ES2248936T3 - Procedimiento y dispositivo para descomponer material biologico. - Google Patents
Procedimiento y dispositivo para descomponer material biologico.Info
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Abstract
Un molino vibrante de bolas que tiene recipientes que se van a sujetar a él en un soporte (10) en forma de U que tiene dos brazos (13) de retención opuestos, en el que estos recipientes están construidos como bloques (16) multi-pocillos que tienen una pluralidad de cámaras de molienda (Pocillos (18)) incorporados y que se cierran por medio de una tapadera situada sobre el bloque (16) multi-pocillos, y en el que además uno de los brazos (13) de retención está montado de forma movible para sujetar el recipiente y que tiene un tornillo (14) de sujeción y ajuste, y en el que los medios individuales de molienda están situados en los recipientes con el fin de suministrar energía para el proceso de trituración, caracterizado porque los bloques (16) multi-pocillos son bloque multi-pocillos uniformes que se adaptan se forma que se puedan asegurar, mediante un ajuste por entrecruzamiento, en el soporte que tiene medios (10) para impedir la rotación mediante levas (20) integrantes que sobresalen por encima del plano de los bloques multi-pocillos, y en el que los brazos (13) de retención del soporte (10) que tiene cada uno un encastre (15) que se corresponde, en profundidad, con la altura de las levas, para recibir las levas de forma entrecruzada.
Description
Procedimiento y dispositivo para descomponer
material biológico.
El análisis de materiales biológicos, que en
particular usan métodos basados en ácidos nucleicos, se está
haciendo cada vez más importante en muchos campos, particularmente
en la investigación médica y biológica básica y, especialmente, en
aplicaciones tales como los diagnósticos moleculares o la cría de
animales y la horticultura.
Con el fin de poder analizar materiales
biológicos, ante todo el material de la muestra biológica se tiene
que descomponer. Ante todo, se tiene que destruir la estructura
celular con el fin de permitir que se aíslen las moléculas
biológicas. Los materiales de partida, tales como plantas,
bacterias, o levaduras, además, tienen una pared celular muy
resistente que hace incluso más difícil liberar las moléculas que se
va a analizar, en particular ácidos nucleicos y/o proteínas.
Un procedimiento adecuado para descomponer estos
materiales, se asegurará de que las muestras se puedan descomponer
muy rápidamente, si es posible en unos pocos segundos, y al mismo
tiempo de una forma muy eficaz. Esto es particularmente importante
al aislar los ácidos nucleicos, en particular el ARN, ya que muchos
métodos de análisis de expresión de los genes requieren el
aislamiento cuantitativo del ácido nucleico intacto, en particular
el ARN. El ARN es un material que se degrada muy rápidamente después
de la destrucción de la estructura celular y es, por lo tanto,
imposible de analizar cuando se usan métodos de descomposición
inadecuadamente lentos.
En el documento DE 19755960 se ha puesto de
manifiesto un procedimiento para la descomposición de materiales
biológicos y la extracción, con altos rendimientos, de ingredientes
celulares, como el ácido nucleico, en el que se descompondrá el
material biológico, por ejemplo células de animales o de plantas, en
estado sólido en presencia de una sustancia sólida que se
desnaturaliza, por ejemplo urea, hidrocloruro de guanidinio o
sulfato de amonio.
Numerosas aplicaciones de análisis basados en los
ácidos nucleicos, tal como la tipificación de tejidos, la
investigación de nuevos ingredientes farmacéuticos activos o el
control de calidad de semillas, se caracterizan por una alta
capacidad de procesamiento de muestras y el uso de pequeñas
cantidades de material de partida. Para muchas aplicaciones de alta
capacidad de procesamiento, el procedimiento de descomposición de la
muestra biológica es la etapa limitante, puesto que ya hay sistemas
automatizados para tratar más la muestra, una vez que se ha
descompuesto, por ejemplo el BioRobot hecho por QIAGEN.
En la técnica anterior se describen diversos
procedimientos de descomposición mecánica. En el documento US
5.707.861 se da a conocer un dispositivo para la descomposición de
células, en el que la célula será agitada por sacudidas, mediante el
dispositivo, en presencia de cuentas de vidrio. Otro dispositivo
para la descomposición de células, conocido a partir de la técnica
anterior, se da a conocer en el documento WO 98/20164. En el
dispositivo descrito, se moverá un pistilo magnetizable en el
recipiente mediante un electroimán hasta la descomposición mecánica
de las células.
