JPH0672161B2 - アフイニテイクロマトグラフイ用材料の製法 - Google Patents

アフイニテイクロマトグラフイ用材料の製法

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JPH0672161B2
JPH0672161B2 JP61117684A JP11768486A JPH0672161B2 JP H0672161 B2 JPH0672161 B2 JP H0672161B2 JP 61117684 A JP61117684 A JP 61117684A JP 11768486 A JP11768486 A JP 11768486A JP H0672161 B2 JPH0672161 B2 JP H0672161B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、硫酸化多糖類がアミノ基を有する担体物質に
結合されているアフイニテイクロマトグラフイ用の材料
の製法に関する。
この材料は、硫酸化多糖類と相互に作用する物質の単離
および精製に使用することができる。
（発明の背景） 酵素の単離法については、アフイニテイクロマトグラフ
イ技術によつて、近年著しい改良されている。この方法
は、物質間の特異性相互作用を利用するものである。こ
の目的のために、物質は不溶性の担体（マトリツクス）
上のリガンドとして共有結合する。リガンドは単離され
るべき物質と錯体の性格をそなえた相互作用を行ない得
るものでなければならない。リガンドは、それと特異的
に反応する物質のみを保持し、その他の物質を洗浄除去
する。この保持された目的物質は、未結合のリガンド溶
液の使用または例えば塩濃度勾配溶液（salt gradien
t）の使用により担体物質より溶出することができる。
アフイニテイクロマトグラフイが成功するかどうかは、
単離されるべき物質とリガンドとの間に自然に起こる相
互作用がいかんによくシミユレートされるかにかかつて
いる。このようにマトリツクスの選択とリガンドの固定
化方法は重要である。マトリツクスは親水性であり、良
好な物質的および化学的安定性を有するべきである。相
互作用を妨げる立体の効果は、スペーサによつて有利に
影響を受けることができる。マトリツクスまたはスペー
サのいずれも非特異的吸着作用を引き起すものであつて
はならない。
タンパク質単離のためには、単一のタンパク質またはい
くつかのタンパク質のみと相互作用を行なうリガンドを
使用することが最も好ましいことはもちろんである。吸
着剤の能力は、マトリツクスへのリガンドの負荷が充分
に高いかどうかにかかつている。化学結合は、可能な限
り均一かつ安定であるべきであり、すなわちできるだけ
加水分解されにくいことが必要である。
アフイニテイクロマトグラフイは、例えば血漿からのた
んぱく質特にアンチスロンビンIIIの単離に使用するこ
とができる。固定された硫酸化多糖類は、本発明の目的
達成のための親和性物質特に担体結合ヘパリンとして有
効であることが証明されている。しかし、ヘパリンおよ
び他の硫酸化多糖類の固定化において、生物活性の低下
を伴なうリガンドの修飾が起こり得ることは周知であ
る。
本発明は、硫酸化多糖類を担体に共有結合させることに
よつて高生物学的活性、高リガンド密度および高安定性
を有する材料を得ることよりなるアフイニテイクロマト
グラフイのための材料を調製することをその目的とす
る。
（従来の技術） 特にヘパリンを使用するアフイニテイクロマトグラフイ
は、硫酸化多糖類とともに、錯体を形成するタンパク質
の単離に利用される。
この目的のために、硫酸化多糖類は適当な担体に結合さ
れるが、この多糖類はムコ多糖類であることが多い。Se
pharose 4B（スウエーデン国 Pharmacia社製、溶球
形態のアガロースゲル）が担体マトリツクスとして特に
有効であることが証明されている。
硫酸化多糖類と担体との共有結合は、主に、臭化シアノ
ーゲンによる担体物質即ち硫酸化多糖類の活性化によつ
て達成される〔Thromb.Res.５,439〜452（1974）、西独
国公開公報第2,243,688号公報〕。しかしこの方法は固
有の問題点を有している。リガンドのアミノ基と慣用の
担体物質のヒドロキシ基との間に形成されるイソ尿素結
合は、求核性試薬に対してある程度不安定である。この
ことは、リガンドの脱離は、溶離条件、特にpH上昇下に
おいて期待されるべきものであることを意味する。〔En
zyme Microb.Technol.４,161〜163（1981）に記載〕。
この問題点は、臭化シアノーゲンをオキシラン基含有の
