KR20230006446A - 폴리펩티드 친화성 리간드 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고체 지지체에 커플링되는 신규한 폴리펩티드 친화성 리간드 및 IgG 항체의 친화성 정제에 관한 것이다. 본 발명은 (1) 폴리펩티드 리간드의 설계, 생성 및 정제, (2) 고체 지지체 매트릭스에 대한 폴리펩티드 친화성 리간드의 커플링, (3) IgG (다클론 및 단클론 항체)의 정제, 및 (4) 폴리펩티드가 지지된 고체 매트릭스의 세정 및 재사용을 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 8월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 63/064,213 및 2020년 2월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 62/971,509에 대한 우선권을 주장하며, 두 문헌 모두 모두 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 단백질, 특히 면역글로불린 단백질에 대해 높은 친화성을 갖는 폴리펩티드 친화성 리간드, 및 이러한 리간드가 부착된 고체 지지체, 및 이러한 고체 지지체를 사용한, 단백질, 특히 면역글로불린 단백질(예를 들어, IgG (다클론 또는 단클론) 항체)의 정제 방법에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는 리간드가 부착된 지지체로 구성된다. 리간드는 분리 및 정제될 특정 물질(즉, 분석물)에 특이적으로 결합한다. 친화성 크로마토그래피용 고체 지지체의 전형적인 예는, 당 사슬을 가교시켜 수득한 입자(예를 들어, 아가로스 겔), 또는 폴리메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아실아미드, 실리카 겔 및 조절된 다공성 유리와 같은 합성 중합체를 함유하는 입자를 포함한다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 일반적인 리간드에는 단백질 A, 단백질 G, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 말토스-결합 단백질, 키틴 및 고정된 금속 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
지지체는 일반적으로 반복적으로 사용되며, 일반적으로 정제 작업 후 지지체에 잔류량의 오염 물질이 발생한다. 따라서, 오염물을 제거하는 세척 단계를 수행하여 지지체를 원래 상태로 복원할 수 있다. 일반적으로 정치 세정(cleaning in place, CIP)으로 알려진 작업은 지지체에서 오염 물질을 용리시킬 수 있는 시약을 사용하여 수행된다. 이러한 시약의 예에는, 미생물, 단백질, 지질 및 핵산과 같은 오염 물질을 효과적으로 제거하는, 알칼리성 및 산성 액체, 카오트로픽제, 우레아 및 구아니딘 염산염이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 그러나 알칼리성 액체를 사용하여 친화성 크로마토그래피 지지체에서 오염 물질을 제거하는 동안, 이러한 알칼리성 조건은 리간드를 불안정하게 만들고 결합 능력을 감소시킬 수 있다.
항체 기반 요법이 질병의 유망한 치료법으로 계속 등장함에 따라 이러한 분자들의 신속한 정제가 절실히 필요하다. IgG 항체의 친화성 정제를 위한 단백질 A 수지는 지난 30년 동안 사용되어 왔다. 그러나 단백질 A 수지는 상대적으로 낮은 동적 결합능으로 인해 정제 효율을 감소시킨다. 또한, 최근 세포 배양 기술의 발전으로 항체 역가가 크게 증가하여, 이러한 분자들의 현재의 다운스트림 정제에 더 큰 부담을 주고 있다. 이러한 컬럼에 사용되는 수지는 이러한 세정에 필요한 높은 pH에 견디지 못하므로, 이러한 수지의 사용 수명이 제한되어 비용이 증가한다. 항체-기반 치료제에 대한 높은 수요로 인해 발생하는 정제 문제를 완화하기 위해, 다량의 항체를 효율적으로 정제하면서도 알칼리성 세정 공정을 견딜 수 있는 친화성 크로마토그래피 수지가, 이러한 분자들의 다운스트림 정제를 크게 향상시킬 것이다.
본 발명은 폴리펩티드 친화성 리간드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 단백질 분석물, 예를 들어 면역글로불린 단백질(예를 들어, IgG (다클론 또는 단클론) 항체)의 친화성 정제를 위한 고체 지지체에 커플링될 수 있다. 본 발명은 (1) 폴리펩티드 친화성 리간드의 발현 및 정제, (2) 고체 지지체 상에 폴리펩티드 친화성 리간드의 고정, (3) 면역글로불린 단백질의 정제, 및 (4) 고체 지지체 매트릭스의 세정 및 재사용을 포함한다. 폴리펩티드 친화성 리간드는 분석물의 완전한 용리/회수를 가능하게 하면서, 단백질 분석물에 대한 결합 친화성을 증가시켰다.
본 발명은 단백질 분석물(예를 들어, 면역글로불린)을 단리하기 위한 친화성 크로마토그래피 및 방법을 제공한다. 친화성 크로마토그래피용 지지체는 우수한 내알칼리성을 나타내므로 알칼리 조건에서의 세척에 대한 내성이 높다. 따라서, 면역글로불린 정제용 지지체를 반복적으로 사용해도, 면역글로불린의 동적 결합능(dynamic binding capacity, DBC)이 크게 감소하지 않는다.
도 1은 서열번호 3의 폴리펩티드 친화성 리간드로 기능화된 고체 지지체의 DBC를 나타내는 그래프이다.
도 2는 60분 접촉 시간 동안 0.1N 수산화나트륨으로 처리되거나 15분 접촉 시간 동안 0.5N 또는 1.0N 수산화나트륨으로 처리될 때, 폴리펩티드 친화성 리간드 서열번호 3으로 기능화된 고체 지지체의 알칼리 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 1.0N NaOH, 1.0N NaOH + 1.0M 에틸렌 글리콜, 1.0N NaOH + 1.0M 프로필렌 글리콜, 1.0N NaOH + 1.0M 수크로스를 사용한 100 주기의 세정에 대한 상대적 DBC를 나타내는 그래프이다.
도 4는 세척 완충액에서 아르기닌의 농도를 변화시키면서 정제 단계의 숙주 세포 단백질 로그 감소 값을 나타내는 그래프이다. IgG는 1ml 컬럼에 미리-포장된 고정화된 리간드를 사용하여 정제되었다.
도 2는 60분 접촉 시간 동안 0.1N 수산화나트륨으로 처리되거나 15분 접촉 시간 동안 0.5N 또는 1.0N 수산화나트륨으로 처리될 때, 폴리펩티드 친화성 리간드 서열번호 3으로 기능화된 고체 지지체의 알칼리 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 1.0N NaOH, 1.0N NaOH + 1.0M 에틸렌 글리콜, 1.0N NaOH + 1.0M 프로필렌 글리콜, 1.0N NaOH + 1.0M 수크로스를 사용한 100 주기의 세정에 대한 상대적 DBC를 나타내는 그래프이다.
도 4는 세척 완충액에서 아르기닌의 농도를 변화시키면서 정제 단계의 숙주 세포 단백질 로그 감소 값을 나타내는 그래프이다. IgG는 1ml 컬럼에 미리-포장된 고정화된 리간드를 사용하여 정제되었다.
한 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 친화성 리간드에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 친화성 리간드의 정제 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 친화성 리간드가 부착된 고체 지지체에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 고체 지지체 매트릭스에 부착된 폴리펩티드 친화성 리간드를 사용하여 IgG 항체에 융합된 분석물을 정제하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 고체 지지체에 고정화될 때 폴리펩티드 친화성 리간드의 알칼리 안정성에 관한 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 양은 범위에 의해, 그리고 범위의 하한 및 상한으로 정의된다. 각 하한은 각 상한과 결합하여 범위를 정의할 수 있다. 하한 및 상한은 각각 별도의 요소로 간주되어야 한다.
