ES2266197T3 - Procedimiento in vintro para la introduccion de acido nucleico en una celula (transfeccion) por medio de fosfato de calcio. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para la introducción de al menos un ácido nucleico en al menos una célula por medio de fosfato de calcio (CaPi), que comprende las etapas: (a) mezclar el (los) ácido(s) nucleico(s) mencionado(s) con al menos una disolución de reacción, que presenta iones Ca2+ y PO43-; (b) incubar la(s) disolución(ones) de reacción, mediante lo cual se forma un precipitado, que presenta al menos ácido nucleico, calcio y fosfato; (c) añadir el precipitado a la célula mencionada; (d) incubar la célula de la etapa (c) con aire en sistema cerrado sin dióxido de carbono (CO2) adicional, mediante lo cual se absorbe(n) el (los) ácido(s) nucleico(s) en la célula.
Description
Procedimiento in vitro para la
introducción de ácido nucleico en una célula (transfección) por
medio de fosfato de calcio.
La presente invención se refiere a un
procedimiento in vitro para la introducción de ácido
nucleico en al menos una célula (transfección) por medio de fosfato
de calcio (CaPi), mezclándose en primer lugar el ácido nucleico con
una disolución de reacción, que presenta iones Ca^{2+} y
PO_{4}^{3-}, incubándose posteriormente la disolución de
reacción, mediante lo cual se forma un precipitado, que presenta al
menos el ácido nucleico, calcio y fosfato, añadiéndose
posteriormente el precipitado a la célula e incubándose de nuevo la
célula, mediante lo cual se absorbe el ácido nucleico en la célula.
Además la presente invención se refiere a un procedimiento para la
producción de la célula transfectada.
Con el creciente interés en la aclaración de la
estructura y la función de genes y proteínas en el marco de la
tecnología genética y la biotecnología se desarrollaron a nivel
mundial en los laboratorios los más diversos métodos, para
introducir ácidos nucleicos en células recién aisladas o
cultivadas. Dependiendo del planteamiento que va a estudiarse
pueden tratarse células con ácido nucleico añadido desde fuera
(ácido nucleico externo) e integrar éste de manera permanente o
bien en el genoma o presentarlo como una molécula de ácido nucleico
extracromosómico en forma de anillo. En ambos casos se multiplica
(replica) el ácido nucleico externo antes de la división celular y
se transmite a la célula hija, por lo que también se denomina este
método de transfección estable. Alternativamente a esto las células
sólo pueden absorber ácido nucleico externo temporalmente
(transfección transitoria), no multiplicándose el ácido nucleico
añadido y por tanto no transmitiéndose a las células hijas en las
divisiones celulares siguientes y perdiéndose según el número de
copias más o menos rápidamente. Las células transfectadas de manera
transitoria se abren (se recogen o se lisan) por regla general
pocas horas o días tras la transfección. Posteriormente a esto se
estudian en ensayos de laboratorio adicionales por ejemplo la
función de las proteínas codificadas en el ácido nucleico externo,
que se expresaron tras la transfección en la célula.
Independientemente del procedimiento, que se
utiliza para la introducción de ácido nucleico en la célula, la
eficacia tanto en el caso de la transfección estable como en el
caso de la transitoria depende mucho del tipo de célula utilizado.
Las células que ya se encuentran en cultivo durante un periodo de
tiempo más largo (líneas celulares) se diferencian parcialmente en
una pluralidad en su capacidad de absorber ácido nucleico externo y
expresar las proteínas codificadas en ellas. Así puede ser un
método de transfección, que se estableció para un tipo de célula y
que conduce a buenas eficacias de transfección, completamente
inadecuado en el caso de otro tipo de célula.
Uno de los procedimientos más antiguos para
introducir ácidos nucleicos en células utiliza el polisacárido
DEAE-dextrano como sustancia soporte para un ácido
nucleico externo. El DEAE-dextrano se utilizó en
células originariamente como mediador para la introducción de ácido
ribonucleico (ARN) del virus de la polio (Vaheri y Pagano (1965)
Virology 27:434) así como de ácido desoxirribonucleico (ADN) del
virus de los simios (SV40) y de virus de polioma (McCutchan y
Pagano (1968) J. Natl. Cancer Inst. 41:351; Warden y Thorne (1968)
J. Gen. Virol. 3:371). El método se aplica también todavía hoy en
día con escasas modificaciones para la transfección de genomas
virales y de moléculas de ADN anulares (plásmidos), que portan
secuencias de genes virales. Aunque no se conoce el mecanismo de
acción exacto del DEAE-dextrano, se supone que el
polímero une el ácido nucleico externo, en la mayoría de los casos
ADN externo, y así impide el ataque de enzimas que destruyen el
ácido nucleico celular (nucleasas) y/o se une el mismo a la
superficie de las células y mediante esto favorece la absorción de
ADN en la célula por medio de endocitosis. Las transfecciones
mediadas por DEAE-dextrano se utilizan de manera
habitual exclusivamente para la expresión transitoria de genes
clonados y no para la transfección estable de células. Las líneas
celulares establecidas tales como por ejemplo
BSC-1, CV-1 y COS pueden
transfectarse muy bien con DEAE-dextrano, mientras
que otras líneas celulares establecidas tales como por ejemplo las
células HeLa son inadecuadas posiblemente debido a la toxicidad del
polímero. Para la transfección con DEAE-dextrano se
utilizan por regla general cantidades reducidas de ADN externo,
consiguiéndose eficacias de transfección máximas de 10^{5}
células con sólo 100 - 200 ng de ADN de plásmido. Cantidades mayores
de ADN (< 2 - 3 \mug) no muestran ningún aumento de efecto
sino uno inhibitorio. En contraposición con otros procedimientos de
transfección, que aún se describirán en lo sucesivo, que requieren
elevadas concentraciones de ADN, no se añade para la transfección
mediada por DEAE-dextrano ningún ADN soporte
adicional tal como por ejemplo ADN de esperma de salmón o de
arenque al ADN externo que va a transfectarse. Aunque este
procedimiento de transfección se desarrolló ya hace más de 30 años,
se realiza en la mayoría de los casos sólo con escasas
modificaciones del procedimiento descrito originariamente. Sin
embargo, mientras tanto se conoce que tanto la concentración del
DEAE-dextrano utilizada como el tiempo, durante el
cual están expuestas las células a la mezcla de
ADN/DEAE-dextrano (tiempo de incubación), son
críticos para el éxito de la transfección.
