CN113351191B - 多齿配体的新型imac色谱介质及其制备方法 - Google Patents
多齿配体的新型imac色谱介质及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113351191B CN113351191B CN202110514537.XA CN202110514537A CN113351191B CN 113351191 B CN113351191 B CN 113351191B CN 202110514537 A CN202110514537 A CN 202110514537A CN 113351191 B CN113351191 B CN 113351191B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medium
- novel
- solid support
- support medium
- chromatographic medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 title claims abstract 9
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 title claims abstract 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 38
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 18
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4-dimethylphenyl)propan-1-one Chemical compound CCC(=O)C1=CC=C(C)C=C1C UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WTYYGFLRBWMFRY-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(oxiran-2-ylmethoxy)hexoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCCCOCC1CO1 WTYYGFLRBWMFRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BKMMTJMQCTUHRP-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropan-1-ol Chemical compound CC(N)CO BKMMTJMQCTUHRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HQMLIDZJXVVKCW-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropanamide Chemical compound CC(N)C(N)=O HQMLIDZJXVVKCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims description 2
- -1 alpha-propanolamine Chemical compound 0.000 claims description 2
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 claims description 2
- GKIPXFAANLTWBM-UHFFFAOYSA-N epibromohydrin Chemical compound BrCC1CO1 GKIPXFAANLTWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 3
- AOBIOSPNXBMOAT-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(oxiran-2-ylmethoxy)ethoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCOCC1CO1 AOBIOSPNXBMOAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- BHGQBJPBTDBJIB-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetamide Chemical compound NCC(N)=O.NCC(N)=O BHGQBJPBTDBJIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- RSDOASZYYCOXIB-UHFFFAOYSA-N beta-alaninamide Chemical compound NCCC(N)=O RSDOASZYYCOXIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 13
- 239000000945 filler Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N diglycidyl ether Chemical class C1OC1COCC1CO1 GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminetriacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明提供一种多齿配体的新型IMAC色谱介质，其特征在于：该介质具有如式(1)所示的结构：并公开了其制备方法。本发明的新型IMAC色谱介质，具有更多可与金属离子螯合的螯合齿，进一步增强填料对目的蛋白的选择性，降低固相介质与生物分子的亲和力，从而减少非特异吸附。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种多齿配体的新型IMAC色谱介质及其制备方法。
背景技术
固定化金属亲和色谱(IMAC)是通过将特定金属离子(通常为Ni2+、Cu2+、Zn2+或Co2+)固定在固相支持介质上，利用生物分子中某些化学基团进行亲和纯化的技术，技术发展已有较长时间，金属配合物结构逐渐发展，从亚氨基二乙酸(IDA)、氨三乙酸(NTA)、三(羧甲基)乙二胺(TED)到最近的乙二胺四乙酸(EDTA)，金属螯合配基数量逐渐上升，带来的效果也是显而易见的，即对纯化体系中常用的螯合剂(如EDTA)和还原剂(如巯基乙醇/DTT)的耐受性逐渐上升，且获得的生物产品纯度也逐渐提高。
