎｇｅｔ）及びニコルソン（Ｎ１ｃｈｏｌｓ。

ｎ）著科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１７５巻、７２０ページ（１９７２年）に提案 され、後にハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）及びＳｐａｒｒｏｗ（スバロウ）の“ 高性能クロマトグラフィー（）１１ｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒ■ａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉ ｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　”　３　＠、　５１ページ（Ａｃａｄｅ ＊ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８３　）において改質された膜構造をあられすいわゆ る流動モザイクモデルである。生物学的膜構造（１ｏ）が両親媒性燐脂質分子（ １３）の二重層（１２ａ）、（１２ｂ）として示され、各分子は頭部基の部分（ １４）と疎水性部分（１５）とを有する。それぞれの二重層燐脂質の頭部基の部 分（１４）は、集合して、外側親水性膜表面の輪郭を形成し、これらは膜構造の 主要燐脂質構成成分の疎水性部分（１５）によって構成される無極性（疎水性） 環境によって分離される。両親媒性燐脂質分子（１３）に加えて、生物学的膜に は以下のものを含むその他の構成要素（１６）が存在する：たとえば、細胞機能 調節のために重要な、たとえはずレセプター分子、酵素などの膜関連性（結合性 ）蛋白質、及びたとえば脂質（例：コレステロール）及び糖類などその他の構成 要素。

本発明によって、クロマトグラフィー系に使用するための大きさの、機械的に安 定した粒状構造と、支持体材料の表面の人工膜構造と、上記膜構造を支持体材料 の表面に固定する手段とから成る新規の物質構造が提供される。その膜構造は、 親水性の頭部基部分と疎水性部分とを有する両親媒性化合物から成り、その両親 媒性化合物は燐脂質及びその他の生物学的膜構成成分から選択される。固定膜構 造は、生物学的膜のように、外側親水性頭部基部分と、内側無極性（疎水性）部 分とをもつように形成される。

膜構造の固定は、成分両親媒性分その共有結合によるか、両親媒性分子と、粒状 支持体構造の疎水性表面との疎水性相互作用によるか又は疎水性相互作用と共有 結合との組み合わせによって実現できる。膜固定のどの方法も何らかの利点をも っており、固定膜支持体物質の使用目的を考慮した後に好ましい方法を決めるこ とができる。こうして、膜構造を形成する構成要素両親媒性化合物の共有結合は より安定な（すなわち成分分子の移動に対してより大きく抵抗する）固定膜構造 及び広い範囲の移動相と共に使用できる構造を提供するか、　も知れないが、支 持体表面に共有結合で結合し、集合して固定膜構造を輪郭づける両親媒性分子は 生物学的膜の両親媒性分子がもつ横側への移動性（ｌａｔｅｒａｌ　ｎｏｂｉｌ ｉｔｙ）をもたない。

他方、膜構成成分両親媒性分子と粒状支持体の疎水性表面との疎水性相互作用の みによって固定された人工膜構造は、生物学的膜においてこのような分子が本来 もっている横側への移動性を有する。人工膜構造を固定するための手段として疎 水性相互作用を利用することは、クロマトグラフィー支持体の寿命の減少及び移 動相の制限という不利益を菅むる。こうして、ホスファチジルコリンなどの燐脂 質の膜形成溶液を市販の逆相クロマトグラフィー支持体物質と接触させることに よって得られる固定膜支持体は、人工膜支持体の固定膜の疎水性相互作用を妨害 しない極性移動相と共に使用しなければならない。さらに、移動相が水に限られ る場合でさえ、燐脂質は、それらの両親媒性並びに移動相の溶質分子の特性によ って、“疎水性相互作用で固定された°膜構造から徐々に漏れる。このような疎 水性相互作用で固定された膜支持体の再生は、たとえば新たに調製した燐脂質溶 液を、膜担持支持体物質を含有するクロマトグラフィーカラムを潅流することに よって実現する。

固定膜支持体は、疎水性相互作用及び共有結合による結合の両方を利用してつく ることもできる。たとえば、燐脂質分子の疎水性部分上に架橋可能官能基をもつ 燐脂質から固定膜を形成するためのベースとして、疎水性逆相粒状支持体物質を 用いることができる。このような燐脂質の例は、１９８２年９月７日発行のチャ ブマン（Ｃｈａｐｍａｎ）の米国特許第４゜３４８．３２９号に記載されたもの である。これの開示は引例によってニーに明らかに挿入されている。チャブマン によって開示された燐脂質は、疎水性部分にＣｌ１−Ｃ２６脂肪酸エステルを有 し、このエステルは化学線照射によって同様の基と架橋して分子間−及び分子内 架橋を生成し得る共軛ジーイン（ｄｉ−ｙｎｅ）官能砺を有するこうしてこのよ うな共軛ジイン燐脂質は溶液中で、疎水性逆相粒子又は疎水性表面をもつ樹脂性 （重合した）粒状支持体物質と接触して、粒子表面に膜状燐脂質−重層を形成す ることができる。これはその後照射され、それによって架橋され、粒子表面上の 共有結合によって効果的に固定された膜状外皮（ｗｅｓｂｒａｎｅ−１１ｋｅ　 ｐｅｌｌｌｃｕｌａｒｃｏａｔ　ｉ　ｎｇ）を形成することができる。

別法として疎水性部分に反応性官能基をもつ燐脂質を用いて人工膜構造を形成す ることができる。そしてその後、或いは膜生成と共に、それらは粒状支持体表面 に結合している官能基と反応して、固定膜構造を構成する両親媒性分子の全部又 はかなりの部分をその支持体表面に共有結合させることができる。

このような共有結合の性質は本発明による固定人工膜支持体の機能にとって重要 でない。こうして反応性官能基をもっている両親媒性分子を表面官能基によって −又はそれとの反応によって一支持体表面に共有結合させることは、照射による 架橋反応によって、又はたとえば、エステル、エーテル又はアミド結合などの生 成に通ずる求核性、又は縮合型反応によって実現される。

本発明によって製造される固定人工膜担持支持体は単独の両親媒性化合物又は、 もし必要ならば、異なる両親媒性化合物の混合物から形成され、固定膜担持クロ マトグラフィー支持体物質の表面特性を変えることができる。

本発明の固定膜構造の基礎として用いられる機械的に安定な粒状支持体構造は当 業者には公知である。それらは多孔質であっても非孔質であってもよく、シリカ 、アルミナ、チタンから、又は高性能クロマトグラフィー系であられれる圧力に 十分抵抗できる構造的一体性をもつ樹脂からも形成され得る。粒子サイズは約５ 乃至約１００ミクロン、より好ましくは約５乃至約５０ミクロンの範囲の直径で ある。本発明による固定膜支持体を形成するために、市販のＣ８及びＣ１１ｌ逆 相粒状支持体が好都合に用いられる：こへでは膜は上記支持体の疎水性表面と、 使用した両親媒性化合物の疎水性部分との疎水性相互作用によって固定される。

その他の市販の粒状支持体を好都合に用いて、共有結合による固定膜支持体を形 成することができる。こうしてたとえば本発明の好ましい実施例では、ヌクレオ シル−３００（７ＮＨ２）　−粒子サイズ約７ミクロンで、共有結合せるプロピ ルアミン基をもっているシリカ基礎−支持体−を以下により詳細に記述するよう に用いて、膜構造を構成する両親媒性燐脂質分子が全部、粒子表面に共有結合で 結合している固定膜担持クロマトグラフィー支持体を提供することができる。こ ＼でも共有結合の性質は、本発明による固定膜支持体の機能にとって重要でない 。

両親媒性燐脂質化合物の疎水性部分の官能基と反応し、その官能基と共有結合を 形成し得る官能基をもっそめ他の市販の粒状支持体構造が使用できると予想され る。両親媒性化合物と共有結合を形成するために使用できる官能基をもつ市販の 薄膜被覆クロマトグラフィー支持体物質は、機械的に安定な支持体構造としての 使用が容認される。より詳細に言うならば、エポキシ樹脂、又はその他のアミン 架橋剤で架橋されたポリアミン、たとえばポリエチレンイミンから形成される薄 膜コーティングをもつ支持体は、本発明の組成物のための適した支持体構造であ る。このような支持体は１９８１年１月１３日発行のレグニール（Ｒｅｇｎｌｅ ｒ）らの米国特許第４゜２４５．００５号に記載されている。

第２図及び第３図は、本発明による固定膜担持粒状クロマトグラフィー支持体を 示す。ｔｊ／４２　（ａ）図を例に引くと、固定膜構造は、親水性頭部基部性（ １４）と疎水性部分（１５）とを有し、共有結合によって結合した両親媒性分子 から成る。

両親媒性化合物分子は結合（２２）によって、機械的に安定な粒状支持体（１９ ）の表面に共有結合する。固定膜構造は、実際には第１図に示される生物学的膜 （１０）の二重層（１２ａ）、（１２ｂ）の半分として見ることができる、但し 二重層状表面をもつ支持体も本発明により仕上げられる。膜構造は外側親水性表 面、すなわち親水性頭部基（１４）と、共有結合せる両親媒性分子（１８）の疎 水性部分（１５）によって集合的に輪郭づけられる疎水性内側部分とを示す。

第３（ａ）図及び第３（ｂ）図は、疎水性表面構造（２１）及び疎水性表面構造 （２１）と両親媒性分子（１８）の疎水性部分（１５）との間の疎水性相互作用 の座（２６）を有する粒子（１つ）上の、頭部基部分（１４）と疎水性部分（１ ５）とを有する多数の両親媒性分子（１８）、最も好ましくは燐脂質分子から成 る固定膜構造（２４）を説明している。

第３（ｂ）図も同様に、疎水性表面構造（２１）をもつ粒子（１９）の表面１の 親水性相互作用−固定膜構造（２４）を説明している。しかしながら第３（ｂ） 図に示される膜構造では、両親媒性分子（１８）の疎水性部分（１５）は、疎水 性表面構造（２１）を集合的に輪郭づけている疎水性置換基と互いにかみ合い（ 組み合わせた両手の指のように）、疎水性相互作用の座（２６）の増加と、′こ れによる固定人工膜構造の安定性（移動性に対する抵抗）の増加をおこす。