Dado que no se puede transfectar eficazmente con
ayuda de DEAE-dextrano todas las líneas celulares
establecidas, se desarrollaron métodos de transfección alternativos.
En un procedimiento adicional se utiliza el policatión polibreno
como mediador sobre todo para la introducción de ADN en células, que
han demostrado ser resistentes frente al
DEAE-dextrano (Kawai y Nishizawa (1984) Mol. Cell.
Biol. 4:1172; Chaney et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet.
12:237). En contraposición con la transfección mediada por
DEAE-dextrano, el polibreno es adecuado no sólo para
la transfección transitoria de células sino también para la estable.
Sin embargo este procedimiento de transfección se limita a ácidos
nucleicos con un peso molecular reducido, por ejemplo ADN de
plásmido.
\newpage
Además puede introducirse en éstas ADN clonado
mediante la fusión de protoplastos, que se obtienen a partir de
bacterias, que portan el ADN de plásmido de interés, con las
células cultivadas (Schaffner (1980) Proc. Natl. Acad. Sci.
77:2163; Rassoulzadegan et al. (1982) Nature 295:257). Para
este procedimiento se cultivan bacterias en presencia de
cloranfenicol, para amplificar el ADN de plásmido, que portan las
bacterias en su interior en un número de copias elevado.
Posteriormente se tratan las bacterias con la enzima lisozima,
mediante lo cual se destruye su pared celular. Los protoplastos así
obtenidos se mezclan con las células que van a transfectarse,
añadiéndose el polímero polietilenglicol (PEG), para favorecer la
fusión de la célula y el protoplasto bacteriano. Durante este
proceso llega tanto el ADN de plásmido como el ADN del cromosoma
bacteriano en la célula que va a transfectarse, transportándose de
una manera hasta ahora no aclarada el ADN de plásmido en el núcleo
celular de la célula. Posteriormente se elimina el PEG y se mezclan
las células con un medio de cultivo celular nuevo, que contiene un
antibiótico, por regla general canamicina, para impedir el
crecimiento de bacterias que han sobrevivido. El método de la
fusión de protoplastos se utilizó tanto para la expresión
transitoria de genes clonados como para el establecimiento de
líneas celulares de mamífero. Cuando se mezclan bacterias y células
de mamíferos en una razón de 10.000:1, se transfectaron de manera
transitoria células de mamífero con una eficacia de aproximadamente
el 6% (Schaffner (1980), anteriormente). Con esto el procedimiento
de la fusión de protoplastos en comparación con otros métodos de
transfección es comparativamente ineficaz, sin embargo es adecuado
especialmente para la introducción de ADN en líneas celulares, que
son resistentes frente a la endocitosis de ADN mediado por
DEAE-dextrano. Además se observó, que la fusión de
protoplastos con mucha frecuencia conduce a la integración de
varias copias del ADN de plásmido en el cromosoma huésped (Robert
de Saint Vincent et al. (1981) Cell 27:267).
El uso de un impulso eléctrico corto con una
tensión elevada se utilizó igualmente, para introducir ADN en un
gran número de bacterias, células vegetales y de mamíferos (Neumann
et al. (1982) EMBO J. 1:841; Wong y Neumann (1982) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 107:584; Potter et al. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:7161; Fromm et al. (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. 82:5824, Fromm et al. (1986) Nature 319:791;
Andreason y Evans (1988) BioTechniques 6:650). Este procedimiento
de transfección se denomina electroporación (Neumann et al.
(1982), anteriormente). Este procedimiento es adecuado tanto para
la transfección de células transitoria como para la estable, sin
embargo las eficacias de transfección conseguidas se diferencian en
los informes individuales parcialmente en una pluralidad. Mediante
el impulso se generan los poros más pequeños en el orden de
magnitud de pocos nanómetros en la membrana plasmática de la célula
que va a transfectarse, (Neumann et al. (1982),
anteriormente; Zimmermann (1982) Biochim. Biophys. Acta 694:227).
El ADN externo se absorbe en el citoplasma de la célula o bien
directamente a través de estos poros o bien como consecuencia de
una reorganización de los componentes de membrana, que acompaña el
cierre de nuevo de los poros generados. En contraposición con la
transfección mediada por DEAE-dextrano o con la
fusión de protoplastos, la electroporación conduce por regla
general a líneas celulares, que presentan una o sólo ocasionalmente
varias copias del ADN externo (Boggs et al. (1986) Exp.
