JP4762395B2 - 生物材料の破砕方法及び装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
生物材料の分析、特に核酸に基づく方法は、多くの分野、特に基礎生物学及び医薬品研究、とりわけ分子診断又は畜産及び園芸のような応用において、ますます重要になってきている。
【０００２】
生物材料の分析を可能にするためには、まず第一に生物試料材料が破砕されなければならない。まず第一に、生物学的分子を単離させるために、細胞構造が破壊されなければならない。植物、バクテリア又は酵母のような出発材料は、分析されるべき分子、特に核酸及び／又はタンパクを放出することをより一層困難にする高抵抗性細胞壁をさらに有する。
【０００３】
これらの材料を破砕するのに適当な分解過程は、前記試料が非常に素早く、可能であれば数秒以内に、かつ同時に高効率で破砕され得ることを保証すべきである。これは、多くの遺伝子発現分析法が、そのままの（intact）核酸、特にRNAの定量的な単離を必要とするため、核酸、特にRNAを単離するときに、殊に重要である。RNAは、細胞構造の破壊後、非常に素早く変質し、それ故、不適当な遅い破砕方法が使用される場合には、分析することができない材料である。
【０００４】
種（seeds）の質的制御又は医薬品のための、組織分類（tissue typing）、新規活性材料のスクリーニングのような核酸に基づく分析の多数の応用は、試料の高処理量（ハイ・スループット）及び出発材料の少量の使用を特徴とする。多くの高処理量応用のためには、一度破砕された試料をさらに処理するために利用可能な自動化された系、例えば、キアゲン（QIAGEN）製バイオロボット（BioRobot）が既に存在するので、生物試料の破砕が律速段階である。
【０００５】
いくつかの機械的な破砕方法が、従来技術において説明されている。そのような装置の一つは、アプリカンツ・レッチェ（applicants Retsch）という会社の「振動ミル（“Schwingmuhle”） MM 2000」のパンフレットに説明されている。
生物細胞の分割（breaking up）が議論される範囲では、５又は１０の単一使用試験管をつかむようにデザインされた保持手段（holding means）は、振動ボールミルのホルダー内に締め付け固定される（clamped）ことができ、前記試験管は、破砕方法のために保持手段内に挿入され、かつ生物材料を破砕するために、少なくとも１つのガラスビーズが、個々の試験管に配置される。保持装置を適所に締め付け固定するために、又は、振動ボールミルが他のすり潰し目的のために使用される場合には、適当なすり潰しカップを締め付け固定するために、振動ボールミル上に備えられる台は、振動ボールミルのドライブに取り付けられたベースプレート、及び２つの向かい合う、それらアームの間の保持装置又はすり潰しカップを掴むプレーナー保持アーム（planer retaining arms）を有するU型枠から成り、それらの１つは、動くように据え付けられ、調整締め付け固定ねじによって、保持装置又はすり潰しカップ上の締め付け固定する迫台（abutment）内に持ち込まれ得る。
【０００６】
この既知の装置は、生物材料の破砕が、異なるバッチにおいては再現できず、それ故、問題の保持装置は、破砕過程の間でさえ、調整締め付け固定ねじによって加えられた張力に応じて、台の保持アームの間の正確に同じ位置に締め付け固定されることができず、かつその位置がわずかながら変化することがある〔それにより、保持装置の支軸（spindle）の位置は、振動ボールミルのドライブとの空間的なつながり（spatial relationship）において固定されない〕ので、十分正確に評価することができないという欠点を有する。しかし、破砕の間、保持装置上で動作する振動作動装置の振幅が、ドライブへの保持装置の軸の空間的なつながりの機能としてそれ自体調整されるので、生物材料が異なる程度に破砕されることを意味する異なる度合いの張力又は変化する張力とともに、異なる量のエネルギーがすり潰し手段に加えられる。さらなる欠点は、５個又は１０個の試験管のバッチのための破砕能力が、デザインによっては非常に小さいことである。
【０００７】
サンプルの高処理量は、核酸に基づく分析法及び診断方法における使用のために、特に重要である。さらに、破砕方法は、相互汚染（cross-contamination）を避けるべきである。
【０００８】
今まで、従来技術では、１０より多い試料が、相互汚染から可能な限り解放されて、同時に、迅速にかつ高効率に分割を行うことを許容する、いずれの破砕方法も説明されていなかった。
【０００９】
本発明の目的は、それ故、１０より多い試料が、相互汚染から可能な限り解放されて、同時に、迅速にかつ高効率に破砕を行うことを許容する、この目的のために適した装置を含む迅速かつ効果的な機械的破砕方法を提供することである。
【００１０】
この課題は、振動ボールミルにおける生物試料の破砕のための、１０より多いウェル（well）を含むマルチウェル・ブロック(multi-well blocks)の使用及び以下により詳細に説明されるような、請求項２に詳しく記載された方法、及び請求項９に説明される装置によって、本発明に従って解決される。本発明に記載の方法の好ましい態様及び本発明に記載の装置は、従属項において詳しく記載されている。
【００１１】
特に、本発明は、振動ボールミルにおいて、生物試料を破砕するための、１０より多いウェルを有する、マルチウェル・ブロックの使用に関する。
【００１２】
本発明の目的のための「生物材料」又は「生物試料」という用語は、生物学的有機体によって生成され、又はそれらから単離され得るすべての材料を示し、それらは核酸及び／又はタンパクを含有する材料を特に示す。「生物材料」又は「生物試料」という用語は、未処理の、又は前処理された試料、例えば、血漿、体液、特に血液、痰、尿、糞、精液、細胞又は細胞培地、血清、白血球、フラクション、なすりつけ標本（smear）、全種類の組織試料、植物及び植物の部分、バクテリアのような微生物、シトメガロウィルス(cytomegalo virus)のようなウイルス、HIV、B型肝炎、C型肝炎、δ型肝炎ウィルス、酵母、胚、菌類、細胞遊離試料材料等を包含する。「生物試料」という用語もまた、菌類に感染された植物のような上記植物、又は、フリーの、若しくは結合された核酸又は核酸を含有する食品試料、フリーの、若しくは結合した核酸又は核酸を含有する環境的材料と同様に、ミコバクテリアを含有した全ヒト血液の混合物の両方を包含する。前処理された生物試料は、例えば、熱処理−凍結、乾燥等が行われることもあり、又は、例えばホルマリン、アルコール等のような適当な化学物質中に固定されるような化学的処理が行われることもある。
【００１３】
本発明の目的のための生物分子は、生きた（living）細胞又は有機体の一部、特に核酸及び／又はタンパク、特にDNA及び／又はRNAである有機分子又はそれらの誘導体である。
【００１４】
本発明の目的のための核酸という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）、二本鎖、一本鎖、環状及び直鎖、分枝等のようなすべての長さ及び形状のリボ核酸、動物及び植物細胞、又は他の真核からのゲノムの、又は他の非ゲノムのDNA及びRNAと同様に、プラズミド、ウィルス及びバクテリアのDNA及びRNA、t-RNA、加工処理された、又は加工処理されていない形態のmRNA、hn-RNA、ｒRNA及びcDNA並びにすべてのその他考えられる限りの核酸のような、すべての可能な種類の核酸を包含する。さらに、本発明の範囲内で、前記定義は、インビボ（in vivo）転写、PCR反応又はcDNA合成のような“下流の（downstream）応用”のために適当な抽出物として使用され得る、核酸又は核酸を含有する試料若しくは試料の混合物を包含する。
