CN114797804B - 一种具有长连接臂的nta色谱介质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有长间隔臂的NTA层析介质，其特征在于：该介质具有如式(1)所示的结构：并公开了其制备方法和应用。本发明的新型色谱介质，具有更长的间隔臂，对于某些因蛋白构象而难以结合的His标签蛋白具有更好的纯化效果。

Description

一种具有长连接臂的NTA色谱介质及其制备方法
技术领域
本发明专利涉及一种具有长连接臂的NTA色谱介质及其制备方法。
背景技术
His标签蛋白纯化是目前最为常用的纯化手段之一，固定化的Ni2+、Co2+、Cu2+或Zn2+与重组蛋白的6-10个连续的组氨酸标签结合，从而达到分离目的蛋白与其他蛋白的目的。固定化金属的介质目前主要有IDA、NTA、TED几种，介质的活化方式为环氧活化，介质与活性分子之间的连接臂为4个原子。有部分重组蛋白因为本身构象原因，His标签不能完全结合在介质上，导致目的蛋白纯化量低、杂蛋白较多。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有长连接臂的NTA亲和层析介质，可以降低蛋白本身构象的影响，达到更优的纯化效果。
本发明采用的技术方案为：一种具有长连接臂的NTA亲和层析介质，其特征在于：该介质具有如式(1)所示的结构：
其中G是固相支持介质；
n为6-10中任一整数。
优选的，所述固相支持介质为多孔固相支持物或磁性介质。
优选的，所述固相支持介质为琼脂糖、葡聚糖、硅胶或磁珠。
优选的，所述固相支持介质直径为20-200μm，由琼脂糖制成，n1为2，n2为0或1，R1为H，R2为COOH。更优选的直径为45-160μm。
优选的，所述固相支持介质在使用时螯合有金属离子，所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+或Co2+。更优选的方案为Ni2+。
本发明还公开了上述的具有长间隔臂的NTA亲和层析介质的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)活化固相支持介质，在固相支持介质表面连接环氧基团；
(2)环氧活化的介质与同时含有氨基和羧基的分子反应，制得羧基介质；
(3)步骤(2)的产物通过缩合剂与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和/或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)偶连；
(4)NHS和/或sulfo-NHS活化的羧基介质与N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸偶连形成长间隔臂的NTA介质；
(5)用氨基乙醇封闭NTA介质中未完全偶连的活性基团；
(6)NTA介质螯合金属离子，得到NTA亲和层析介质。
优选的，步骤(1)在碱性条件下进行，用环氧氯丙烷或环氧溴丙烷进行环氧活化。
优选的，步骤(2)中同时含氨基和羧基的分子，为氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基辛酸的任意一种或多种的混合物。
优选的，步骤(6)中用NTA介质与Ni2+、Co2+、Cu2+或Zn2+的可溶性盐反应，以螯合金属离子。
本发明还公开了上述的具有长间隔臂的NTA亲和层析介质在纯化含有His标签的重组蛋白中的应用。
优选的，所述重组蛋白带有6-10个His标签。
本发明的色谱介质，具有更长的连接臂，在His标签被蛋白本身构象影响的条件下，能够减少杂蛋白的吸附，提高回收的重组蛋白的纯度。
附图说明
图1为大肠杆菌裂解液中His标签重组蛋白A的纯化效果图。M：蛋白Marker。1：现有的Ni-NTA色谱介质。2：实施例1制备的纯化介质。
图2为大肠杆菌裂解液中His标签重组蛋白B的纯化效果图。M：蛋白Marker。1：现有的Ni-NTA色谱介质。2：实施例1制备的纯化介质。
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
具体实施方式
实施例1
取10ml Sepharose CL-6B，水洗除去乙醇。加入水8ml，环氧氯丙烷1ml，10M NaOH1ml，置于摇床中，40℃活化2h。将活化的凝胶用水洗至中性。加入10ml含0.1M Na2CO3，0.5M6-氨基己酸，pH 11的溶液，置于摇床中60℃反应过夜。100ml水洗除去反应液。加入0.1MMES缓冲液，pH 4.0，再加入0.11g NHS及0.19g EDCI，25℃反应1h。100ml水洗除去反应液。加入10ml N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸，pH 7.5，25℃反应过夜。100ml水洗，加入1M氨基乙醇pH 8.0，25℃封闭4h，100ml水洗。滤干后加入5ml 100mM NiSO4混匀后过滤，50ml水洗，50mlNaCl洗，100ml水洗，保存于10ml 20％乙醇中。
本实施例的反应原理如下：第一步活化
第二步引入长链间隔臂
第三步活化及偶连N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸
第四步氨基乙醇封闭剩余的活性基团。
实施例2
按照如下Buffer配制裂解缓冲液(Buffer1)和洗脱缓冲液(Buffer2、Buffer3)，
Buffer 1：
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
pH 7.5。
Buffer 2：
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
20mM咪唑
pH 7.5。
Buffer 3：
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
250mM咪唑
pH 7.5。
将大肠杆菌表达的带有6个His标签的重组蛋白A表达菌离心收集，菌体用Buffer1重悬，超声破碎，离心收集蛋白上清；将对照和实施例1中制备的填料各1ml装入重力柱，水洗并用Buffer1平衡，用15ml蛋白上清过柱收集流穿液，10ml Buffer1洗涤，10ml Buffer2洗涤，5ml Buffer3洗脱并收集，对各组分取样电泳。电泳结果如图1所示。其中对照为现有NTA纯化介质，处理步骤相同。
实施例3
缓冲液配制同实施例2。
将大肠杆菌表达的带有6个His标签的重组蛋白B表达菌离心收集，菌体用Buffer1重悬，超声破碎，离心收集蛋白上清；将对照和实施例1中制备的填料各1ml装入重力柱，水洗并用Buffer1平衡，用15ml蛋白上清过柱收集流穿液，10ml Buffer1洗涤，10ml Buffer2洗涤，5ml Buffer3洗脱并收集，对各组分取样电泳。电泳结果如图2所示。其中对照为现有NTA纯化介质，处理步骤相同。