Hematol. 14:988). La eficacia de la transfección se influye
precisamente en el caso de la electroporación por un gran número de
factores. A este respecto se reconocieron como especialmente
críticos la potencia del campo eléctrico aplicado (Patterson (1979)
Methods Enzymol. 58:141), la duración del impulso eléctrico
(Rabussay et al. (1987) Bethesda Res. Lab. Focus
9(3):1), la temperatura (Reiss et al. (1986) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 137:244; Chu et al. (1987) Nucleic
Acids Res., 15:1311), la conformación y la concentración del ADN
externo (Neumann et al. (1982), anteriormente; Potter et
al. (1984), anteriormente) así como la composición iónica del
medio (Rabussay et al. (1987), anteriormente). Aunque con la
ayuda de la electroporación en determinadas circunstancias pueden
alcanzarse eficacias de transfección muy elevadas, el gran número
de parámetros críticos muestra que precisamente este procedimiento
debe ajustarse de manera muy exacta a las condiciones
experimentales. Los ensayos previos necesarios para la optimación
de la transfección mediante electroporación se dificultan
adicionalmente mediante el hecho, de que los equipos de
electroporación más diversos están disponibles en el comercio, que
se diferencian claramente con respecto a los parámetros
ajustables.
Un procedimiento alternativo para la
introducción de ácido nucleico externo en células se basa en la
microinyección directa de ADN en el núcleo celular (Capecchi (1980)
Cell 22:479). Este procedimiento posee la ventaja, que el ADN
externo no entra en contacto con compartimentos celulares, tal como
por ejemplo los endosomas con un valor de pH bajo, que puede
modificar químicamente el ADN introducido. Pero dado que en el
contexto de la microinyección debe transfectarse con ADN cada
célula independientemente, este procedimiento no es adecuado en
ningún caso para una aplicación a escala industrial, pero que se
necesita para los análisis bioquímicos. Por tanto el uso de la
microinyección como procedimiento de transfección se mantiene
limitado a la aplicación en el laboratorio de investigación y sólo
se aplica, cuando los planteamientos especiales de un problema lo
requieren.
Para la introducción de ácido nucleico externo
en células se estudiaron además vesículas de membrana artificiales
(liposomas) de manera intensa, determinándose que estas vesículas
de transporte son adecuadas in vitro e in vivo, para
introducir el ADN de interés en las células. En este procedimiento
se incluye el ARN o ADN externo debido a su carga total negativa en
liposomas. Posteriormente se mezclan los liposomas con las células
que van a transfectarse, mediante lo cual se funde el lado exterior
de los liposomas por su similitud con la membrana celular a ésta y
se transporta el ácido nucleico al interior de la célula diana
(artículo general: Mannino y Gould-Fogerite (1988)
BioTechniques 6:682). Aunque esté procedimiento tanto puede
realizarse fácilmente como conduce a buenos resultados con respecto
a la eficacia de la transfección, no puede utilizarse a escala
industrial debido al elevado precio de los liposomas
necesarios.
Sin embargo el procedimiento para la
introducción de ácido nucleico externo en células utilizado con
diferencia con más frecuencia es la transfección mediada por
fosfato de calcio (CaPi). Ya en el año 1973 se determinó por parte
de Graham y van der Eb, que la absorción de ADN en células
cultivadas puede aumentarse claramente, cuando estas se encuentran
como coprecipitado de fosfato de calcio - ADN (Graham y van der Eb
(1973) Virology 52: 456). En estos ensayos iniciales se introdujo
ADN de SV40 y adenovirus en células, que crecían en contacto fuerte
con el suelo del recipiente de cultivo (células adherentes). Para
esto se utilizó calcio en una concentración de 125 mM y ADN en una
concentración de desde 5 hasta 30 \mug/ml, observándose la
formación óptima de un coprecipitado de CaPi - ADN con un valor de
pH neutro de 7,05. El mecanismo exacto de la transfección de ADN
mediada por CaPi es desconocido de manera similar tal como en el
caso del DEAE-dextrano, sin embargo se supone que
se absorbe el ADN transfectado por medio de endocitosis en el
citoplasma de la célula huésped y se transporta desde allí en el
núcleo celular. Adicionalmente a la determinación de los intervalos
de concentración críticos de calcio y ADN habían fijado Graham y
van der Eb el tiempo de reacción óptimo para la formación del
coprecipitado de CaPi - ADN a 20 - 30 min y la incubación posterior
de las células con el coprecipitado a 5 - 24 h. Estos trabajos
iniciales fijaron los cimientos para el desarrollo de un
procedimiento de transfección eficaz, que se modificó de múltiples
maneras por parte de los laboratorios más diversos desde entonces
en más de 30 años. Un aumento adicional de la eficacia de
transfección se alcanzó por ejemplo mediante la introducción de un
choque de glicerol adicional (Parker y Stark (1979) J. Virol.
31:360) y/o un tratamiento de cloroquina (Luthman y Magnusson
(1983) Nucleic Acids Res. 11:1295). Igualmente se describió el uso
de butirato de sodio como ventajoso para la expresión de proteínas
de genes codificados sobre plásmidos, que presentan un potenciador
SV40 (Gormann et al. (1983a) Nucleic Acids Res. 11:7631;
Gormann et al. (1983b) Science 221:551).