活性剤によつて置換することによつて解決することがで
きる。エピクロロヒドリン〔J.Chromatogr.51、479（19
70）に記載〕または、1,4−ブタンジオールビス（エポ
キシプロピル）エーテル〔J.Chromotogr.90,87（197
4）〕のようなビス−オキシランを使用することによつ
て、オキシラン基をヒドロキシ基を含有するマトリツク
スへ誘導することが可能となる。誘導されたオキシラン
基をアンモニアによりアミノ基に変換することができ
る。カルボジイミド〔Anal.Biochem.126 414〜421（198
2）〕を使用し、カルボキシル基を含有する硫酸化多糖
類をこれらのアミノ基に結合させることができる。
得られたアミド結合は、高化学的安定性で特徴づけられ
る。この方法による問題点は、多数のカルボキシル基
が、カルボジイミドによる活性化中にＮ−アシル尿素誘
導体に変換される点にある。このことは、本方法が化学
的修飾の結果として硫酸化多糖類による多大の担体の負
荷を達成するにもかかわらず、アフイニテイクロマトグ
ラフイにより単離される物質に対して比較的低い結合能
力しか得られないことを意味する。
しかし、アミノ基が誘導されている担体物質へ硫酸化多
糖類を結合させることは、還元的カツプリングによる化
学的に明白な方法で行なうことができる。〔Analyt.Bio
chem.126,414〜421（1982）〕。この方法は、糖類の鎖
の還元末端（アルデヒド基）をポリマーのアミノ基に結
合させシツフ塩基を形成することを含む。Ｃ＝Ｎ二重結
合を安定化させるために、例えばシアノホウ化水素化ナ
トリウムを用いて還元し第２アミンとする。この方法に
よつて、アミノ基が導入されているSepharose 4Bに例
えばヘパリンを適当に負荷させることはできるが、他の
ポリマーに対してはそのままで直接応用することはでき
ない。
広く使用されているSepharose 4Bの代わりに、担体物
質としてヒドロキシ基を含有する他のポリマー、例えば
FractogelＲ HW−65（Ｆ）〔ヒドロキシ基含有合成親水
性ポリマー;J.Chromatogr.239,747〜754（1982）〕を使
用することは原則として可能である。このポリマーは、
その化学的および物理的性質より、Sepharose 4Bより
も工業的使用には適していることが多い。
しかし、アミノ基を導入した後は、FractogelＲ HW−65
（Ｆ）を満足できる収率において硫酸化多糖類の還元末
端に結合するための方法は知られていない。
本発明は、従来技術に伴う問題点を解決し、かつ高収率
において、適当に誘導された硫酸化多糖類をアミノ基が
導入されている担体物質に結合することを可能とする。
発明の要約 前記した方法において、硫酸化多糖類は、ジオール分解
酸化剤（diol-cleaving oxidizing agent）により変成
され、追加的アルデヒド基がこうして多糖類上に生成さ
れる。この種の誘導体は、高収率でアミノ基が導入され
ている担体に結合させることができる。生成されたシツ
フ塩基は例えばシアノホウ化水素ナトリウムのような還
元剤によつてアミンに還元することができる。
このように、本発明は、担体に結合されている硫酸化多
糖類の調製方法に関する。その方法は、グリコールをア
ルデヒドに酸化する酸化剤を用いる炭素鎖の分解を伴う
硫酸化多糖類の処理およびこの変成された硫酸化多糖類
とアミノ基を有する担体との反応よりなる。
出発物質として、周知の硫酸化多糖類の１つ、好ましく
はヘパリンまたはそのナトリウム塩を使用することがで
きる。アルデヒド基は、ジオールと反応してアルデヒド
基を生成することが公知である酸化剤、好ましくは過ヨ
ウ素酸アルカリ金属による処理によつて水性溶液中で生
成する。反応溶液は、塩基、好ましくは水酸化アルカリ
金属特に水酸化リチウムによつてpH5〜９、好ましくは
６〜８に維持される。ヘパリン1g当り過ヨウ素酸アルカ
リ金属５〜100mg、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム30
〜40mgが特に好適であることが明らかにされている。反
応時間は、10分間〜５時間であり、反応温度は０℃〜30
℃に維持される。酸化反応は、１時間４℃において行な
うのが好ましい。
ポリアルデヒド誘導硫酸化多糖類を結合するために、酸
化混合物をアミノ基が導入されている単体に直接加える
ことが可能である。アミノ基が導入されている担体は、
「Analyt.Biochem.」126,414〜421（1982）に記載され
ている。
下記のものは、機能化のための担体物質として適当であ
る。
即ち、ヒドロキシ基を含有し、かつ適当な方法によつて