폴리펩티드 친화성 리간드
본 발명의 폴리펩티드 친화성 리간드(본원에서 "리간드"로 지칭됨)는 분석물, 예를 들어 면역글로불린 단백질에 특이적으로 결합한다. 용어 폴리펩티드는 폴리펩티드 아미노산 서열 및 구조로 구성된 임의의 분자를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 리간드는 전형적으로 약 80 내지 약 400개의 아미노산을 포함하고, 단백질 유사 구조와 유사하다. 이 범위의 다른 하한의 예는 약 100개, 약 121개, 약 150개, 및 약 200개 아미노산을 포함한다. 이 범위의 다른 상한의 예는 약 200개, 약 300개, 약 350개, 및 약 391개 아미노산을 포함한다. 리간드의 아미노산 서열은 폴리펩티드의 나선 도메인의 향상된 나선 구조를 가능하게 하는 이황화 결합 형성을 촉진하는 방식으로 배열된다. 즉, 이황화 결합은 폴리펩티드 리간드의 나선 성질을 안정화시킨다. 일부 실시양태에서, 전형적으로 리간드의 약 80-125개 아미노산마다 약 1개의 이황화 결합이 존재한다. 이황화 결합을 형성하는 시스테인 아미노산들은 전형적으로 서로 떨어져 있는 약 28개의 아미노산 잔기들이다.
한 실시양태에서, 리간드는 본원에서 "서브유닛-1"로 지칭되는 아미노산 서열 1 내지 10개, 및 본원에서 "서브유닛-2"로 지칭되는 아미노산 서열 1 내지 10개를 포함한다.
서브유닛-1의 서열은 서열번호 17과 약 80% 이상의 동일성, 약 85% 이상의 동일성, 약 90% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 99% 이상의 동일성, 또는 100% 의 동일성을 갖는다.
서브유닛-2의 서열은 서열번호 18과 약 80% 이상의 동일성, 약 85% 이상의 동일성, 약 90% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 99% 이상의 동일성, 또는 100% 의 동일성을 가지며, 상기 서열은 2개의 시스테인 잔기를 갖고, 바람직하게는 시스테인 잔기는 위치 5 및 34에 존재한다. 전형적으로, 리간드의 각각의 서브유닛 2 내의 두 시스테인 잔기 사이에는 이황화 결합이 존재한다.
서브유닛 1과 서브유닛 2는 넓은 pH 범위(3-13)에 걸쳐 리간드의 안정성을 제공하면서도 분석물에 대한 친화도가 우수한 방식으로 배열된다.
한 실시양태에서, 친화성 폴리펩티드 리간드는 1 내지 10개의 서브유닛-1 아미노산 서열 및 1 내지 10개의 서브유닛-2 아미노산 서열를 포함하고, 서브유닛-1은 서열번호 17과 약 90% 이상의 동일성을 갖고, 서브유닛-2는 서열번호 18과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 위치 5 및 29의 잔기는 시스테인이고, 2개의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합이 존재하고, 상기 리간드는 2개 이상의 서브유닛-1 또는 2개 이상의 서브유닛-2 를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 서브유닛-1은 임의의 두 개의 서브유닛-2 를 분리한다. 즉, 서브유닛-1은 리간드의 서열에서 서브유닛-1 뒤에 올 수 있지만, 서브유닛-2는 리간드의 서열에서 서브유닛-2 뒤에 올 수 없다.
일부 실시양태에서, 서브유닛 1 및 서브유닛 2는 리간드의 1차 구조에서 순서대로 교대로 배열되고, 서브유닛 1 및 서브유닛 2는 리간드의 2차 구조에서 반복되는 알파 나선 서브유닛을 형성한다.
일부 실시양태에서, 리간드는 서브유닛-1과 서브유닛-1 사이, 및/또는 서브유닛-1과 서브유닛-2 사이에 스페이서를 포함한다. 스페이서는 전형적으로 약 5 내지 20개의 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 시스테인, 메티오닌, 프롤린, 아스파르트산 또는 트립토판을 포함하지 않는다. 스페이서의 예는 서열번호 19이다. 다른 스페이서의 예는 서열번호 19와 약 80% 이상의 동일성, 약 85% 이상의 동일성, 약 90% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 99% 이상의 동일성을 갖는 스페이서를 포함한다. 동일한 리간드에 상이한 스페이서들을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는, 스페이서로서 작용하고 아미노산 앵커 잔기를 제공하는, 임의의 천연 또는 비천연 아미노산으로 구성된 C-말단 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, C-말단 아미노산 잔기는 리간드를 고체 지지체에 고정시키기 위해 사용될 수 있다. 즉, 앵커 잔기가 고체 지지체에 접합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 앵커 잔기는, 통상적으로 숙련된 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 커플링될 수 있는 측쇄 내에 1차 아민이 함유된 아미노산으로, 예를 들어 라이신, 세린 또는 알라닌이다. 아미노산 스페이서의 길이는 제한되지 않는다. 스페이서의 전형적인 길이 범위는 약 5 내지 약 25개의 아미노산이다. 이 범위의 다른 하한의 예는 약 7, 약 10, 및 약 15개의 아미노산을 포함한다. 이 범위의 다른 상한의 예는 약 16개, 약 18개, 및 약 20개 아미노산을 포함한다.
친화성 리간드의 생산
한 실시양태에서, 리간드는 당업자에게 공지된 바와 같이 적합한 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성적으로 생성될 수 있다.
다른 실시양태에서, 리간드는 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 리간드는 대장균, 고초균 또는 황색 포도구균과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 원핵 유기체에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 추가로 진핵생물 발현 시스템, 예를 들어 진균(예를 들어, 효모), 곤충 세포 또는 포유동물 세포가 리간드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Frederick M. Ausbel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 및 Sambrook, et al., ed., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)에 기술된 공지된 유전자 재조합 기술을 사용할 수 있다. 원하는 리간드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터는 숙주의 형질전환에 사용되며, 이후 적절한 배지에서 배양되어 당업계에 널리 공지된 바와 같이 리간드를 다량으로 수득한다.
친화성 리간드의 정제
단백질 발현 후, 리간드는 순수한 리간드를 생성하기 위해 적합한 정제 방법을 사용하여 정제된다. 정제 전략은 리간드의 이황화 결합 안정화, 예를 들어 리간드의 시스테인 잔기 내의 이황화 결합을 촉진하고, 분석물, 예를 들어 IgG 항체에 대한 리간드의 향상된 친화성을 유지하는 방식으로 수행된다. 정제 과정은 다음을 포함할 수 있다: (1) 초음파 처리, 화학적 용해, 또는 고압 균질화를 사용하여 파괴에 의해 숙주 세포로부터 세포내 단백질 방출, (2) DNA 및 숙주 세포 단백질과 같은 원치 않는 불순물 제거를 위한, 분자량 범위가 800 Da 내지 20,000 Da 범위인 고도로 양으로 하전된 중합체의 첨가, (3) 가용성 친화성 리간드로부터 다른 모든 불용성 물질을 제거하기 위한 세포 용해물의 정화, (4) 혼합 모드 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하가거나 임의의 다른 동등한 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지를 사용한, 친화성 리간드의 정제, 및 (5) 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 사용한 리간드의 최종 정제.
고체 지지체
본 발명의 정제된 리간드는 고체 지지체 매트릭스(즉, "지지체")에 부착된다. 지지체는 입자(즉, 다공성 또는 비다공성 입자)로 구성될 수 있다. 입자는 충전층(packed bed) 형태 또는 서스펜션 형태일 수 있다. 서스펜션 형태는 유동층(팽창층)과 쉬어 쉬어 서스펜션 (sheer suspension)으로 알려진 생성물을 포함하며, 입자들이 내부에서 자유롭게 이동할 수 있다. 충전층 및 유동층의 경우, 분리 단계의 순서는 일반적으로 농도 구배를 기반으로 하는 기존 크로마토그래피 방법을 따른다. 쉬어 서스펜션의 경우 배치 방법이 사용된다.
고체 지지체는 화학적 조성에 따라 유기 및 무기 지지체로 정의할 수 있다. 고체 지지체는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리에테르 설폰, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐에테르, 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체 및 이들의 임의의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는 합성 중합체 또는 공중합체를 기반으로 할 수 있다. 고체 지지체는 다당류(아가로스, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 콜라겐 등)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 천연 중합체일 수 있다. 고체 지지체는 또한 무기 재료를 기반으로 할 수 있으며, 그 예로는 실리카, 유리, 산화알루미늄, 산화티탄, 세라믹, 점토 및 하이드록시아파타이트가 있지만 이에 제한되지 않는다. 거의 모든 친화성 분리가 수용액 중에서 발생하기 때문에, 고체 지지체는 일반적으로, 카보닐(알데히드 또는 케톤), 카복실산, 에폭사이드, 하이드록실, 아미노 그룹 및 이들의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 반응성 작용기를 갖는 친수성 표면을 함유한다. 이러한 반응성 작용기는, 고체 지지체를 폴리펩티드 리간드와 직접 커플링시키거나 적절한 반응 조건 하에서 후속 표면 화학적 활성화 후에 촉진할 수 있다.
