CN109663384B - 基于nta的imac填料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用。该制备方法包括如下步骤：提供一种基质；在所述基质的表面构建醛基，得到表面具有醛基的基质；将醛基转化为α‑氨基羧酸，得到表面具有α‑氨基羧酸的基质；在所述表面具有α‑氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团，得到表面具有NTA基团的基质；以及将NTA基团与过渡金属离子螯合，得到基于NTA的IMAC填料。上述基于NTA的IMAC填料的制备方法，避免使用高成本原料，而且制备工艺清洁，纯化过程简单。

Description

基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及填料技术领域，特别是涉及一种基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用。

背景技术

固定化金属亲和层析的概念最早由Porath等人在1975年提出，其原理是基于固定在固相载体上的过渡金属离子如Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺等与组氨酸残基、半胱氨酸残基的亲和作用来分离目的蛋白。在Porath等人的著作发表之后，IMAC技术被广泛用于各种蛋白质和多肽的纯化应用。至今，Porath等人研究的用于固定金属离子到固相载体上的螯合配体亚氨基二乙酸(IDA)仍然被很多IMAC商品所使用。在1987年，Hochuli等人发明了改进的金属螯合配体次氮基三乙酸(NTA)，伴随着现代分子生物学和重组蛋白技术的高速发展，基于NTA配体的IMAC在纯化组氨酸标签(His-tagged)蛋白方面得到了很重要的应用。此外，Porath等人还发明了三羧甲基乙二胺(TED)作为新型的金属螯合配体。

众所周知，广泛用于IMAC的金属离子为Ni²⁺，其周围共有六个配位点供配体结合。在上述三种金属螯合配体中，IDA是三齿配体，即可以结合Ni²⁺周围的三个配位点，剩余的三个配位点中两个用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基，另一个用于和H₂O配位结合，因此，IDA对Ni²⁺的结合能力相对较弱，造成结合到介质上的Ni²⁺容易脱落，致使介质的性能不稳定。而NTA是四齿配体，即NTA可以结合Ni²⁺周围的四个配位点，剩余两个配位点用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基。相对于IDA，NTA可以充分利用Ni²⁺周围的配位点，增强对Ni²⁺的螯合能力，但又不会影响Ni²⁺对组氨酸标签蛋白的结合能力。此外，TED为五齿配体，即TED可以结合Ni²⁺周围的五个配位点，只剩余一个配位点用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基，导致Ni²⁺对组氨酸标签蛋白的结合能力下降，选择性减弱，因此在实际应用当中使用较少。

综上所述，NTA作为较理想的金属螯合配体，被广泛应用于IMAC技术进行组氨酸标签蛋白纯化。而制备基于NTA的IMAC填料的传统方法是通过N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸与微球基质偶联，螯合Ni²⁺的活性基团是NTA，而活性基团与微球之间的连接臂是氨基丁基基团。但这种方法最大的缺陷是N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸具有高昂的成本，严重阻碍基于NTA的IMAC填料的工业化应用。

发明内容

基于此，有必要针对制备基于NTA的IMAC填料的原料成本高昂的问题，提供一种基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用。

一种基于NTA的IMAC填料的制备方法，包括如下步骤：

提供一种基质；

在所述基质的表面构建醛基，得到表面具有醛基的基质；

将醛基转化为α-氨基羧酸，得到表面具有α-氨基羧酸的基质；

在所述表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团，得到表面具有NTA基团的基质；以及

将NTA基团与过渡金属离子螯合，得到基于NTA的IMAC填料。

上述基于NTA的IMAC填料的制备方法，一方面，采用低成本原料，避免了使用N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸合成IMAC填料带来的高昂成本，同时在利用醛基制备具有α-氨基羧酸基团时避免了使用剧毒的氰化物，提供了一种清洁工艺；另一方面，在制备过程中利用简单的过滤方法去除溶剂、未反应完的试剂、催化剂等杂质；此外，该制备方法还避免传统方法合成NTA基团时遇到的基团保护与脱保护、分离纯化难等问题。

在其中一个实施例中，所述基质为表面含有羟基的聚合物基质或者表面含有环氧基的聚合物基质。

在其中一个实施例中，所述聚合物基质选自聚甲基丙烯酸酯微球和聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种。