本発明による固定膜を形成するために用いられる好ましい両親媒性分子は、天然 の生物学的膜に見出される両親媒性分子である。このようなものの例は、成る種 の海の生物の膜に見出されるホスファチジルスルフォコリン刊酸物を含むレシチ ン及びその他の、当業者には公知のレシチン同族体、セファリン、スフィンゴミ エリン、カルシオリピン、糖脂質、ガングリオシド、及びセレブロシド及び上記 化合物のリソ同族体である。脂肪酸及び当業者には公知の両性イオン性両親媒性 化合物−ムラカミらのＪ　、　Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、１９８２，４７＠、　２１ ３７−２１４４ページに記載されているようなアミノ酸を含む−　も含まれる。

本発明による使用に適応する好ましい両親媒性化合物群は燐脂質及びそれらのリ ソ同族体である。本発明を明確に示す目的から、燐脂質の“リソ同族体“とは、 親の脂質化合物よりも少ない疎水性置換基をもつ脂質を意味する。燐脂質の中で レシチンと、リゾレシチンが特に好ましい。こうして、本発明による固定膜は、 ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファ チジルエタノールアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、 ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール及びホ スファチジルグリセロールを用いて支持体物質上に形成される。生物学的膜に最 も多い燐脂質であるホスファチジルコリンが特に好ましい。このような両親媒性 化合物を用いて疎水性逆相粒状支持体上に直接固定膜を形成せしめ、疎水性相互 作用固定膜表面をつくり出すことができる。別法として、これらの組成物を変形 して、これら分子の疎水性部分の末端又はその近くに反応性官能基をつくること ができる。上記官能基は支持体材料の表面上の反応性官能基と共有結合を生成す ることができるものである。

支持体に類似の（ｍｉｍｅｔｉｃ）本発明の膜を形成するために用いられるもう 一つの化合物群は、以下の構造式■の環状無水物である。

本発明による固定人工膜支持体を形成するのに用いられる燐脂質の量は、支持体 構造の表面積１００平方オングストロームにつき両親媒性化合物約１乃至２分子 の濃度で、支持体構造の表面を覆うのに十分な量でなければならない。両親媒性 化合物が支持体の表面に共有結合したホスファチジルコリンである場合、その量 は、支持体構造１００平方オングストロームにつき約１．３乃至約１．６分子の 濃度でその支持体構造の表面を覆うのに十分な量でなければならない。

本発明による固定人工膜構造は、上述の固定両親媒性分子の他に、脂質（その他 の燐脂質を含む）、ペプチド又は蛋白質（レセプター、酵素、抗体などを含む） 、糖類、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及びペプチド、糖類、オリゴヌ クレオチド及びポリヌクレオチドの膜結合同族体を含む−但しこれらに限定され るわけではない−　その他の生物学的膜構成成分を含むようにつくることができ る。ニーに用いた“膜結合同族体”とは、化学的に変形されて少くとも一つの付 加的膜結合基をもつ誘導体であって、その付加的膜結合基はその誘導体化合物の 膜結合特性を増加するようにはたらくという誘導体を指す。たとえば、ペプチド 又は蛋白質の膜結合特性は、このような化合物を、生物学的膜に対して高い親和 性をもつことが知られているもう一つの化学的実体、たとえば公知の経、膜的（ ｔｒａｎｓｍｅＩｌｂｒａｎｅ　）ペプチド配列の全部又は官能的部分に一致す るアミノ酸配列をもつペプチド、又はその他の膜結合分子、たとえばコレステロ ール又はコレステロールエステルに共有結合させることによって高められる。

膜結合配列は、第２（ａ）図に示されるような本発明の支持体を用いるクロマト グラフィー系において実験的に確認される。このような系における大きい滞溜時 間は、高い膜親和性を示唆するものである。

第２（ａ）図に示されるような固定膜を、溶液中の溶媒分子に対してよりも固定 膜構造の方により大きい親和性をもつ一つ以上の膜構成成分の溶液で処理し、そ の膜構成成分が固定膜構造上に、又はその中に吸着或いは吸収されるようにする ことができる。このような処理による生成物は第２（ｂ）図に示され、このよう な膜構成成分（１６）が粒子表面の固定膜構造内に吸着又は吸収されることを示 している。このような付加的膜構成要素は、それら自体、粒子表面か又は人工膜 構造の両親媒性燐脂質分子上の利用可能の官能基かどちらかに共有結合すること ができる。本発明による固定膜に“負荷゛される好ましい膜構成要素群は、燐脂 質（すなわち固定膜において側方移動性をもつ燐脂質相）、コレステロール。

コレステロールエステル及びペプチド、特に膜結合領域（すなわち膜結合アミノ 酸配列）をもつものである。文献には、膜界面に吸着するか或いは天然の生物学 的膜にのび又はそれを突き抜けることがわかっている蛋白質のソース及びアミノ 酸配列を記載した例が多くある。本発明の固定膜担持クロマトグラフィー支持体 の補充的構成要素として用いる場合、このような分子の、それらの“天然の°環 境におけるその他の物質との相互作用を、高−１中−又は低圧液体クロマトグラ フィーによって研究することができる。

第４図及び第５図は、本発明による共有詰合せる好ましい人工膜の構造を若干よ り詳しく説明している。第４図および第５図に示される化学式において、Ｚは式 −〇ＰＯ，ＯＲで表される基を示す。こ＼でＲは水素、２アミノエチル、２−（ Ｎ−メチル）アミノエチル、２−　（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エチル、２−（ トリメチルアンモニウム）エチル、イノジチル、グリセリル、２−カルボキシ− ２−アミノエチル。

及びガラクトピラノシルから成る群から選択される。それらによってあられされ る燐脂質分子は共有結合（２２）によって粒子（１９）の表面に共有結合してい る。こうして結合した燐脂質分子は集合して固定膜を構成する。この固定膜は疎 水性部分（２４）及び（２５）によって輪郭づけられる内側疎水性領域と、頭部 基（１４）によって集合的に形づけられる外側親水性部分とを有する。粒子支持 体の表面と共有結合するための燐脂質中間体を選択する場合、粒子表面の官能基 と反応して共有結合（２２）を形成するための官能基を担持する分子中の疎水性 部分（２４）は、その分子のその他の疎水性部分（２５）の長さが、共有結合生 成に対して立体障害をおこさないように、官能基担持疎水性部分（２４）より短 かいように寸法を定められるのが好ましい。言いかえれば、結合する疎水性部分 （２４）は、支持体表面と頭部基部分との間に十分な距離をもち、非担持疎水性 部分（２５）が、自然の、立体的に影響されないコンホメーシヨンで粒子（１９ ）の表面の方に延びることができなければならない。疎水性部分（２５）が官能 基担持部分（２４）よりかなり長い場合、こ・のような疎水性部分は、生成する 共有結合固定膜構造の製造、及び、多分、官能性も妨害することがある。

第５図は、共有結合したリソ燐脂質基から成る本発明による共有結合固定構造を 示す。第４図及び第５図に示す両構造において、前述の制限を除けば、疎水性部 分（２４）−それは任意に３つまでの不飽和−又は枝分かれ点をもつことができ る−の長さは重要でない。

本発明の説明において、化学式“ＯＰＯ□ＯＲ“という表わし方が用いられてい る。この表わし方は、描かれている燐酸エステルのプロトン型も非プロトン型も 両方共含む。

第２図、第４図及び第５図に説明される共有結合膜構造は、グリセロホスファチ ド又はリソ燐脂質と、環状ジカルボン酸無水物との反応によって誘導される新規 の燐脂質カルボン酸から好都合に合成される。このような新規の人工膜形成燐脂 質は式 ％式％ こ〜でｎは２乃至１４の整数、 Ｒ６は−ＯＨ又は１−イミダゾリル； Ｑは式 ％式％ ニーでＲは水素、２−アミノエチル、２−（Ｎ−メチル）アミノエチル、２−　 （Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エチル、２−（トリメチルアンモニウム）エチル、 イノジチル、グリセリル、２−カルボキシ−２−アミノエチル及びガラクトピラ ノシル； Ｗは一〇−又は−ＮＨ−； Ｒ４は水素、又はＣ２−Ｃ２゜カルボン酸から誘導されるアシル基；そして Ｒｔは水素であり、Ｒ，ｌは水素である又はＲ７及びＲ，はそれらがくっついて いる炭素と共にシクロペンタン環を形成する。これらの化合物は、対応するリン 燐脂質（たとえば燐脂質をホスフォリパーゼＡ１又はＡ２で酵素的加水分解する ことによって誘導される）、グリセロホスファチット、又は当業者には公知の、 それらの２−デオキシ−２−アミノ−同族体〔チャンドラフマル（Ｃｈａｎｄ　 ｒａｋｕｍａｒ）及びハジュ（）Ｉａｊｄｕ）　、　　Ｊ、　Ｏｒｇ、Ｃｈｅｗ 、、１９８２．　４７巻２１４４−２１４７ページ）と、Ｃ４−Ｃｌ＆アルカル ジカルボン酸無水物との反応によってつくられる。生成したカルボン酸化合物は この化合物のアシル化型に変換される；こ−でＲ６は等量の１．１−カルボニル ジイミダゾールとの反応により、１−イミダゾリルである。生成したイミダゾリ ドを反応性官能基として用いて、クロマトグラフィー支持体物質表面上の親核官 能基、たとえばアミノ基と共有結合を形成することができる。上記式Ｉによる好 マしい化合物群は式 ％式％ で表わされ、こ〜でｎは８乃至１４の整数である新規の環状無水物を、Ｃ１０− Ｃｉ＆脂肪酸から誘導されるアシル基をもつリソ燐脂質と反応させることによっ て得られる化合物である。

本発明を説明するために用いられるＣ、−Ｃ２゜カルボン酸という語は、任意に ３点までの不飽和をもち、分子の形が線状であるのが好ましいが任意に環状又は 枝分れ構造ももち得るモノ−及びジカルボン酸を含む。

驚くべきことに、上記式■によって表されｎ−１２である１５−員環状無水物は 、温（〜４０℃）テトラヒドロフランに溶解した対応するジカルボン酸を当量の ジシクロへキシルカルボジイミドと反応させることによって高収量でつくられる ことが判明した。

式−ＣＨ２０Ｐ　Ｏ２ＯＲ＋で表わされる燐酸ジエステル基を含む基を、共有結 合で結合して含むクロマトグラフィー支持体物質がつくられる。こ〜でＲ１は２ −アミノエチル、２−　（Ｎ−メチルアミノ）エチル、２−　（Ｎ、Ｎ−ジメチ ルアミノ）エチル、２−（トリメチルアンモニウム）エチル、２−カルボキシ− ２−アミノエチル、イノジチル、グリセリル。