고체 지지체의 포맷은 비드 (구형 또는 불규칙적인, 다공성 또는 비다공성인 비드), 다공성 멤브레인 또는 단일체, 중공 또는 고체 섬유, 칩, 슬라이드 또는 플레이트일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 고체 지지체는 이의 제조 공정(예를 들어, 합성 폴리머 기반 매트릭스) 동안 또는 매트릭스 형성(예를 들어, 다당류 기반) 후에 시약과 종종 가교결합되어, 낮은 컬럼 작동 압력에 도움이 되는 상당한 다공성 및 강성을 제공한다(예를 들어, US 4,973,683, 이 문헌은 원용에 의해 본원에 포함됨).
친화성 크로마토그래피용 지지체는 일반적으로 약 20μm 내지 200μm의 입자 크기(평균 부피 직경)를 가질 수 있다. 분취 규모 정제의 경우 더 큰 입자가 선호되는 경우가 많으며 일반적으로 30μm에서 100μm의 입자 크기를 사용하여 고용량, 대규모 및 빠른 단백질 정제 공정을 달성한다(Handbook of Affinity Chromatography, Toni Kline, p.24, CRC Press, 1993). 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 지지체는, 이들의 응용분야에서 다공성 지지체의 높은 표면적이 높은 단백질 고정량 및 결합력을 가능하게 하기 때문에, 부피 평균 기공 크기가 50~4000Å인 것이 바람직하다. 더 작은 기공을 가진 입자는 리간드 고정화에 사용할 수 있는 총 표면적을 증가시키는 반면, 기공에 들어가는 단백질에 대한 확산 저항도 더 높다. 단백질 고정화를 위한 최적의 기공 크기는 일반적으로 단백질 리간드의 유체역학적 직경의 약 3-5배인 것으로 이전에 보고되었다. 기공 직경 및 고체 지지체의 분포를 포함한 제어된 입자 크기 및 기공 매개변수는 지지체의 총 표면적 및 유동 특성을 정의하므로, 단백질의 결합 능력 및 다운스트림 정제 공정 효율에 영향을 미친다 (Anal. Biochem., 406(2):235-237 (2010); J. Chromatogr. A., 888:13-22 (2000); Biotechnol. Equip., 29(2):205-220 (2015)).
고체 지지체에 대한 리간드의 커플링
고체 지지체는 종종 표면에 본 발명의 폴리펩티드 리간드의 고정화를 위한 적절한 반응성 작용기를 함유하거나 및/또는 이들로 개질된다. 지지체의 표면은 친수성이거나 친수성 반응성 작용기로 개질될 수 있다. 고체 지지체의 활성화된 표면은 카르보닐(알데히드 또는 케톤), 에폭사이드, 하이드록실, 카르복실산, 시아노겐 브로마이드(CNBr), N-하이드록시 숙신이미드 에스테르, 카르보닐 디이미아졸(CDI), 유기 설포네이트(토실레이트 및 트레실레이트), 아즐락톤, 요오도아세틸 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 반응성 기를 함유할 수 있다. 리간드는 환원성 아민화, 아민/티올-에폭사이드, '클릭' 화학 및 기타 치환 반응을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 단일점 또는 다가 부착을 통한 전통적인 고정화 기술에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 커플링 방법의 적절한 선택은 고체 지지체와 폴리펩티드 리간드의 특성에 따라 달라진다 (Affinity Chromatography and Importance in Drug Discovery, Column Chromatography, IntechOpen, DOI: 10.5772/55781).
커플링은, 폴리펩티드 리간드가 공유 결합되고 이황화 결합이 파괴되지 않은 지지체에 단백질을 고정화하는 일반적인 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 리간드는 아민 및 알데히드 화학을 사용하여 부착될 수 있다. 커플링은 먼저 에폭사이드 작용기로 고체 지지 수지를 활성화함으로써 개시될 수 있다. 에폭사이드 기능화는 염기성 조건 하에 α,ω-디글리시딜 에테르 또는 에피클로로히드린과 같이 길이가 약 1 내지 135개의 탄소인 링커 분자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 링커 분자는, 단리 동안 리간드와 분석물, 예를 들어 항체의 상호작용을 입체적으로 촉진한다. 에폭사이드 모이어티는 후속적인 개환 및 산화 반응에 의해 반응성 알데히드기로 전환될 수 있다. 그 다음 리간드의 측쇄로부터의 아민 기는 환원성 아민화 반응을 통해 공유 부착을 형성하기 위해 적절한 완충 조건에서 알데히드 기능화된 고체 지지체와 반응한다. 대안적으로, 전술한 같은 에폭시-활성화된 고체 지지체는 온화한 커플링 조건 하에서 1단계 친핵성 치환 반응을 통해 폴리펩티드 리간드의 아미노, 티올 또는 하이드록실 기와 효율적으로 커플링될 수 있다. 다른 예는, 각각 N-하이드록시숙신이미드, 카르보디이미드 및 시아노겐 할라이드에 의해 활성화된 후 카르복실기, 아미노기 또는 하이드록실기를 갖는 고체 지지체를 아미드 결합 형성을 통해 폴리펩티드 리간드의 아미노 또는 카르복실기와 커플링하는데 사용하는 것이다. 또한, 토실화 또는 트레실화 시약을 사용하여 활성화된 후 하이드록실기 기능화된 고체 지지체 또한, 폴리펩티드 리간드의 아미노 또는 하이드록실기와 커플링하는데 사용될 수 있다(예를 들어, US 9,040,661 B2; US 9,051,375 B2; WO 2011/012302 A1, 이들은 원용엥 의해 본원에 포함됨).
표면 친수성과 같은, 물질 표면 성질의 개질은, 단백질 흡착 능력의 정도를 변경하는 것으로 나타났다 (Curr. Top. Med. Chem., 8:270-280 (2008)). 수지 표면의 에폭시기의 개환 반응을 통해 생성된 하이드록실기는 물질의 친수성을 증가시켜 단백질의 비특이적 흡착을 방지할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드 리간드와 커플링되지 않은 나머지 에폭시기는 리간드 고정화 후 지지체에 존재하고 개방되어 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 나머지 에폭시기는 가열 또는 실온 하에서 산 또는 알칼리와 함께 물에서 지지체를 교반함으로써 친핵성 시약으로 물을 사용함에 의해 개환될 수 있다. 대안적으로, 나머지 에폭시기는 메르캅토에탄올 또는 티오글리세롤 및 모노에탄올아민과 같은 적절한 차단 시약을 사용하여 차단될 수도 있다.
일부 상황에서, 링커는 종종 고체 지지체 표면과 친화성 리간드 사이에 설계 및 최적화되어 부착된 리간드의 배향 유연성 및 가용성을 개선하여 친화성 매질 성능을 향상시킨다. 링커는 고체 지지체 표면에 부착될 수 있는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 친화성 매질 성능에 대한 링커 길이 효과를, 다른 분자들 및 화학에 의한 수지 매트릭스의 활성화를 통해 평가하였다. 링커는 약 1 내지 135개의 탄소 범위의 탄소 사슬을 함유할 수 있으며, 링커의 중간에 N, O, S 등과 같은 하나 이상의 헤테로 원자가 포함될 수 있다. 링커는 선택한 고체 지지체 활성화 기술에 따라 하나 또는 여러 개의 반응성 기가 있는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 링커 시약의 예는 폴리에틸렌글리콜, 에피클로로히드린, 글리시돌, 다양한 직쇄 탄소 쇄를 갖는 α,ω-디아민을 포함하는, 다양한 직쇄 탄소 사슬을 갖는 임의의 α,ω-디글리시딜 에테르이지만 이에 제한되지는 않는다.