【００１５】
マルチウェル・ブロックを使用するための振動ボールミルは、２つの向かい合う保持アームを有するU型ホルダーにおいて、その上に締め付け固定されるための容器を有する振動ボールミルに基づく。前記保持アームの一つは、すり潰し容器を締め付け固定するために、動くように据え付けられ、かつ調整及び締め付け固定するねじを有し、一方、個々のすり潰し部材は、粉砕過程のためのエネルギーを与えるために容器内に配置される。本発明の根本的な概念は、以下の通りである。すり潰し容器は、その中に組み入れられた複数のすり潰しチャンバーを有する、統合されたウェルのブロックとして構成され、かつウェルブロック上に配置されたふたによって、又は複数のふたによって遮断される。さらに、ウェルブロックは、回転を防止するための手段を有するホルダー内に、それの平面上に突出する整列させられたカム（cam）によって、連動する連結部により固定されることができる。そして、ホルダーの保持アームはそれぞれ、カムを連動して受け入れるためのカムの高さに深さが対応する凹部を有する。
【００１６】
その中に供給される、異なる数及び配置の受容（receiving）チャンバー（ウェル）を有するウェルブロックは、例えば、会社のパンフレットであるキアゲン（QIAGEN） GmbH of Hilden発行の“キアゲン製品ガイド 1997,p.135(Qiagen Product Guide 1997,p.135)”からの、生物材料の試料のための貯蔵容器及び反応容器として知られている。９６個のウェルを含むこともあるこれらのウェルブロックは、例えば薄い壁で囲まれた、プラスチックで成形された射出成形物（injection）からなり、そしてカバーとしてその上に配置された粘着性の薄片シートを使用して遮断することができる。
【００１７】
本発明の１つの利点は、純粋に貯蔵目的のために今まで使用されていたウェルブロックが、容器として、特に生物材料の破砕のためのすり潰し容器として、それ自体機能できることであり、それにより、一方では装置の能力が増加され、他方では、例えば、さらなる加工処理又は分析のために、試験管から、貯蔵容器の個々のウェル内に移されるために破砕されていた生物材料のための必要性は存在しない。保持アーム内の凹部において連結するカムにより達成される、ホルダー内のウェルブロックの連動する連結部は、ホルダー内のウェルブロックの、はっきりと定義され、かつそれ故に再現可能な配置を確実にする。それにより、異なる破砕方法の結果は、同等のエネルギー投入の基において比較することができる。凹部の深さは、カムの高さに対応されるので、ウェルブロックは、横向きの加速度が加えられるときでさえ、ホルダー内にしっかりと設置される。
【００１８】
本発明の一つの態様によれば、カムは、それの平面上に突出するように、ウェルブロックのベース及びふたの上に据え付けられる。言うまでもなく、ベース及びふたは、ウェル内に備えられるすり潰し手段が、ベース又はふたを破らないのに十分なほど強固にされなければならない。
【００１９】
あるいは、問題のウェルブロックのベースは、その平面上に突出するカム及びそれの平面上に突出するカムとともに、ふたの上方に連動して連結するアダプタープレートを有することもある。これは、異なる高さの異なるウェルブロックが、ふたの上方に連結するアダプタープレートによって、ホルダー内に締め付け固定され得るという利点を有し、異なる厚さのアダプタープレートが、ウェルブロックの高さに応じて使用される。前記アダプタープレートは、それ自体がふたとして機能することもある。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、ホルダーの保持アーム内の凹部において連結するカムは、すり潰し容器として機能するために適所に締め付け固定されなければならないウェルブロックのベース又はふたの上方に連動して連結するアダプタープレート上にそれぞれ形成される。これは、２つのアダプタープレート間に、これらのウェルブロックを挿入し、かつ振動ボールミルのホルダー内にアダプタープレートを締め付け固定することによって、今まで貯蔵容器として使用されていたウェルブロックを、破砕操作のために、修正なしに直接的に使用することができるという利点を有する。アダプタープレートは、薄い壁に囲まれたベース、又は薄い壁に囲まれた若しくは薄片様のふたのために必要な支持体を提供し、それによってウェル内に設置されたすり潰し手段は、ウェルブロックのベース及び／又はふたを貫通しない。上述の通り、異なる厚さのアダプタープレートは、ウェルブロックの高さに応じて使用されることがあり、特に、アダプタープレートの一つは、一定配置のベースアダプタープレートとして構成されることもあり、一方、他の関連するアダプタープレートは、挿入されるべき特定のウェルブロックの高さに調整され得る。それが作られることにより、射出成形過程の全般に渡る直立部（upstand）を有する、ウェルブロックのベースのための完全な支持体を確保するために、ベースの上方に連結するアダプタープレートが、この立ち上がりを収容するためのくぼみを有することもある。
【００２１】
回転防止手段を形成するために、ホルダー内に締め付け固定されるウェルブロックが、U型ホルダーのベースプレート上に置かれるように、カムが、回転防止手段として配列されることもある。あるいは、カム及び凹部は、側面から見てお互いに対応するように形成されることもある。かなり多数のウェル、例えば、前述のような１ブロック当たり９６個のウェル、又は３８４個のウェルを含有するウェルブロックを使用するときに、個々のウェルにすり潰し手段を配置する際に問題がある場合がある。この場合、本発明の１つの態様によれば、ウェルブロック上に配向されなければならず、ウェルブロックの個々のすり潰しチャンバーと連結された開口部を有し、かつプレート上に動くように据え付けられたスライドを有し、かつ開口部内に配置されるすり潰し手段を保持するためのプレートにおける開口部のための可動ベースを形成するプレートが提供される。前記すり潰し手段は、その後、既知の方法において、適当な材料のビーズとして、便宜上構成されることもある。
【００２２】
生物試料を破砕するために、適当な材料のすり潰し手段が使用され、特にガラス又はセラミック、とりわけ、焼成されたセラミック、さらに特別に硬質磁器、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、同様に岩石鉱物、特に大理石、めのう、及び金属も、特にステンレススチール、タングステンカーバイド及び適当なプラスチック、特にポリアミド、テフロン及び２相系、とりわけテフロンコートされたスチール粉砕機が使用される。
【００２３】
本発明によって使用される粉砕機の寸法及び／又は数は、すり潰し空間の結合構造（geometry）及び／又は使用される生物試料によって決定される。生物試料を破砕するために、ビーズ又はボール、より好ましくは前記材料から成る１つ以上のビーズ又はボールの形状の、１つ以上の粉砕機を使用することが好ましい。
【００２４】
好ましい態様において、動物及び／又は植物細胞は、ビーズ又はボール、好ましくは、５g/cm3以上の比重を有する１つ以上のビーズ又はボール、最も好ましくは、すり潰しチャンバー、最も好ましくは丸底すり潰しチャンバーにおけるスチール又はタングステンカーバイドの１つ以上のボールを使用して破砕される。
【００２５】
本発明による装置は、特にマルチウェルフォーマットにおいて、とりわけ一般に市販の９６−ウェル又は３８４−ウェルのプレートを使用する、非常に少量の試料の同時並行破砕に顕著に適している。
【００２６】