Un aparato semejante está descrito en el folleto
comercial de los solicitantes, Retsch,"Vibration Mill
("Schwingmüller") MM 2000" (Molino de vibración), en la
medida en que discute la descomposición de células biológicas; se
pueden sujetar en el soporte del molino vibrante de bolas,
dispositivos de soporte para sostener cinco o diez tubos de reacción
de un único uso; con el fin de descomponer el material biológico los
tubos de ensayo se insertan en el dispositivo de soporte y se coloca
al menos una cuenta de vidrio en cada tubo de ensayo individual. La
base de sustentación facilitada en el molino vibrante de bolas para
sujetar en su sitio el dispositivo de soporte o, si el molino
vibrante de bolas se usa para otros fines de molienda, para sujetar
vasos de molienda adecuados, consiste en un bastidor en forma de U
con una placa base unida a la transmisión del molino vibrante de
bolas y con dos brazos planos de retención opuestos, que sustentan
el dispositivo de soporte o el vaso de molienda entre ellos, uno de
los cuales se monta de forma que se mueva y puede ser dirigido
mediante un tornillo de sujeción y ajuste a un estribo de reunión en
el dispositivo de soporte o en el vaso de molienda.
Este conocido aparato tiene el inconveniente de
que la descomposición de los materiales biológicos no es
reproducible en lotes diferentes y, por lo tanto, no se pueden
evaluar con suficiente precisión, en la medida en que el respectivo
dispositivo de soporte no puede ser sujetado exactamente en la misma
posición entre los brazos del soporte de la base de sustentación y
pueden cambiar su posición, aunque ligeramente, incluso durante un
proceso de descomposición, dependiendo de la tensión aplicada
mediante el tornillo de sujeción y ajuste; sin embargo, la posición
del eje del dispositivo de soporte no está, por ello, fija en
relación espacial con la transmisión del molino vibrante de bolas.
Sin embargo, ya que la amplitud del movimiento oscilatorio que actúa
sobre el dispositivo de soporte durante la descomposición se ajusta,
ella misma, en función de la relación espacial del eje del
dispositivo de soporte respecto a la transmisión, se ponen
diferentes cantidades de energía en los medios de molienda con
diferentes fuerzas de sujeción o con fuerzas de sujeción variables,
lo que significa que el material biológico se descompone en
diferentes medidas. Un inconveniente más es que la capacidad de
descomposición, para un lote de cinco o diez tubos, es por diseño
demasiado pequeña.
Basándose en la técnica anterior surge una
demanda de descomposición simultánea de más de diez muestras. Son
bien conocidos por parte de los expertos, dispositivos para la
recepción por separado de más de diez muestras, por ejemplo placas
multi-pocillos. También, por la técnica anterior, se
conoce la aplicación en dispositivos técnicos, por ejemplo la
aplicación de placas multi-pocillos en una
centrifugadora, dada a conocer en el documento DE 2230624.
Es particularmente importante una alta capacidad
de procesamiento de muestras para usarlas en métodos de análisis y
procedimientos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos. Además,
el procedimiento de descomposición deberá evitar la contaminación
por cruzamiento.
Hasta ahora, la técnica anterior no ha descrito
ningún procedimiento de descomposición que permita la descomposición
rápida, eficaz y simultánea de más de diez muestras, tan exentas de
contaminación por cruzamiento como sea posible.
El objeto de la presente invención es, por lo
tanto, proporcionar un método mecánico de descomposición rápida y
eficaz, que incluya un dispositivo adecuado para este fin, que
permita que más de diez muestras sean sometidas a descomposición
simultánea, rápida y eficaz, tan exenta de contaminación por
cruzamiento como sea posible.
Este problema se resuelve según la invención
mediante el dispositivo descrito en la reivindicación 1, y mediante
el procedimiento relatado en la reivindicación 11, como se describe
con más detalle de aquí en adelante. En las subrreivindicaciones se
relatan realizaciones preferidas del procedimiento según la
invención y el dispositivo según la invención.
Los términos "material biológico" o
"muestras biológicas", con fines de la presente invención,
indican a todos lo materiales que son producidos por organismos
biológicos o se pueden aislar a partir de ellos; en particular,
indican materiales que contienen ácidos nucleicos y/o proteínas. El
término "material biológico" o "muestra biológica" incluye
muestras no tratadas o pretratadas, por ejemplo plasma, fluidos
corporales, en particular sangre, esputos, orina, heces, esperma,
células o cultivos de células, suero, fracciones de leucocitos,
frotis, muestras de tejidos de todas las clases, plantas y partes de
plantas, microorganismos tales como bacterias, virus tales como el
citomegalovirus, VIH, virus de la hepatitis B, hepatitis C,
hepatitis \delta, levaduras, brotes de gérmenes, hongos,
materiales de muestras exentas de células, etc. El término
"muestra biológica" incluye también tanto una mezcla de las
muestras anteriormente mencionadas, tales como plantas infectadas
con hongos, como sangre humana completa que contenga micobacterias,
así como muestras de alimentos que contengan ácidos nucleicos libres
o unidos, o células que contengan ácidos nucleicos. Muestras
ambientales que contengan ácidos nucleico libres o unidos, o células
que contengan ácidos nucleicos. Las muestras biológicas pretratadas
pueden ser, por ejemplo, tratadas térmicamente, congeladas, secadas,
etc, o tratadas químicamente, por ejemplo fijadas en productos
químicos adecuados tales como formalina, alcohol, etc.