中国专利文献CN 109789385 A提供了一种将EDTA通过酰胺键连接至固相支持物的色谱介质，提供了五齿螯合的条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种多齿配体的新型IMAC色谱介质，提供可与金属离子螯合的6齿结构，进一步降低了固相介质与生物分子的亲和力，从而减少非特异吸附。
本发明采用的技术方案为：一种多齿配体的新型IMAC色谱介质，其特征在于：该介质具有如式(1)所示的结构：
其中G是固相支持介质；
R1为H，C1-C3烷烃或醇中的一种；
R2为提供额外配体齿的COOH，CONH2或CH2OH中的一种；
n1为2或3；
n2为0-3中任一整数。
优选的，所述固相支持介质为多孔固相支持物或磁性介质。
优选的，所述固相支持介质为琼脂糖、葡聚糖、硅胶或磁珠。
优选的，所述固相支持介质直径为20-200μm，由琼脂糖制成，n1为2，n2为0或1，R1为H，R2为COOH。更优选的直径为45-160μm。
优选的，所述固相支持介质加载有金属离子，所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Fe3+或Ga3+。更优选的方案为Ni2+。
本发明还公开了上述的多齿配体的新型IMAC色谱介质的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)活化固相支持介质，在固相支持介质中引入羧基；
(2)活化后的固相支持物与含羧基、酰胺或羟基的分子连接；
(3)步骤(2)的产物通过含酰胺键的缩合剂与含胺多羧酸缩合连接，得到如式(1)所示的介质。
优选的，步骤(2)中含羧基、酰胺或羟基的分子为甘氨酸、α-丙氨酸、β-丙氨酸、乙醇胺、α-丙醇胺、β-丙醇胺、2-氨基乙酰胺、2-氨基丙酰胺或3-氨基丙酰胺的其中一种或任意两种或多种的组合。
优选的，步骤(3)中含胺多羧酸为乙二胺四乙酸或丙二胺四乙酸，使用的缩合剂为EDC或EDCI。
优选的，步骤(1)中的活化在碱性条件下进行，活化剂为环氧氯丙烷，环氧溴丙烷，乙二醇双缩水甘油醚、1，4－丁二醇双缩水甘油醚、1，6－己二醇双缩水甘油醚或聚乙二醇双缩水甘油醚的一种或任意两种或任意多种的组合。
优选的，还包括步骤(4)：步骤(3)的产物与金属离子螯合。
本发明的新型IMAC色谱介质，具有更多可与金属离子螯合的螯合齿，进一步增强填料对目的蛋白的选择性，降低固相介质与生物分子的亲和力，从而减少非特异吸附。利用本发明的新型多齿配体色谱介质进行蛋白纯化能够得到高纯度的目的蛋白。
附图说明
图1为大肠杆菌裂解液中His标签重组蛋白A的纯化效果图。M：蛋白Marker。S：蛋白上清。FT：各组流穿。Elution：各组洗脱。con：对照。A-C：实施例1-3制备的纯化介质。
图2为大肠杆菌裂解液中His标签重组T4DNA Ligase的上清及流穿。M：蛋白Marker。S：蛋白上清。con：对照。A-C：实施例1-3制备的纯化介质。
图3为大肠杆菌裂解液中His标签重组T4DNA Ligase的洗涤液。M：蛋白Marker。con：对照。A-C：实施例1-3制备的纯化介质。
图4为大肠杆菌裂解液中His标签重组T4DNA Ligase的洗脱液。M：蛋白Marker。con：对照。A-C：实施例1-3制备的纯化介质。箭头所指蛋白条带为AB介质洗脱组分不含有的非特异吸附的杂蛋白。
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。
具体实施方式
实施例1
取10ml Sepharose CL-6B，水洗除去乙醇。加入水8ml，环氧氯丙烷1ml，10M NaOH1ml，置于摇床中，40℃活化2h。将活化的凝胶用水洗至中性。加入10ml含0.1M Na2CO3，1M甘氨酸，pH 11的溶液，置于摇床中60℃反应过夜。100ml水洗除去反应液。加入1M EDTA，pH8.0，混匀后加入0.19g EDCI，25℃反应1h，再加入0.19g EDCI，25℃过夜。100ml水洗除去反应液。加入10ml 100mM NiSO4混匀后过滤，50ml水洗，50ml NaCl洗，100ml水洗，保存于10ml20％乙醇中。标记为介质A。
本实施例的反应原理如下：第一步活化
第二步引入羧基
第三步缩合多羧酸
最终得到的介质A的结构式为：
实施例2
取10ml Sepharose CL-6B，水洗除去乙醇。加入水8ml，环氧氯丙烷1.5ml，10MNaOH0.5ml，置于摇床中，30℃活化3h。将活化的凝胶用水洗至中性。加入10ml含0.1MNa2CO3，1Mβ-丙氨酸，pH 9.5的溶液，置于摇床中40℃反应过夜。100ml水洗除去反应液。加入0.5M EDTA，pH 8.0，混匀后加入0.1g EDCI，25℃反应3h，再加入0.1g EDCI，25℃过夜。100ml水洗除去反应液。加入10ml 100mM NiSO4混匀后过滤，50ml水洗，50ml NaCl洗，100ml水洗，保存于10ml 20％乙醇中。标记为介质B，其结构式如下：
实施例3
取10ml Sepharose CL-6B，水洗除去乙醇。加入水8.8ml，环氧氯丙烷0.6ml，10MNaOH0.6ml，置于摇床中，35℃活化4h。将活化的凝胶用水洗至中性。加入10ml 1M乙醇胺，pH10.0的溶液，置于摇床中40℃反应过夜。100ml水洗除去反应液。加入1M EDTA，pH 8.0，混匀后加入0.1g EDCI，25℃反应1h，再加入0.1g EDCI，25℃过夜。100ml水洗除去反应液。加入10ml 100mM NiSO4混匀后过滤，50ml水洗，50ml NaCl洗，100ml水洗，保存于10ml 20％乙醇中。标记为介质C，其结构式如下：
实施例4
取10ml羟基磁珠，100ml水洗。加入水8.8ml，环氧氯丙烷0.6ml，10M NaOH 0.6ml，置于摇床中，40℃活化2h。将活化的磁珠用水洗至中性。加入10ml含0.1M Na2CO3，1M甘氨酸，pH 11的溶液，置于摇床中60℃反应过夜。100ml水洗除去反应液。加入1M EDTA，pH 8.0，混匀后加入0.19g EDCI，25℃反应1h，再加入0.19g EDCI，25℃过夜。100ml水洗除去反应液。加入10ml 100mM NiSO4混匀后过滤，50ml水洗，50ml NaCl洗，100ml水洗，保存于10ml20％乙醇中。其结构式同实施例1。
实施例5