ガラクトピラノシルから成る群から選択される。このような燐脂質頭部基部分を 担持するクロマトグラフィーは、生物学的膜の燐脂質成分の頭部基部分に対して 選択的親和性を示す物質のクロマトグラフィーのために特に有用な親水性表面を 提供する。燐酸ジエステル部分の、クロマトグラフィー支持体物質表面への共存 結合の性質は重要でない；しかしながらそれは、結合の長さ並びに化学構造に依 存して、固定燐酸ジエステル固定相の表面特性に対して顕著な影響をもつ。さら に、クロマトグラフィー条件下では、成る型の共有結合は他の型よりも安定であ るかも知れない。たとえばエーテル結合はエステル結合よりも加水分解を受けに くい。よって、いくつかの用途では、グリセリル部分と、使用燐脂質化合物の疎 水性部分との間のエーテル結合を用いて、本発明の膜類似組成物をつくるのが有 利である。

好ましい一実施例では支持体物質は、式−０ＣＲ２ＣＨＯＲａ　ＣＨ２０Ｐ　Ｏ □Ｒ１で表され、こ−でＲ４が水素、又はカルボン酸から誘導されるアシル基で ある、共有結合によりて結合したグリセリル燐酸ジエステルをもっている。ニー でもその基とクロマトグラフィー支持体物質表面との間の共有結合の長さ及び性 質は、重要ではないが、このような共有結合基をもつ支持体材料のクロマトグラ フィー特性に影響を与え得る。

より好ましい実施例において、支持体物質は、式％式％ で表わされる共有詰合せる基を有する；こ〜でｎは２乃至１４の整数であり、ｍ は＜ｎの整数である（もう一つの好ましい実施例において、支持体物質は、式 ％式％ で表わされる共有結合せる基を有する；こ−でｎは８乃至１４の整数である。こ のようなりロマトグラフイー支持体材料は、燐脂質から誘導される中間生成物を 環状無水物と反応させ、生成したカルボン酸を、たとえば１−１−カルボニルジ イミダゾールを用いて活性化アシル化作用物質（ａｇｅｎｔ）に変形し、そのイ ミダゾリド中間生成物を、エステル形成−又はアミン形成求核置換／縮合反応に より、反応及び共有結合のためのアルコール又はアミノ基をもつ市販の支持体材 料と反応させることによってつくられる。

式■によって表わされ、ニーでｎが８乃至１４である環状無水物は、表面に共有 詰合せる官能基をもつクロマトグラフィーを製造するための貴重な中間生成物で ある。環状無水物は市販のクロマトグラフィー支持体物質表面の共有結合せる求 核基（立体的制限のみを受ける）。たとえばヌクレオシル３００（７ＮＨ２）の プロピルアミン基と反応し、反応性カルボン酸に終るＣ８乃至ＣＩ４の実質上疎 水性の結合基をつくることができる。このように（これらの無水物などで）改質 されたクロマトグラフィー支持体物質はそれ自体、本発明による高圧液体クロマ トグラフィーのための効果的クロマトグラフィー支持体物質として役立つ一方、 それらは、末端カルボキシル基がクロマトグラフィー系において生物分子と相互 作用するのに所望の特性をもつその他の分子の共有結合のための官能基として用 いられるという中間体としての価値ももつ。こうして、その無水物は、式−ＣＯ （ＣＨ２）−Ｃ０−で表わされ、ニーでｎが８乃至１４の整数である二価結合基 の便利なソースとして役立つ。

式■の環状無水物を二価結合基のソースとして用いる一例は、本発明による固定 膜の生成である。より詳細に述べるならば、その結合基を用いて、膜構成成分分 子と支持体表面との距離を置き、より多く“二重層状°である固定膜構造をつく ることができる。前に、“共有結合により固定された膜構造は支持体表面に結合 した生物学的膜二重層の半分に匹敵する°と述べた。支持体表面と膜構成成分両 親媒性分子との間に二価結合基として環状無水物を使用することによって、完全 な膜二重層に、よりよく似た（少くとも疎水性部分の深さでは）、固定膜構造が つくられる。要するに、このような組成物は下記の段階を用いてつくられる：　 （１）ヌクレオシル−３００（７Ｎ　Ｈ２）をたとえば、式■によって表わされ 、ニーでｎが４である環状ジカルボン酸無水物と反応させ、支持体構造から約１ ６−１８炭素原子（プロピルアミン基の炭素原子を含む）の共有結合せるカルボ キシル基の表面をもつ支持体物質をつくる〔第１５図参照）；　　（２）生成支 持体を１．１−カルボニルジイミダゾールと反応せしめ対応するイミダゾリドを 形成する；　（３）イミダゾリド担持支持体物質をエチレンジアミンの過剰（架 橋を最小にするため）と反応させ、ヌクレオシル−３００（７ＮＨ２）の表面の 結合基が式 ％式％ ＣＨ２Ｎ　Ｈ２の基によって表わされるようにし、（４）その生成物を、たとえ ば以下の実施例でつくられるレシチンイミダゾリドと反応させる。

二重層状固定人工膜は、粒子表面に、当業者には公知の“ボロ両親媒性物質（ｂ ｏｌｏａｍｐｈｊｐｈｃｌｅｓ）　’−二頭両親媒性物質として最もよく説明さ れる、−すなわち長い疎水性鎖の各端に親水性頭部基をもつ化合物を結合せしめ ることによってもつくられる。

本発明による固定膜クロマトグラフィー支持体物質は有機化合物精製のための種 々様々のクロマトグラフィー系に用いることができる。本発明の支持体物質は伝 統的液体固体クロマトグラフィー並びに薄層クロマトグラフィー及び高圧液体ク ロマトグラフィーにも用いることができる。こうして本発明のクロマトグラフィ ー基質は、化学化合物の膜関連（結合）特性を評価する方法、並びに化学化合物 の膜関連（結合）特性を利用して上記化合物を異なる膜関連特性をもつ化合物か ら分離する方法に用いられる。その方法は高圧液相クロマトグラフィー系におい て好都合に行われる。実質上結合両親媒性燐脂質から成る固定膜構造と、固定さ れた生物学的活性蛋白質とから成る固定相を利用するＨＰＬＣクロマトグラフィ ー系を用いて、試験化合物の固定膜結合（ａｓｓｏｃｌａｔｌｏｎ）特性を、固 定膜固定相中のペプチドと関係する（結合する）生物学的活性をもつことがわか っている化合物の固定膜結合特性と比較する手段をつくり出すことによって、諸 物質のあり得る生物学的活性を確認することができると考えられる。蛋白質構成 要素は、共有結合によって、その天然の膜親和性によって（たとえば蛋白質それ 自体が経膜的配列をもっている）、又は前述のように膜結合性類似物への変換に よって固定化され得る。

本発明の固定膜固定相は新しい薬のリードを確認する可能性を与えると考えられ る。本発明の固定膜基質のこのような応用は次の仮説に基づいている：膜構成成 分に結合する分子はたとえば（１）その他の薬物を細胞の標的部位に達せしめる 界面障壁を変えることによって、及び／又は（２）膜関連蛋白質を界面ペプチド に結合させることによって、薬物学的活性をもつ。薬物の、界面ペプチドへの結 合は、固定蛋白質構成成分の動揺をおこす。

ＨＰＬＣ薬物発見法における固定膜の使用は多分、請求の組成物の最も重要な応 用である。薬物発見は、ＨＰＬＣ固定膜カラム上における界面ペプチドの滞留時 間を減らす移動相中の分子を確認する。このような移動相置換リガンドが潜在的 薬物リードである。薬物発見の別法は、薬物標的部位（たとえば固定膜で固定さ れた生物学的活性蛋白質又はその官能性配列）をもつか又はもたない、たとえば ヌクレオシル−レシチンカラムの使用を含む。薬物標的部位を含むカラム上の滞 留時間が長い分子は薬物リードである。固定膜か、伝統的アフィニティーカラム かどちらかを用いるＨＰＬＣ−薬物発見のこの概念は、当業者には新規である。

請求の固定膜組成物について予期されるその他の用途としては、燐脂質のクロマ トグラフィー分離のための固体支持体としての利用、モしてキラル合成の基質と しての利用がある。

はとんど水性の移動相を用いて本発明の固定膜組成物上の蛋白質を溶出する能力 は高い（逆相クロマトグラフィー系における高い溶媒濃度に対して）から、この 膜担持支持体物質は非常に種々様々の蛋白質物質の非変性性分離を可能にする。

その上、本発明の組成物は、内毒素を汚染蛋白質試料がら分離又は除去するため に有用な固定相を提供する可能性がある。

さらに、この固定膜は膜結合ペプチドに対して選択的親和性をもつため、固定膜 を固定相として用いるクロマトグラフィー系を用いて、多価ワクチン組成物の製 造のために細胞−又はウィルスホモジネートを分離することができる。表面（膜 結合性の〕蛋白質フラクシヨンは、普通からだの抗原形成機構にさらされるとこ ろである。そこで、高い膜親和性をもつ領域と結合したウィルス蛋白質の抗原領 域がホモジネートから分離され、ワクチン製造のために用いられる。

本発明の固定膜支持体を利用するクロマトグラフィー系はペプチド及び蛋白質の 分離、精製のための手段である。それらは組換えＤＮＡ研究の蛋白質／ペプチド 生成物の精製のために特別に利用される。たとえば成る蛋白質を表現することの できるＤＮＡ表現ベクターで形質転換された宿主細胞中に表現される蛋白質を、 本発明の固定膜支持体物質を用いるクロマトグラフィー技術によって細胞溶解物 から分離することができる。固定膜支持体物質のクロマトグラフィー性能につい ては比較的少ないデータしか得られていないが、多くのペプチド及び蛋白質のク ロマトグラフィーが非変性水性移動相の条件下で実施できる。

本発明の固定膜支持体と膜結合ペプチドとの間の選択的相互作用は、組換えＤＮ Ａ技術を使用して産生される蛋白質のための一般的精製法において特別な利点を もって利用される。

組換えＤＮＡ技術は、共有結合せる過剰のアミノ酸をもつ官能性蛋白質（ポリペ プチド）の生産を可能とし、ニーでは生成した“ハイブリッドポリペプチド”の 物理化学的特性はハイブリッド蛋白質の分離および精製を容易にする。このよう な特別のアミノ酸配列は“精製ハンドル（ｐｕｒｌｆｌｃａｔｉｏｎ　ｈａｎｄ ｌｅ　）　’　、又は“確認ペプチド（１ｄｅｎｔＲ１ｃａｔｌｏｎ　ｐｅｐｔ ｉｄｅ）　’と呼ばれる、これは選択的に切断可能のペプチド結合によって所望 の蛋白質に結合しているのが好ましい。“ハイブリッド蛋白質の精製後、精製ハ ンドル又は確認ペプチドによってハイブリッド分子に与えられる物理化学的特性 によって定まる精製手段を用いて、その配列（精製ハンドル／確認ペプチド）は 、あらかじめ定められた介在分断部位で所望の蛋白質から切断される。遺伝子工 学的微生物によって製造された蛋白質を精製するためのこのような技術は１９８ 年２月１１日に発行された米国特許第４．５６９．７９４号及び米国特許第４． ７０３．００４号に記載されている：これらの開示は引例によってニーに明らか に挿入される。