El término "ácidos nucleicos" para los fines
de la presente invención incluye todas las posibles clases de ácidos
nucleicos, tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN), ácidos
nucleicos de todas las longitudes y configuraciones, tales como ARN
y ADN virales, bacterianos y de plásmidos, de doble cadena, de
cadena sencilla, circulares y lineales, ramificados, etc., así como
ADN y ARN genómicos u otros no genómicos, procedentes de células de
animales y plantas u otras eucariotas, t-ARN,
m-ARN en forma tratada y sin tratar,
hn-ARN, rARN y cADN y todos los otros ácidos
nucleicos concebibles. Además, dentro del alcance de la presente
invención, la definición incluye una muestra que contiene ácido
nucleico o una muestra o mezcla de muestras que contienen ácido
nucleico, que se pueden usar como aductos adecuados para
"aplicaciones aguas abajo" tales como transcripciones in
Vitro, reacciones PCR o síntesis del cADN.
El molino vibrante de bolas pensado para
utilizarlo en bloques multi-pocillos está basado en
un molino vibrante de bolas que tiene recipientes que se van a
sujetar a él, en un soporte en forma de U que tiene dos brazos de
retención opuestos, que tiene montado uno de los brazos de retención
de forma movible para sujetar el recipiente y que tiene un tornillo
de sujeción y ajuste, y en el que los medios de molienda individual
están situados en los recipientes con el fin de suministrar energía
para los procesos de trituración. El concepto subyacente de la
invención es que los recipientes de molienda están construidos como
bloques uniformes de pocillos con una pluralidad de cámaras de
molienda incorporadas a ellos y cerrados por medio de una tapadera
situada sobre el bloque de pocillos o por medio de una pluralidad de
de tapaderas y los bloques de pocillos se pueden asegurar mediante
un ajuste por entrecruzamiento, en el soporte, que tiene medios para
impedir la rotación mediante levas que sobresalen por encima de los
bloques de pocillos, y en los que los brazos de retención del
soporte tienen, cada uno, un encastre que se corresponde en
profundidad con la altura de las levas, para recibir las levas de
forma entrecruzada.
Los bloques de pocillos que tienen diferentes
números y configuraciones de cámaras receptoras (pocillos),
proporcionados en la presente memoria descriptiva, son conocidos
como recipientes de almacenamiento y recipientes de reacción para
muestras de material biológico, por ejemplo del folleto comercial
"Qiagen Product Guide 1997, página 135" expedido por QIAGEN
GMBH de Hilden. Estos bloques de pocillos que pueden contener 96
pocillos, por ejemplo, están hecho de plásticos de paredes delgadas
moldeadas por inyección y se pueden cerrar usando una lámina de
papel de aluminio situado sobre ellos a modo de cubierta.
Una ventaja de la invención es que el bloque de
pocillos que se ha usado hasta ahora, únicamente con fines de
almacenamiento, pueden por sí mismo actuar como recipientes, en
particular recipientes de molienda para la descomposición del
material biológico, de forma que por un lado se aumenta la capacidad
del dispositivo y por otro lado no hay necesidad que el material
biológico, que ha sido dispersado, sea transferido desde, por
ejemplo, los tubos de ensayo a los pocillos individuales de los
recipientes de almacenamiento para un tratamiento adicional o para
análisis. El ajuste por entrecruzamiento de los bloques de pocillos
en el soporte, conseguido por medio de las levas que se encajan en
los encastres en los brazos de retención, asegura un posicionamiento
claramente definido, y por lo tanto reproducible, de los bloque de
pocillos en el soporte, de forma que los resultados de diferentes
procesos de descomposición son comparables por razones de un igual
suministro de energía. Ya que la profundidad de los encastres se
ajusta a la altura de las levas, los bloques de pocillos están
situados de forma segura en el soporte incluso cuando se aplica una
aceleración transversal.
Según una realización de la presente invención,
se monta una leva sobre la base y la tapadera de los bloques de
pocillos para sobresalir por encima de su plano; ni que decir tiene
que la base y la tapadera deben ser lo suficientemente estables para
que los cuerpos de la molienda situados en el pocillo no salgan por
la base ni por la tapadera.
Como alternativa, la base del bloque de pocillos
en cuestión puede tener una leva que sobresalga por encima de su
plano y una placa adaptadora que se ajuste de forma entrecruzada
sobre la tapadera con una leva que sobresalga por encima de su
plano; esto tiene la ventaja de que se pueden sujetar, en el
soporte, diferentes bloques de pocillos de diferentes alturas, por
medio de la placa adaptadora que se ajusta sobre la tapadera,
usándose diferentes espesores de las placas adaptadoras dependiendo
de la altura del bloque de pocillos. La placa adaptadora puede por
sí misma actuar como tapadera.