在其中一个实施例中，所述将醛基转化为α-氨基羧酸的步骤为：通过相转移催化剂催化醛基与氯仿、氨气在碱性条件下反应，将醛基转化为α-氨基羧酸。

在其中一个实施例中，所述将醛基转化为α-氨基羧酸的步骤为：

以每100g表面具有醛基的基质计，将表面具有醛基的基质置于反应容器中，加入100ml-120ml二氯甲烷和2.0g-2.5g TEBAC，搅拌并控制温度为0℃-4℃；向反应容器中通入氨气30min-40min，之后加入30g-35g氢氧化钾、7g-9g氯化锂和50mL-60mL浓氨水配成的溶液，搅拌并控制温度为0℃-4℃；继续通入氨气，滴加16g-20g氯仿和40mL-60mL二氯甲烷配成的溶液，控制滴加速度在1h-1.5h内滴完，搅拌并控制温度为0℃-4℃，反应11h-12h；反应结束后将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有α-氨基羧酸的基质。

在其中一个实施例中，在所述表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团的步骤为：将表面具有α-氨基羧酸的基质与α-溴代乙酸在碱性、0℃-10℃温度下发生亲和取代反应，形成单取代产物；之后将温度升至室温继续反应，形成双取代产物，得到表面具有NTA基团的基质。

在其中一个实施例中，在所述表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团的步骤为：

以每100g表面具有α-氨基羧酸的基质计，将表面具有α-氨基羧酸的基质置于反应容器中，加入100mL-110mL的1.8M-2.1M NaOH，搅拌并控制温度为0℃-10℃；之后逐滴加入用100mL-110mL的1.8M-2.1M NaOH和27g-28gα-溴代乙酸配成的溶液，搅拌并控制温度为0℃-10℃，反应2h-3h；之后，在室温条件下，搅拌、反应16h-18h；反应结束后，将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有NTA基团的基质。

在其中一个实施例中，所述过渡金属离子选自Ni²⁺、Co²⁺和Cu²⁺中的一种。

一种基于NTA的IMAC填料，由所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法制备而成。

上述基于NTA的IMAC填料，采用所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法制备而成，避免了使用N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸合成IMAC带来的高昂成本，而且制备工艺清洁，纯化过程简单。

一种基于NTA的IMAC填料在组氨酸标签蛋白纯化的应用。

上述基于NTA的IMAC填料应用于组氨酸标签蛋白纯化，能够实现工业化应用。

附图说明

图1为本发明一实施方式的一种基于NTA的IMAC填料的制备方法的流程图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请参见图1，本发明一实施方式的一种基于NTA的IMAC填料的制备方法，包括如下步骤：

S10、提供一种基质。

优选地，基质为表面含有羟基的聚合物基质或者表面含有环氧基的聚合物基质。聚合物基质的表面含有羟基或环氧基，便于进行下一步的反应。

优选地，聚合物基质选自聚甲基丙烯酸酯微球和聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种。

S20、在基质的表面构建醛基，得到表面具有醛基的基质。如式(1)所示：

SP-R-CHO

式(1)

其中，SP代表基质，R代表基质与醛基之间的连接臂。

优选地，当基质为表面含有羟基的聚合物基质时，在基质的表面构建醛基的方法为：

表面含有羟基的聚合物基质与乙二醇二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚等两端含有双环氧基团的长链化合物在碱性条件下反应，过滤洗涤后，在酸性条件下水解得到表面含有二醇结构的基质，之后将表面含有二醇结构的基质与0.2M高碘酸钠溶液在室温下反应1h-3h，得到表面具有醛基的聚合物基质。

具体的步骤为：以每100g表面含有羟基的聚合物基质计，将表面含羟基的聚合物基质置于反应容器中，加入100mL-110mL的0.5M-0.6M NaOH溶液(含有2mg/mL NaBH₄)，接着加入100mL-110mL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在37℃-40℃的温度下，搅拌反应3h-4h，反应结束后将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性。接着将得到的固体产物置于反应容器中，加入250mL-300mL的0.5M-0.6M H₂SO₄溶液，在20℃-60℃的温度下，搅拌反应2h，反应结束后将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性。接着将得到的固体产物置于反应容器中，加入100mL-110mL的0.1M-0.2M NaIO₄溶液，在室温条件下，搅拌反应1h-2h，反应结束后将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有醛基的聚合物基质。

优选地，当基质为表面含有环氧基的聚合物基质时，在基质的表面构建醛基的方法为：

表面含有环氧基的聚合物基质在弱碱性条件下与氨基葡萄糖的氨基发生环氧基开环反应，将氨基葡萄糖自有的醛基偶联到聚合物基质的表面。

具体的步骤为：以每100g表面含有环氧基的聚合物基质计，将表面含有环氧基的聚合物基质置于反应容器中，加入130mL-150mL的0.1M-0.15M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，调节混合液的pH为10-10.5，接着加入89.6g-91g氨基葡萄糖，控制温度为70℃-80℃，搅拌反应16h-20h，反应结束后将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有醛基的聚合物基质。