米国特許第４，５６９．７９４号は、生物学的活性ペプチド又は蛋白質を前駆物 質の形で、その前駆物質を固定化金属イオン含有樹脂と接触させることによって 上記前駆物質と不純物を含む混合物から分離する方法を記載している。その前駆 体は、固定化金属イオン−キレートペプチドに直接又は間接に共有結合した生物 学的活性ポリペプチド又は蛋白質から成る。ハイブリッド蛋白質前駆物質は固定 金属イオン樹脂から選択的に溶出され、任意に切断条件にさらさね、前駆物質精 製後、生物学的活性ペプチドを放出する。第４５６９７９４号の特許は、紹換え ＤＮＡ法によって前駆体ハイブリッド分子を生産する方法を詳述し°Ｃいる。

米国特許第４．７０３．００４号も同様な方法を記載しており、そこでは精製ハ ンドル、又はこの特許で称されている″確認ペプチド″は、抗原性の大きいＮ末 端部分と、官能性蛋白質のＮ−末端部分に結合せるＣ−末端結合部分とから成る 。確認ペプチドの結合部分は、配列に特異的な蛋白質分解酵素又は化学的蛋白質 分解剤の使用によって、官能性蛋白質に隣接せる特異的アミノ酸残基のところで 切断できる。クローニングベクターによって形質転換された宿主細胞によって表 現されるハイブリッドポリペプチドは、確認ペプチドの抗原部分に特異的な固定 リガンドを利′用するアフィニティークロマトグラフィー法によって、それらか ら除去され、精製される。その後蛋白質は、分離されたハイブリッドポリペプチ ドから適当な蛋白質分解酵素又は化学試薬で切断され、それによって成熟した官 能性蛋白質が高度に純粋な高度に活性な状態で遊離する。同様な方法が、モウク （Ｔ、Ｍｏｋｅ）の“生化学（Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ）　”　、１９８７． 　２６巻、５２３９−５２４４にも記されている。

７９４及び００４の特許に記載の一般的方法を用いて、予測可能の膜親和性をも つ確認ペプチド及び所望の官能性蛋白質から成るハイブリッドポリペプチド／蛋 白質が遺伝子工学的微生物によって生産され、本発明による固定膜クロマトグラ フィー支持体を用いて精製され、その後選択的に切断されて、高純度状態の官能 性蛋白質が提供される。

米国特許第４．５６９，７９４号に記載の方法における固定金属イオンキレート ペプチドに代る、或いは米国特許第４７０３００４に記載のハイブリッドポリペ プチドの製造に用いられた抗原性確認ペプチドの代りとなり得る適当な膜結合ペ プチドは、天然に生ずる蛋白質の公知の膜結合配列、たとえば、いわゆる“軽層 的配列（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）　＠を含むペプチ ド配列である。生物学的蛋白質の膜結合ペプチド配列を記載した文献は多数ある 。このような天然ペプチド配列、より好ましくは介在分断可能ペプチド結合をも った、生物学的官能性蛋白質と並んで（ｔｎ　ｔａｎｄｅ■ｗｉｔｈ）クローン 化される約１０乃至約３０のアミノ酸から成る配列の使用がより好ましい。精製 ハンドルとしての膜結合ペプチドの使用は、このような配列の、膜環境に対する 天然の親和性を利用して、共有結合せる膜結合精製ハンドルなしには、必要な選 択的表面と膜表面との相互作用（これによって本発明の固定人工膜上での精製が 可能である）を多分もたない官能性蛋白質を精製することができる。今開示した 一般的精製法は、それ自体細胞膜表面に対して高い親和性をもたない蛋白質の分 離のためにより大きい利用性を有するのは明らかである。

ペプチド配列の膜親和性は上記のように実験的に定められるか、又はホップ（Ｈ ｏｐｐ）及びウッド（Ｗｏｏｄ）　　（１９８１）の“自然科学アカデミ−会報 （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ａｃａｄｅｔａｙ 　ｏｒ　５ｃｅｌｎｃｅ）　’　７８巻３８２４ページ、又はカイト（Ｋｌｔｅ ）及びドゥーリトウル（Ｄｏｏｌｌｔｔｌｅ）　　（１９８２）の“分子生物学 雑ｍ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ）　、　 　１５７巻１０５ページに記載されているようにエネルギー計算水はヒトロバシ ープロットによって予測できることに注目すべきである。こうして膜親和性は最 初の原理から予測できる。こ−に開示される一般的蛋白質精製法にしたがい、精 製ハンドルとして用いられる合成膜結合ペプチドの一例は、サバラオ（５ｕｂｂ ａｒａｏ）らが“生物理学雑誌（Ｂｌｏｐｈｙｓｌｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）　 ”’４９巻１３４ａページ（１９８Ｂ）に記載し、同著者によって“Ｐｌｏｏ” と名づけられた３０アミノ酸両親媒性ペプチドである。Ｐｌｏｏは次の配列をも っ：Ｈ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ　−Ａｌａ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌ　ｕ−Ａ ｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌ　ｕ−Ｈｉｓ −Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ−Ｇ　１ｕ−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ−Ｇｉ　ｕ−Ａｌ ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ０それは、ＰＨが ７．６乃至４．２である場合はランダムコイルとなり、α−らせんコンホメーシ ョン変化を受ける。この両親媒性ペプチドが、ＰＨに対するフンホメーション的 感受性をもつために、それは本性による精製ハンドルとしての使用に特異的に適 応する。たとえば、そのペプチド又はそれの膜結合断片は、上に引用した特許に 詳細に述べられている選択的に切断可能のペプチド結合によって、生物学的官能 性の蛋白質に並んで（１ｎ　ｔａｎｄｅ■ｔｏ）クローン化される。生成したハ イブリッドペプチドは一般的構造Ｐ１０〇−分割可能のベブチッド結合鎖−官能 性ベブチドそのハイブリッドペプチドは、クロマトグラフィーによって、たとえ ばＨＰＬＣ系で、本発明の固定膜クロマトグラフィー支持体を用いて精製される 。ペプチドと、膜担持支持体との相互作用は、移動相のＰＨ調節によってコント ロールされる。

組換えＤＮＡ法によって生産された正しく設計されたハイブリッド蛋白質は、所 望生成物と膜結合蛋白質の接合点（ｊｕｎｃｔ　ｔｏｎ）に切断部位を含む。ハ イブリッド蛋白質生成物の化学的又は酵素的処理によって、切断部位から成熟生 成物が生ずる。高度に有用な選択的切断部位は、そのＣ末端で化学的又は酵素的 に切断可能であるアミノ酸配列から成る。

蛋白質を切断するために有用な化学的試薬の例は、臭化シアン、２−＜２−二ト ロフェニルスルフェニル）−３−ブロモ−３′−メチルインドリニウム（ＢＮＦ Ｓ−スカトール）。

ヒドロキシルアミンなどである。臭化シアンはメチオニン残基のＣ末端で蛋白質 を切断する。したがって選択的切断部位はメチオニン残基そのものである。ヒド ロキシルアミンは−Ａｓｎ−Ｂ−（こ〜でＢはＧｌｙ、Ｌｅｕ又はＡｌａである ）部分のＣ末端で切断する。ＢＮＦＳ−スカトールはトリプトファン残基のＣ− 末端で切断する。

切断のために有効な酵素剤の例はトリプシン、パパイン。

ペプシン、プラスミン、トロンビン、エンテロキナーゼなどである。これらの各 々は、それが識別する特定のアミノ酸配列で切断をおこす。たとえばエンテロキ ナーゼはアミノ酸配列−（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ−を識別する。ニーでｎは２から ４までの整数である。

最も好ましい選択的切断部位は、もしも所望の生物学的活性蛋白質にメチオニン がない場合は特に、メチオニン残基である。所望生成物のＮ末端に結合している この残基は、臭化シアンを用いる公知の方法により、容易に切断されて、所望生 成物を生産する。

切断可能のペプチド結合によって官能性ペプチドのＮ末端に詰合せる膜結合ペプ チド配列をもつハイブリッドペプチドとして表現され得る官能性蛋白質としては 、成長ホルモン。

インシュリン様成長因子、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出因子 、インターフェロン、インターロイキン１、インターロイ半２２１組織ブラスダ ンーゲンアクチベーターなと二がある。

固定化膜材料の調製 モノミリストリル拳リゾレシチンは、アバンチ会ポーラ−・リビッド社（Ａｖａ ｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　　Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ、）　、バーミンガム（Ｂｌｒｓ ｉｎｇｈａｍ）　、アラμｖ　（Ａｌａｂａｍａ　）によって注文合成された。

このリゾレシチンは、グリセロホスホコリンをジアシル化後レシチンのＣ−２位 を酵素切断することによって、調製された。ミリスチン酸９５％をこのジアシル 化に用いた。

最終産物で２％未満の不純物類は、最終固体担体にはほとんど影響を及ぼさない Ｃ１６およびＣＩ２飽和脂肪酸である。

１．３−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１゜１２−ドデカンジカ ルボン酸、酸化シュウトリウム（重水）。

カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）は、アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒ ｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。赤外分光分析用臭 化カリウム（ＫＢｒ）も同様にアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手した。

ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００（７ＮＨ２）は、レイニン・イ ンスッルメント社（Ｒａｉｎｉｎ　］ｎｓｔ、Ｃｏ、、Ｉｎｃ、）　、　ワアブ ーン（Ｗｏｂｕｒｎ）　、　ｖサチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ） から入手した。ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００（７ＮＨｚ　） は、逆相クロマトグラフィカラムに使用される担体材料のプロピルアミン基と類 似の表面密度のプロピルアミン基で誘導体化したシリカである。