取10ml羟基磁珠，100ml水洗。加入水8ml，环氧氯丙烷1.5ml，10M NaOH 0.5ml，置于摇床中，30℃活化3h。将活化的凝胶用水洗至中性。加入10ml含0.1M Na2CO3，1Mβ-丙氨酸，pH 9.5的溶液，置于摇床中40℃反应过夜。100ml水洗除去反应液。加入0.5M EDTA，pH 8.0，混匀后加入0.1g EDCI，25℃反应3h，再加入0.1g EDCI，25℃过夜。100ml水洗除去反应液。加入10ml 100mM NiSO4混匀后过滤，50ml水洗，50ml NaCl洗，100ml水洗，保存于10ml 20％乙醇中。其结构式同实施例2。
实施例6
按照如下Buffer配制裂解缓冲液(Buffer1)和洗脱缓冲液(Buffer2)，
Buffer 1：
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
pH 7.5。
Buffer 2：
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
50mM咪唑
pH 7.5。
将大肠杆菌表达的带有6个His标签的重组蛋白A离心收集，沉淀用Buffer1重悬，超声破碎，离心收集蛋白上清；将对照和实施例1-3中制备的填料各1ml装入重力柱，水洗并用Buffer1平衡，用5ml蛋白上清过柱收集流穿液，10ml Buffer1洗涤，5ml Buffer2洗脱并收集，对各组分取样电泳。电泳结果如图1所示。其中对照为按照美国专利US2011/0071274A1的实施例1中记载的方法制备的纯化介质。
实施例7
按照如下Buffer配制裂解缓冲液(Buffer3)、洗涤缓冲液(Buffer4)及洗脱缓冲液(Buffer5)。
Buffer 3：
50mM NaH2PO4
150mM NaCl
pH 7.5。
Buffer 4：
50mM NaH2PO4
700mM NaCl
50mM咪唑
pH 7.5。
Buffer 5：
50mM NaH2PO4
150mM NaCl
50mM咪唑
pH 7.5。
将大肠杆菌表达的带有6个His标签的T4DNA Ligase离心收集，沉淀用Buffer3重悬，超声破碎，离心收集蛋白上清，将对照和实施例1-3中制备的填料各1ml装入重力柱，水洗并用Buffer3平衡，用5ml蛋白上清过柱收集流穿液，10ml Buffer3洗涤，5ml Buffer4洗涤并收集，5ml Buffer5洗脱并收集，对各组分取样电泳，电泳结果如图2-4所示。其中对照为按照US 20110071274实施例1中记载的方法制备的纯化介质。
如图1-4所示，螯合齿的增加能够增强填料对目的蛋白的选择性，相较对照，介质A-C均能减少杂蛋白的吸附，提供的额外羧基(介质AB)比额外羟基(介质C)效果更加明显。
Claims (10)
1.一种多齿配体的新型IMAC色谱介质，其特征在于：该介质具有如式（1）所示的结构：
（1）
其中G是活化后的固相支持介质；
R1为H，C1-C3烷烃或醇中的一种；
R2为提供额外配体齿的COOH，CONH2或CH2OH中的一种；
n1为2或3；
n2为0-3中任一整数。
2.根据权利要求1所述的多齿配体的新型IMAC色谱介质，其特征在于：所述固相支持介质为多孔固相支持物或磁性介质。
3.根据权利要求2所述的多齿配体的新型IMAC色谱介质，其特征在于：所述固相支持介质为琼脂糖、葡聚糖、硅胶或磁珠。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多齿配体的新型IMAC色谱介质，其特征在于：所述固相支持介质直径为20-200μm，由琼脂糖制成，n1为2，n2为0或1，R1为H，R2为COOH。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的多齿配体的新型IMAC色谱介质，其特征在于：所述固相支持介质加载有金属离子，所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Fe3+或Ga3+。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多齿配体的新型IMAC色谱介质的制备方法，其特征在于其步骤包括：
（1）活化固相支持介质；
（2）活化后的固相支持介质与含羧基、酰胺或羟基的分子连接，在固相支持介质中引入羧基；
（3）步骤（2）的产物通过含酰胺键的缩合剂与含胺多羧酸缩合连接，得到如式（1）所示的介质。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中含羧基、酰胺或羟基的分子为甘氨酸、α-丙氨酸、β-丙氨酸、乙醇胺、α-丙醇胺、β-丙醇胺、2-氨基乙酰胺、2-氨基丙酰胺或3-氨基丙酰胺的其中一种或任意两种或多种的组合。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中含胺多羧酸为乙二胺四乙酸或丙二胺四乙酸，使用的缩合剂为EDC或EDCI。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中的活化在碱性条件下进行，活化剂为环氧氯丙烷，环氧溴丙烷，乙二醇双缩水甘油醚、1，4－丁二醇双缩水甘油醚、1，6－己二醇双缩水甘油醚或聚乙二醇双缩水甘油醚的一种或任意两种或任意多种的组合。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的制备方法，其特征在于：还包括步骤（4）：步骤（3）的产物与金属离子螯合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110514537.XA CN113351191B (zh) | 2021-05-10 | 2021-05-10 | 多齿配体的新型imac色谱介质及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110514537.XA CN113351191B (zh) | 2021-05-10 | 2021-05-10 | 多齿配体的新型imac色谱介质及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113351191A CN113351191A (zh) | 2021-09-07 |