En el contexto del gran número de modificaciones
de la transfección de células mediadas por CaPi se combinó el
tratamiento con cloroquina, que impide la degradación del ADN
externo mediante hidrolasas lisosomales con la aplicación de un
choque de glicerol, que aumenta la absorción del ADN externo en las
células. Dependiendo del tipo de las células de partida pueden
transfectarse simultáneamente con ayuda de CaPi de manera rutinaria
el 90% de las células cultivadas. Por tanto la transfección mediada
por CaPi es con frecuencia el método elegido tanto para la
expresión transitoria de ADN externo en un gran número de células
como para el establecimiento de líneas celulares estables, que tras
la transfección presentan copias integradas del ADN externo.
La publicación US 7.156.579 (publicada el 2 de
agosto de 1988) da a conocer la transformación de células de
mamífero, que comprende la transfección mediada por fosfato de
calcio con el control de ciertos parámetros críticos incluyendo la
tasa de adición de fosfato de calcio, del valor de pH y del nivel
de CO_{2} durante la incubación, pudiendo producirse con este
procedimiento líneas celulares transformadas estables con una
eficacia del 10-50%.
La transfección mediada por CaPi es
especialmente adecuada para la transfección eficaz de células de
mamífero, que expresan el ADN externo tras la transfección de
manera estable a través de muchos pasos de cultivo celular (Chen y
Okayama (1987) Mol. Cell. Biol. 7:2745). En el contexto de este
protocolo se formó el coprecipitado de CaPi - ADN lenta y
escalonadamente durante la incubación con la células que van a
transfectarse en el medio de cultivo celular sobre las células.
Para una transfección eficaz se reconoció como crítico un valor de
pH del tampón utilizado de 6,95 y una concentración de ADN circular
de 20 - 30 \mug por aproximadamente 10^{6} células. Sin embargo
estos resultados sólo pudieron conseguirse con ADN cerrado anular
(ADN de plásmido), mientras que el ADN lineal no pudo transfectarse
en las células con ayuda de este procedimiento. Los autores
utilizaron para la transfección mediada por CaPi células de
crecimiento exponencial, que se trataron con tripsina antes de la
transfección y posteriormente se sembraron en bandejas de cultivo
celular en una densidad de células de aproximadamente 5 x 10^{6}
células por 75 cm^{2}. Las células se incubaron durante la noche
con 10 ml de un medio de cultivo nutritivo normal. Al día siguiente
se incubaron 10 - 30 \mug del ADN de plásmido de interés con 0,5
ml de CaCl_{2} 0,25 M, 0,5 ml de solución salina tamponada 2 x
BES (2 x BBS), que contenía BES 50 mM (pH 6,95), NaCl 280 mM y
Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, durante 10 - 20 min a temperatura
ambiente. El coprecipitado de CaPi - ADN formado en este intervalo
de tiempo se añadió en una cantidad de 1 ml gota a gota al medio de
cultivo celular de las células. Las bandejas de cultivo celular se
agitaron de manera ligera posteriormente, para distribuir la mezcla
de CaPi - ADN homogéneamente en el medio. Siguió una etapa de
incubación durante 15 - 24 h a 35ºC en una atmósfera de CO_{2} al
2 - 4%. Después se eliminó el medio, y se lavaron las células dos
veces en medio de cultivo nutritivo, posteriormente se mezcló con
medio de cultivo nutritivo nuevo y se incubó de nuevo durante 24 h
adicionales a 35 - 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Las
células se distribuyeron para la selección de transformantes
estables en una razón de 1:10 sobre nuevos recipientes de cultivo
celular.
Aunque los autores han descrito con este
procedimiento por primera vez tanto una reducción de la temperatura
de la primera fase de incubación de habitualmente 37ºC hasta 35ºC
como la reducción de la atmósfera de CO_{2} de habitualmente al
5% hasta al 2 - 4%, preferiblemente CO_{2} al 3% (cambio de
temperatura; cambio de CO_{2}), se mantiene la aplicación de su
procedimiento a escala de laboratorio y no es adecuado para la
aplicación a escala industrial.
En los procedimientos descritos en la literatura
se parte generalmente, de que las células que se encuentran en
cultivo se mantienen en un medio de cultivo nutritivo y un
atmósfera de CO_{2} fuertemente enriquecida (Taylor et al.
(1973) In Vitro 7(5):295; Minshull y Strong (1985)
Int. J. Biochem. 17(4):529). El aire, que rodea como mezcla
de gases la tierra como cubierta, se compone además de
aproximadamente el 77% de nitrógeno, el 21% de oxígeno de
aproximadamente el 1,2% de vapor de agua, el 0,9% de argón, el
0,01% de hidrógeno y el 0,03% de dióxido de carbono (CO_{2}).
(Der kleine Brockhaus Enzyklopádie, de dos tomos (1950) Wiesbaden,
Alemania).
Una concentración de CO_{2} aumentada
aproximadamente 100 - 300 veces frente al aire normal (CO_{2} al
3 - 10%) se considera esencial para un crecimiento eficaz de
células en condiciones de cultivo celular, que se proporcionan en
una incubadora de cultivo celular mediante la alimentación de
CO_{2} externo (Chen y Okayama, anteriormente; Chen y Okayama
(1988) BioTechniques 6:632; Wilson (1995) Analytical Biochemistry
226:212).