本発明の他の好ましい態様は、生物分子、特にタンパク及び／又は核酸、さらに特別にDNA及び／又はRNAをさらに単離するための生物試料の破砕のための本発明による装置の使用である。
【００２７】
生物試料は、適当な濃度において溶解効果を有する、以下に“溶解剤（lysing agent）”として言及される補助剤の存在下、特に、洗浄剤及びカオトロピック塩類の存在下で、好ましくは破砕される。適当な濃度において、単離されるべき生物分子の破壊及び／又は変性を防ぎ、かつ以下に“安定剤”として言及されるさらなる材料を添加することは、特に有利である。
【００２８】
単離されるべき生物分子の破壊及び／変性は、酵素、特にヌクレアーゼ及び／又はプロテアーゼ、より特別に液体窒素及び／又は錯化剤、とりわけキレート物質、特に、EDTA及び／又は洗浄剤、とりわけSDS及び／又は塩類、特にカオトロピック塩類及び／又は酸化防止剤による破壊を防止する安定化剤によって、好ましくは防止される。
【００２９】
本発明の他の好ましい態様において、生物試料は、溶解剤及び安定化剤の存在下で破砕される。その細胞は、同時に溶解され、かつ放出された生物分子は、破砕／破壊から防御される。放出された前記生物分子、特にタンパク及び／又は核酸、とりわけDNA及び／又はRNAは、その後単離される。
【００３０】
他の態様において、説明される装置は、前処理された生物試料、特に凍結状態の生物材料を破砕するために特に適しており、分割は、凍結状態、特に液体窒素の下で行われる。この分割方法は、特にヌクレアーゼがこの方法において抑制されるので、RNAを単離するために有利に適している。
【００３１】
上述の装置及びその使用は、特に、言及された好ましい態様において、その後の高処理量分析のための、自動化されたプラットフォーム、特にキアゲン製のバイオロボットと類似するプラットフォーム上での試料の調製に特に理想的に適合する。
【００３２】
本発明による方法を使用して調製された核酸は、生物学的分子を処理するために、特に核酸を増幅するために、とりわけPCR、NASBA、鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification)、リガーゼ鎖反応（LCR）のために、診断学における使用のために、とりわけ本発明による方法によって放出された核酸が、後続の段階において増幅され、かつその後及び／又は同時に、増幅された核酸が検出されることを特徴とする診断方法（例えば、Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl Acad.Sci.88,7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods Applic.4,357-362;Kievits,T.et al.,1991,J.Virol.Meth.35,273-286;Uyttendaele,M.et al.,1994,J.Appl.Bacteriol.77,694-701）の使用のために、特に適している。
【００３３】
さらに、本発明による方法によって利用できるようにされた核酸は、特に、本発明による方法によって調製された核酸が、以下の参照文献（例えば、Bresters,D.et al.,1994,J.Med.Virol.43(3),252-286;Collins M.L.et al.,1997,Nucl.Acids Res.25(15),2979-3984）に記載のように、“分枝した核酸”、特に、分枝したDNA及び／又は分枝したRNA及び／又は対応する核酸のデンドリマーと接触させられることを特徴とするハイブリッド形成反応に基づくシグナル増幅のために特に適しており、そして、生成されたシグナルが検出される。
【００３４】
本発明の他の好ましい態様は、以下の段階を含む方法である。
−本発明による装置を使用して試料を破砕し、
−核酸、特にDNA及び／又はRNAを濃縮し、及び／又は単離し、
−核酸、特に増幅する核酸を、最も特別にはPCR、NASBA、RT-PCR又は他の適当な方法によって、任意に処理し、
−かつ、その後、それにより得られた核酸を任意に分析する。
【００３５】
本発明の他の好ましい態様は、以下の方法である。
−本発明による装置を使用して試料を破砕し、
−かつ、タンパクを、特にアフィニティークロマトグラフィーによって続いて単離及び／又は分析する。
【００３６】
アフィニティークロマトグラフィーの好ましい方法は、例えば、米国特許5 047 513、4 877 830及び5 520 850に説明されたような、抗体及び／又は金属アフィニティー系、特に金属／ヒスチジン（histidine）系、特にNi−ＮＴＡ／6His系に基づく方法である。
【００３７】
本発明による方法を使用すると、特に説明された方法が自動化もされる場合には、短時間で、大量の試料材料を精製及び／又は分析することが可能である。
【００３８】
図１に詳細に示されたホルダー１０は、振動ボールミル（図示されていない）のドライブにホルダー１０を取り付けるための固定穴１２を有するベースプレート１１を有するU型構造である。ベースプレート１１から２つの保持アーム１３が突き出しており、１つの保持アーム１３は、動くように据え付けられ、かつ調整締め付け固定ねじ１４による調整及び固定が可能である。前記２つの保持アーム１３はそれぞれ、挿入されるべきすり潰し容器上に適当に備えられるカムを連動して受容するための凹部１５を有し、凹部１５は、それらの約半円周上に開いており、それにより、その上に載せられたカムを有するすり潰し容器が、開口側から凹部１５に挿入され得る。
【００３９】
図２には、すり潰し容器として提供されたウェルブロック１６が、いわゆるウェル１８の形状に構成された個々のすり潰しチャンバーとともに、詳細に示されている。この種のウェルブロック１６は、好ましくは総計９６個のウェル１８を有する。
【００４０】
図３からわかるように、図２に示されたウェルブロック１６は、ベース１７及びウェルブロック１６の上部に連動して連結された２つのアダプタープレート１９によって、任意にその上に形成されたふたとともに、図１に示されたホルダー１０において締め付け固定され、そしてそれによりウェルブロック１６を、それらの間に確保する。各アダプタープレート１９の外側には、その形状及び寸法が、ホルダー１０の保持アーム１３における凹部１５に適合されており、かつそれの平面上に突き出したカム２０がある。それによって、アダプタープレート１９は、保持アーム１３の間に配置されることができ、その後動作可能な保持アーム１３が、調整締め付け固定ねじ１４によって連結したアダプタープレート１９上の迫台の位置に持ち込まれる。
【００４１】
図４において、さらに詳細に見られるように、ウェルブロック１６のベース１７を受容するアダプタープレート１９は、射出成形法によるウェルブロック１６の製造の結果として通常そこに存在する、ウェルブロック１６のベース１７から突出する直立部を収容するためにその周囲にくぼみ２１を有する。これは、ウェル１８の末端を形成するベース１７が、アダプタープレート１９によって完全に支持され、ウェル１８に配置されるすり潰し手段が、破砕工程の間、ベース１７を通過できないことを確実にする。
【００４２】
図５に示されたプレートは、本発明によって提供される、個々のすり潰しチャンバー（ウェル１８）が多数であるために苦労する、個々のすり潰し手段をウェル１８内に移動する工程を簡単にするために使用され得る。この目的のために、プレート２２は、実施例によって示される態様において、ボール又はビーズとして形成されたすり潰し手段よりも、寸法がやや大きい開口部２３を有する。スライド２４は、プレート２２上に動くように据え付けられ、そして図５に示される押し込み位置（pushed-in position）において、プレート２２における開口部２３のためのベースを形成し、その結果、この位置において、すり潰し手段が開口部２３に挿入され得る。その後、プレート２２は、好ましくは備えられた連動する調節装置によってウェルブロック１６上に配向され、それによって、開口部２３は、ウェルブロック１６におけるウェル１８とともに位置を合わせるように配置される。スライド２４が、その後プレート２２から引き抜かれるときに、すり潰し手段がウェル１８内に落下する。