분석물질의 단리 방법
본 발명에 따른 분석물질(예를 들어, IgG 항체)을 단리하는 방법은 분석물질을 포함하는 시료를 지지 상에 도포하여 분석물질을 지지체에 흡착시키는 단계(제1 단계); 및 지지체로부터 분석물질을 용리시키는 단계(제 2단계)를 포함하며; 제2 단계(제 3단계) 후에 알칼리성 액체로 지지체를 세척하는 단계를 더 포함하는 것이 더 바람직하다.
제1 단계에서, 분석물이 포함된 시료를, 예를 들어 친화성 크로마토그래피를 위해 친화성 폴리펩티드가 고정화된 고체 지지체로 채워진 컬럼에, 분석물이 고체 지지체에 흡착하는 조건 하에서 도포한다. 제1 단계에서 시료의 분석물질을 제외한 대부분의 물질은 리간드에 흡착되지 않고 컬럼을 통과한다. 필요한 경우 리간드에 의해 약하게 유지되는 일부 물질을 제거하기 위해, 지지체를 염화나트륨과 같은 염이 포함된 중성 완충 용액으로 세척할 수 있다.
제2 단계에서는 약 pH 3~5의 적절한 완충액을 적용하여 고체 지지체에 흡착된 분석물질을 용리시킨다. 용리액을 수집하여 분석물을 시료로부터 분리할 수 있다.
제3 단계에서 지지체는 알칼리성 액체로 세척된다(CIP 세척). 제3 단계에서 사용하는 알칼리성 액체로서는, 예를 들면 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 트리에틸아민, 수산화테트라부틸암모늄을 포함한다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 지지체는 제 3단계에서의 세척 후에도 리간드의 높은 내알칼리성으로 인해 분석물질 결합능을 안정적으로 유지하고; 따라서, 지지체는 본 발명의 분석물 단리 방법을 위해 반복적으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 친화성 크로마토그래피 고체 지지체는 약 30g/L 초과의 용량을 갖는 IgG에 대해 높은 DBC를 갖고, 알칼리성 조건 하에서의 세척(예를 들어, 0.01N ~ 1.0N의 수산화나트륨 용액과 같은 알칼리성 액체를 사용한 세척)에 대해 높은 내성을 나타내어, 결합 분석물에 대해 90% 효율성을 유지하면서 15분 접촉 시간으로 0.5N 수산화나트륨을 이용한 100 주기 이상 세척을 제공한다.
정제 성능 향상을 위한 첨가제
본 발명에서 고체 지지체를 사용하여 정제되는 일반적인 분석물은 IgG 항체로, 이는 내독소, 숙주 세포 단백질, DNA 단편, 세포 배양 배지 성분, 및 기타 생성물 관련 불순물, 예를 들어 응집체 또는 분해 생성물의 제거를 필요로 한다. 정제되지 않은 항체를 지지체에 로딩한 후, 세척 단계를 사용하여 불순물을 제거한다. 일반적으로 알려진 세척 완충액으로는, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨과 같은 염이 있거나 없는, pH 4.5~9.0 범위의 PBS 완충액, Tris 완충액, HEPES 완충액이 포함된다.
본 출원에 개시된 바와 같이 친화성 리간드를 고정화함으로써 제조된 친화성 수지를 이용하는 항체 정제 공정에 사용되는 특정 첨가제는, 수율에 상당한 영향을 주지 않으면서도 불순물 제거 및 증가된 항체 순도를 놀랍게도 상당히 개선시킨다. 약 4.5 내지 10.0 범위의 pH를 갖는 세척 완충액에 첨가될 때 이들 첨가제는 친화성 리간드 또는 고체 지지체와 강하게 상호작용하는 불순물을 제거한다. 개별적으로 또는 조합하여 효과적인 것으로 나타난 첨가제는 도 4 및 표 1에 제시된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 불순물 제거를 개선하기 위해 세척 단계에서 사용하기 위한 첨가제 조성물(즉, "첨가제")이 제공된다. 세척 완충액의 첨가제는 개별적으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다. 첨가제에는 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 아세틸 아르기닌 또는 프로필렌 글리콜, 트윈 20, 구아니딘 HCl, 우레아 또는 IPA가 포함된다.
일부 실시양태에서, 첨가제 용액은 약 1% 내지 10%의 프로필렌 글리콜; 0.1M 내지 1M 아르기닌; 0.1% ~ 1%의 트윈 20; 0.1M 내지 1M의 구아니딘 HCl; 1% ~ 10%의 IPA; 1.0M에서 3.0M의 우레아를 포함한다.
알칼리 처리 중 고정화된 친화성 리간드의 안정성을 개선하기 위한 첨가제
고정화된 친화성 리간드를 포함한 고체 지지체는 일반적으로 분석 물질을 정제하기 위해 반복적으로 사용되며, 이는 전형적으로 지지체에 잔류량의 오염 물질을 생성한다. 세정 단계(알칼리 처리 단계)는 이러한 오염 물질을 제거하기 위해 마지막에 사용된다; 그러나 세정 용액은 전형적으로 고알칼리성으로, 고체 지지체/친화성 리간드의 안정성에 영향을 미친다.
본 발명의 한 실시양태에서, 오염 물질을 효과적으로 제거하면서 지지체/리간드의 안정성을 유지하기 위해, 세정 단계에서 사용하기 위한 첨가제 조성물 (즉, "첨가제")이 제공된다. 즉, 첨가제는 고정된 친화성 리간드를 보호하고 분해를 억제한다.
첨가제는, 예를 들어 1몰 이상의 수산화나트륨과 같은 고알칼리성 용액에 포함될 수 있다. 예를 들어, NaOH의 농도가 약 0.1N 내지 1.0N의 범위일 때, 첨가제의 농도는 약 0.1M 내지 2.0M의 범위일 수 있다. 알칼리 용액의 농도에 따라 첨가제의 특정 농도를 이용하여 안정화 효과를 조절할 수 있다. 예를 들어, 1M 의 수크로스 첨가제 용액은 1N NaOH 용액에 효과적이다.
첨가제는 탄수화물(예를 들어, 수크로스, 트레할로스), 폴리올, 글리콜(예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜) 및/또는 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 아세틸 아르기닌)을 포함한다.
한 실시양태에서, 첨가제 용액은 약 1.0M 에틸렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH; 1.0M 프로필렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH; 1.0M 수크로스가 포함된 1.0N NaOH 를 포함한다.
동일성(%)
본 발명의 범위에 속하는 서열는 열거된 특정 서열에 제한되지 않으며, 그이 변형들도 포함한다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 BLASTP, BLASTN 및 FASTA 을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). BLASTX 프로그램은 NCB I(National Center for Biotechnology Information) 및 기타 출처(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NILM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)로부터 공중에 이용가능하다. 공지된 Smith Waterman 알고리즘도 동일성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1
분자 클로닝 및 친화성 리간드 발현
재료 및 방법
친화성 리간드를 암호화하는 유전자는 E. coli에서 재조합 발현을 위해 코돈 최적화하였다. 이들 유전자들을 합성한 후 NdeI 및 XhoI 제한효소 부위(Synbio)를 사용하여 pET24a(Novagen) 발현 벡터에 클로닝하였다. 연결(ligation) 후, 42℃에서 45초 동안 박테리아에 열 충격을 가하여 발현벡터를 BL21 DE3 컴피턴트 E. coli에 형질전환하였다. 형질전환된 배양물을 LB 배지에서 37℃ 및 250 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 박테리아를 50μg/mL 카나마이신이 포함된 LB 한천 플레이트(Teknova)에 스트리킹하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 발현 검증을 위해 개별 콜로니를 선택하였다.
목적 친화성 리간드로 형질전환된 E.coli의 단일 콜로니를, 밤새 성장시킨 50μg/mL 카나마이신 플레이트(Teknova)에서 선별하였다. 이 콜로니는 LB 배지(Sigma)의 새로운 배양물을 접종하는 데 사용하며, 배양물이 ~0.6의 광학 밀도로 성장할 때까지 진탕하면서 37℃에서 배양하였다. 이 시점에서, 1mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)(Avantor)를 배양물에 도입하였다. IPTG를 첨가한 후, 배양물을 추가로 3시간 동안 진탕하면서 37℃에서 배양하였다. 그런 다음 세포를 6000xg에서 15분 동안 원심분리하여 수확하고 SDS-PAGE를 사용하여 발현을 확인하였다.