En el documento WO 96/07750 se describe
igualmente un procedimiento para la transfección eficaz de células
huésped eucariotas con ADN mediante la transfección mediada por
CaPi. Aunque en esta solicitud de patente internacional se describe
un procedimiento, con el que se obtiene partículas de
coprecipitado de CaPi - ADN lo más grandes posibles, se parte
también aquí de condiciones de cultivo normales con respecto a la
atmósfera de CO_{2} utilizada (CO_{2} al 5%). Se consideran como
especialmente críticos por el contrario para la transfección
mediada por CaPi la concentración de Ca^{2+} y PO_{4}^{3-}, el
valor de pH y la temperatura (35ºC). Frente a esto puede
conseguirse una reducción de las partículas de coprecipitado de
CaPi - ADN, reduciendo el valor de pH de medio de cultivo nutritivo
lentamente con motivo del CO_{2} producido a través de las
células (formación de HCO_{3}^{-} mediante el CO_{2} y
H_{2}O que se encuentran en el medio de cultivo nutritivo) así
como la producción endógena de ácido láctico de las células. Sin
embargo el pequeño tamaño de partícula del coprecipitado de CaPi -
ADN así obtenido sólo es adecuado para la transfección de
determinados tipos de células, de modo que este procedimiento no es
aplicable generalmente para las líneas celulares normales. Aunque
esta solicitud de patente internacional describe la aplicación a
escala industrial de la transfección de ADN mediada por CaPi en
células en un biorreactor de hasta 40 l, debe añadirse a éste
también CO_{2} externo, para permitir un crecimiento celular
eficaz.
Por consiguiente todos los numerosos
procedimientos de transfección de CaPi - ADN descritos en el estado
de la técnica parten de una gasificación de CO_{2} externa de las
células cultivadas, para lo cual se utilizan espacios de
incubación especiales (incubadoras, biorreactores), que poseen una
entrada de CO_{2} regulable. Pero precisamente para la aplicación
a escala industrial deben conseguirse especialmente bajo el aspecto
de los costes, condiciones de reacción sencillas y con poco
esfuerzo.
Por tanto la presente invención se basó en el
objetivo de conseguir un procedimiento para la introducción eficaz
de ácido nucleico en una célula mediante una transfección mediada
por CaPi, que pueda realizarse de manera económica a escala
industrial.
Ahora bien se encontró sorprendentemente que el
ácido nucleico puede introducirse en las células por medio de una
transfección mediada por CaPi de manera eficaz, cultivándose las
células en el sistema de cultivo cerrado sin gasificación de
CO_{2} externa.
Por tanto es un objeto de la presente invención
un procedimiento in vitro para la introducción de al menos
un ácido nucleico en al menos una célula por medio de fosfato de
calcio (CaPi), que comprende las etapas de:
- (a)
- mezclar el (los) ácido(s) nucleico(s) mencionado(s) con al menos una disolución de reacción, que presenta iones Ca^{2+} y PO_{4}^{3-};
- (b)
- incubar la(s) disolución(ones) de reacción, mediante lo cual se forma un precipitado, que presenta al menos ácido nucleico, calcio y fosfato;
- (c)
- añadir el precipitado a la célula mencionada;
- (d)
- incubar la célula de la etapa (c) con aire en sistema cerrado sin dióxido de carbono (CO_{2}) adicional, mediante lo cual se absorbe(n) el (los) ácido(s) nucleico(s) en la célula.
En otra forma de realización preferida se
transfectan sucesivamente dos o más ácidos nucleicos diferentes,
especialmente dos o tres ácidos nucleicos diferentes. A este
respecto se prefiere especialmente que en el caso de una nueva
transfección se utilice un medio nuevo.
Puesto que la incubación en la etapa (d) tiene
lugar con aire en sistema cerrado sin dióxido de carbono (CO_{2})
adicional, se consigue especialmente que el procedimiento de
transfección mediado por CaPi pueda realizarse a escala industrial
en condiciones sencillas y económicas.
Por las denominaciones "transfección mediada
por fosfato de calcio (CaPi)" y "coprecipitado de CaPi -
ADN" se entienden en el sentido de la presente invención la
introducción de ácido nucleico externo en una célula huésped con
ayuda de un coprecipitado, que se compone de iones Ca^{2+} y
PO_{4}^{3-} así como del ácido nucleico que va a introducirse.
A este respecto el precipitado presenta hidroxiapatita (con la
fórmula química de manera nutricional de (Ca_{5}OH
(PO_{4})_{3})_{2}).
(PO_{4})_{3})_{2}).
Como ácido nucleico externo puede utilizarse
tanto cualquier tipo de ARN (ARNm, ARNr, etc.) como cualquier tipo
de ADN, sin embargo preferiblemente ADN genómico, ADNc, ADN lineal o
ADN de plásmido. Se prefiere especialmente el uso de ADN de plásmido
cerrado circular, que se obtiene según procedimientos habituales a
partir de bacterias transformadas.
El ácido nucleico, que es preferiblemente ADN de
plásmido, se utiliza en el contexto de la presente invención en una
cantidad de aproximadamente 0,2 \mug - 20 \mug, preferiblemente
de aproximadamente 1 \mug - 20 \mug, especialmente de
aproximadamente 2 \mug - 10 \mug, pero sobre todo de
aproximadamente 6 \mug por aproximadamente 10^{6} células.
Dentro de estas cantidades utilizadas se consiguen eficacias de
transfección elevadas.