【００４３】
【実施例】
本発明による方法は、以下に説明された応用例によってより詳細に説明される。
【００４４】
１．緩衝溶液中の９６ウェルブロック（96 well block）における新鮮な未処理葉材料の並行破砕及び溶解
約50mgの、小麦植物からの新鮮な葉の材料が、一般に市販されている９６ウェルプレート（例えばキアゲン）におけるそれぞれ1.2mlの穴に置かれた。タングステンカーバイドから成るすり潰しボール（直径3mm）が、図５に示される装置を使用して各試料に加えられた。400μlの溶解バッファーI（50mM Tris/HCl pH8.0, 10mM EDTA pH8.0, 100mM NaCl, 1% SDS）、２μlのRNase A（100mg/ml）及び2μlの消泡剤（例えばアンチフォームA、シグマ）がそれぞれの穴にピペットで加えられた。９６ウェルプレートは、適当な閉鎖キャップを用いて密封され、そしてアダプタープレートに配置された（図４）。９６ウェルプレート並びに上側及び下側アダプタープレートから成るプレートサンドイッチは（図３）、振動ボールミルのホルダー内に締め付け固定された。この振動ボールミルは、２分間30 ｌ/sの振動数で操作された。前記プレートサンドイッチは、ホルダーから取り外され、９６ウェルブロックは１８０°回転させ、そしてその後にアダプタープレート内に戻された。前記プレートサンドイッチは、振動ミルに再度締め付け固定されるが、このときには、９６ウェルプレートの回転のお陰で、以前は内側にあり、そしてわずかな範囲で振動していた位置が、そのときは外側になり、逆もまた同じであった。前記方法は、30 l/sにおいてさらに２分間続けられた。核酸の、その後の単離のために、タンパク及び多糖類は、3Mの酢酸カリウム140μlの添加によって、沈殿させられた。細胞破片及び沈殿は、遠心分離によって除去され、そしてDNAが上清から単離された。これを行うために、DNAはシリカゲル膜に結合され、そしてバッファーAE（10mM TRIS/HCl pH9.0, 0.5mM EDTA）200μlで繰り返し洗浄した後に溶離された。前記DNAの収量は、葉材料10mg当たり約１μgのDNAであった。溶離液２μlから、葉緑体DNAの非コード領域がユニバーサルプライマーを用いるPCR反応（Taberlet et al.1991）において増幅された。
【００４５】
２．緩衝溶液中の９６ウェルブロックにおける新鮮な未処理葉材料の並行破砕及び溶解：相互汚染の確認
約50mgの、小麦植物からの新鮮な葉材料が、一般に市販されている、1.2mlの穴を有する９６ウェルプレート（例えばキアゲン）に置かれた。葉材料は、９６ウェルプレートにおける２穴ごとにのみ置かれた。実施例１に説明されたように、すり潰しボール、溶解バッファー、RNase A及び消泡剤は、それぞれの穴に加えられた。分割、溶解及びその後のDNA単離並びにPCR増幅は、実施例１に説明されたように行われた。
【００４６】
増幅された材料は、アガロースゲルへ移され、そして臭化エチジウムを用いて染色された。植物材料で充たされた位置において、予想された寸法のDNAバンドが得られたのに対し、植物材料を除いた試料におけるアガロースゲル上では、DNAバンドは認識できなかった。前記破砕方法は、相互汚染を起こさない。
【００４７】
３．液体窒素を使用した９６ウェルブロックにおける凍結葉の破砕
約50mgの小麦植物からの葉材料は、一般に市販の９６ウェルプレート（例えばキアゲン）の1.2mlの穴ごとに置かれた。前記９６ウェルプレートは、適当な閉鎖キャップを用いて遮断され、そしてその試料は、さらなる使用のために必要とされるまで、-80℃において過度に凍結することによって、数日間貯蔵された。
【００４８】
破砕方法及びその後のDNA単離のために、前記９６ウェルプレートは、液体窒素中で予備冷却された。ステンレススチール製のすり潰しボール（直径3mm）が、図５に示された装置（ボールディスペンサー）を用いてそれぞれの穴に加えられた。ウェルは密閉され、前記９６プレートは液体窒素中で再度冷却され、その後対応するアダプタープレート内に挿入された。９６ウェルプレート並びに上側及び下側アダプタープレートからなるプレートサンドイッチは、振動ボールミルのホルダー内に締め付け固定された。前記ミルは、20 l/sの振動数で１分間操作された。前記プレートサンドイッチは、ホルダーから取り外され、９６ウェルプレートは窒素中でもう一度冷却され、そして、１８０°回転された後に、アダプタープレート内に戻された。前記プレートサンドイッチは、その後振動ボールミルに戻され、その中で、９６ウェルプレートの回転の結果として以前は内側であり、かつわずかな振動範囲を有していた位置が、そのときには外側になり、かつ逆もまた同じであった。前記破砕方法は、20 l/sにおいて１分間続けられた。400μlの（８０℃で予熱された）溶解バッファーI及び2μlのRNase A（100mg/l）が、粉砕された材料に加えられた。塩沈殿、DNA単離及びPCR増幅は、実施例１と同様に行われた。
【００４９】
DNAの収量は、葉材料10mg当たり約1μgであった。所望の配列は、すべての試料からうまく増幅することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 振動ボールミルのホルダーの詳細図。
【図２】 ウェルが開いた場合のウェルブロックの詳細図。
【図３】 図１に記載のホルダーにおいて使用するための２つのアダプタープレート間に挿入されたウェルブロック。
【図４】 それらの間に置かれたウェルブロックがない場合の図３に記載の２つのアダプタープレート。
【図５】 ウェルブロック内のウェルにおいてすり潰し手段を挿入するために使用されるプレートの詳細図。
【発明の属する技術分野】
生物材料の分析、特に核酸に基づく方法は、多くの分野、特に基礎生物学及び医薬品研究、とりわけ分子診断又は畜産及び園芸のような応用において、ますます重要になってきている。
【０００２】
生物材料の分析を可能にするためには、まず第一に生物試料材料が破砕されなければならない。まず第一に、生物学的分子を単離させるために、細胞構造が破壊されなければならない。植物、バクテリア又は酵母のような出発材料は、分析されるべき分子、特に核酸及び／又はタンパクを放出することをより一層困難にする高抵抗性細胞壁をさらに有する。
【０００３】
これらの材料を破砕するのに適当な分解過程は、前記試料が非常に素早く、可能であれば数秒以内に、かつ同時に高効率で破砕され得ることを保証すべきである。これは、多くの遺伝子発現分析法が、そのままの（intact）核酸、特にRNAの定量的な単離を必要とするため、核酸、特にRNAを単離するときに、殊に重要である。RNAは、細胞構造の破壊後、非常に素早く変質し、それ故、不適当な遅い破砕方法が使用される場合には、分析することができない材料である。
【０００４】
種（seeds）の質的制御又は医薬品のための、組織分類（tissue typing）、新規活性材料のスクリーニングのような核酸に基づく分析の多数の応用は、試料の高処理量（ハイ・スループット）及び出発材料の少量の使用を特徴とする。多くの高処理量応用のためには、一度破砕された試料をさらに処理するために利用可能な自動化された系、例えば、キアゲン（QIAGEN）製バイオロボット（BioRobot）が既に存在するので、生物試料の破砕が律速段階である。