Claims (10)

1.一种具有长间隔臂的NTA亲和层析介质，其特征在于：该介质具有如式(1)所示的结构：
其中G是固相支持介质；
n为6-10之间的整数。
2.根据权利要求1所述的具有长间隔臂的NTA亲和层析介质，其特征在于：所述固相支持介质为多孔固相支持物或磁性介质。
3.根据权利要求2所述的具有长间隔臂的NTA亲和层析介质，其特征在于：所述固相支持介质为琼脂糖、硅胶、葡聚糖或磁珠。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的具有长间隔臂的NTA亲和层析介质，其特征在于：所述固相支持介质螯合有金属离子，所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+或Co2+。
5.权利要求1-4中任一项所述的具有长间隔臂的NTA亲和层析介质的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)活化固相支持介质，在固相支持介质表面连接环氧基团；
(2)环氧活化的介质与同时含有氨基和羧基的分子反应，制得羧基介质；
(3)步骤(2)的产物通过缩合剂与NHS和/或sulfo-NHS偶连；
(4)NHS和/或sulfo-NHS活化的羧基介质与N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸偶连形成长间隔臂的NTA介质；
(5)用氨基乙醇封闭NTA介质中未完全偶连的活性基团；
(6)NTA介质螯合金属离子，得到NTA亲和层析介质。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)在碱性条件下进行，用环氧氯丙烷或环氧溴丙烷进行环氧活化。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中同时含氨基和羧基的分子，为氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基辛酸的任意一种或多种的混合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)中用NTA介质与Cu2+、Ni2+、Zn2+或Co2+的可溶性盐反应，以螯合金属离子。
9.权利要求1-4中任一项所述的具有长间隔臂的NTA亲和层析介质在纯化含有His标签的重组蛋白中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述重组蛋白带有6-10个His标签。
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