溶媒は全て分析用等級であった。乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、水素化 カルシウム上で蒸留し調製した。乾燥りｏｏホルム（ＣＨＣｌｉ）は、五酸化リ ン（ｐｅｎｔｏｗｉｄｅ）（マリンクロット（Ｎａｌｌｌｎｃｋｒｏｄｔ）　ｌ 上で精製し調製し、かつ調製２４時間内に使用した。アルドリッチ（Ａｌｄｒｌ ｃｈ）から入手したジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）は、下記の如くエチル エーテルから結晶化した。酢酢エチル３０ｍ（に溶解したＤＭＡＰ８ｓｒを約２ ００ｍＪのエチルエーテルで稀釈した。−晩冷蔵しＤＭＡＰを沈殿させ、それは 焼結ガラス漏斗でろ過し採取できる。このＤＭＡＰは、室温下真空中で一晩乾燥 させた。

レシチンは、アミド結合を介してシリカベース粒子に連結させる。ヌクレオシル （Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）　−３００（７Ｎ　Ｈ２）のレシチンによる誘導体化に 用いた４段階合成を下記に要約した。

（１）１．１２−ドデカンジカルボン酸＋ＤＣＣ→ドデカンジカルボン酸無水物 （環式無水物）（２）モノミリストリルリゾレシチン＋環式無水物−レシチン− Ｃ００Ｈ （３）レシチン−ＣＯＯＨ十カルボニルジイミダゾール→レシチン−イミダゾリ ド （４）ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）　−３００（７ＮＨｚ　）　＋レシ チンーイミダゾリド→ ヌクレオシル−レシチン 炎光乾燥した５００ｍＪ２の丸底フラスコを放冷し、１．１２−ドデカンジカル ボン酸固体８ｇ　（０，０３１モル）を添加した。乾燥ＴＨＦ　（〜１００ｒｒ ＋Ｊ２）を添加し、この二酸を懸濁した。５〜１０分間撹拌後、この混合物を水 道水で約４０°まで温め、二酸の溶解を進行させた。この時点で、通常、反応フ ラスコ中に数個の粒子が見られた。ＤＣＣを炎光乾燥ビーカー中に秤量した。Ｄ ＣＣ（６，４ｔｒ、０．０３１モル）を、ＴＨＦ２ＯｍＪ中に溶解した。この濃 厚なりＣＣ溶液をディスポタイプのピペットを用いて前器の反応容器に移した。

全操作を通じて、反応容器はチッ素でパージした。反応をチッ素圧で密封し、室 温で１５時間撹拌した。１５時間後、濃厚な白色ペーストが形成し、撹拌棒を停 止した。（最初に反応に充分量のＴＨＦを添加しペースト形成を防止するのが理 想的である。）１５時間後、試薬等級のアセトン５００ｍＪ２を添加後、焼結ガ ラス漏斗（中、３００ｍＪ？容量）でろ過した。このろ液を冷蔵庫に一晩保存し 、生成物を結晶化した。

環式無水物は、中型焼結ガラスろう斗でろ過し採取した。生成物を試薬等級アセ トンで洗浄し真空下、室温で一晩乾燥させた。結晶の一次生成量のみを基準とす ると、典型的収量は５０−７０％である。反応は、この反応混合物の一定量をロ ータリーエバポレーションで乾燥させ調製したＫＢｒベレットを用いてＦＴＩＲ でモニターした。第６図を参照。

環式無水物の形成が不充分である調製においては、少量（〜２００ｍｇ）のＤＣ Ｃを添加してこの反応を継続させた。

本反応がＦＴＩＲスペクトルに基づき完了したことが示された時、本反応を停止 させた。この二酸を前記無水物から分離するのは困難であるので、ゆえに、前記 の環式無水物を定量的に形成することが重要である。

異なる３反応から入手した３つの異なるマススペクトルは、親イオンＭ＋１−２ ４１が環式無水物の形成を示しダイマーの形成を示さないことを明らかとした。

生成物のＮＭＲは、予測されたピークを示した。

（２）１−ミリストイル−２−（１３−カルボキシル−トリデシロイル）−ｓｎ −３−グリセロ−ホスホコリン（レシチン−ＣＯＯＨ）。

数回の試験反応を行い、生成物形成を最適化した。試験研究は、この無水物が触 媒（ＤＭＡＰ）なしではりゾレシチンに対し実質的に反応しないことを示した。

４等量の無水物が最大収量を持たらすようであった。リゾレシチンおよびこの無 水物を、使用に先立ち、５０℃のポンプで一晩乾燥させた。

モノミリストリル・リゾレシチン３ｇ　（６，４ナノモル）。

１．１２−ドデカンジカルボン酸無水物６．！ｚｒ　（２７ミリモル）およびＤ ＭＡＰｏ、７８ｇ　（’６．５ミリモル）を炎光乾燥した２５０ｍｆの丸底フラ スコに添加した。充分量の乾燥ＣＨＣＪ２ｓ（〜２００ｍぶ）を添加し、出発原 料を完全に溶解した。この溶液をチッ素でパージし、密封後、暗所で４８時間撹 拌した。本反応混合物の薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）は、レシチンのスポッ ト２個およびリゾレシチンのわずかなスポット１個を示した。この２個のレシチ ンスポットは、レシチン−ＣＯＯＨのプロトン化および脱プロトン化形態に対応 する。反応混合物での作業終了後では、レシチンのスポットはただ１個のみがＴ ＬＣで観察された。レシチンアナログ類のＴＬＣ分析を、シリカプレートを用い 、ＣＨＣＪ）　／Ｍｅ　ＯＨ／Ｈ２０６５：　２５　：　２中で行った。

４８時間後、本反応は、わずかに黄色色調である。反応溶ｆｌＩ（ＣＨＣＪｓ） は、ロータリーエバポレーションによって反応混合物から除去し、かつ、〜２０ ２０−３Ｏのメタノールを添加して全て固体を溶解した。このメタノール溶液は 、中型焼結ガラスろ過漏斗を介してろ過した。約８００ｍＪ２のアセトンを生成 物レチシンーＣ０ＯＨのメタノール溶液に添加した。このアセトン／メタノール 混合物を冷蔵して、レシチンおよびリゾレシチンを沈殿させる。結晶化中、生成 物はフラスコ底部に沈殿する。上清をデカントし、レシチンを約５０ｍＪｌのア セトンに再懸濁後、焼結ガラスろう斗を用いてろ過によってレシチン−ＣＯＯＨ を採取した。典型的収量は、トレース量のりゾレシチンが混入したレシチン−Ｃ ＯＯＨ〜６５−８０％であり、かつ１合成では、少量のＤＭＡＰが混入していた 。これらの不純物は、次のカップリング段階を妨害することがなく、シたがって 、除去しなかった。最終生成物純度は、上記溶媒系を用いたＴＬＣによって確認 した。レチシン純度は、ホスレイ（Ｐｈｏｓｒａｙ）　　（スベルコ（Ｓｕｐｅ ｌｃｏ）によるリン酸陽性スポットを基づけば、常に９５％を超えて（〉９５％ ）いた、ＴＬＣを用いて、ＭｅＯＨ：ＣＨＣＪｉ／１：９によるろ液、沈殿物、 ＤＭＡＰおよび無水物について比較した。レシチンおよびリゾレシチンは原点に 留まる。

無水物はＲＦ−０，７を示した。ＤＭＡＰはＲＦ−０，１５、およびドデカンジ カルボン酸はＲＦ−０，４を示した。その系では、ヨウ素を用いてＴＬＣプレー トを発色させた。Ｃ１Ｃ１３Ｎスペクトルは、ＣＰＭＡＳモード、周波数５０， １８８ＭＨｚで動作するケマグネタス（Ｃｈｅｓ＋ａｇｎｅｔｕｓ）　Ｍ　２０ 　ＯＳソリッドステートＮＭＲ分光光度計で得た。１３ガウスのデカップリング 場を用い、３００ｐｐｍのスペクトルウィンドウで２にデータポイントを得た。

試料は、３３００Ｈｚに分布していた。接触時間およびパルス遅れは、それぞれ 、２ミリ秒および３秒であった。化学シフトは、外部標準としてのへキサメチル ベンゼンに対応していた。第７図最上端のスペクトルが、レシチン−ＣＯＯＨの ものである。

（レシチン−イミダゾリド）。

レシチン−ＣＯＯＨのイミダゾリドは、カルボニルジイミダゾールを用いて調製 した。本反応における副生物は、次段階を妨害せず、その結果、レシチン−イミ ダゾリドは精製せずに最終段階においてヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）　 −３００（７Ｎ　Ｈ２）にレシチンをカップリングさせた。炎光乾燥および冷却 後、シンチレーシッンバイアルまたは５０ｍ１の丸底フラスーコを前記のカップ リングに用いた。典型的には、レシチン−ＣＯＯＨ（２５０，，３５ミリモル） およびカルボニルジイミダゾール（５６，７ｍｇ、０．３５ミリモル）を乾燥Ｃ ＨＣｆｌ　ｓ中で２時間反応させた。反応は容易であった。

ＴＬＣは、レシチン−ＣＯＯＨがほとんど定量的に生成物レシチン−イミダゾリ ドに変換することを示している。このレシチン−イミダゾリドは、調製２時間内 に担体材料へのカップリングに常に使用した。

（４）ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−レシチンレシチン−イミダゾリド は、２つの方法でヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００（７Ｎ　Ｈｚ 　）にカップリングした。

ｅｏｓｉｌ）　−３００（７ＮＨ２）のカラム潅流または、反応フラスコ中にお いてヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）　−３００（７ＮＨ，）をレシチン− イミダゾリドと共に撹拌することである。両反応ともに、−晩（総反応時間１８ 時間）行った。数反応では、このヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）　−３０ ０（７ＮＨ２）粒子をカップリングに先立ち脱気した。脱気では、乾燥ＣＨＣＪ ？ｉｌＯｍＪ！中に懸濁したヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−３００（７ ＮＨ２）のロータリエバポレージジンを要した。脱気段階は、少なくとも２回、 通常３回繰り返した。

脱気は、レシチン−イミダゾリドをヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−３０ ０（７ＮＨ２）にカップリングするのに使用した反応容器中で行った。典型的に は、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−３００（７ＮＨ２）１ｔｒを乾燥Ｃ ＨＣｆｆ１３中でレシチンイミダゾリド１００■とともに撹拌した。