【０００５】
いくつかの機械的な破砕方法が、従来技術において説明されている。そのような装置の一つは、アプリカンツ・レッチェ（applicants Retsch）という会社の「振動ミル（“Schwingmuhle”） MM 2000」のパンフレットに説明されている。
生物細胞の分割（breaking up）が議論される範囲では、５又は１０の単一使用試験管をつかむようにデザインされた保持手段（holding means）は、振動ボールミルのホルダー内に締め付け固定される（clamped）ことができ、前記試験管は、破砕方法のために保持手段内に挿入され、かつ生物材料を破砕するために、少なくとも１つのガラスビーズが、個々の試験管に配置される。保持装置を適所に締め付け固定するために、又は、振動ボールミルが他のすり潰し目的のために使用される場合には、適当なすり潰しカップを締め付け固定するために、振動ボールミル上に備えられる台は、振動ボールミルのドライブに取り付けられたベースプレート、及び２つの向かい合う、それらアームの間の保持装置又はすり潰しカップを掴むプレーナー保持アーム（planer retaining arms）を有するU型枠から成り、それらの１つは、動くように据え付けられ、調整締め付け固定ねじによって、保持装置又はすり潰しカップ上の締め付け固定する迫台（abutment）内に持ち込まれ得る。
【０００６】
この既知の装置は、生物材料の破砕が、異なるバッチにおいては再現できず、それ故、問題の保持装置は、破砕過程の間でさえ、調整締め付け固定ねじによって加えられた張力に応じて、台の保持アームの間の正確に同じ位置に締め付け固定されることができず、かつその位置がわずかながら変化することがある〔それにより、保持装置の支軸（spindle）の位置は、振動ボールミルのドライブとの空間的なつながり（spatial relationship）において固定されない〕ので、十分正確に評価することができないという欠点を有する。しかし、破砕の間、保持装置上で動作する振動作動装置の振幅が、ドライブへの保持装置の軸の空間的なつながりの機能としてそれ自体調整されるので、生物材料が異なる程度に破砕されることを意味する異なる度合いの張力又は変化する張力とともに、異なる量のエネルギーがすり潰し手段に加えられる。さらなる欠点は、５個又は１０個の試験管のバッチのための破砕能力が、デザインによっては非常に小さいことである。
【０００７】
サンプルの高処理量は、核酸に基づく分析法及び診断方法における使用のために、特に重要である。さらに、破砕方法は、相互汚染（cross-contamination）を避けるべきである。
【０００８】
今まで、従来技術では、１０より多い試料が、相互汚染から可能な限り解放されて、同時に、迅速にかつ高効率に分割を行うことを許容する、いずれの破砕方法も説明されていなかった。
【０００９】
本発明の目的は、それ故、１０より多い試料が、相互汚染から可能な限り解放されて、同時に、迅速にかつ高効率に破砕を行うことを許容する、この目的のために適した装置を含む迅速かつ効果的な機械的破砕方法を提供することである。
【００１０】
この課題は、振動ボールミルにおける生物試料の破砕のための、１０より多いウェル（well）を含むマルチウェル・ブロック(multi-well blocks)の使用及び以下により詳細に説明されるような、請求項２に詳しく記載された方法、及び請求項９に説明される装置によって、本発明に従って解決される。本発明に記載の方法の好ましい態様及び本発明に記載の装置は、従属項において詳しく記載されている。
【００１１】
特に、本発明は、振動ボールミルにおいて、生物試料を破砕するための、１０より多いウェルを有する、マルチウェル・ブロックの使用に関する。
【００１２】
本発明の目的のための「生物材料」又は「生物試料」という用語は、生物学的有機体によって生成され、又はそれらから単離され得るすべての材料を示し、それらは核酸及び／又はタンパクを含有する材料を特に示す。「生物材料」又は「生物試料」という用語は、未処理の、又は前処理された試料、例えば、血漿、体液、特に血液、痰、尿、糞、精液、細胞又は細胞培地、血清、白血球、フラクション、なすりつけ標本（smear）、全種類の組織試料、植物及び植物の部分、バクテリアのような微生物、シトメガロウィルス(cytomegalo virus)のようなウイルス、HIV、B型肝炎、C型肝炎、δ型肝炎ウィルス、酵母、胚、菌類、細胞遊離試料材料等を包含する。「生物試料」という用語もまた、菌類に感染された植物のような上記植物、又は、フリーの、若しくは結合された核酸又は核酸を含有する食品試料、フリーの、若しくは結合した核酸又は核酸を含有する環境的材料と同様に、ミコバクテリアを含有した全ヒト血液の混合物の両方を包含する。前処理された生物試料は、例えば、熱処理−凍結、乾燥等が行われることもあり、又は、例えばホルマリン、アルコール等のような適当な化学物質中に固定されるような化学的処理が行われることもある。
【００１３】
本発明の目的のための生物分子は、生きた（living）細胞又は有機体の一部、特に核酸及び／又はタンパク、特にDNA及び／又はRNAである有機分子又はそれらの誘導体である。
【００１４】
本発明の目的のための核酸という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）、二本鎖、一本鎖、環状及び直鎖、分枝等のようなすべての長さ及び形状のリボ核酸、動物及び植物細胞、又は他の真核からのゲノムの、又は他の非ゲノムのDNA及びRNAと同様に、プラズミド、ウィルス及びバクテリアのDNA及びRNA、t-RNA、加工処理された、又は加工処理されていない形態のmRNA、hn-RNA、ｒRNA及びcDNA並びにすべてのその他考えられる限りの核酸のような、すべての可能な種類の核酸を包含する。さらに、本発明の範囲内で、前記定義は、インビボ（in vivo）転写、PCR反応又はcDNA合成のような“下流の（downstream）応用”のために適当な抽出物として使用され得る、核酸又は核酸を含有する試料若しくは試料の混合物を包含する。
【００１５】
マルチウェル・ブロックを使用するための振動ボールミルは、２つの向かい合う保持アームを有するU型ホルダーにおいて、その上に締め付け固定されるための容器を有する振動ボールミルに基づく。前記保持アームの一つは、すり潰し容器を締め付け固定するために、動くように据え付けられ、かつ調整及び締め付け固定するねじを有し、一方、個々のすり潰し部材は、粉砕過程のためのエネルギーを与えるために容器内に配置される。本発明の根本的な概念は、以下の通りである。すり潰し容器は、その中に組み入れられた複数のすり潰しチャンバーを有する、統合されたウェルのブロックとして構成され、かつウェルブロック上に配置されたふたによって、又は複数のふたによって遮断される。さらに、ウェルブロックは、回転を防止するための手段を有するホルダー内に、それの平面上に突出する整列させられたカム（cam）によって、連動する連結部により固定されることができる。そして、ホルダーの保持アームはそれぞれ、カムを連動して受け入れるためのカムの高さに深さが対応する凹部を有する。
【００１６】
その中に供給される、異なる数及び配置の受容（receiving）チャンバー（ウェル）を有するウェルブロックは、例えば、会社のパンフレットであるキアゲン（QIAGEN） GmbH of Hilden発行の“キアゲン製品ガイド 1997,p.135(Qiagen Product Guide 1997,p.135)”からの、生物材料の試料のための貯蔵容器及び反応容器として知られている。９６個のウェルを含むこともあるこれらのウェルブロックは、例えば薄い壁で囲まれた、プラスチックで成形された射出成形物（injection）からなり、そしてカバーとしてその上に配置された粘着性の薄片シートを使用して遮断することができる。