| CN113351191B true CN113351191B (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=77526265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110514537.XA Active CN113351191B (zh) | 2021-05-10 | 2021-05-10 | 多齿配体的新型imac色谱介质及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113351191B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114797804B (zh) * | 2022-03-29 | 2023-08-04 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 一种具有长连接臂的nta色谱介质及其制备方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1878739A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-16 | LEK Pharmaceuticals D.D. | One step IMAC (MCAC) purification of proteins |
| CN101348520A (zh) * | 2007-12-14 | 2009-01-21 | 北京康铭优盛生化技术有限公司 | 一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法 |
| EP2022561A1 (en) * | 2007-08-06 | 2009-02-11 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Immobilisation of chelating groups for immobilised metal ion chromatography (IMAC) |
| CN101808731A (zh) * | 2007-08-06 | 2010-08-18 | 马普科技促进协会 | 用于固定金属离子色谱法(imac)的螯合基团的固定 |
| CN106000326A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-10-12 | 常州天地人和生物科技有限公司 | 一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用 |
| WO2017046625A1 (en) * | 2015-06-25 | 2017-03-23 | Cube Biotech Gmbh | New chelators for affinity purification of recombinant proteins |
| CN106946926A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-07-14 | 西北大学 | 一种具有多齿氨羧类二聚体螯合剂及其制备方法、应用和分离介质 |
| CN109789385A (zh) * | 2016-10-03 | 2019-05-21 | 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 | 新型色谱介质 |
| WO2019127686A1 (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-04 | 浙江大学 | 组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用 |
| CN110904187A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-03-24 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 一种Taq酶活性测定方法 |
-
2021
- 2021-05-10 CN CN202110514537.XA patent/CN113351191B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1878739A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-16 | LEK Pharmaceuticals D.D. | One step IMAC (MCAC) purification of proteins |
| EP2022561A1 (en) * | 2007-08-06 | 2009-02-11 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Immobilisation of chelating groups for immobilised metal ion chromatography (IMAC) |
| CN101808731A (zh) * | 2007-08-06 | 2010-08-18 | 马普科技促进协会 | 用于固定金属离子色谱法(imac)的螯合基团的固定 |
| CN101348520A (zh) * | 2007-12-14 | 2009-01-21 | 北京康铭优盛生化技术有限公司 | 一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法 |
| WO2017046625A1 (en) * | 2015-06-25 | 2017-03-23 | Cube Biotech Gmbh | New chelators for affinity purification of recombinant proteins |
| CN106000326A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-10-12 | 常州天地人和生物科技有限公司 | 一种超耐受金属螯合亲和填料的制备和应用 |
| CN109789385A (zh) * | 2016-10-03 | 2019-05-21 | 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 | 新型色谱介质 |
| CN106946926A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-07-14 | 西北大学 | 一种具有多齿氨羧类二聚体螯合剂及其制备方法、应用和分离介质 |
| WO2019127686A1 (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-04 | 浙江大学 | 组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用 |