カラム潅流法　レイニン・インスツルメンツ社（Ｒａｌｎｌｎｌｎｓｔ、ｃｏ、 　）から購入したペンデックス（Ｂｅｎｄｅｘ）シングルピストンポンプ（モデ ル（Ｍｏｄｅｔ）　Ａ−３０−８）をカラム潅流カップリング法に用いた。この シングルピストンポンプは、５０００ｐｓ　ｉまでの圧力で０．０５から１．５ ｍＪｉ！／分を潅流できる。これらの動作条件は、分析用ＨＰＬＣ条件と同様で ある。旧式のＨＰＬＣカラムの当初の充填材料を除き、ディスポタイプのピペッ トを用いてＣＨＣＪｓスラリーとしてヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏａｌｌ）　− ３００−７ＮＨ２（１ｇ）を添加した。旧式の分析用カラムを洗浄し使用の前に 乾燥し、かつ、当初のフリット（５ミクロンカットオフ）を用いてヌクレオシル （Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００（７Ｎ　Ｈ２）充填材料が誘導体化されるよ う保持した。乾燥ＣＨＣＪ２３をカラム中に循環させた後、レシチン−イミダゾ リド溶液を液体溜め中の溶媒と置換した。ＣＨＣＪ？３（〜５ｍり中しシチンー イミダゾリド（２５０■）を溶媒液体溜めに置換し、レシチン−イミダゾリドの ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００（７ＮＨ２）へのカップリング を開始した。潅流条件は、〜１．５ｍ２／分で一晩であった。

記載のカップリング法のそれぞれが、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓ目）−３０ ０７ＮＨ２への効率的カップリングを持たらした。各方法が、生体膜中における それ（表面密度）に近い共有結合レシチンの表面密度を持たらした。ヌクレオシ ル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００へのダブルカップリング（すなわち、先に カップリングされた生成物に２次カップリング反応を試みること）によって、結 合されたレシチンのμｓｏｌが適度に増加することになる。第１表を参照。約１ ０−１５％のレシチンがこの２次カップリング反応でカップリングされる。この ２次カップリングにおいて異なる脂質を用いれば、２次カップリング段階で２つ の異なる脂質を含有する膜状表面の形成が可能となる。たとえば、ホスファチジ ルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジン酸をこの２次 段階においてカップリングさせ、荷電された表面を作ることもできる。したがっ て、約９／１の比のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミ ンは、もし１次カップリング反応がレシチンを利用しかつ２次カップリング反応 がホスファチジルエタノールアミンを利用すれば、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏ ｓｌｌ）　−３００（７Ｎ　Ｈ２）に共有結合させることができる。もちろん、 ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンは、結合されたホ スファチジルコリンと同様に、前記固体担体にこの脂質類を結合させる脂肪酸の 少なくともひとつの末端あるいはその近傍に適切な官能基を含有するように誘導 体化される必要が゛ある。これとは別に、この２次リン脂質組成物をいったん反 応させたヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）　−３００（７Ｎ　Ｈ２）生成物 にのせ、部分的側方移動性を有する不均質膜構造を形成することができる。

シリカの総表面は、気体吸着等混線を基準としている。しかし、この表面の部分 のみが有機分子の結合に利用され得る。

結合に利用できる表面積の量は、結合される有機グループの大きさによる。通常 、立体阻害は、結合可能な有機分子類の量を制限する。例えば、低分子量の気体 類は、プロピルアミンのようなより大きな有機分子類が接近できない微小間隙に 接近することができる。ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓ目）−３００（７ＮＨ， ）は、１００ｒｒｒ／ｒ（製造業者の技術仕様書）を有している◎ヌクレオシル （Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００（７ＮＯ３）の元素分析は、結合されるＭ当 たり１．６４μ霧ｏ１−プロピルアミンを示した。表面積／レシチン分子の算出 のためには、この１．６４μｍｏｌ／ｒｒｒプロピルアミン密度をちゅう密充填 において利用可能な表面密度であると仮定する。長軸を調べて見ると、直鎖アル カン類は２０−２５立方オングストロームの突出表面部を有している。生体膜に おけるレシチンは、６ロー７７立方オングストロームを占めている。したがって 、結合できるレシチンの限定量は、利用可能なプロピルアミングループの約３分 の１である。第８図は、これらの仮定に基づく推定表面積／分子計算を示してい る。第１表の結果を第８図のグラフ表示と比較すれば、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌ ｅｏｓ目）−レシチン生成物が、生体膜で見られるものに匹敵する共有結合レン チン分子類の表面密度を有することが明らかである。レシチンは、担体表面積１ ００立方オングストローム当たり好適には約１から約２、より好適には約１゜３ から約１．６分子を付与するのに充分な程度に共有結合されている。ヌクレオシ ル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）　−３００（７Ｎ　Ｈ２）表面上における未反応アミ ン基は、所望であれば、有機官能基でキャップすることもできる。生成物ヌクレ オシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）−レシチンの反射！Ｒで、連結しているアミド結 合の存在が確認された。第９図を参照−１６５３，９ｃ！ｌ−’にアミドＩ、１ ，５５０．９０Ｉ＋−’にアミド■。ヌクレオシル−レシチンのＣ１３のＮＭＲ でさらに、結合されたレシチンの安定相の存在が確認された。第７図参照。ヌク レオシル（Ｎｕｃ　Ｉ　ｅｏｓ　１１）−レシチン（Ｌｅｃｌｔｈｌｎ）は、“ ホスプレイ（Ｐｈｏｓｐｒａｙ）　”（スベルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）　ｌベルフ ォンテ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）　、　ＰＡでリン酸陽性と試験された。

カラム充填 ４ｍｍＸ１００＋ｕ＋のＨＰＬＣカラムをシャントン（Ｓｈａ　ｎ　ｄ　ｏ　ｎ ）カラムバッカーを用いて約１ｇのヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）−レシ チン（上記の数回の調製でプールした）で充填した。

過剰のヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）−レシチン（１，４５グラム）は脱 気メタノール１５ｍＪ２に懸濁後、５分間超音波処理して、粒子の分散を確認し た。この分散を、カラムパッカー上の３０ｍＪスラリー溜めに移し、次いで、脱 気メタノール１５ｍＪを添加してこの溜めを満たした。カラムは、４５００ｐｓ ｉでバックした。このヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｌｌ）−レシチンカラムの ）ＩＰＬＣ溶出特性を評価した。

Ａ、ｄ−フェニルアラニンおよびβ−トリプトファンの分離第１０図は、移動相 として等張リン酸緩衝生理食塩水（１ｍ、ｉ？／分）を用い、２６０ｎｍで検出 したｄ−フェニルアラニンとＪ−）リブトファンの分離を示している。前記アミ ノ酸類は、この純粋なアミノ酸類のＨＰＬＣクロマトグラムから同定した。フェ ニルアラニンとトリプトファンの鏡像異性体混合物類はこの系では分割できなか った。

Ｂ、デオキシヌクレオシド類の分離 ２−デオキシシチジン（Ｃ）、２−デオキシウリジン（Ｕ）、２′−デオキシグ アノシン（Ｇ）および２′−デオキシアデノシン（Ａ）の分離は、１．０ｍβ／ 分で移動相として等張緩衝生理食塩水を用い、２６０ｎｍで検出し行った。溶出 時間は、以下の通りであった：Ｃ−１．１７５；ｕ−１．４６５．０−１．７３ ０．およびＡ−２，０９０゜Ｃ１溶出研究を２，３．下記のペプチド類について 行った。

Ｉ　　　　ＮＨｚ　Ｙ−Ｇ−８−Ｔ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｃ−ＣＯＯＨＩＩ　　　　Ｎ ）＋２　Ｙ−Ｇ−９−Ｔ−トＰ−Ｇ−ＣＯＯ）ｌＩＩＩ　　　　ＮＯ３Ｍ−Ｐ− Ｓ−トＴ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−ＣＯＯＨＩＶ　　　　Ｎ）１２　Ｍ−Ｐ−８−トＴ−Ｇ −Ｇ−Ｃｏｏ）ｌＶ　　　　ＮＯ３Ｃ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−８−Ｔ−１１−Ｐ−ＣＯＯ ＨＶＩ　　　　ＮＯ３Ｂ−１−Ｆ−Ｎ−Ｑ　Ｎ　Ｈ２■　　　　　ＮａＣＨ−ｌ −Ｆ−Ｎ−ＱＮＨ２■　　　ＮＯ３ｄ９Ｍ−ｄ、Ｐ−ｄ、Ｓ−ｄ、Ｉｆ−ｄ、Ｔ −Ｇ−Ｇ−ｄ、Ｃ−Ｃｏｏ）ｌペプチド■は、ペプチド■のｄ異性体である。ペ プチドＩとペプチド■は、そのＣ末端におけるシスティン１個で異なっている。

ペプチド■およびペプチド■は、そのＣ末端のシスティン１個で異なっている。

ペプチドＩおよびペプチドＶは、異なる配列の同一アミノ酸類を有しており、か つ、ペプチド■は、そのＮ末端にＮ−アセチル基を１個有するペプチド■である 。

第１１図は、０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）水溶液に溶解したペプチ ドＩおよび■の混合物を２２０ｎｍで検出したクロマトグラムである。第１１図 においては、移動相（ま、等張リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，３４）である。

第１２図は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に溶解したペプチド■ および■の混合物を２２０ｎｍで検出したクロマトグラムである。第１２図にお いて、移動相は０．１％ＴＦＡであった。

ペプチドＩ−ＩＶ、Ｖｌおよび■の溶出容量を下記の第２表に示した。

第２表 ヌクレオシル−レシチンの溶出容量 １　　　　　　　　７．３　　　　　　１３．１Ｉ＋　　　　　　　　　　　　 　３．１　　　　　　　　　　　７．８ＩＩＩ　　　　　　　　　　　　９．４ 　　　　　　　　　　１０．０■　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　３，８コレステロールの装填（ローディング）このヌクレオシル（Ｎｕ ｃ　Ｉ　ｅｏｓ　１１）−レシチンクロマトグラフィ担体材料に次いで下記の操 作を用いてインサイチュ−でコレステロールを“のせた”。

Ｍ　ｅ　ＯＨ：イソプロパノール／８：２中コレステロール１＋ｃｇ　／　ｍ　 ｆ２の８０ｒｒ＋Ｊ２溶液をペンペックス（Ｂｅｎｄｅｘ）ポンプを用いてこの ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−レシチン中にポンプで入れた。カラム溶 出液の容量を減らし、カラムに結合しなかったコレステロールを定量した。約４ ０．が溶出液中に回収され、コレステロール４０膳ｇがヌクレオシル（Ｎｕｅｌ ｅｏｓｉｌ）−レシチンカラムにのせられたことを示していた。これは、結合相 の約５０重量％である。Ｍ　ｅ　ＯＨ／イソプロパツール含有ヌクレオシルＣＮ ｕｃｌｅｏｓ目）−レシチン／コレステロールカラムをＨＰＬＣに連結しそして 水（約１００ｒｒ＋Ｊ２）で溶出した。移動相を０，１％ＴＦＡに変え、０．１ ％ＴＦＡに溶解したペプチド類を注入しこの溶出容量を決定した。