【００１７】
本発明の１つの利点は、純粋に貯蔵目的のために今まで使用されていたウェルブロックが、容器として、特に生物材料の破砕のためのすり潰し容器として、それ自体機能できることであり、それにより、一方では装置の能力が増加され、他方では、例えば、さらなる加工処理又は分析のために、試験管から、貯蔵容器の個々のウェル内に移されるために破砕されていた生物材料のための必要性は存在しない。保持アーム内の凹部において連結するカムにより達成される、ホルダー内のウェルブロックの連動する連結部は、ホルダー内のウェルブロックの、はっきりと定義され、かつそれ故に再現可能な配置を確実にする。それにより、異なる破砕方法の結果は、同等のエネルギー投入の基において比較することができる。凹部の深さは、カムの高さに対応されるので、ウェルブロックは、横向きの加速度が加えられるときでさえ、ホルダー内にしっかりと設置される。
【００１８】
本発明の一つの態様によれば、カムは、それの平面上に突出するように、ウェルブロックのベース及びふたの上に据え付けられる。言うまでもなく、ベース及びふたは、ウェル内に備えられるすり潰し手段が、ベース又はふたを破らないのに十分なほど強固にされなければならない。
【００１９】
あるいは、問題のウェルブロックのベースは、その平面上に突出するカム及びそれの平面上に突出するカムとともに、ふたの上方に連動して連結するアダプタープレートを有することもある。これは、異なる高さの異なるウェルブロックが、ふたの上方に連結するアダプタープレートによって、ホルダー内に締め付け固定され得るという利点を有し、異なる厚さのアダプタープレートが、ウェルブロックの高さに応じて使用される。前記アダプタープレートは、それ自体がふたとして機能することもある。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、ホルダーの保持アーム内の凹部において連結するカムは、すり潰し容器として機能するために適所に締め付け固定されなければならないウェルブロックのベース又はふたの上方に連動して連結するアダプタープレート上にそれぞれ形成される。これは、２つのアダプタープレート間に、これらのウェルブロックを挿入し、かつ振動ボールミルのホルダー内にアダプタープレートを締め付け固定することによって、今まで貯蔵容器として使用されていたウェルブロックを、破砕操作のために、修正なしに直接的に使用することができるという利点を有する。アダプタープレートは、薄い壁に囲まれたベース、又は薄い壁に囲まれた若しくは薄片様のふたのために必要な支持体を提供し、それによってウェル内に設置されたすり潰し手段は、ウェルブロックのベース及び／又はふたを貫通しない。上述の通り、異なる厚さのアダプタープレートは、ウェルブロックの高さに応じて使用されることがあり、特に、アダプタープレートの一つは、一定配置のベースアダプタープレートとして構成されることもあり、一方、他の関連するアダプタープレートは、挿入されるべき特定のウェルブロックの高さに調整され得る。それが作られることにより、射出成形過程の全般に渡る直立部（upstand）を有する、ウェルブロックのベースのための完全な支持体を確保するために、ベースの上方に連結するアダプタープレートが、この立ち上がりを収容するためのくぼみを有することもある。
【００２１】
回転防止手段を形成するために、ホルダー内に締め付け固定されるウェルブロックが、U型ホルダーのベースプレート上に置かれるように、カムが、回転防止手段として配列されることもある。あるいは、カム及び凹部は、側面から見てお互いに対応するように形成されることもある。かなり多数のウェル、例えば、前述のような１ブロック当たり９６個のウェル、又は３８４個のウェルを含有するウェルブロックを使用するときに、個々のウェルにすり潰し手段を配置する際に問題がある場合がある。この場合、本発明の１つの態様によれば、ウェルブロック上に配向されなければならず、ウェルブロックの個々のすり潰しチャンバーと連結された開口部を有し、かつプレート上に動くように据え付けられたスライドを有し、かつ開口部内に配置されるすり潰し手段を保持するためのプレートにおける開口部のための可動ベースを形成するプレートが提供される。前記すり潰し手段は、その後、既知の方法において、適当な材料のビーズとして、便宜上構成されることもある。
【００２２】
生物試料を破砕するために、適当な材料のすり潰し手段が使用され、特にガラス又はセラミック、とりわけ、焼成されたセラミック、さらに特別に硬質磁器、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、同様に岩石鉱物、特に大理石、めのう、及び金属も、特にステンレススチール、タングステンカーバイド及び適当なプラスチック、特にポリアミド、テフロン及び２相系、とりわけテフロンコートされたスチール粉砕機が使用される。
【００２３】
本発明によって使用される粉砕機の寸法及び／又は数は、すり潰し空間の結合構造（geometry）及び／又は使用される生物試料によって決定される。生物試料を破砕するために、ビーズ又はボール、より好ましくは前記材料から成る１つ以上のビーズ又はボールの形状の、１つ以上の粉砕機を使用することが好ましい。
【００２４】
好ましい態様において、動物及び／又は植物細胞は、ビーズ又はボール、好ましくは、５g/cm3以上の比重を有する１つ以上のビーズ又はボール、最も好ましくは、すり潰しチャンバー、最も好ましくは丸底すり潰しチャンバーにおけるスチール又はタングステンカーバイドの１つ以上のボールを使用して破砕される。
【００２５】
本発明による装置は、特にマルチウェルフォーマットにおいて、とりわけ一般に市販の９６−ウェル又は３８４−ウェルのプレートを使用する、非常に少量の試料の同時並行破砕に顕著に適している。
【００２６】
本発明の他の好ましい態様は、生物分子、特にタンパク及び／又は核酸、さらに特別にDNA及び／又はRNAをさらに単離するための生物試料の破砕のための本発明による装置の使用である。
【００２７】
生物試料は、適当な濃度において溶解効果を有する、以下に“溶解剤（lysing agent）”として言及される補助剤の存在下、特に、洗浄剤及びカオトロピック塩類の存在下で、好ましくは破砕される。適当な濃度において、単離されるべき生物分子の破壊及び／又は変性を防ぎ、かつ以下に“安定剤”として言及されるさらなる材料を添加することは、特に有利である。
【００２８】
単離されるべき生物分子の破壊及び／変性は、酵素、特にヌクレアーゼ及び／又はプロテアーゼ、より特別に液体窒素及び／又は錯化剤、とりわけキレート物質、特に、EDTA及び／又は洗浄剤、とりわけSDS及び／又は塩類、特にカオトロピック塩類及び／又は酸化防止剤による破壊を防止する安定化剤によって、好ましくは防止される。
【００２９】
本発明の他の好ましい態様において、生物試料は、溶解剤及び安定化剤の存在下で破砕される。その細胞は、同時に溶解され、かつ放出された生物分子は、破砕／破壊から防御される。放出された前記生物分子、特にタンパク及び／又は核酸、とりわけDNA及び／又はRNAは、その後単離される。
【００３０】
他の態様において、説明される装置は、前処理された生物試料、特に凍結状態の生物材料を破砕するために特に適しており、分割は、凍結状態、特に液体窒素の下で行われる。この分割方法は、特にヌクレアーゼがこの方法において抑制されるので、RNAを単離するために有利に適している。
【００３１】