| CN110904187A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-03-24 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 一种Taq酶活性测定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Jianmin Wu等.Trypsin immobilization by direct adsorption on metal ion chelated macroporous chitosan-silica gel beads.《International Journal of Biological Macromolecules》.2006,第39卷第185-191页. * |
| 孙永亮等.纯化组氨酸标签蛋白金属螯合亲和色谱填料的制备与性能.《陕西师范大学学报(自然科学版)》.2007,第35卷(第2期),第67-71页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113351191A (zh) | 2021-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2826555B1 (en) | Use of immobilized chelator for purification of recombinant polypeptides by immobilized metal ion chromatography | |
| JP7544704B2 (ja) | 固相キレート材、その製造方法およびタンパク質の精製におけるその使用 | |
| Heebøll-Nielsen et al. | Fractionation of whey proteins with high-capacity superparamagnetic ion-exchangers | |
| WO2009126603A1 (en) | Chromatography purification of antibodies | |
| US20060027501A1 (en) | Method of generating metal chelating affinity ligands | |
| US8999157B2 (en) | Method for preparation of a biomolecule adsorbent | |
| CN113351191B (zh) | 多齿配体的新型imac色谱介质及其制备方法 | |
| CN114797804B (zh) | 一种具有长连接臂的nta色谱介质及其制备方法 | |
| WO2017046625A1 (en) | New chelators for affinity purification of recombinant proteins | |
| Heebøll-Nielsen et al. | Superparamagnetic cation–exchange adsorbents for bioproduct recovery from crude process liquors by high-gradient magnetic fishing | |
| US20100016564A1 (en) | Method of preparing an immobilised metal ion chromatography adsorbent and methods of purifying proteins, peptides or polynucleotides | |
| CN106334544B (zh) | 一种以亚氨基二琥珀酸为配体的分离介质及其制备方法和应用 | |
| WO2005000441A9 (en) | Conjugates of magnetic polymer particles and carboxymethylated aspartic acid | |
| US20220258130A1 (en) | Chromatography Media | |
| JPH0337976B2 (zh) | ||
| JPWO2017145553A1 (ja) | 吸着材及び精製方法 | |
| EP2022561A1 (en) | Immobilisation of chelating groups for immobilised metal ion chromatography (IMAC) | |
| Varilova et al. | Separation media in affinity chromatography of proteins-A critical review | |
| CN117339250A (zh) | 一种从含铀及裂片元素的硝酸溶液中选择性分离钼的方法 | |
| BO et al. | Preparation of Immobilized Metal Affinity Chromatographic Packings Based on Monodisperse Hydrophilic Non‐porous Beads and Their Application | |
| JPH01107150A (ja) | クロマトグラフィー用吸着担体 | |
| JPS62153754A (ja) | クロマトグラフイ−用吸着担体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Room 402, building 1, Lane 166, Tianxiong Road, Pudong New Area, Shanghai, 200120 Patentee after: Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Room 402, building 1, Lane 166, Tianxiong Road, Pudong New Area, Shanghai, 200120 Patentee before: YEASEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY (SHANGHAI) CO.,LTD. Country or region before: China |
|
| CP03 | Change of name, title or address |