그런 다음 발현된 변이체를 IgG 친화성 크로마토그래피 컬럼(GE)을 사용하여 발현 수준을 특성화하였다. 50mM Tris, 50mM 염화나트륨, pH 7.4의 용액을, 10% 고체에 도달할 때까지 수확된 세포의 ~2-3g 샘플에 첨가하였다. 혼합물은 turrax 회전식 균질기를 사용하여 균질화하였다. 균질화된 용액은 이어서 10,000PSI에서 3회 세포 균질화기(Microfluidics Model 110Y homogenizer)를 통과시켜 세포를 용해시켰다. 용해된 세포 용액을 4℃에서 30분 동안 20,000 x g에서 원심분리하여 청정화하였다. 상층액을 무게를 잰 멸균 용기에 붓고 순 질량을 기록하였다. 10% 용액을 만들기 위해 첨가된 초기 세포의 질량을 사용하여 상층액 농도 (상층액/세포 페이스트 g)를 계산하였다. IgG 친화성 컬럼에 로딩된 상층액의 양은 세포 페이스트 0.5g에서 얻은 상층액과 동일하도록 계산하였다. 크로마토그래피 공정은 각각 로드 및 용리 완충액으로 1X 인산염 완충 식염수 pH 7.4(PBS) 및 100mM 아세트산 pH 3.4(HAc)를 사용하였다. 컬럼은 3개의 컬럼 부피(CV)의 HAc로 결합된 임의의 물질들을 제거하고 10CV의 PBS로 평형화하였다. 미리 계산된 양의 상층액 샘플을 컬럼에 직접 로드한 다음 컬럼을 5 CV의 PBS로 세척하였다. 그런 다음 샘플은 5 CV의 HAc를 사용하여 용리시켰다. 그 후, 컬럼은 5 CV의 PBS로 평형화하였다. 용출 UV 피크의 면적은 자동 분획 적분을 사용하여 계산하고, 표적 리간드의 양은 폴리펩티드 소광 계수를 사용하여 계산하였다. 다음으로 표적 단백질의 이 양을, 표적 리간드 폴리펩티드 리간드 mg/세포 페이스트 g으로서 최종 표적 폴리펩티드 리간드 발현을 제공하도록 정규화하였다.
실시예 2
친화성 리간드의 정제
목적하는 가용성 친화성 리간드를 발현하는 세포를 완충액에 재현탁하고, 압력, 전단력 또는 초음파 처리를 포함할 수 있는, 화학적, 효소적 또는 기계적 수단을 사용하여 용해시켰다. 생성된 세포 용해물은 원심분리를 통한 정화, 심층 여과, DNA의 PEI 침전 또는 황산암모늄 또는 PEG를 통한 단백질의 분획화와 같은 다양한 수단을 통해 크로마토그래피를 위해 준비된다. 그런 다음 단백질 표적을 IMAC 친화성, 크기 배제, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 이들의 조합과 같은 크로마토그래피 기술을 통해 정제하였다. 완충액은 UFDF/TFF, 희석 또는 투석의 사용을 통해 단계들 간에 교환하여 pH 및/또는 이온 강도를 변경하거나 첨가제를 제거할 수 있다.
보다 구체적으로, 동결된 세포 페이스트는 50mM Tris, 50mM NaCl, pH 8.0 용액에 현탁되어 10-20% 고체 현탁액 용액을 생성하였다. 세포를 10,000psi에서 균질화기(Microfluidics Model 110Y homogenizer)를 통해 2-5회 통과시켜 세포 용해물 용액을 생성하였다. 0.25% PEI(w/v)를 용액에 첨가하고 30분 동안 혼합하였다. 용액은 후속적으로 4℃에서 15-30분 동안 15,000xg에서 원심분리하여, 청정화된 세포 용해물 용액을 생성하였다. 0.08g의 황산암모늄/mL의 청정화된 세포 용해물 용액을 첨가하고 멸균 여과 전에 30분 동안 혼합하였다. 생성된 용액은 후속적으로 실온에서 6 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 청정화된 세포 용해물 물질을 25mM Tris, 0.6M 황산암모늄, pH 8.0으로 평형화된 충전된 BAKERBONDTM polyHiPropyl 컬럼에 수지 1 ml당 세포 페이스트 1.0g의 농도로 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 25mM Tris, 0.6M 황산암모늄, pH 8.0의 10CV로 세척하였다. 컬럼은 후속적으로 1 CV에 걸쳐 100% 25mM Tris, 0.6M 황산암모늄, pH 8.0에서 100% 25mM Tris, pH 8.0의 구배를 사용하고 이어 100% 25mM Tris, pH 8.0의 추가 4 CV로 표적 폴리펩티드 리간드를 용리하도록 처리하였다. 그런 다음 물질을 25mM Tris, pH 9.0 용액 및 3-5kDa 분자량 컷 오프(MWCO) 한외여과/정용여과(UFDF) 멤브레인을 사용하여 5 - 10mg 총 단백질/mL의 최종 농도로 완충제 교환하였다. 완충제 교환 물질을 충전된 BAKERBONDTM PolyQuat 컬럼에 로딩하고 최대 20mg/ml의 수지 농도에서 25mM Tris, pH 9.0으로 평형화하였다. 컬럼을 후속적으로 5CV 25mM Tris, 25mM 아세트산나트륨, pH 9.0으로 세척하였다. 이어서, 로딩된 표적 단백질을 3CV에 걸쳐 25mM - 137mM 아세트산 나트륨, pH 9.0의 구배 용출에 이어 150mM 아세트산 나트륨, pH 9.0으로의 10CV 구배를 통해 컬럼으로부터 용리시켰다. 이후 표적 폴리펩티드 리간드는 3-5 MWCO 멤브레인을 사용하여 UFDF를 통해 1X PBS로 완충제 교환하였다. 정제 후, 친화성 리간드는 이황화 결합 형성을 확인하기 위한 질량 분석법으로 특성화하였다.
실시예 3
알데히드 기능화된 고체 지지체에 대한 리간드의 고정화
아가로스 수지 입자(20mL, 50 - 85μm), 에피클로로히드린(4.45 - 23.6g) 및 NaOH 수용액(20mL, 0.6 - 2.5M)을 50mL 원심분리 튜브에 혼합하고 35℃에서 4시간동안 200rpm 으로 기계식 진탕기에 두었다. 혼합물을 진탕기에서 제거하고, 프릿 유리 깔때기(중간 다공성)에서 여과하고 탈이온(DI)수 (40mL x 3), 50% 알코올/물 (40mL x 1), 알코올 (40mL x 2) 및 탈이온수 (40mL x 3)로 세척하였다. 그런 다음 수지를 H2SO4 수용액(pH = 2.5)으로 세척하고 H2SO4수용액으로 헹구어 100mL 튜브로 다시 옮겼다. 혼합물(~50mL)을 진탕기(60℃)에 넣고 밤새 ~225rpm에서 진탕하였다. 혼합물을 여과하고 탈이온수(20mL x 6)로 세척하고 100mL 튜브로 옮겼다. 과요오드산나트륨 용액(60mL, 0.4M)을 첨가하기 전에 수지를 침전시키고 조심스럽게 따라내고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하고 탈이온수로 세척하고 향후 사용을 위해 탈이온수로 냉장고에 보관하였다.