\newpage
En una forma de realización especialmente
preferida pueden transfectarse con ayuda del procedimiento según la
invención simultánea o sucesivamente dos o más ácidos nucleicos
externos diferentes, especialmente dos o tres ácidos nucleicos
externos diferentes. Para esto se mezclan los ácidos nucleicos de
interés y se utilizan para la formación del coprecipitado de CaPi -
ADN. A este respecto se prefiere especialmente el uso de dos o tres
ADN de plásmido diferentes (cotransfección).
Además es especialmente ventajoso, ajustar el
valor de pH de la disolución de reacción en la etapa (b) a
temperatura ambiente a entre aproximadamente 6,8 - 7,1,
preferiblemente a entre aproximadamente 6,86 - 7,05, especialmente
hasta aproximadamente 7,05, mediante lo cual se consigue la mayor
eficacia de transfección.
Igualmente se prefiere realizar la incubación de
la disolución de reacción en la etapa (b) a temperatura ambiente
(aproximadamente 18 - 24ºC) durante aproximadamente 5 - 30 min,
preferiblemente durante aproximadamente 10 - 20 min, especialmente
durante aproximadamente 15 min. A este respecto se obtienen tamaños
de partícula de coprecipitado de CaPi - ADN, que han demostrado ser
especialmente ventajosos para una transfección eficaz.
En otra forma de realización especialmente
preferida la incubación de las células tiene lugar en la etapa (d)
a aproximadamente 37ºC en una estufa durante aproximadamente 20 -
72 h, de manera preferible aproximadamente 30 - 72 h, de manera
especial aproximadamente 24 - 48 h, sobre todo aproximadamente 40 -
48 h. Este periodo de tiempo ha demostrado ser óptimo, para que las
células puedan "recuperarse" antes del tratamiento con el
coprecipitado de CaPi - ADN y la absorción que ha tenido lugar del
ácido nucleico externo, antes de que se utilicen para estudios
adicionales del ácido nucleico externo o de la expresión de los
genes codificados sobre el ácido nucleico.
En una forma de realización adicional se
mantiene el ácido nucleico externo absorbido de manera permanente
en la célula transfectada (transfección estable). A este respecto
se multiplica por ejemplo como partícula de ADN episomal,
extracromosómico, en la célula mediante un origen de replicación
adecuado y se transmite a la célula hija de manera controlada en la
división celular.
Alternativamente a esto puede integrarse el
ácido nucleico externo introducido también, cuando no presenta
ningún origen de replicación, de manera dirigida o no dirigida en
el genoma de la célula, mediante lo cual se mantiene igualmente
estable, se replica antes de la división celular junto con el
genoma de la célula huésped y posteriormente se transmite a la
célula hija en la división celular.
En una forma de realización alternativa se
mantiene el ácido nucleico externo absorbido sólo en la célula
transfectada. Dado que no presenta ningún origen de replicación
adecuado, no se replica y no se transmite de manera dirigida a la
célula hija en la división celular (transfección transitoria). Este
procedimiento alternativo es sobre todo ventajoso cuando sobre el
ácido nucleico externo se expresan genes codificados en la célula
huésped, para posteriormente analizarse en ensayos adicionales.
Además este procedimiento alternativo es adecuado para el estudio
de genes, cuyos productos génicos (proteínas) son tóxicos para la
célula, de modo que la célula no sobreviviría en caso de un paso de
cultivo celular.
En una forma de realización preferida se utiliza
como célula de partida para la transfección especialmente una
célula eucariota, preferiblemente una célula de mamífero y
especialmente una célula humana, tal como por ejemplo una célula
HeLa.
Como células de partida para el procedimiento
según la invención pueden utilizarse especialmente células de
cultivos celulares de crecimiento adherente, que crecen en contacto
constante con el recipiente de cultivo, especialmente sobre el
suelo del recipiente de cultivo en un "césped". Por lo demás
las células pueden crecer de manera adherente sobre microsoportes.
Líneas celulares preferidas son por ejemplo líneas epidérmicas
tales como células HeLa o 293.
Pero en una forma de realización alternativa
pueden utilizarse también células que crecen y se multiplican sin
contacto constante con el recipiente de cultivo en el medio de
cultivo celular, tal como por ejemplo células sanguíneas o células
del sistema linfático, que en el organismo natural tampoco
necesitan ningún contacto célula-célula para el
crecimiento y cuyo crecimiento es independiente de la dirección.
Además son adecuadas líneas celulares que se adaptaron al
crecimiento en cultivo de suspensión.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento in vitro para la producción de una célula
transfectada, introduciéndose el al menos un ácido nucleico en al
menos una célula por medio de CaPi según el procedimiento según la
invención, así como la célula transfectada, que se obtiene con
ayuda del procedimiento según la invención.