上述の装置及びその使用は、特に、言及された好ましい態様において、その後の高処理量分析のための、自動化されたプラットフォーム、特にキアゲン製のバイオロボットと類似するプラットフォーム上での試料の調製に特に理想的に適合する。
【００３２】
本発明による方法を使用して調製された核酸は、生物学的分子を処理するために、特に核酸を増幅するために、とりわけPCR、NASBA、鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification)、リガーゼ鎖反応（LCR）のために、診断学における使用のために、とりわけ本発明による方法によって放出された核酸が、後続の段階において増幅され、かつその後及び／又は同時に、増幅された核酸が検出されることを特徴とする診断方法（例えば、Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl Acad.Sci.88,7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods Applic.4,357-362;Kievits,T.et al.,1991,J.Virol.Meth.35,273-286;Uyttendaele,M.et al.,1994,J.Appl.Bacteriol.77,694-701）の使用のために、特に適している。
【００３３】
さらに、本発明による方法によって利用できるようにされた核酸は、特に、本発明による方法によって調製された核酸が、以下の参照文献（例えば、Bresters,D.et al.,1994,J.Med.Virol.43(3),252-286;Collins M.L.et al.,1997,Nucl.Acids Res.25(15),2979-3984）に記載のように、“分枝した核酸”、特に、分枝したDNA及び／又は分枝したRNA及び／又は対応する核酸のデンドリマーと接触させられることを特徴とするハイブリッド形成反応に基づくシグナル増幅のために特に適しており、そして、生成されたシグナルが検出される。
【００３４】
本発明の他の好ましい態様は、以下の段階を含む方法である。
−本発明による装置を使用して試料を破砕し、
−核酸、特にDNA及び／又はRNAを濃縮し、及び／又は単離し、
−核酸、特に増幅する核酸を、最も特別にはPCR、NASBA、RT-PCR又は他の適当な方法によって、任意に処理し、
−かつ、その後、それにより得られた核酸を任意に分析する。
【００３５】
本発明の他の好ましい態様は、以下の方法である。
−本発明による装置を使用して試料を破砕し、
−かつ、タンパクを、特にアフィニティークロマトグラフィーによって続いて単離及び／又は分析する。
【００３６】
アフィニティークロマトグラフィーの好ましい方法は、例えば、米国特許5 047 513、4 877 830及び5 520 850に説明されたような、抗体及び／又は金属アフィニティー系、特に金属／ヒスチジン（histidine）系、特にNi−ＮＴＡ／6His系に基づく方法である。
【００３７】
本発明による方法を使用すると、特に説明された方法が自動化もされる場合には、短時間で、大量の試料材料を精製及び／又は分析することが可能である。
【００３８】
図１に詳細に示されたホルダー１０は、振動ボールミル（図示されていない）のドライブにホルダー１０を取り付けるための固定穴１２を有するベースプレート１１を有するU型構造である。ベースプレート１１から２つの保持アーム１３が突き出しており、１つの保持アーム１３は、動くように据え付けられ、かつ調整締め付け固定ねじ１４による調整及び固定が可能である。前記２つの保持アーム１３はそれぞれ、挿入されるべきすり潰し容器上に適当に備えられるカムを連動して受容するための凹部１５を有し、凹部１５は、それらの約半円周上に開いており、それにより、その上に載せられたカムを有するすり潰し容器が、開口側から凹部１５に挿入され得る。
【００３９】
図２には、すり潰し容器として提供されたウェルブロック１６が、いわゆるウェル１８の形状に構成された個々のすり潰しチャンバーとともに、詳細に示されている。この種のウェルブロック１６は、好ましくは総計９６個のウェル１８を有する。
【００４０】
図３からわかるように、図２に示されたウェルブロック１６は、ベース１７及びウェルブロック１６の上部に連動して連結された２つのアダプタープレート１９によって、任意にその上に形成されたふたとともに、図１に示されたホルダー１０において締め付け固定され、そしてそれによりウェルブロック１６を、それらの間に確保する。各アダプタープレート１９の外側には、その形状及び寸法が、ホルダー１０の保持アーム１３における凹部１５に適合されており、かつそれの平面上に突き出したカム２０がある。それによって、アダプタープレート１９は、保持アーム１３の間に配置されることができ、その後動作可能な保持アーム１３が、調整締め付け固定ねじ１４によって連結したアダプタープレート１９上の迫台の位置に持ち込まれる。
【００４１】
図４において、さらに詳細に見られるように、ウェルブロック１６のベース１７を受容するアダプタープレート１９は、射出成形法によるウェルブロック１６の製造の結果として通常そこに存在する、ウェルブロック１６のベース１７から突出する直立部を収容するためにその周囲にくぼみ２１を有する。これは、ウェル１８の末端を形成するベース１７が、アダプタープレート１９によって完全に支持され、ウェル１８に配置されるすり潰し手段が、破砕工程の間、ベース１７を通過できないことを確実にする。
【００４２】
図５に示されたプレートは、本発明によって提供される、個々のすり潰しチャンバー（ウェル１８）が多数であるために苦労する、個々のすり潰し手段をウェル１８内に移動する工程を簡単にするために使用され得る。この目的のために、プレート２２は、実施例によって示される態様において、ボール又はビーズとして形成されたすり潰し手段よりも、寸法がやや大きい開口部２３を有する。スライド２４は、プレート２２上に動くように据え付けられ、そして図５に示される押し込み位置（pushed-in position）において、プレート２２における開口部２３のためのベースを形成し、その結果、この位置において、すり潰し手段が開口部２３に挿入され得る。その後、プレート２２は、好ましくは備えられた連動する調節装置によってウェルブロック１６上に配向され、それによって、開口部２３は、ウェルブロック１６におけるウェル１８とともに位置を合わせるように配置される。スライド２４が、その後プレート２２から引き抜かれるときに、すり潰し手段がウェル１８内に落下する。
【００４３】
【実施例】
本発明による方法は、以下に説明された応用例によってより詳細に説明される。
【００４４】
１．緩衝溶液中の９６ウェルブロック（96 well block）における新鮮な未処理葉材料の並行破砕及び溶解