알데히드 기능화된 아가로스(1.5mL 수지)의 슬러리를 15mL 원심분리 튜브에 넣었다. 상층액을 제거하기 전에 500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 0.1M Na2HPO4 (pH = 6.7)에 용해된 2M 구아니딘 염산염 3ml를 수지에 첨가하고 혼합하고 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 슬러리를 동일한 염 용액을 사용하여 완충액을 두 번 더 교환하였다. 상층액을 제거하고 리간드(15 - 22.5 mg.)를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 수직 진탕기에서 3시간 동안 진탕한 후 0.1M Na2HPO4 (2mL, 100mg/mL, pH = 7) 중 NaBH3CN 을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진탕을 계속하였다. 이 슬러리를 물에 0.9 ml의 1% NH2EtOH 를 첨가한 후 1시간 동안 진탕하여 켄칭하였다. 이어서, 슬러리를 원심분리하고 상층액을 수집하여 HPLC에 의해 결합되지 않은 폴리펩티드의 양을 계산하였다. 이어서, 슬러리를 0.1M Na2HPO4 (pH = 7), 0.2M 아세테이트(pH = 3) 및 1x PBS(pH = 7.2)로 3회 세척하였다. 최종 수지는 1x PBS에 50% 용액으로 보관하고 4℃에서 보관하였다.
실시예 4
에폭시 기능화된 고체 지지체에 대한 리간드의 고정화
아가로스 수지 입자(20 mL, 50 - 85μm), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(2.8 - 8.4 g) 및 NaOH 수용액(20 mL, 0.6 M)을 50 mL 원심분리 튜브에 혼합하고 실온에서 4~8시간 동안 200rpm 으로 기계식 진탕기에 두었다. 혼합물을 진탕기에서 제거하고, 프릿 유리 깔때기(중간 다공성)에서 여과하고, 탈이온(DI)수 (20mL x 5), 50% 이소프로필 알코올/물 (50mL x 1), 이소프로필 알코올 (50mL x 3)로 세척하였다. 생성된 수지는 향후 사용을 위해 냉장고의 이소프로필 알코올에 보관하였다.
이소프로필 알코올 중의 에폭사이드 활성화 아가로스(1.5mL 수지)의 슬러리를 5분 동안 600rpm에서 15mL 원심분리 튜브에서 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 0.15M Na2CO3 (pH 11) 중의 1.2M Na2SO4 3.0 - 4.5 mL를 첨가하고 수지와 혼합하였다. 생성된 슬러리를 두 번째 완충제 교환 전에 500rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이 완충제 교환 과정을 3회 반복하고 아가로스 수지와 완충액의 최종 수지 부피를 ~1.8mL로 조심스럽게 조정하였다. 폴리펩티드 리간드(15 - 22.5 mg)를 첨가한 다음, 170 - 256 mg의 Na2SO4 및 24 - 36 mg의 Na2CO3를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 7 - 24시간 동안 진탕하였다. 슬러리를 원심분리하여 상층액을 수집하여 HPLC에 의해 결합된 리간드의 양을 계산하였다. 슬러리를 원심분리를 통해 4.5mL DI H2O 로 3회 세척하였다. 이후에 원심분리를 통해 4.5mL의 1x PBS (pH = 7.2)를 3회 사용하여 슬러리를 완충제 교환하였다. 최종 수지는 1x PBS 중에 50% 용액으로 유지하고 4℃에서 보관하였다.
실시예 5
동적 결합능(Dynamic Binding Capacity)
IgG에 결합하는 친화성 폴리펩티드 리간드로 기능화된 고체 지지체의 DBC를 2-8℃에서 평가하였다(도 1). 고정된 리간드가 포함된 1ml의 고체 지지체 수지를 1ml 컬럼에 패킹하고 1xPBS에서 평형화하였다. 10mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4, 137mM NaCl pH 7.4 완충액에서 제조된 2mg/ml IgG를, 0.125 ml/분, 0.167 ml/분, 0.25 ml/분 또는 0.5 ml/분에서, gG A280 max의 10%가 관찰될 때까지 컬럼에 로드하였다. 표적 IgG 단백질은 10CV에 대해 100mM 아세트산으로 용리되고, 10CV 1X PBS에서 재평형화되었다. 고체 지지체의 DBC는 먼저 10% 파과(breakthrough)에서 IgG 로드 부피에서 시스템 공극 부피를 뺀 다음 IgG 로드 용액의 농도를 곱하여 결정된다.
실시예 6
알칼리 안정성 분석
리간드가 고정화된 고체 지지체의 알칼리 안정성을, 0.1N, 0.5N 및 1.0N NaOH를 사용하여 2-8℃에서 측정하였다(도 2). 이들 실험에서, 고정된 리간드를 포함하는 고체 지지체는 먼저 실시예 5에 언급된 바와 같이 1X PBS로 평형화하고, IgG로 로딩하고, 1X PBS로 세척하고, 아세트산으로 처리하여 IgG를 용리시켰다. 아세트산으로 IgG를 용리시킨 후, 컬럼을 1X PBS로 평형화하고 후속적으로 0.1N, 0.5N 또는 1.0N NaOH로 처리하였다. 0.5N 또는 1.0N NaOH를 사용할 때, 15분 접촉 시간을 달성하기에 충분한 유속을 사용하여 알칼리 처리의 한 주기를 완료하였다. 0.1N NaOH를 사용할 때, 10CV를 수지 베드 위로 통과시킨 다음 60분 접촉 시간을 보장하기 위해 유속을 일시 중지하여 알칼리 처리의 한 주기를 완료하였다. 컬럼을 1X PBS 및 수산화나트륨으로 처리하는 과정을 고체 지지체의 총 10번의 알칼리 처리가 완료될 때까지 반복한다. 컬럼의 10 번의 알칼리 처리 주기 후, 고체 지지체를 1XPBS로 평형화하고, IgG를 로딩하고, 1X PBS로 세척하고, 아세트산으로 처리하고, 위에서 언급한 바와 같이 컬럼을 추가로 10회 PBS/NaOH 처리하였다. 이 과정은 0.1N NaOH와 0.5N NaOH를 사용하여 총 100번의 알칼리 처리 주기 동안 반복하였고, 1.0N NaOH를 사용하는 경우 총 50번의 알칼리 처리 주기 동안 반복하였다. 고체 지지체의 DBC는 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100번의 알칼리 처리 주기 후에 실시예 5에 기재된 바와 같이 결정하였다. 고체 지지체의 알칼리 안정성은 NaOH 처리 후 DBC의 손실을 통해 결정하였다.
실시예 7
알칼리 처리 동안 안정성을 증가시키는 첨가제
이 실시예는 펩타이드 친화성 리간드를 고정화하여 제조된 고체 지지체의 안정성 증가에 대한 첨가제의 효과를 설명한다.
도 3은 1.0M 에틸렌 글리콜 또는 1.0M 프로필렌 글리콜 또는 1.0M 수크로스의 첨가제를 2-8℃에서 1.0N NaOH 세정 용액과 함께 사용한 경우의 % DBC(동적 결합능)를 보여준다. 각 세정 주기는, 15분의 접촉 시간으로 고정된 리간드가 포함된 미리-포장된 컬럼 1ml를 통해 세정 용액 혼합물을 흐르게 함으로써 수행하였다. DBC는 세정 주기 10회마다 파과(breakthrough)의 10%에서 측정하였다.
컬럼을 1.0N NaOH 만으로 세정한 경우에는, 100 주기의 세정 후 DBC가 초기값의 80%로 감소하였다. 컬럼을 1.0M 에틸렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH 로 세정한 경우에는, 100 주기의 세정 후 DBC가 초기값의 90.3%로 감소하였다. 컬럼을 1.0M 프로필렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH 로 세정한 경우에는, 100 주기의 세정 후 DBC가 초기값의 89.2%로 감소하였다. 마지막으로, 컬럼을 1.0M 수크로스가 포함된 1.0N NaOH 로 세정한 경우에는, 100 주기의 세정 후 DBC가 초기값의 98.4%로 감소하였다. 이 데이터는, 1.0N NaOH를 사용한 세정 단계에서 첨가제를 사용할 때 수지의 안정성이 증가하고, 1.0N NaOH 단독으로 세정하는 것보다 남아 있는 동적 결합능이 더 높다는 것을 보여준다.