La célula transfectada puede utilizarse
especialmente para la producción de virus adenoasociados
recombinantes (rVAA). Una descripción detallada de la producción de
los rVAA con ayuda del procedimiento según la invención se describe
en los ejemplo, pretendiendo los ejemplos únicamente explicar con
más detalle la invención, sin limitarla a los mismos.
| Células HeLa-t | MediGene Master Cell Bank |
| Placas (de pocillos) de 6 orificios | NUNC; Nº Cat. 152795 |
| Frascos de cultivo celular T25 | NUNC; Nº Cat. 136196 |
| Frascos de cultivo celular T185 | NUNC; Nº Cat. 144903 |
| Apilamiento de cubas | NUNC; Nº Cat. 164327 |
| Medio de cultivo celular DMEM | LifeTechnologies; Nº Cat. 41965-039 |
| Suero de ternera fetal (STF) | PAA; Nº Cat. A15-653 |
| FKS-América del Norte | Gibco; Nº Cat. 10084-169 |
| L-glutamina | LifeTechnologies; Nº Cat. 25030-024 |
| Antibiótico/Antimicótico (AB/AM) | PAA; Nº Cat. P11-002 |
| Gentamicina | Gibco; Nº Cat. 15750-037 |
| CaCl_{2} | Sigma; C-7902 |
| H_{2}O | Sigma; W-3500 |
| 0,2 \mum filtro de aire | NUNC; Gelman 4210 |
| 2 x tampón BBS | BES 50 mM, NaCl 280 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,75 mM, NaH_{2}PO_{4} |
| 0,75 mM, pH 6,8-7,1 óptimo), | |
| Reactivo luciferasa | Promega E1501 |
| Tampón de lisis tritón | Promega E1501 |
| Equipo de medición luciferasa | Berthold Lumat LB 9501 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Plásmido auxiliar pSVori | Chiorini et al. (1995) Hum Gene Ther 6 (12):1531 |
| Plásmido auxiliar pUC"rep/fs/cap"(RBS)\Delta37 | DE19905501 |
| Plásmido auxiliar pUC"rep/cap"\Delta37 | DE19905501 |
| Plásmido auxiliar pUC"rep/cap"(RBS)\Delta37 | DE19905501 |
| Plásmido transgénico VAA-(B7.2libre/GMCSF) | DE19905501 |
| Plásmido pCI-luc | Ejemplo 5 |
| Plásmido transgénico pVAA-GFP | Ejemplo 5 |
| Plásmido transgénico pVAA-(B7.2) | Ejemplo 5 |
| Adenovirus-5 | ATCC |
Se sembraron 3 x 10^{5} células
HeLa-t en 3 ml de medio completo DMEM (500 ml de
DMEM + 50 ml de FKS + 5 ml de L-glutamina + 5 ml de
AB/AM) en cada caso en un orificio (pocillo) de una placa de 6
pocillos y se incubaron durante 16 - 24 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. Se
realizaron todas las transfecciones en tripletes, realizándose en
total cuatro transfecciones distintas: con o sin cambio de la
temperatura o de la atmósfera de CO_{2} en combinación con o sin
cambio de medio. El cambio de medio tuvo lugar directamente antes de
la adición de los precipitados de ADN - CaPi. A este respecto se
cambió el medio usado por 3 ml de medio completo nuevo, sin
gasificar, precalentado.
Por cada pocillo se mezclaron bien 6 \mug de
ADN pCI-luc con 150 \mul de CaCl_{2} 260 mM y
después se mezclaron con cuidado con 150 \mul de 2 x BBS. La
disolución se dejó reposar durante 15 min a temperatura ambiente.
Después se pipetearon por cada pocillo respectivamente 300 \mul de
la mezcla de ADN - CaPi rápidamente a los 3 ml de medio en un
pocillo.
Se incubaron las muestras sin cambio de
temperatura/CO_{2} directamente a 37ºC/CO_{2} al 5%. Por el
contrario se incubaron las muestras con cambio durante 16 - 20 h a
35ºC/CO_{2} al 3% y sólo después a 37ºC/CO_{2} al 5%.
Tras un total de aproximadamente 40 - 48 h se
recogieron las células y se midió la expresión de luciferasa.
Además de esto se lavaron las células con 500 \mul de PBS, se
lisaron en 500 \mul de tampón de lisis tritón a temperatura
ambiente y se separaron de la superficie con una rasqueta de
células. Se llevó el lisado a un tubito de centrifugación de 1,5 ml
y se centrifugó durante 2 min con un índice de giro máximo. Se
añadieron 2 \mul del residuo a 50 \mul de reactivo luciferasa y
se midieron inmediatamente.
Se dividió el valor de medición entre el número
de las células transfectadas (= células sembradas x 2) y se
multiplicó por 1 x 10^{6}, de modo que el valor se refiere a 1 x
10^{6} células.
| + cambio de temperatura/CO_{2} | - cambio de temperatura/CO_{2} | ||
| - cambio de medio | + cambio de medio | - cambio de medio | + cambio de medio |
| 9,12 x 10^{8} | 7,15 x 10^{8} | 6,93 x 10^{8} | 7,49 x 10^{8} |
| 100% | 78% | 76% | 82% |
Este experimento hace evidente que el método
habitual con cambio de temperatura/CO_{2} y sin cambio de medio
muestra una eficacia de transfección similar que las mezclas
básicas de prueba restantes (véase la tabla 1).
Se cultivaron células HeLa-t en
medio completo de DMEM (500 ml de DMEM + 50 ml de FKS + 5 ml de
L-glutamina + 5 ml de AB/AM) a 37ºC/CO_{2} al 5%.
Se sembraron 5 x 10^{5} células por frasco T25 en 5 ml de medio
completo. Se incubaron las células durante 16 - 24 h a
37ºC/CO_{2} al 5%. Después se cambió el medio usado por 3 ml de
medio nuevo, sin gasificar, calentado.