En una realización preferida de la invención, las
levas que se ajustan a los encastres en los brazos de retención del
soporte están conformadas sobre una placa adaptadora que se ajusta
de forma entrecruzada sobre la base o la tapadera del bloque de
pocillos que se va a sujetar en su sitio para actuar como un
recipiente de molienda. Esto tiene la ventaja de que los bloques de
pocillos, que se han usado hasta ahora como recipientes de
almacenamiento, se pueden usar directamente, sin modificaciones,
para la operación de descomposición, insertando estos bloques de
pocillos entre dos placas adaptadoras y sujetando las placas
adaptadoras en el soporte del molino vibrante de bolas. Las dos
placas adaptadoras proporcionan el soporte necesario para la base de
paredes delgadas o una tapadera de paredes delgadas o una tapadera
similar a una hoja de papel de aluminio, de forma que los medios de
molienda situados en los pocillos no penetren la base y/o la
tapadera de los bloques de pocillos. Como se describió
anteriormente, se pueden usar placas adaptadoras de diferentes
espesores, dependiendo de la altura de los bloques de pocillos; en
particular, una de las placas adaptadoras puede estar construida
como la placa adaptadora base de configuración constante, mientras
que la otra placa adaptadora asociada se puede ajustar a la altura
del bloque de pocillos en particular en el que se va a insertar.
Para asegurar el soporte completo para la base del bloque de
pocillos, que tiene un saliente en todo su alrededor desde el
proceso de moldeo por inyección mediante el que se hizo, la placa
adaptadora que se encaja sobre la base puede tener una ranura para
acomodar este saliente.
Con el fin de conformar los medios para impedir
la rotación, las levas pueden estar dispuestas como medios para
impedir la rotación de forma que el bloque de pocillos sujeto en el
soporte descanse sobre la placa base del soporte en forma de U; como
alternativa, las levas y los encastres pueden estar conformados para
que se correspondan mutuamente en su perfil. Según una realización
de la invención, donde hay un problema de colocación de los medios
de molienda en los pocillos individuales, cuando se usan bloques de
pocillos que contienen un número de pocillos bastante grande, como
se mencionó anteriormente, por ejemplo 96 pocillos o 384 pocillos
por bloque, se dispone de una placa que va a estar orientada sobre
el bloque de pocillos, que tienen orificios asociados con las
cámaras individuales de molienda del bloque de pocillos y que tienen
una corredera que se puede desplazar, montada sobre la placa y
formando una base movible para los orificios en la placa para
retener los medios de molienda situados en los orificios. Los medios
de molienda pueden construirse luego convenientemente, de forma
conocida, como cuentas de un material adecuado.
Para descomponer muestras biológicas, se usan
medios de molienda de material adecuado, en particular de vidrio o
de materiales cerámicos, especialmente materiales cerámicos
sinterizados, en particular porcelana dura, óxido de circonio, óxido
de aluminio, así como minerales rocosos, en particular mármol, ágata
y también metales, en particular acero inoxidable, carburo de
volframio y plásticos adecuados, en particular poliamida, Teflón, y
sistemas bifásicos, especialmente medios de molienda de acero
recubierto con Teflón.
El tamaño y/o el número de medios de molienda
usados según la invención está determinado por la geometría del
espacio de molienda y/o la muestra biológica usada. Para descomponer
muestras biológicas es preferible usar uno o más medios de molienda
en forma de bolas, más preferiblemente una o más bolas de los
materiales anteriormente mencionados.
En una realización preferida, el tejido animal o
de plantas se descompone usando bolas, preferiblemente una o más
bolas que tienen un peso específico \geq 5 g/cm^{3}, muy
preferiblemente una o más bolas de acero o de carburo de volframio
en una cámara de molienda, muy preferiblemente una cámara de
molienda de fondo redondeado.
El dispositivo según la invención es
preeminentemente adecuado para la descomposición simultánea y
paralela de volúmenes muy pequeños de muestra, en particular en el
formato multi-pocillos, que usan especialmente
placas comerciales estándar de 96 o de 384 pocillos.
Otra realización preferida de la presente
invención es el uso del dispositivo según la invención para
descomponer muestras biológicas para un mayor aislamiento de las
moléculas biológicas, en particular proteínas y/o ácidos nucleicos,
más especialmente ADN y/o ARN.
Las muestras biológicas se descomponen,
preferiblemente, en presencia de adyuvantes que, en concentraciones
adecuadas, tiene un efecto disgregante, de aquí en adelante
referidos como "agentes disgregantes", particularmente en
presencia de detergentes y/o sales caotrópicas. La presencia de
sustancias adicionales que, en concentraciones adecuadas, impiden la
destrucción y/o la modificación de moléculas biológicas que se van a
aislar, y referidas de ahora en adelante como "agentes
estabilizadores", resulta particularmente ventajosa.
La destrucción y/o modificación de las moléculas
biológicas que se van a aislar se impide, preferiblemente, mediante
agentes estabilizadores que impiden la destrucción por enzimas,
especialmente nucleasas y/o proteasas, más particularmente nitrógeno
líquido y/o agentes complejantes, especialmente sustancias
quelantes, en particular AEDT y/o detergentes, especialmente SDS y/o
sales, en particular sales caotrópicas y/o agentes
antioxidantes.