移動相を水に変え、カラムを水１００ｍＪで平衡とした後に前記のペプチド類を 再注入しこの溶出容量を決定した。カラムをＰＢＳ緩衝液（１００ｍＪ２）で洗 浄し、移動相としてＰＢＳを用いて前記のペプチド類を再度注入し溶出容量を決 定した。結果を第３表に列挙した。

第　　３　　表 カラム：ヌクレオシル−レシチン／コレステロールｎ　　　　　　　８．ｆｉ　 　　　　　２．７　　　　４．８ｍ　　　　　　　９．２　　　　　５．３　　 　　８．９Ｎ　　　　　　　４．９　　　　　２．９　　　　５．０■６．６ Ｖｌ　　　　　　　Ｏ，８１，０４，２■　　　　　　０．８　　　　　１．３ 　　　　３．２■　　　　　　３．０　　　　　５．８　　　　６．５水溶性溶 媒を移動相としておよそ５０回注入した後、カラムをＭ　ｅ　ＯＨで溶出しカラ ムからコレステロールを除去した。

このカラム洗浄で約３■のコレステロールしか生成しなかった。この試験中、約 ４リツトルの水溶性移動相がカラムを通過した。コレステロールがカラムからゆ っくりと溶出されたのは明らかであった。

固定化人工膜ＣＩ　ＡＭ）固体坦体が完全な膜タンパク質精製のためのマトリッ クスとして機能する能力を、チトクロームＰ−４５０の数種のアイソザイムで試 験した。クロマトグラフィによる予備分離を２回行って、ＨＰＬＣマトリックス としてのこの担体の能力を評価した。

第１回分離では、フェノバルビタール１００　ｔａｇ／　ｋｇ／日で３日間前処 理した動物から調製した溶解されたラット肝ミクロゾーム（タンパク質４．５ｓ ｇ；Ｐ−４５０８ナノモル」３ｍＪ２を１５１×４．６論ｍのＩＡＭカラム上に 注入した。溶出には、非イオン性界面活性剤勾配（ルブロール（Ｌｕｂｒｏｌ） ＰＸ；リン酸カリウム緩衝液中０．０−０．２％および０゜２−２％）を要し５ た。ヘムタンパク質は、４０５ｎｍで検出される。４０５ｎｍで吸収する物質の 極小ピークおよび次にルブロール（Ｌｕｂｒｏｌ）高濃度で溶出するはるかに大 きなビ〜りが回収された。第１のピークは、有意量のチト・クロームＰ−４５０ を含有していなかった。第２のピークは、カラムにかけられたＰ−４５０のほと んどを含有しており、これは、−酸化炭素結合により分光的に決定された。分光 分析に基づき、回収されたＰ−４５０はインタクトなホロエンザイムのようであ り、Ｐ−４２０は全く存在していなかった。

カラム分画は、Ｐ−４５０ｂおよびＰ　−４，５０ｅの両者を認°識するＩｇＧ を用いて、７，５％Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅおよびウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔ ｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔ！ｎｇ）によって分析した。

意量含有していた。チトクロームＰ−４５０ｂおよびＰ−４５０ｅは９７％相同 性を有する２つのアイソザイムであるが、それでもなおかつ、この予備分離で部 分的に分離された。さらに、このウェスタンプロットは、他のミクロゾームタン パク質のほとんどに関し、Ｐ−４５０ｂおよびＰ−４５０ｅの両者が有意に精製 されることを示唆している。チトクロームｐ−４５ｏｂおよびＰ−４５０ｅは、 ラット（ｒａｔｅ）肝においてフェノバルビクール誘発可能な主要形態である。

もうひとつの分離は、フェノバルビタールの代わりに４−ｎ−ブチル−メチレン ジオキシベンゼン（ＭＤＢ）で前処理したラットから入手した溶解されたミクロ ゾームを用いて実施した。ＭＤＢはチトクロームＰ−４５０の少なくとも４つの アイソザイム、Ｐ−４５０ｂ、Ｐ−４５０ｅ、Ｐ−４５０ＣおよびＰ−４５０ｄ を誘発する。この分離においては、ウェスタン（νｅｓｔｅｒｎ）プロットおよ びＰＡＧＥで示されたように、Ｐ　−４，５０ｂ　／　ｅはＰ−４５０ｅ／ｄか らほとんど完全に分離され、かつ、Ｐ−４５０ｄとＰ−４５０ｅは互いにほとん ど完全に分離された。ミクロゾームチトクロームＰ　−４５０の副腎形態を精製 する試みでは、Ｐ−４５０溶出のためにはるかに高い界面活性剤濃度を要した。

完全膜タンパク質はその精製が非常に困難であるが、しかし、ＩＡＭ固体担体は これらの予備的研究で極めて有効であることが証明された。異なるアルキル鎖、 すなわち、異なる疎水性を有するＩＡＭ類は、Ｐ−４５０のアイソザイム類を分 割できる。ＩＡＭ担体上における完全膜タンパク質の精製成功は、技術的にひと つの突破口である。

さらに、第１３−１５図は、本発明の粒子組成物の表面の化学構造を示したもの である。第１４図は、第１３図の組成物を上記構造式■の環式無水物（ｎ＝１２ ）の過剰量と乾燥クロロホルム中で２５℃で約１０から約２４時間反応させ形成 された膜様表面の構造を示したものである。

例えば、ｎｍ６から１０の他の環式無水物類の使用で、それぞれ特有の生体分子 親和性機能性を有する類似の混合両親媒性膜様表面を得ることができる。第１５ 図は、本発明の膜様表面を示している。第１３−１５図に示した模様表面は、５ ．７および１２ミクロンのシリカアミン粒子類上に作製された。

イソクラティック（ｌ５ｏｃｒａＮｃ）条件下で模様表面を有する５ミクロン担 体材料を用いてＨＰＬＣによって、２′−デオキシヌクレオチド類ＣＭＰ、ＴＭ Ｐ、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＤＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＡＴＰおよび ＧＴＰの分離を示すクロマトグラムは、第１６図に図示した通りである。

ＩＩ６３（ＩＩ） ＩＩ６；　　３　（ｔθ） Ｆｆ６；４！−Ｆ’Ｍ、　５ ＦＩＧ、　６　　淑へ ２４０．００　２００．００　　＋５０．００　　！２０．００　８０．００　 ４０．００　−αｏｏ　　−４０，００ＦｉｌθＺ 斌長 ＦＩ６；、Ｉ５’ Ｆ１″６ｊＣ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年８月２７日