アミノ基を導入し得る不溶性のポリマー、例えば炭水化
物を基本とするポリマーである。これらの中には、デキ
ストランおよびアガロース樹脂と共にメタクリル酸誘導
体ペンタエリトリツト、ポリエチレングリコールおよび
ジビニルベンゼンのコポリマーであつてFractogel の
商標名で市販されているものも含まれる。
アミノ基がこのようにして導入された担体は、ポリアル
デヒド−誘導多糖類との反応に付され好ましくは多糖類
30〜40gに対して担体1000mlの割合で反応させられる。
反応は、pH6〜９好ましくは室温および水性緩衝溶液、
特にリン酸緩衝液においてpH6〜７で行なわれる。反応
体を混合した後、シアノホウ化水素ナトリウムを追加す
る。室温における反応は１〜30日間行なう。好適な反応
時間は12〜１日間である。生成物を水洗し、無水酢酸で
処理することによつてまだ遊離しているアミノ基がアセ
チル化される。
適当な酸化剤を使用して、例えば糖のような隣接する炭
素原子上にヒドロキシ基を有するジオール（グリコー
ル）は、炭素−炭素結合の開裂によつてアルデヒド基を
生成させる。驚くべきことであるが必要な「強」酸化剤
の作用は、硫酸化多糖類の生物学的活性を減少させるこ
とがなく、前記した方法によりポリアルデヒドに誘導さ
れたヘパリンは、ヘパリンとともに錯体を形成するタン
パク質とは高結合親和力および高活性を示す。この生物
学的活性は、担体に結合された誘導体にも保持される。
結合の収率は、担体上のアミノ基の数だけでなくリガン
ド中のアルデヒド基の数にも左右されるので、リガンド
中の多数のアルデヒド基によつて好適な結合反応が達成
される。アミノ基をほとんど有しない担体は、多数の反
応性アルデヒド基を必要とする。
吸着されるべきタンパク質に対する吸着剤の結合能力
は、リガンドの負荷に直接影響を受ける。
前記の方法により得られる親和性材料を用いて、タンパ
ク質の溶液よりこれらのタンパク質を硫酸化された多糖
類に結合したものとして吸着させ、適当である場合には
それらを脱着することが可能であるが、それは例えば血
漿からのantithrombin IIIの脱着であり得る。樹脂内の
アミノ基数がヘパリンおよびポリアルデヒド誘導化ヘパ
リンに対する結合反応へ与える影響は、好適に用いられ
るSepharose 4BおよびFractogelＲ HW−65（Ｆ）のよ
うなポリマーによつて示されている。
本方法によつてポリアルデヒド−誘導されたヘパリンが
アミノ−セフアロース4Bに結合された場合に、antithro
mbin IIIに対する結合能力は、ヘパリンおよびアミノ−
Sepharoseから周知の方法により調製された材料を用い
た場合の2.5倍あることが明らかとなつている。より少
ない数のアミノ基を有する担体例えばアミノ−Fractoge
l HW−65（Ｆ）を用いた場合の差異はなお著しいものが
ある。追加のアルデヒド基によつて、結合能力は未変成
の固定化されたリガンドの２〜５倍まで増大する。
リガンド結合の化学的性質によつて、誘導された（酸化
された）硫酸化された多糖類を使用して調製された吸着
剤により示されるリガンドの損失の傾向は極めて低い。
臭化シアノーゲンによる活性化により生成されたイソウ
レア結合を経て固定化されたリガンドと比較すると、比
較可能な条件下におけるリガンドの損失は、前記した方
法によつて0.1〜１％まで減少することができる。
実施例 １ アミノ基のSepharose 4Bへの誘導 水1,500mlおよび2Nの水酸化ナトリウム溶液650mlを完全
に洗浄したSepharose 4B1,000ml中へ加えた。この懸
濁液を40℃まで加熱し、エピロクロロヒドリン150mlを
加え、混合物を40℃において２時間振盪した。生成物を
水によつて中性になるまで洗浄し、アンモニア溶液（密
度0.91g/ml）750mlによつて40℃において90分間処理し
た。過剰の試薬を除去すべく、水洗し中和反応に付し
た。
ヘパリンのナトリウム塩の酸化 ヘパリン（約160IU/g）のナトリウム塩30gを水500ml中
に溶解し、水酸化リチウム溶液20g/によつてpH7に調
整した。溶液を４℃に冷却し、過酸化ナトリウム1.2gを
加えた。１時間酸化を続け、水酸化リチウム溶液20g/
を滴下することによりpHを７に維持した。この溶液を、
アミノ基が導入されている担体に結合するのに直接用い
た。
酸化ヘパリンのアミノ−Sepharose 4Bへの結合 アミノ基が誘導されているSepharose 4B1000mlをリン
酸水素二ナトリウム緩衝液0,2mol/1,000ml、pH9中に
懸濁した。酸化ヘパリン30gとシアノホウ化水素ナトリ