約50mgの、小麦植物からの新鮮な葉の材料が、一般に市販されている９６ウェルプレート（例えばキアゲン）におけるそれぞれ1.2mlの穴に置かれた。タングステンカーバイドから成るすり潰しボール（直径3mm）が、図５に示される装置を使用して各試料に加えられた。400μlの溶解バッファーI（50mM Tris/HCl pH8.0, 10mM EDTA pH8.0, 100mM NaCl, 1% SDS）、２μlのRNase A（100mg/ml）及び2μlの消泡剤（例えばアンチフォームA、シグマ）がそれぞれの穴にピペットで加えられた。９６ウェルプレートは、適当な閉鎖キャップを用いて密封され、そしてアダプタープレートに配置された（図４）。９６ウェルプレート並びに上側及び下側アダプタープレートから成るプレートサンドイッチは（図３）、振動ボールミルのホルダー内に締め付け固定された。この振動ボールミルは、２分間30 ｌ/sの振動数で操作された。前記プレートサンドイッチは、ホルダーから取り外され、９６ウェルブロックは１８０°回転させ、そしてその後にアダプタープレート内に戻された。前記プレートサンドイッチは、振動ミルに再度締め付け固定されるが、このときには、９６ウェルプレートの回転のお陰で、以前は内側にあり、そしてわずかな範囲で振動していた位置が、そのときは外側になり、逆もまた同じであった。前記方法は、30 l/sにおいてさらに２分間続けられた。核酸の、その後の単離のために、タンパク及び多糖類は、3Mの酢酸カリウム140μlの添加によって、沈殿させられた。細胞破片及び沈殿は、遠心分離によって除去され、そしてDNAが上清から単離された。これを行うために、DNAはシリカゲル膜に結合され、そしてバッファーAE（10mM TRIS/HCl pH9.0, 0.5mM EDTA）200μlで繰り返し洗浄した後に溶離された。前記DNAの収量は、葉材料10mg当たり約１μgのDNAであった。溶離液２μlから、葉緑体DNAの非コード領域がユニバーサルプライマーを用いるPCR反応（Taberlet et al.1991）において増幅された。
【００４５】
２．緩衝溶液中の９６ウェルブロックにおける新鮮な未処理葉材料の並行破砕及び溶解：相互汚染の確認
約50mgの、小麦植物からの新鮮な葉材料が、一般に市販されている、1.2mlの穴を有する９６ウェルプレート（例えばキアゲン）に置かれた。葉材料は、９６ウェルプレートにおける２穴ごとにのみ置かれた。実施例１に説明されたように、すり潰しボール、溶解バッファー、RNase A及び消泡剤は、それぞれの穴に加えられた。分割、溶解及びその後のDNA単離並びにPCR増幅は、実施例１に説明されたように行われた。
【００４６】
増幅された材料は、アガロースゲルへ移され、そして臭化エチジウムを用いて染色された。植物材料で充たされた位置において、予想された寸法のDNAバンドが得られたのに対し、植物材料を除いた試料におけるアガロースゲル上では、DNAバンドは認識できなかった。前記破砕方法は、相互汚染を起こさない。
【００４７】
３．液体窒素を使用した９６ウェルブロックにおける凍結葉の破砕
約50mgの小麦植物からの葉材料は、一般に市販の９６ウェルプレート（例えばキアゲン）の1.2mlの穴ごとに置かれた。前記９６ウェルプレートは、適当な閉鎖キャップを用いて遮断され、そしてその試料は、さらなる使用のために必要とされるまで、-80℃において過度に凍結することによって、数日間貯蔵された。
【００４８】
破砕方法及びその後のDNA単離のために、前記９６ウェルプレートは、液体窒素中で予備冷却された。ステンレススチール製のすり潰しボール（直径3mm）が、図５に示された装置（ボールディスペンサー）を用いてそれぞれの穴に加えられた。ウェルは密閉され、前記９６プレートは液体窒素中で再度冷却され、その後対応するアダプタープレート内に挿入された。９６ウェルプレート並びに上側及び下側アダプタープレートからなるプレートサンドイッチは、振動ボールミルのホルダー内に締め付け固定された。前記ミルは、20 l/sの振動数で１分間操作された。前記プレートサンドイッチは、ホルダーから取り外され、９６ウェルプレートは窒素中でもう一度冷却され、そして、１８０°回転された後に、アダプタープレート内に戻された。前記プレートサンドイッチは、その後振動ボールミルに戻され、その中で、９６ウェルプレートの回転の結果として以前は内側であり、かつわずかな振動範囲を有していた位置が、そのときには外側になり、かつ逆もまた同じであった。前記破砕方法は、20 l/sにおいて１分間続けられた。400μlの（８０℃で予熱された）溶解バッファーI及び2μlのRNase A（100mg/l）が、粉砕された材料に加えられた。塩沈殿、DNA単離及びPCR増幅は、実施例１と同様に行われた。
【００４９】
DNAの収量は、葉材料10mg当たり約1μgであった。所望の配列は、すべての試料からうまく増幅することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 振動ボールミルのホルダーの詳細図。
【図２】 ウェルが開いた場合のウェルブロックの詳細図。
【図３】 図１に記載のホルダーにおいて使用するための２つのアダプタープレート間に挿入されたウェルブロック。
【図４】 それらの間に置かれたウェルブロックがない場合の図３に記載の２つのアダプタープレート。
【図５】 ウェルブロック内のウェルにおいてすり潰し手段を挿入するために使用されるプレートの詳細図。
Claims (4)
- タンパク及び／又は核酸の単離のために振動ボールミルにおいて複数の生物試料を同時に破砕するための方法であって、
１０より多いウェルを有するマルチウェルブロックのウェルに各生物試料を配置する工程、
ここで、生物試料を含む個々のウェルにはすり潰し手段が設けられ、さらに前記マルチウェルブロック上に前記ウェルを遮断するためのふたを配置し、
前記ウェルブロックは前記ボールミルのU型ホルダー内に締め付け固定され、
前記ホルダーは２つの向かい合う保持アームを有し、それらの１つは、調整締め付け固定ねじによって前記ウェルブロックを前記ホルダーに締め付けるために動くように据え付けられ、
前記ホルダーはカムによってウェルブロックの回転を防止しており、
前記カムは、前記ウェルブロック上のベース及びふたの平面の上に突出し、前記ホルダーの保持アームの凹部に連動して接合し、
前記凹部の深さは前記カムの高さに対応する；
前記ウェルブロック中の前記生物試料およびすり潰し手段を前記生物試料の破砕に十分な投入エネルギーに付す工程；及び
粉砕試料からタンパク及び／又は核酸を単離する工程を含む方法。 - 振動ボールミルにおいて１０より多いウェルを有するマルチウェルブロック（１６）を固定するためのホルダー（１０）であって：
振動ボールミルのドライブに前記ホルダー（１０）を取り付けるための固定穴（１２）を有するベースプレート（１１）と２つの向かい合う保持アーム（１３）とを有するU型構造を有し；
前記保持アーム（１３）の１つは、前記マルチウェルブロック（１６）を締め付け固定するために動くように据え付けられ、かつ前記マルチウェルブロック（１６）を締め付け固定するための調整締め付け固定ねじ（１４）を有し；
前記マルチウェルブロック（１６）は、前記マルチウェルブロック（１６）の上部及びベース（１７）にそれぞれ連結する２つのアダプタープレート（１９）によって前記ホルダー（１０）内に締め付け固定されることができ、前記アダプタープレート（１９）は平面上に突出するカム（２０）を有し；かつ
前記保持アーム（１３）は、前記カム（２０）により前記アダプタープレート（１９）を前記ホルダー（１０）に配置するための、前記カム（２０）の高さに深さが対応する凹部（１５）をそれぞれ有する
ホルダー（１０）。 - 請求項２に記載のホルダー（１０）とともに使用するための、前記保持アーム（１３）のいずれかの前記凹部（１５）の深さに高さが対応する前記カム（２０）を有するアダプタープレート（１９）。
- １０より多いウェルを有するマルチウェルブロック（１６）のすり潰しチャンバー（ウェル１８）において、すり潰し手段を配置するために、前記マルチウェルブロック（１６）上に配向できるプレート（２２）であって、
前記マルチウェルブロック（１６）の個々のすり潰しチャンバー（ウェル１８）と連結される開口部（２３）が施され、かつ、
前記プレート（２２）上で動くように据え付けられ、かつ、前記開口部（２３）に配置されたすり潰し手段を確保するために、前記プレート（２２）における前記開口部（２３）のための可動ベースを形成しているスライド（２４）を有するプレート。
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