此外，在基质的表面构建醛基，得到表面具有醛基的基质的方式并不限于上述两种，任意可实现在基质的表面构建醛基的方式都可以。

S30、将醛基转化为α-氨基羧酸，得到表面具有α-氨基羧酸的基质。如式(2)所示：

优选地，将醛基转化为α-氨基羧酸的步骤为：通过相转移催化剂催化醛基与氯仿、氨气在碱性条件下反应，醛基转化为α-氨基羧酸。反应机理如式(3)所示：

具体的，将醛基转化为α-氨基羧酸的步骤为：

以每100g表面具有醛基的基质计，将所述表面具有醛基的基质置于反应容器中，加入100ml-120ml二氯甲烷和2.0g-2.5g TEBAC(苄基三乙基氯化铵)，搅拌并控制温度为0℃-4℃；向反应容器中通入氨气30min-40min，之后加入30g-35g氢氧化钾、7g-9g氯化锂和50mL-60mL浓氨水配成的溶液，搅拌并控制温度为0℃-4℃；继续通入氨气，滴加16g-20g氯仿和40mL-60mL二氯甲烷配成的溶液，控制滴加速度在1h-1.5h内滴完，搅拌并控制温度为0℃-4℃，反应11h-12h；反应结束后将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有α-氨基羧酸的基质。

S40、在表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团，得到表面具有NTA基团的基质。

优选地，在表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团的步骤为：将表面具有α-氨基羧酸的基质与α-溴代乙酸在碱性、0℃-10℃温度下发生亲和取代反应，形成单取代产物，之后将温度升至室温继续反应，形成双取代产物，即得表面具有NTA基团的基质。如式(4)所示：

反应机理如式(5)所示：

具体的，在表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团的步骤为：

以每100g表面具有α-氨基羧酸的基质计，将表面具有α-氨基羧酸的基质置于反应容器中，加入100mL-110mL的1.8M-2.1M NaOH，搅拌并控制温度为0℃-10℃；之后逐滴加入用100mL-110mL的1.8M-2.1M NaOH和27g-28gα-溴代乙酸配成的溶液，搅拌并控制温度为0℃-10℃，反应2h-3h；之后，在室温条件下，搅拌、反应16h-18h；反应结束后，将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有NTA基团的基质。

S50、将NTA基团与过渡金属离子螯合，得到基于NTA的IMAC填料。

优选地，过渡金属离子选自Ni²⁺、Co²⁺和Cu²⁺中的一种。

具体的，将NTA基团与过渡金属离子螯合的步骤为：将具有NTA基团的基质与过渡金属盐溶液混合，之后用3M-3.2M NaOH调节混合液的pH大于7.5，在室温条件下搅拌反应1h-3h，即得基于NTA的IMAC填料。

上述基于NTA的IMAC填料的制备方法，一方面，采用低成本原料，避免了使用N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸合成IMAC填料带来的高昂成本，同时在利用醛基制备具有α-氨基羧酸基团时避免了使用剧毒的氰化物，提供了一种清洁工艺；另一方面，在制备过程中利用简单的过滤方法去除溶剂、未反应完的试剂、催化剂等杂质；此外，该制备方法还避免传统方法合成NTA基团时遇到的基团保护与脱保护、分离纯化难等问题。

本发明一实施方式的一种基于NTA的IMAC填料，由所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法制备而成。

上述基于NTA的IMAC填料，采用所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法制备而成，避免了使用N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸合成IMAC带来的高昂成本，而且制备工艺清洁，纯化过程简单。

本发明一实施方式一种所述的基于NTA的IMAC填料在组氨酸标签蛋白纯化的应用。

上述基于NTA的IMAC填料应用于组氨酸标签蛋白纯化，能够实现工业化应用。

下面为具体实施方式：

实施例1

本实施例中采用的聚甲基丙烯酸酯微球，型号为Monomix MC30(粒径为30μm，孔径为100nm，表面含有大量羟基，颜色为白色)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司自行制备。其余原料均为市售。