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. １．クロマトグラフィ系での用途のための次元の力学的に安定な粒子担体構造、 前記担体材料の表面上における人工膜構造であって、前記膜構造が親水性ヘッド グループ部分および疎水性部分を有する両親媒性化合物から成り、前記両親媒性 化合物が生体および人工膜構成分から選択される人工膜構造、および前記担体材 料表面上に前記膜構造を固定化する手段、から成る組成物。
2. ２．前記膜構造がさらに、疎水性内部部分および親水性外部ヘッドグループ部分 から成る請求の範囲第１項記載の組成物。
3. ３．前記粒子担体構造がシリカ，アルミナ，チタニアまたはレジンをベースとし た約５から約１００ミクロンの粒子径を有するクロマトグラフィ担体材料である 請求の範囲第１項記載の組成物。
4. ４．前記粒子担体構造が実質的に疎水性の表面を１個有しかつ前記膜構造を固定 化する手段が前記表面と前記膜構造の両親媒性化合物の疎水性部分の疎水性相互 作用から成る請求の範囲第３項記載の組成物。
5. ５．前記粒子担体構造の実質的に疎水性の表面が、下記化合物の親水性ヘッドグ ループ部分上の官能基を介して前記粒子担体構造に共有結合された２次両親媒性 化合物の疎水性部分である請求の範囲第３項記載の組成物。
6. ６．前記両親媒性化合物の疎水性部分が、前記粒子担体構造の実質的に疎水性表 面上の２次官能基と共有結合を形成することができる官能基を１個有する請求の 範囲第３項記載の組成物。
7. ７．前記両親媒性化合物が、レシチン類，リゾレシチン類，セファリン類，スフ ィンゴミエリン，カルジオリピン，糖脂質類，ガンダリオシド類およびセレブロ シド類から成る群がら選択される請求の範囲第４項記載の組成物。
8. ８．前記両親媒性化合物が、ホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノール アミン，Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン，Ｎ，Ｎ−ジメチルホスフ ァチジルエタノールアミン，ホスファチジン酸，ホスファチジルセリン，ホスフ ァチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールおよびその対応するリ ゾリシチン誘導体類から成る群から選択される請求の範囲第４項記載の組成物。
9. ９．前記両親媒性化合物がリン脂質であり、かつ、前記リン脂質分子類の疎水性 部分が、前記リン脂質分子類を架橋させ前記の人工膜構造を形成しそれによって 前記の架橋反応が前記粒子担体材料の表面上に前記膝構造を固定化することを補 助するように作用する反応に適合させられた官能基を少なくとも１個有する請求 の範囲第８項記載の組成物。
10. １０．前記両親媒性化合物がホスファチジルコリンであり、前記化合物の疎水性 部分が、光化学線照射によって同様の基と架橋可能な共役ジエン基を有するジア セチレンＣ９−Ｃ２６脂肪酸から成る請求の範囲第９項記載の組成物。
11. １１．前記粒子担体構造が１次官能基から成る表面を有し、前記両親媒性化合物 の疎水性部分が前記の１次官能基と反応しかつ共有結合を形成可能な２次官能基 を有し、前記膜構造を固定化する前記手段が前記１次および２次官能基間の共有 結合から成る請求の範囲第１項記載の組成物。
12. １２．前記１次および２次官能基が、前記共有結合が求核性置換反応の結果とし て形成されるように選択される請求の範囲第１項記載の組成物。
13. １３．前記両親媒性化合物がリン脂質または脂肪酸である請求の範囲第１１項記 載の組成物。
14. １４．前記両親媒性化合物が、レシチン類，リゾレシチン類，セファリン類，フ フィンゴミエリン，カルジオリピン，糖脂質類，ガンダリオシド類およびセレプ ロシド類から成る群がら選択される請求の範囲第１１項記載の組成物。
15. １５．前記両親媒性化合物が、ホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノー ルアミン，Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン，Ｎ，Ｎ−ジメチルホス ファチジルエタノールアミン，ホスファチジン酸，ホスファチジルセリン，ホス ファチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールから成る群から選択 される請求の範囲第１４項記載の組成物。
16. １６．前記両親媒性化合物が、ホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノー ルアミン，Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン，Ｎ，Ｎ−ジメチルホス ファチジルエタノールアミン，ホスファチジン酸，ホスファチジルセリン，ホス ファチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールから成る群から選択 される請求の範囲第１１項記載の組成物。
17. １７．前記両親媒性化合物が、前記担体構造の表面積１００立方オングストロー ム当たり約１から約２分子の両親媒性化合物の濃度で前記担体構造の表面を覆う のに充分な量でこの表面に共有結合されている請求の範囲第１６項記載の組成物 。
18. １８．前記粒子担体構造がシリカ，アルミナ，チタニアまたはレジンをベースと した約５から約１００ミクロンの粒子径を有するクロマトグラフィ担体材料であ る請求の範囲第１７項記載の組成物。
19. １９．前記固定化膜構造がさらに、脂質類，ペプチド類，サッカリド類，オリゴ ヌクレオチド類，ポリヌクレオチド類およびペプチド類，サッカリド類，オリゴ ヌクレオチド類およびポリヌクレオチド類の膜結合アナログ類から成る群から選 択された吸着された成分から成る請求の範囲第１１項記載の組成物。
20. ２０．前記吸着された成分が、リン脂質類，コレステロール，コレステロールエ ステル類および膜結合性アミノ酸配列を有するペプチド類から成る群から選択さ れる請求の範囲第１９項記載の組成物。
21. ２１．前記両親媒性化合物が、前記担体構造の表面積１００立方オングストロー ム当たり約１．０から約２．０分子のリン脂質の濃度で前記担体構造の表面を覆 うのに充分な量で共有結合されているリン脂質である請求の範囲第１１項記載の 組成物。
22. ２２．前記両親媒性化合物が、前記担体構造の表面積１００立方オングストロー ム当たり約１．３から約１．６分子の濃度で前記担体構造の表面を覆うのに充分 な量で共有結合されているホスファチジルコリンである請求の範囲第１１項記載 の組成物。
23. ２３．コレステロールが、前記共有結合されたホスファチジルコリンで形成され た固定化膜構造中に吸着されている請求の範囲第２２項記載の組成物。
24. ２４．化学的化合物の膜会合特性を評価しおよび化学的化合物の膜会合特性を利 用して前記化合物を異なる膜会合特性を有する化合物から分離する方法で、前記 方法が前記化合物を人工膜保有クロマトグラフィ担体材料の表面に接触させる段 階から成り、前記担体材料が、クロマトグラフィ系での用途のための次元の力学 的に安定な粒子担体構造、前記担体材料の表面上における人工膜構造であって前 記膜構造が親水性ヘッドグルーブ部分および疎水性部分を有する両親媒性化合物 から成り、前記両親媒性化合物が生体膜構成分から成る群がら選択される人工膝 構造、および、前記膜構造を前記担体材料の表面に固定化する手段から成る前記 方法。
25. ２５．前記膜構造がさらに疏水性内部部分および親水性外部ヘッドグループ部分 から成る請求の範囲第２４項記載の方法。
26. ２６．前記担体構造が実質的に疏水性表面を有し前記膜構造を固定化する手段が 、前記表面および前記膜構造を形成する両親媒性化合物の疎水性部分との疎水性 相互作用から成る請求の範囲第２４項記載の方法。
27. ２７．前記両親媒性化合物が、ホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノー ルアミン，Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン，Ｎ，Ｎ−ジメチルホス ファチジルエタノールアミン，ホスファチジン酸，ホスファチジルセリン，ホス ファチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールから成る群から選択 される請求の範囲第２６項記載の方法。
28. ２８．前記両親媒性化合物の疎水性部分が、前記人工膜構造を形成する両親媒性 化合物の分子類を架橋させそれによって前記架橋反応が前記担体材料表面上への 前記膜構造の固定化を補助するように作用する反応に適合させられた官能基を少 なくとも１個有する請求の範囲第２７項記載の方法。
29. ２９．前記担体構造が１次官能基から成る表面を有し、かつ、前記両親媒性化合 物の疏水性部分が前記１次官能基と反応しかつ共有結合を形成できる２次官能基 を有し、前記膜構造を固定化する前記手段が前記１次および２次官能基間の共有 結合から成る請求の範囲第２６項記載の方法。
30. ３０．前記１次および２次官能基が求核性置換または縮合反応によって反応し前 記の共有結合を生成するように選択される請求の範囲第２９項記載の方法。
31. ３１．前記両親媒性化合物が、レシチン類，リゾレシチン類，セファリン類，ス フィンゴミエリン，カルジオリビン，糖脂質，ガンダリオシド類およびセレブロ シド類およびＣ９−Ｃ１６カルボン酸から成る群から選択される請求の範囲第３ ０項記載の方法。
32. ３２．前記両親媒性化合物が、ホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノー ルアミン，Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン，Ｎ，Ｎ−ジメチルホス ファチジルエタノールアミン，ホスファチジン酸，ホスファチジルセリン，ホス ファチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールから成る群から選択 される請求の範囲第２９項記載の方法。
33. ３３．前記固定化膜構造が、さらに、脂質類，ペプチド類，サッカリド類，オリ ゴヌクレオチド類，ポリヌクレオチド類およびペプチド類，サッカリド類，オリ ゴヌクレオチド類およびポリヌクレオチド類の膜結合アナログ類から成る群から 選択される成分から成る請求の範囲第２９項記載の方法。
34. ３４．前記成分が、生物活性タンパク質のトランスメンブレン領域のポリペプチ ドセグメントから成る請求の範囲第３３項記載の方法。
35. ３５．前記化学的化合物の膜会合特性を公知の生物活性化合物の特性と比較し、 それによって、前記方法を用いて可能な生物活性物質を同定する追加段階から成 る請求の範囲第３３項記載の方法。
36. ３６．前記化学的化合物が細胞またはウィルスホモジネートに由来しており、お よび、前記ホモジネートの膜結合部分が多価ワクチン製剤における用途のために 分離される請求の範囲第２４項記載の方法。
37. ３７．前記化合物がタンパク質である請求の範囲第２４項記載の方法。
38. ３８．前記タンパク質が、前記タンパク質を発現できるＤＮＡ発現ベクターで変 換された宿主細胞中に発現されたものである請求の範囲第２４項記載の方法。
39. ３９．前記タンパク質が、生物活性タンパク質にカップリングした膜結合アミノ 酸配列から成るハイブリッドポリペプチドである請求の範囲第３８項記載の方法 。
40. ４０．前記ハイブリッドポリペプチドが、さらに、前記膜結合配列および前記タ ンパク質間のプロテアーゼで切断可能であるかまたは化学的に切断可能である連 結部から成る請求の範囲第３８項記載の方法。
41. ４１．式一ＣＨ２ＯＰＯ２ＯＲ１〔式中、Ｒ１は、２−アミノエチル，２−（Ｎ −メチルアミノ）エチル，２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル，２−（トリ メチルアンモニウム）エチル，２−カルボキシ−２−アミノエチル，イノシチル ，グリセリルおよびガラクトピラノシルから成る群から選択される〕のリン酸ジ エステル基から成る共有結合を有するクロマトグラフィ担体材料。
42. ４２．式 −ＯＣＨ２ＣＨＯＲ４ＣＨ２ＯＰＯ２Ｒ１または ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ４は、水素またはカルボキシル酸由来のアシル基である〕の共有結合 基を有する請求の範囲第４１項記載の担体材料。
43. ４３．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは２から１４までの整数であり、かつ、ｍはｎ以下（＜ｎ）の整数で ある〕の共有結合基を有する請求の範囲第４２項記載の担体材料。
44. ４４．前記共有結合基が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは８から１４までの整数である〕である請求の範囲第４３項記載の担 体材料。
45. ４５．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは８から１４までの整数である〕の環式ジカルボン酸無水物。
46. ４６．ｎが１２である請求の範囲第４５項記載の化合物。
47. ４７．ｎが１０である請求の範囲第４５項記載の化合物。
48. ４８．ｎが８である請求の範囲第４５項記載の化合物。
49. ４９．表面上に共有結合官能基を有するクロマトグラフィ担体材料の調整におい て、式 −ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯ−〔式中、ｎは８から１４までの整数である〕の２価の 基を介して、前記担体材料の表面上に前記の官能基を共有結合させることから成 る改良。
50. ５０．ｎが１２である請求の範囲第４９項記載の改良。
51. ５１．式　Ｒ６ＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＱ〔式中、ｎは２から１４までの整数，Ｒ ６は、−ＯＨまたは１−イミダゾリル；およびＱは、 式▲数式、化学式、表等があります▼ または▲数式、化学式、表等があります▼｛式中、Ｒは、水素，２−アミノエチ ル，２−（Ｎ−メチル）アミノエチル，２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル ，２−（トリメチルアンモニウム）エチル，イノシチル，グリセリル，２−カル ボキシ−２−アミノエチルおよびガラクトピラノシル；Ｗは−Ｏ−または−ＮＨ −；Ｒ４は水素またはＣ２−Ｃ２０カルボン酸由来のアシル基；Ｒ７は水素およ びＲ８は水素またはＲ７およびＲ８は、それらが結合している炭素原子で合わさ れてシクロベンタン環を形成する｝〕の化合物。
52. ５２．Ｗが−Ｏ−である請求の範囲第５１項記載の化合物。
53. ５３．Ｑが式　▲数式、化学式、表等があります▼〔式中、ｎは８から１４まで の整数およびＲ４はＣ１０−Ｃ１６脂肪酸由来のアシル基である〕の基である請 求の範囲第５１項記載の化合物。
54. ５４．Ｒが２−（トリメチルアンモニウム）エチルである請求の範囲第５１項記 載の化合物。
55. ５５．膜結合ペプチドに共有結合した生物活性ポリペプチドから成る化合物。
56. ５６．前記膜結合ペプチドが、天然のポリペプチドのトランスメンブレン配列の 少なくとも一部分から成る請求の範囲第５５項記載の化合物。
57. ５７．前記膜結合ペプチドが、特異的切断部位を介して、間接的に前記の生物活 性ポリペプチドまたはタンパク質に後者のアミノ末端部で共有結合している請求 の範囲第５６項記載の化合物。