En otra realización preferida de la presente
invención, la muestra biológica se descompone en presencia de un
agente disgregante y un agente estabilizador. Las células se
disgregan simultáneamente y las moléculas biológicas liberadas están
protegidas de la descomposición/destrucción. Las moléculas
biológicas liberadas, en particular proteínas y/o ácidos nucleicos,
especialmente ADN y/o ARN, se pueden aislar posteriormente.
En otra realización, el dispositivo descrito es
preferiblemente adecuado para descomponer material biológico
pretratado, en particular material biológico en estado congelado,
teniendo lugar la descomposición en estado congelado,
particularmente en presencia de nitrógeno líquido. Este método de
descomposición está ventajosamente indicado para aislar ARN, ya que,
en particular, las nucleasas se inhiben en este procedimiento.
El dispositivo anteriormente mencionado y su uso,
en particular en las realizaciones preferidas mencionadas, están
idealmente indicados para la preparación de muestras para el
posterior análisis del rendimiento total, en particular en unidades
automatizadas, en particular unidades que se asemejan al BioRobot
fabricado por QIAGEN.
Los ácidos nucleicos preparados usando el
procedimiento según la invención están particularmente indicados
para manipular moléculas biológicas, en particular para amplificar
ácidos nucleicos, especialmente por PCR, NASBA, amplificación del
desplazamiento de cadena, reacción en cadena de la ligasa (LCR), de
uso en diagnósticos, especialmente de uso en métodos de diagnosis
que se caracterizan en que el ácido nucleico liberado por el
procedimiento según la invención se amplifica en una etapa sucesiva
y entonces, y/o al mismo tiempo, se detecta el ácido nucleico (por
ejemplo, Hollanmd, P.M. y colaboradores, 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. 88, 7276-7280; Livak, K. J. y colaboradores,
1995, PCR Methods Applic. 4, 357-362; Klevits, T y
colaboradores, 1991, J. Virol. Meth. 35, 273-286;
Uyttendaele, M. y colaboradores, 1994, J. Appl. Bacteriol, 77,
694-701).
Además, los ácidos nucleicos puestos a
disposición mediante el procedimiento según la invención, están
particularmente indicados para la amplificación de señal basada en
una reacción de hibridación, caracterizada en particular porque los
ácidos nucleicos preparados por el procedimiento según la invención
se ponen en contacto con "ácidos nucleicos ramificados", en
particular ADN ramificado y/o ARN ramificado y/o los
correspondientes dendrímeros de ácidos nucleicos, según se describe
en las siguientes referencias (por ejemplo, Bresters, D. y
colaboradores, 1994, J. Med. Virol., 43 (3),
252-286; Collins M. L. y colaboradores, 1997, Nucl.
Acids Res. 25 (15), 2979-3984), y se detecta la
señal producida.
Otra realización preferida de la presente
invención es un procedimiento que comprende las siguientes
etapas:
- -
- descomponer la muestras usando el dispositivo según la invención,
- -
- concentrar y/o aislar los ácidos nucleicos, en particular ADN y/o ARN,
- -
- manipular, opcionalmente, el ácido nucleico, en particular amplificar los ácidos nucleicos, muy especialmente mediante por PCR, NASBA, RT-PCR u otros métodos adecuados,
- -
- y analizar, opcionalmente después de eso, los ácidos nucleicos así obtenidos.
Otra realización preferida de la presente
invención es el siguiente procedimiento:
- -
- descomponer las muestras usando el dispositivo según la invención,
- -
- y, a continuación, aislar y/o analizar las proteínas, en particular mediante cromatografía de afinidad.
Los métodos preferidos de cromatografía de
afinidad son métodos basados en sistemas de afinidad de anticuerpos
y/o metales, en particular el sistema metal/histidina, en particular
el sistema Ni-NTA/6His, como se describe, por
ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 5.047.513; 4.877.830 y
5.520.850.
Usando el procedimiento según la invención es así
posible purificar y/o analizar grandes cantidades de material de
muestra en corto tiempo, en particular si el procedimiento descrito
está también automatizado.
Los dibujos muestran una realización, a modo de
ejemplo, del dispositivo según la invención que se describe de aquí
en adelante. Mostrado en:
la Fig. 1 es el soporte de un molino vibrante de
bolas, mostrado en una figura por separado;
la Fig. 2 es un bloque de pocillos con pocillos
abiertos, mostrados en una figura por separado;
la Fig. 3 es un bloque de pocillos insertado
entre dos placas adaptadoras para usarlo en el soporte según la Fig.
1;
la Fig. 4 son las dos placas adaptadoras según la
Fig. 3 sin el bloque de pocillos colocado entre ellas;
la Fig. 5 es la placa usada para insertar los
medios de molienda en los pocillos del bloque de pocillos, en una
figura por separado.