用天平称取100g聚甲基丙烯酸酯微球，转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL的0.6M NaOH溶液(含有2mg/mL NaBH₄)，接着加入100mL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在37℃的温度下，100rpm机械搅拌反应4h，反应结束后将反应液用布氏漏斗抽干，保留固体产物，无水乙醇洗涤3次，去离子水洗涤至中性。之后将得到的固体产物加入至1000mL三口烧瓶中，加入300mL的0.5M H₂SO₄溶液，在50℃的温度下，100rpm机械搅拌反应2h，反应结束后将反应液用布氏漏斗抽干，保留固体产物，去离子水洗涤至中性。之后将得到的固体产物转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL的0.2M NaIO₄溶液，室温条件下，100rpm机械搅拌反应1h，反应结束后将反应液用布氏漏斗抽干，保留固体产物，去离子水洗涤5次，得到表面具有醛基的聚甲基丙烯酸酯微球。

将上述步骤得到的表面具有醛基的聚甲基丙烯酸酯微球转移至500mL三口烧瓶中，并将其置于冷阱中，加入100mL二氯甲烷和2.3g TEBAC，100rpm机械搅拌并控制温度为0℃。之后向反应容器中通入氨气30min，之后加入33.6g KOH、8.5g LiCl和56mL浓氨水配成的溶液，搅拌并控制温度为0℃。继续通入氨气，滴加18g氯仿和50mL二氯甲烷配成的溶液，调节滴加速度在1.5h内滴完，搅拌并控制温度为0℃，反应12h；反应结束后用布氏漏斗抽干，保留固体产物，无水乙醇洗涤3次，去离子水洗涤至中性，得到表面具有α-氨基羧酸的聚甲基丙烯酸酯微球。

将上述步骤得到的表面具有α-氨基羧酸的聚甲基丙烯酸酯微球转移至500mL三口烧瓶中，并将其置于冷阱中，加入100mL的2M NaOH，100rpm机械搅拌并控制温度为0℃；逐滴加入用100mL的2M NaOH和27.8gα-溴代乙酸配成的溶液，控制温度为0℃，100rpm机械搅拌反应2h。撤去冷阱，在室温条件下，100rpm机械搅拌继续反应16h，反应结束后反应结束后用布氏漏斗抽干，保留固体产物，无水乙醇洗涤3次，去离子水洗涤至中性，得到表面具有NTA基团的聚甲基丙烯酸酯微球。

将上述步骤得到的表面具有NTA基团的聚甲基丙烯酸酯微球转移至1000mL三口烧瓶中，加入400mL去离子水，50mL 1M NiSO₄水溶液，之后用3MNaOH调节混合液的pH大于7.5，在室温条件下，100rpm机械搅拌反应1h，反应结束后用布氏漏斗抽干，然后用400mL去离子水洗涤3次并分别收集滤液，保留固体产物，得到基于NTA的IMAC填料。

本实施例制备得到的IMAC填料的颜色为绿色，表明该填料制备成功。另外，采用紫外分光光度计分别测上述3次收集的滤液在390nm波长处的吸光度，利用标准曲线法估测IMAC填料螯合Ni²⁺的量为41μmol/mL。

实施例2

本实施例中采用的聚甲基丙烯酸酯微球，型号为Monomix MC30-Epoxy(粒径为30μm，孔径为100nm，表面含有环氧基，颜色为白色)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司自行制备。其余原料均为市售。

用天平称取100g聚甲基丙烯酸酯微球，转移至500mL三口烧瓶中，加入150mL 0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，调节混合液的pH为10.5，接着加入89.6g氨基葡萄糖，控制温度为70℃，100rpm机械搅拌反应16h，反应结束后用布氏漏斗抽干，保留固体产物，去离子水洗涤5次，得到表面具有醛基的聚甲基丙烯酸酯微球。

其余实验步骤与实施例1中相对应的实验步骤一致，得到基于NTA的IMAC填料。

本实施例制备得到的IMAC填料的颜色为绿色，表明该填料制备成功。另外，采用紫外分光光度计分别测3次收集的滤液在390nm波长处的吸光度，利用标准曲线法估测IMAC填料螯合Ni²⁺的量为45μmol/mL。

实施例3

本实施例中采用的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球，型号为PolyRP-OH-15-1000(粒径为15μm，孔径为100nm，表面含有大量羟基，颜色为白色)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司自行制备。其余原料均为市售。

本实施例实验步骤同实施例1，得到基于NTA的IMAC填料。

本实施例制备得到的IMAC填料的颜色为绿色，表明该填料制备成功。另外，采用紫外分光光度计分别测3次收集的滤液在390nm波长处的吸光度，利用标准曲线法估测IMAC填料螯合Ni²⁺的量为35μmol/mL。