실시예 8
HCP 제거를 개선하기 위한, 세척 단계에서 아르기닌의 첨가
아르기닌 농도는 세척 단계에서 다양하게 하면서 숙주 세포 단백질(HCP)의 제거를 2-8℃에서 분석하였다. 고정화된 리간드 1ml를 패킹하고 1XPBS로 평형화하여 정제를 수행한 다음, 컬럼에 정제되지 않은 항체(공급 원료)를 로딩하고 1XPBS 또는 아르기닌이 포함된 1XPBS 혼합물로 세척하였다. 실시예 5에 기술된 바와 같이 컬럼을 통해 아세트산 용액을 흐르게 함으로써 용출을 수행하였다. 용출 풀을 HCP 농도에 대해 분석하였다. 도 4는 HCP 로그 감소 값(log reduction value, LRV)을 최대화하기 위해 1X PBS 세척 완충액에 아르기닌을 첨가한 효과를 보여준다. 1X PBS 완충액으로 세척 단계를 수행한 경우, HCP LRV는 3.22였으며, 아르기닌을 첨가하면 농도에 관계없이 LRV가 증가하였다. 아르기닌의 농도가 1M일 때 가장 유의한 효과가 관찰되었으며, 이때 LRV는 3.55로 증가하였다.
실시예 9
HCP 제거를 개선하기 위한, 첨가제 혼합물의 첨가
세척 단계에서 성분, pH 및 농도를 변화시키면서 숙주 세포 단백질(HCP)의 제거를 2-8℃에서 분석하였다. 1ml의 고정화된 리간드 컬럼을 패킹하고 1XPBS로 평형화하여 정제를 수행하였다. 컬럼에 IgG 공급원료를 로딩하고 1XPBS로 세척한 후 첨가제가 포함된 완충액으로 세척하고 1XPBS로 최종 세척하였다. 실시예 5에 기술된 바와 같이 컬럼을 통해 아세트산 완충액을 흐르게 함으로써 용출을 수행하였다. 용출 풀을 HCP 농도에 대해 분석하였다. 1XPBS가 세척 단계에 대조군으로 사용되된 경우, HCP LRV(log reduction value)가 3.49였다. 놀랍게도, 상이한 농도의 프로필렌 글리콜, 트윈 20, 구아니딘 HCl, 아르기닌, IPA, 우레아 및 이소프로판올을 첨가제로 사용하는 세척 단계가 단클론 항체의 수율에 영향을 미치지 않고 LRV를 증가시키는 것이 관찰되었다 (즉, 수지로부터 항체의 현저한 용출이 없고 수율이 95% 이상으로 유지됨). 결과 LRV로 테스트한 세척 첨가제 목록은 표 1에 나타내었다. LRV의 가장 현저한 증가는 pH 7.4에서 10% 이소프로판올, 3M 우레아의 첨가 혼합물에서 관찰되었으며, 이때 LRV는 3.82로 증가하였다.
| 세척 완충액 | HCP LRV |
| 대조군 (1x PBS, pH 7.4) | 3.49 |
| 1x PBS, 10% 프로필렌 글리콜, 1M 아르기닌, 1% tween 20, pH 7.4 | 3.65 |
| 1x PBS, 1M 구아니딘 HCl, pH 7.4 | 3.72 |
| 1x PBS 10% 프로필렌 글리콜, 1M 구아니딘 HCl, pH 7.4 | 3.76 |
| 1x PBS, 10% 프로필렌 글리콜, 1M 아르기닌, pH 7.4 | 3.66 |
| 1X PBS, 0.5M 아르기닌, pH 10 | 3.67 |
| 1X PBS, 1M 아르기닌, pH 7.4 | 3.65 |
| 1X PBS, 10% 이소프로판올, 1M 아르기닌, pH 7.4 | 3.81 |
| 1X PBS, 10% 이소프로판올, 1M 아르기닌, 1% 트윈20, pH 7.4 | 3.73 |
| 1X PBS, 1M 우레아, pH 7.4 | 3.61 |
| 1X PBS, 10% 이소프로판올, 1M 우레아, pH 7.4 | 3.67 |
| 1X PBS, 10% 이소프로판올, 2M 우레아, pH 7.4 | 3.77 |
| 1X PBS, 10% 이소프로판올, 2M 우레아, 1% 트윈20, pH 7.4 | 3.75 |
| 1X PBS, 10% 이소프로판올, 3M 우레아, pH 7.4 | 3.82 |
| 1X PBS, 10% 이소프로판올, 3M 우레아, 1% 트윈20, pH 7.4 | 3.81 |
서열목록의 통합
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폴리펩티드 친화성 리간드 서열목록
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Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe
145 150 155 160
Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn
165 170 175
Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp
180 185 190
Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr
195 200 205
Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys
210 215 220
Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln
225 230 235 240
Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val
260 265 270
Ala Gln Ser Lys
275
<210> 14
<211> 314
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNTHETIC SEQUENCE
<400> 14
Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile
20 25 30
Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln
35 40 45
Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu
50 55 60
Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala
65 70 75 80
Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His
85 90 95
Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile
100 105 110
Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg
115 120 125
Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe
145 150 155 160
Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn
165 170 175
Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp
180 185 190
Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr
195 200 205
Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys
210 215 220
Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln
225 230 235 240
Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val
260 265 270
Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu
275 280 285
His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser
290 295 300
Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Lys
305 310
<210> 15
<211> 353
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNTHETIC SEQUENCE
<400> 15
Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile
20 25 30
Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln
35 40 45
Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu
50 55 60
Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala
65 70 75 80
Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His
85 90 95
Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile
100 105 110
Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg
115 120 125
Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe
145 150 155 160
Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn
165 170 175
Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp
180 185 190
Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr
195 200 205
Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys
210 215 220
Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln
225 230 235 240
Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val
260 265 270
Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu
275 280 285
His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser
290 295 300
Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg
305 310 315 320
Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
325 330 335
Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser
340 345 350
Lys
<210> 16
<211> 391
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNTHETIC SEQUENCE
<400> 16
Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu
1 5 10 15
Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile
20 25 30
Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln
35 40 45
Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu
50 55 60
Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala
65 70 75 80
Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His
85 90 95
Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile
100 105 110
Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg
115 120 125
Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe
145 150 155 160
Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn
165 170 175
Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp
180 185 190
Cys Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr
195 200 205
Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys
210 215 220
Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln
225 230 235 240
Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val
260 265 270
Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu
275 280 285
His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser
290 295 300
Ile Arg Asp Asp Ala Val Ala Gln Ser Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg
305 310 315 320
Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
325 330 335
Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp Asp Cys Ala Val Ala Gln Ser
340 345 350
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro
355 360 365
Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp
370 375 380
Asp Ala Val Ala Gln Ser Lys
385 390
<210> 17
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNTHETIC SEQUENCE
<400> 17
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro
1 5 10 15
Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp
20 25 30
Asp
<210> 18
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNTHETIC SEQUENCE
<400> 18
Phe Asn Met Gln Cys Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro
1 5 10 15
Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Gln Ser Ile Arg Asp
20 25 30
Asp Cys
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SYNTHETIC SEQUENCE
<400> 19
Ala Val Ala Gln Ser
1 5
Claims (39)
1 내지 10개의 서브유닛-1 및 1 내지 10개의 서브유닛-2를 포함하는, 친화성 폴리펩티드 리간드로서,
상기 서브유닛-1은 서열번호 17과 약 90%의 동일성을 가지고, 상기 서브유닛-2는 서열번호 18과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 위치 5 및 34의 잔기가 시스테인이고, 상기 2개의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합이 존재하고; 및
상기 리간드는 2개 이상의 서브유닛-1 또는 2개 이상의 서브유닛-2 을 포함하고, 하나 이상의 서브유닛-1이 임의의 2개의 서브유닛-2 사이에 존재하는,
친화성 폴리펩티드 리간드.