El soporte 10 mostrado en detalle en la Fig. 1 es
una construcción en forma de U con un agujero fijador 12 para unir
el soporte 10 con la transmisión de la placa base 11 del molino
vibrante de bolas no mostrado en detalle. Sobresaliendo de la placa
base 11 hay dos brazos 13 de retención, estando un brazo 13 de
retención montado de forma movible y que se puede ajustar y fijar
por medio de un tornillo 14 de sujeción y ajuste. Los dos brazos 13
de retención tienen, cada uno, un encastre 15 para recibir
entrecruzadamente las levas que están dispuestas adecuadamente sobre
los recipientes de molienda para ser insertados, estando el encastre
15 abierto en aproximadamente la mitad de su circunferencia, de
forma que los recipientes de molienda con las levas dispuestas sobre
ellos se puedan insertar en los encastres 15 desde el lado
abierto.
En la Fig. 2 se muestran en detalle los bloques
16 de pocillos dispuestos como recipientes de molienda, con cámaras
individuales de molienda construidas en la forma de los denominados
pocillos 18. Preferiblemente, un bloque de pocillos de esta clase
tiene un total de noventa y seis pocillos 18.
Como se puede ver en la Fig. 3, los bloques 16 de
pocillos mostrados en la Fig. 2 están sujetos en el soporte 10,
mostrado en la Fig. 1, por medio de dos placas adaptadoras 19 que se
ajustan entrecruzadamente sobre la base 17 y la parte superior del
bloque 16, opcionalmente con una tapadera formada sobre ella, y
asegura así el bloque 16 de pocillos entre ellas. Sobre el lado
exterior de cada placa adaptadora 19 hay una leva 20 que sobresale
por encima de su plano, que se adapta, en su forma y dimensiones, a
cada uno de los encastres 15 en los brazos 13 de retención del
soporte 10, de forma que las placas adaptadoras 19 se puedan colocar
entre los brazos 13 de retención, después de lo cual el brazo 13
movible de retención se lleva a una posición de apoyo sobre la placa
adaptadora 19 asociada, por medio del tornillo 14 de sujeción y
ajuste.
Como puede verse como un detalle adicional en la
Fig. 4, la placa adaptadora 19 que recibe la base 17 del bloque 16
de pocillos tiene una ranura 21 que recorre todo su alrededor para
acomodar un protector que surge desde la base 17 del bloque 16 de
pocillos, que está normalmente allí como resultado de la fabricación
del bloque 16 de pocillos mediante el método de moldeo por
inyección. Esto asegura que la base 17 que forma los extremos de los
pocillos 18 esté totalmente soportada por la placa adaptadora 19, de
forma que los medios de molienda localizados en los pocillos 18 no
puedan pasar a través de la base 17 durante el proceso de
descomposición.
La placa mostrada en la Fig. 5 se puede usar para
simplificar el proceso de transferir los medios individuales de
molienda a los pocillos 18, que es laborioso teniendo en cuenta el
gran número de cámaras individuales de molienda (pocillos 18)
provistas según la invención. Con este fin, la placa 22 tiene
orificios 23 que son algo mayores, en tamaño, que los medios de
molienda conformados como bolas en la realización mostrada a modo de
ejemplo. Una corredera 24 está montada de forma movible sobre la
placa 22 y la posición en la que está empujada hacia dentro,
mostrada en la Fig. 5, forma la base para los orificios 23 en la
placa 22, de forma que en esta posición se puedan insertar los
medios de molienda en los orificios 23. Luego se orienta la placa 22
sobre el bloque 16 de pocillos, preferiblemente por medio de una
disposición que se entrecruza, dispuesta de forma que los orificios
23 estén situados para mostrar los pocillos 18 en el bloque 16 de
pocillos. Cuando se tira luego de la corredera 24 hacia fuera de la
placa 22, los medios de molienda caen en los pocillos 18.
El procedimiento según la invención se explica
con más detalle mediante los ejemplos de las aplicaciones descritas
a continuación:
Se pusieron en cada cavidad de 1,2 ml de una
placa estándar comercial de 96 pocillos (por ejemplo, QIAGEN),
aproximadamente 50 mg de material procedente de hojas frescas de
plantas de trigo. Se añadió a cada muestra una bola para molienda
hecha de carburo de volframio (3 mm de diámetro) usando el
dispositivo mostrado en la Fig. 5. Se pipetearon a cada cavidad 400
\mul de solución tampón I disgregante (TRIS/HCl 50 mM pH 8,0; AEDT
10 mM pH 8,0; NACl 100 mM, 1% SDS), 2 \mul de RNasa A (100 mg/ml)
y 2 \mul de un agente antiespumante (por ejemplo, antiespumante A,
SIGMA). Se cerraron herméticamente los 96 pocillos usando tapas de
cierre adecuadas y se pusieron en las placas adaptadoras (Fig. 4).