ウム11.5gをこの懸濁液へ加えた。この混合物を室温に
おいて16日間撹拌し、固形物を除去し、完全に水洗し
た。生成物を酢酸ナトリウム溶液0.2mol/1,000ml中に
懸濁し、４℃において無水酢酸500mlを加えた。30分後
に水洗による中和を行なつた。
実施例 ２ アミノ基のFractogel HW−65（Ｆ）への導入 水325mlおよび5Nの水酸化ナトリウム溶液275mlをFracto
gel HW−65（Ｆ）1,000mlへ加えた。エピクロロヒド
リン200mlをこの混合物中へ加え45℃において２時間振
盪した。生成物を別し、数回水洗した。アミノ基の導
入をアンモニア溶液（密度0.91g/ml）500mlによつて45
℃において90分行なつた。この樹脂を別し、水洗して
中和した。
酸化ヘパリンのアミノ基が導入されているFractogel
HW−65（Ｆ）への結合 アミノ−Fractogel HW−65（Ｆ）1,000mlをリン酸ナト
リウム0.5mol/緩衝液500ml、pH6.5中で懸濁し、実施
例１と同様に酸化ヘパリン30gを加えた。オルト−リン
酸（850g/溶液）によつてpH6.5に維持した。水30ml中
に溶解したシアノホウ化水素ナトリウム11.5gをこの懸
濁液へ加える。室温において16日間撹拌し、固形物を
別し水洗した。生成物を酢酸ナトリウム溶液0.2mol/1
00ml中で懸濁し、無水酢酸500mlを加えて、この混合物
を４℃において30分間撹拌した。固形物を吸引によつて
取り出し、水洗した。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】硫酸化多糖類を、炭素鎖の開裂によってグ
    リコールをアルデヒドに酸化する酸化剤によって処理
    し、この変成された硫酸化多糖類をアミノ基を有するポ
    リマーと反応させ、適当である場合には、この得られた
    物質を還元剤により処理することからなる担体に結合さ
    れた硫酸化多糖類の製法。
  2. 【請求項２】硫酸化多糖類がヘパリンである前記特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】酸化剤がアルカリ金属過ヨウ素酸塩である
    前記特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】アミノ基を有するポリマーが不溶性である
    前記特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】アミノ基を有するポリマーがアガロースで
    ある前記特許請求の範囲第１項記載の方法。
  6. 【請求項６】アミノ基を有するポリマーが、アミノ基が
    導入されているFractogel である前記特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】水性溶液中のヘパリンを、ヘパリン1gあた
    り５〜100mgのアルカリ金属過ヨウ素酸塩によって、pH6
    〜８、温度０〜30℃において10分間から５時間処理し、
    その結果得られた生成物をアミノ基を有するポリマーと
    反応させ、そして必要な場合にはその結果得られた生成
    物をアルカリ金属ボロ水素化物により還元する前記特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】硫酸化多糖類を、炭素鎖の開裂によってグ
    リコールをアルデヒドに酸化する酸化剤によって処理
    し、この変成された硫酸化多糖類をアミノ基を有するポ
    リマーと反応させ、適当である場合には、この得られた
    物質を還元剤で処理することによって調製される、担体
    に結合された硫酸化多糖類。
  9. 【請求項９】硫酸化多糖類を、炭素鎖の開裂によってグ
    リコールをアルデヒドに酸化する酸化剤によって処理
    し、この変成された硫酸化多糖類をアミノ基を有するポ
    リマーと反応させ、適当である場合には、この得られた
    物質を還元剤で処理することによって調製される、担体
    に結合された硫酸化多糖類に結合するタンパク質をこの
    多糖類に吸着させ、そして必要な場合にはそれより脱着
    させることからなるアフィニティクロマトグラフィのた
    めの、前記の担体に結合された硫酸化多糖類からなる材
    料。
  10. 【請求項１０】タンパク質がantithronbin IIIである前
    記特許請求の範囲第９項記載の材料。
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