상기 서브유닛-1은 서열번호 17과 약 90%의 동일성을 가지고, 상기 서브유닛-2는 서열번호 18과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 위치 5 및 34의 잔기가 시스테인이고, 상기 2개의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합이 존재하고; 및
상기 리간드는 2개 이상의 서브유닛-1 또는 2개 이상의 서브유닛-2 을 포함하고, 하나 이상의 서브유닛-1이 임의의 2개의 서브유닛-2 사이에 존재하는,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서브유닛-1과 서브유닛-1 사이, 및 서브유닛-1과 서브유닛-2 사이에 아미노산 스페이서를 포함하고, 상기 스페이서는 약 5 내지 20개의 잔기를 포함하는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서브유닛-1과 서브유닛-1 사이, 및 서브유닛-1과 서브유닛-2 사이에 아미노산 스페이서를 포함하고, 상기 스페이서는 약 5 내지 20개의 잔기를 포함하는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제2항에 있어서,
C-말단 아미노산 잔기가 리간드를 고체 지지체에 고정시키는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
C-말단 아미노산 잔기가 리간드를 고체 지지체에 고정시키는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 3과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 및 위치 125 및 154의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 3과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 및 위치 125 및 154의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 1과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 1과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 2와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77 및 위치 125 및 154의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 2와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77 및 위치 125 및 154의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 4와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 및 위치 202 및 231의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 4와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 및 위치 202 및 231의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 5와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 및 위치 202 및 231의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 5와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 및 위치 202 및 231의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 6과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 위치 202 및 231, 위치 279 및 308 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 6과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 위치 202 및 231, 위치 279 및 308 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 7과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 위치 202 및 231, 위치 279 및 308 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 7과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 위치 202 및 231, 위치 279 및 308 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 8과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 위치 202 및 231, 위치 279과 308, 및 위치 356과 385 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 8과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 위치 125 및 154, 위치 202 및 231, 위치 279과 308, 및 위치 356과 385 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 9와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 및 위치 87 및 116 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 9와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 및 위치 87 및 116 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 10과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 및 위치 87 및 116의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 10과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 및 위치 87 및 116의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 11과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 및 위치 164 및 193 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 11과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 및 위치 164 및 193 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 12와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 및 위치 164 및 193 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 12와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 및 위치 164 및 193 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 13과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 및 위치 241 및 270 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 13과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 및 위치 241 및 270 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 14와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 및 위치 241 및 270 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 14와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 및 위치 241 및 270 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 15와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 위치 241 및 270, 및 위치 318 및 347 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 15와 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 위치 241 및 270, 및 위치 318 및 347 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항에 있어서,
서열번호 16과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 위치 241 및 270, 및 위치 318 및 347 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
서열번호 16과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 10 및 39, 위치 87 및 116, 위치 164 및 193, 위치 241 및 270, 및 위치 318 및 347 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인,
친화성 폴리펩티드 리간드.
제1항의 폴리펩티드 리간드를 단리하는 방법으로서,
상기 폴리펩티드 리간드가 양이온성 첨가제, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제되는 것인, 방법.
상기 폴리펩티드 리간드가 양이온성 첨가제, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제되는 것인, 방법.
제1항의 친화성 폴리펩티드 리간드가 고정화된 다공성인 고체 지지체.
제21항에 있어서,
고체 지지체가 친화성 폴리펩티드 리간드가 부착된 알데히드 모이어티로 기능화된 것인, 고체 지지체.
고체 지지체가 친화성 폴리펩티드 리간드가 부착된 알데히드 모이어티로 기능화된 것인, 고체 지지체.
제21항에 있어서,
고체 지지체가 친화성 폴리펩티드 리간드가 부착된 에폭시 모이어티로 기능화된 것인, 고체 지지체.
고체 지지체가 친화성 폴리펩티드 리간드가 부착된 에폭시 모이어티로 기능화된 것인, 고체 지지체.
제21항에 있어서,
리간드가 서열번호 3과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 및 위치 125 및 154 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인, 고체 지지체.
리간드가 서열번호 3과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 위치 48 및 77, 및 위치 125 및 154 의 시스테인 잔기 사이에 형성되는 것인, 고체 지지체.
제21항에 있어서,
리간드가 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 폴리펩티드의 나선 성질을 안정화시키고, 상기 리간드가 고체 지지체에 결합된 것인, 고체 지지체.
리간드가 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16과 약 90% 이상의 동일성을 가지며, 이황화 결합이 폴리펩티드의 나선 성질을 안정화시키고, 상기 리간드가 고체 지지체에 결합된 것인, 고체 지지체.
제21항에 있어서,
지지체가 약 30 g/L 초과의 면역글로불린 단백질 분석물에 결합하는 것인, 고체 지지체.
지지체가 약 30 g/L 초과의 면역글로불린 단백질 분석물에 결합하는 것인, 고체 지지체.
제21항에 있어서,
지지체가 0.1M - 1.0M 수산화나트륨 알칼리성 세정 용액에 저항하는 것인, 고체 지지체.
지지체가 0.1M - 1.0M 수산화나트륨 알칼리성 세정 용액에 저항하는 것인, 고체 지지체.
제21항에 있어서,
지지체가 DNA, 내독소, 세포 배양 배지 성분 및 기타 비-단클론성 항체 단백질을 포함하는 숙주 세포 불순물을 제거하는 것인, 고체 지지체.
지지체가 DNA, 내독소, 세포 배양 배지 성분 및 기타 비-단클론성 항체 단백질을 포함하는 숙주 세포 불순물을 제거하는 것인, 고체 지지체.
분석물을 단리하는 방법으로서,
제21항의 고체 지지체를 통해 분석물을 함유하는 샘플을 도포하여 분석물을 지지체에 흡착시키는 단계; 및 흡착된 분석물을 지지체로부터 용리시키는 단계를 포함하는, 방법.
제21항의 고체 지지체를 통해 분석물을 함유하는 샘플을 도포하여 분석물을 지지체에 흡착시키는 단계; 및 흡착된 분석물을 지지체로부터 용리시키는 단계를 포함하는, 방법.
제29항에 있어서,
흡착된 분석물을 지지체로부터 용리하기 전에 완충제로 불순물을 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
흡착된 분석물을 지지체로부터 용리하기 전에 완충제로 불순물을 세척하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제29항에 있어서,
분석물이 면역글로불린인 방법.
분석물이 면역글로불린인 방법.
제30항에 있어서,
완충제가 첨가제를 함유하는 것인, 방법.
완충제가 첨가제를 함유하는 것인, 방법.
제32항에 있어서,
첨가제가 약 1% 내지 10% 프로필렌 글리콜; 약 0.1M 내지 1M 아르기닌; 약 0.1% 내지 1%의 트윈 20; 약 0.1M 내지 1M의 구아니딘 HCl; 약 1% 내지 10%의 IPA 및/또는 약 1M 내지 3M의 우레아를 포함하는 것인, 방법.
첨가제가 약 1% 내지 10% 프로필렌 글리콜; 약 0.1M 내지 1M 아르기닌; 약 0.1% 내지 1%의 트윈 20; 약 0.1M 내지 1M의 구아니딘 HCl; 약 1% 내지 10%의 IPA 및/또는 약 1M 내지 3M의 우레아를 포함하는 것인, 방법.
제21항의 고체 지지체를 세정하는 방법으로서,
상기 지지체가 약 1M 내지 2M 알칼리성 수산화나트륨을 포함하는 세정 용액과 접촉되는 것인, 방법.
상기 지지체가 약 1M 내지 2M 알칼리성 수산화나트륨을 포함하는 세정 용액과 접촉되는 것인, 방법.
제34항에 있어서,
세정 용액이 탄수화물, 폴리올, 글리콜 및 아미노산을 포함하는 것인, 방법.
세정 용액이 탄수화물, 폴리올, 글리콜 및 아미노산을 포함하는 것인, 방법.
제35항에 있어서,
탄수화물이 수크로스 및/또는 트레할로스인, 방법.
탄수화물이 수크로스 및/또는 트레할로스인, 방법.
제35항에 있어서,
글리콜이 에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜인, 방법.
글리콜이 에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜인, 방법.
제35항에 있어서,
아미노산이 아르기닌 및/또는 아세틸 아르기닌인, 방법.
아미노산이 아르기닌 및/또는 아세틸 아르기닌인, 방법.
제34항에 있어서,
세정 용액이 약 1.0M 에틸렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH; 약 1.0M 프로필렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH; 및 약 1.0M 수크로스가 포함된 1.0N NaOH 를 포함하는 것인, 방법.
세정 용액이 약 1.0M 에틸렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH; 약 1.0M 프로필렌 글리콜이 포함된 1.0N NaOH; 및 약 1.0M 수크로스가 포함된 1.0N NaOH 를 포함하는 것인, 방법.
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