La estructura en forma de sándwich de placas (Fig. 3), consistente
en una placa de 96 pocillos y placas adaptadoras superior e
inferior, se sujetó en el soporte del molino vibrante de bolas. Se
hizo funcionar el molino vibrante de bolas a una frecuencia de 30
1/s durante 2 minutos. Se separó del soporte la estructura en forma
de sándwich de placas, se giró 180º la placa de 96 pocillos y se
volvió a poner en las placas adaptadoras. Se sujetó una vez más la
estructura en forma de sándwich de placas en el molino vibrante,
pero esta vez según la rotación de la placa de 96 pocillos, las
posiciones en las que habían estado previamente en el lado interior
y que tenían un radio de oscilación más pequeño estaban ahora en el
lado exterior y viceversa. Continuó el proceso de descomposición
durante 2 minutos más a 30 1/s. Para el posterior aislamiento de los
ácidos nucleicos, las proteínas y los polisacáridos, se precipitaron
mediante la adición de 140 \mul de acetato de potasio 3M. Se
separaron los restos celulares y los precipitados centrifugando, y
se aisló el ADN del sobrenadante. Para hacer esto, se unió el ADN a
una membrana de gel de sílice y se eluyó después de repetidos
lavados en 200 \mul de solución tampón AE (TRIS/HCl 10 mM pH 9,0;
AEDT 0,5 mM). El ADN producido fue aproximadamente 1 \mug de
ADN/10 mg de material procedente de las hojas. A partir de 2 \mul
de eluado, una región no transcrita del ADN de los cloroplastos se
amplificó en una reacción PCR usando cebadores universales (Taberlet
y colaboradores, 1991).
Se pusieron en una placa estándar comercial de 96
pocillos, que tenía cavidades de 1,2 ml (por ejemplo, QIAGEN),
aproximadamente 50 mg de material procedente de hojas frescas de
plantas de trigo. El material procedente de las hojas se puso
únicamente en cada segunda cavidad en la placa de 96 pocillos. Se
añadieron a cada cavidad, bolas de molienda, solución tampón
disgregante, RNasa A y agentes antiespumantes. La descomposición, la
disgregación y el posterior aislamiento del ADN y la amplificación
por PCR se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1.
El material amplificado se transfirió a un gel de
agarosa y se tiñó con bromuro de etidio. Mientras que en las
posiciones cargadas con material procedente de la plantas se
obtuvieron bandas de ADN del tamaño esperado; en el gel de agarosa
no fueron visibles bandas de ADN en las muestras sin material
procedente de las plantas. El proceso de descomposición no da como
resultado contaminación por cruzamiento.
Se pusieron en cada cavidad de 1,2 ml de una
placa estándar comercial de 96 pocillos (por ejemplo, QIAGEN),
aproximadamente 50 mg de material procedente de hojas frescas de
plantas de trigo. Se cerró la placa de 96 pocillos usando tapas de
cierre adecuadas y se almacenaron las muestras durante varios días
congelando por inmersión a -80ºC hasta que se requirió para un uso
posterior.
Para el proceso de descomposición y el posterior
aislamiento del ADN, se enfrió previamente la placa de 96 pocillos
en nitrógeno líquido. Se añadió a cada cavidad una bola de molienda
hecha de acero inoxidable (3 mm de diámetro) usando el dispositivo
mostrado en la Fig. 5 (dispensador de bolas). Los pocillos se
cerraron herméticamente, se enfrió de nuevo la placa de 96 pocillos
en nitrógeno líquido y se insertaron luego en las correspondientes
placas adaptadores. La estructura en forma sándwich de placas,
consistente en una placa de 96 pocillos y placas adaptadoras
superior e inferior, se sujetó en el soporte del molino vibrante de
bolas. Se hizo funcionar el molino durante 1 minuto a una frecuencia
de 20 1/s. Se separó del soporte la estructura en forma de sándwich
de placas, se enfrió una vez más la placa de 96 pocillos en
nitrógeno y, después de girarla 180º, se volvió a poner en las
placas adaptadores. Se volvió a llevar la estructura en forma de
sándwich de placas al molino vibrante de bolas, en el que, como
resultado de la rotación de la placa de 96 pocillos, las posiciones
que habían estado previamente en el lado interior y que tenían un
radio de oscilación más pequeño estaban ahora en el lado exterior y
viceversa. El proceso de descomposición continuó durante 1 minuto a
20 1/s. Se añadieron 400 \mul de solución tampón I disgregante
(precalentada a 80ºC) y 2 \mul de RNasa A (100 mg/l) al material
pulverizado. Se llevó a cabo una precipitación salina, el
aislamiento del ADN y la amplificación por PRC como en el Ejemplo
1.
La producción de ADN fue de aproximadamente 1
\mug de ADN/10 mg de material procedente de las hojas. La
secuencia deseada se pudo amplificar con éxito a partir de todas las
muestras.