实施例4

本实施例中采用的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球，型号为PolyRP-Epoxy-15-1000(粒径为15μm，孔径为100nm，表面含有环氧基，颜色为白色)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司自行制备。其余原料均为市售。

本实施例实验步骤同实施例2。得到基于NTA的IMAC填料。

本实施例制备得到的IMAC填料的颜色为绿色，表明该填料制备成功。另外，采用紫外分光光度计分别测3次收集的滤液在390nm波长处的吸光度，利用标准曲线法估测IMAC填料螯合Ni²⁺的量为40μmol/mL。

需要说明的是，本发明中其他可任意组合的实施例均可以实施，并不限于上述4个实施例。此外，本发明的基于NTA的IMAC填料的制备方法除了可以采用上述苏州赛分科技有限公司自行制备的基质外，其他市售的基质亦可以实施。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供一种基质；

在所述基质的表面构建醛基，得到表面具有醛基的基质；

通过相转移催化剂催化所述醛基与氯仿、氨气在碱性条件下反应，将所述醛基转化为α-氨基羧酸，得到表面具有α-氨基羧酸的基质；

将所述表面具有α-氨基羧酸的基质与α-溴代乙酸在碱性、0℃-10℃温度下发生亲核取代反应，形成单取代产物；之后将温度升至室温继续反应，形成双取代产物，得到表面具有NTA基团的基质；以及

将NTA基团与过渡金属离子螯合，得到基于NTA的IMAC填料。

2.根据权利要求1所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，所述基质为表面含有羟基的聚合物基质或者表面含有环氧基的聚合物基质。

3.根据权利要求2所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，当基质为表面含有羟基的聚合物基质时，在基质的表面构建醛基的方法为：

将表面含有羟基的聚合物基质与两端含有双环氧基团的长链化合物在碱性条件下反应，过滤洗涤后，在酸性条件下水解得到表面含有二醇结构的基质，之后将表面含有二醇结构的基质与0.2M高碘酸钠溶液在室温下反应1h-3h，得到表面具有醛基的聚合物基质。

4.根据权利要求2所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，当基质为表面含有环氧基的聚合物基质时，在基质的表面构建醛基的方法为：

将表面含有环氧基的聚合物基质在弱碱性条件下与氨基葡萄糖的氨基发生环氧基开环反应，将氨基葡萄糖自有的醛基偶联到聚合物基质的表面。

5.根据权利要求2所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，所述聚合物基质选自聚甲基丙烯酸酯微球和聚苯乙烯-二乙烯基苯微球中的一种。

6.根据权利要求1所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，所述将醛基转化为α-氨基羧酸的步骤为：

以每100g表面具有醛基的基质计，将表面具有醛基的基质置于反应容器中，加入100ml-120ml二氯甲烷和2.0g-2.5g TEBAC，搅拌并控制温度为0℃-4℃；向反应容器中通入氨气30min-40min，之后加入30g-35g氢氧化钾、7g-9g氯化锂和50mL-60mL浓氨水配成的溶液，搅拌并控制温度为0℃-4℃；继续通入氨气，滴加16g-20g氯仿和40mL-60mL二氯甲烷配成的溶液，控制滴加速度在1h-1.5h内滴完，搅拌并控制温度为0℃-4℃，反应11h-12h；反应结束后将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有α-氨基羧酸的基质。

7.根据权利要求1所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，在所述表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团的步骤为：

以每100g表面具有α-氨基羧酸的基质计，将表面具有α-氨基羧酸的基质置于反应容器中，加入100mL-110mL的1.8M-2.1M NaOH，搅拌并控制温度为0℃-10℃；之后逐滴加入用100mL-110mL的1.8M-2.1M NaOH和27g-28gα-溴代乙酸配成的溶液，搅拌并控制温度为0℃-10℃，反应2h-3h；之后，在室温条件下，搅拌、反应16h-18h；反应结束后，将反应液过滤，保留固体产物，洗净并洗至中性，得到表面具有NTA基团的基质。

8.根据权利要求1所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法，其特征在于，所述过渡金属离子选自Ni²⁺、Co²⁺和Cu²⁺中的一种。

9.一种基于NTA的IMAC填料，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的基于NTA的IMAC填料的制备方法制备而成。

10.一种权利要求9所述的基于NTA的IMAC填料在组氨酸标签蛋白纯化的应用。

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