Claims (17)
1. Un molino vibrante de bolas que tiene
recipientes que se van a sujetar a él en un soporte (10) en forma de
U que tiene dos brazos (13) de retención opuestos, en el que estos
recipientes están construidos como bloques (16)
multi-pocillos que tienen una pluralidad de cámaras
de molienda (Pocillos (18)) incorporados y que se cierran por medio
de una tapadera situada sobre el bloque (16)
multi-pocillos, y en el que además uno de los brazos
(13) de retención está montado de forma movible para sujetar el
recipiente y que tiene un tornillo (14) de sujeción y ajuste, y en
el que los medios individuales de molienda están situados en los
recipientes con el fin de suministrar energía para el proceso de
trituración, caracterizado porque los bloques (16)
multi-pocillos son bloque
multi-pocillos uniformes que se adaptan se forma que
se puedan asegurar, mediante un ajuste por entrecruzamiento, en el
soporte que tiene medios (10) para impedir la rotación mediante
levas (20) integrantes que sobresalen por encima del plano de los
bloques multi-pocillos, y en el que los brazos (13)
de retención del soporte (10) que tiene cada uno un encastre (15)
que se corresponde, en profundidad, con la altura de las levas, para
recibir las levas de forma entrecruzada.
2. Un dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque se dispone de una leva (20) sobre la
base (17) y sobre la tapadera de los bloques (16)
multi-pocillos para sobresalir por encima de su
plano.
3. Un dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque la base (17) del respectivo bloque (16)
multi-pocillos tiene una leva (20) que sobresale por
encima de su plano y una placa adaptadora (19) que se ajusta
entrecruzadamente sobre la tapadera que está provista de una leva
(20) que sobresale por encima de su plano.
4. Un dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque las levas (20) que se ajustan en los
encastres (15) de los brazos (13) de retención del soporte (10)
están formadas, respectivamente, por una placa adaptadora (19) que
se ajusta entrecruzadamente sobre la base (17) o la tapadera del
bloque (16) multi-pocillos que se va a sujetar en su
sitio como recipiente de molienda.
5. Un dispositivo según la reivindicación 4,
caracterizado porque la placa adaptadora (19) que se ajusta
sobre la base (17) del bloque (16) multi-pocillos
tiene una ranura (21) para acomodar un saliente que sobresale de la
base (17) del bloque (16) multi-pocillos de forma
que la base (17) queda al mismo nivel que la placa adaptadora
(19).
6. Un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las levas (20)
están dispuestas, como medios para impedir la rotación, de forma que
el bloque (16) multi-pocillos sujeto al soporte (10)
descansa sobre la placa (11) base del soporte (10) con forma de
U.
7. Un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque como medios para
impedir la rotación, la leva (20) y el encastre (15) tienen formas,
en su perfil, que se corresponden mutuamente.
8. Un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque para poner los
medios de molienda en las cámaras de molienda (Pocillos (18)) de un
bloque (16) multi-pocillos, se dispone de una placa
(22) con orificios (23), que va a estar orientada sobre el bloque
(16) multi-pocillos, asociada con las cámaras
individuales de molienda (Pocillos (18)) del bloque (16)
multi-pocillos y con una corredera (24) montada de
forma que se pueda desplazar sobre la placa (22) y formar una base
movible para los orificios (23) en la placa (22) para retener los
medios de molienda situados en los orificios (23).
9. Un dispositivo según la reivindicación 8,
caracterizado porque los medios de molienda están en forma de
bolas.
10. El uso de un dispositivo según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9 para descomponer muestras biológicas
en un molino vibrante de bolas.
11. Un procedimiento para descomponer muestras
biológicas con la ayuda de un dispositivo según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la muestra
biológica se descompone en un bloque (16)
multi-pocillos que tiene más de 10 pocillos en un
molino vibrante de bolas y posteriormente se aíslan las proteínas
y/o los ácidos nucleicos.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque se aíslan ADN y/o ARN.
13. Un procedimiento según la reivindicación 11 ó
12, caracterizado porque después se lleva a cabo una
manipulación y/o análisis de las moléculas biológicas.
14. Un procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la
descomposición se lleva a cabo en presencia de adyuvantes.
15. Un procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la
descomposición se lleva a cabo en presencia de agentes disgregantes
y/o estabilizadores.
16. Un procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque el material
biológico o la muestra biológica es una muestra de alimentos que
contiene ácidos nucleicos unidos o libres o células que contienen
ácidos nucleicos, una muestra ambiental que contiene ácidos
nucleicos unidos o libres o células que contienen ácidos nucleicos,
un material de muestra exento de células, plasma, fluidos corporales
tales como sangre, esputos, orina, heces, esperma, células o
cultivos de células, suero, fracciones de leucocitos, frotis,
muestras de tejidos de todas las clases, plantas y partes de
plantas, microorganismos tales como bacterias, virus, levaduras,
brotes de gérmenes, hongos.
17. Un procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque la muestra
biológica está previamente tratada.
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