Por cada T25 se mezclaron 6 \mug de ADN con
150 \mul de CaCl_{2} 260 mM y posteriormente se mezclaron con
cuidado con 150 \mul de 2 x BBS. Se dejó reposar la disolución
durante 15 min a temperatura ambiente. Después se pipetearon por
cada frasco T25 respectivamente 300 \mul de la mezcla de ADN -
CaPi rápidamente a los 3 ml de medio en el frasco.
Se incubaron las muestras sin cambio de
temperatura y sin gasificación con CO_{2} en una incubadora a
37ºC sin gasificación de CO_{2}. Además de esto se cerraron las
tapas adicionalmente con parafilm de tres capas. Se incubaron las
muestras con cambio de temperatura durante 16 - 20 h a
35ºC/CO_{2} al 3% y sólo después a 37ºC/CO_{2} al 5%.
Tras un total de 40 - 48 h de incubación se
recogieron las células y se midió la expresión de luc. Además de
esto se lavaron las células con 2.000 \mul de PBS, se lisaron en
1.000 \mul de tampón de lisis tritón a temperatura ambiente y se
separaron de la superficie con una rasqueta de células. Se llevó el
lisado a un tubito de centrifugación de 1,5 ml y se centrifugó
durante 2 min a un índice de giro máximo. Se añadieron 2 \mul del
residuo en 50 \mul de reactivo luciferasa y se midieron
inmediatamente.
Se dividió el valor medido entre el número de
células transfectadas (= células sembradas x 2) y se multiplicó por
1 x 10^{6}, de modo que se obtiene un valor que se refiere a 1 x
10^{6} células.
Se realizaron 2 experimentos independientes con
respectivamente 3 mezclas básicas de prueba promediadas. Se
mantuvieron las células sin gasificación de CO_{2} libres de
CO_{2} durante la transfección. Antes de las transfecciones tuvo
lugar en cada caso un cambio de medio. Se expresan los valores de
medición en cada caso en ULR por 1 x 10^{6} células. Se igualaron
al 100% los valores con CO_{2} y cambio (= patrón).
| Ensayo 1 | Ensayo 2 | ||
| + CO_{2} + cambio de | - CO_{2} - cambio de | + CO_{2} + cambio de | - CO_{2} - cambio de |
| temperatura | temperatura | temperatura | temperatura |
| 5,64 x 10^{8} | 5,06 x 10^{8} | 2,54 x 10^{8} | 2,76 x 10^{8} |
| 100% | 90% | 100% | 109% |
Estos resultados muestran que la transfección
sin gasificación de CO_{2} y sin cambio de temperatura es igual de
eficaz que el método habitual con gasificación de CO_{2} y con
cambio de temperatura (véase la tabla 2).
1) Se clonó pCI-luc de la manera
siguiente:
Se cortó el vector pBL
(Hoppe-Seyler et al. (1991) J. Virol.
65:5613-; Butz y Hoppe-Seyler (1993) J. Virol.
67:6476) con las enzimas de restricción SmaI y PvuII, para aislar
el gen luciferasa (inserto). Se linealizó el vector pCI (Promega
GmbH, Mannheim, Alemania) con SmaI y se desfosforiló (vector). Se
ligaron ambos fragmentos (inserto y vector) para dar
pCI-Luc.
2) Se produjo pVAA-GFP tal como
sigue:
El plásmido de partida para la subclonación de
la "proteína de fluorescencia verde" (GFP/green fluorescence
protein) era el vector pEGFP-N3 (Clontech,
Heidelberg, Alemania). Se amplificó con los oligonucleótidos
(cebadores) GFP/SpeI y GFP/MluI a través de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) un fragmento con un tamaño aproximadamente
de 3.000 pb, que se cortó posteriormente con SpeI y MluI. Se clonó
este fragmento en el vector base de VAA, mediante lo cual se generó
pVAA-GFP. Se describe la producción del vector base
en el documento DE 19905501. (En resumen: se cortó pAV2 (Laughlin
et al. (1983) Gene 23:65) con BglII y se utilizó el
fragmento de VAA en pUC 19 a través del sitio de corte BamHI. En el
pUCAV2 así generado se delecionaron los nucleótidos de VAA
192-4497 y se sustituyeron por los nucleótidos de
pCI 4002-4008 así como 1-1351, que
contienen el casete de expresión CMV-poliA. Se
denomina este constructo vector base de VAA).
- GFP/SpeI: 5' - GGG ATC CAT CAC TAG TAT GGT GAG CAA GG - 3'
- GFP/MluI: 5' - CAA ACG ACC CAA CAC CAC GCG TTT TAT TCT GTC - 3'
3) Se produjo pVAA-(B7.2) a través de dos etapas
de clonación tal como sigue:
En primer lugar se cortaron los vectores pCI, y
pLL279 (Lanier et al. (1995) J Immunol 154(1):97) con
las enzimas de restricción XhoI y NotI y se ligó el inserto B7.2 de
pLL279 con el vector pCI para dar pCI-B7.2. Se
amplificó con los cebadores B7.2/NheI y B7.2/MluI a partir de
pCI-B7.2 mediante PCR un fragmento con un tamaño de
aproximadamente 3.000 pb, que se cortó posteriormente con NheI y
MluI. Se clonó este fragmento en el vector base de VAA (véase el
ejemplo 5.2), mediante lo cual se generó pVAA-(B7.2).
- B7.2/NheI: 5' - GCA TTT GTG CTA GCA CTA TGG GAC TGA G - 3'
- B7.2/MluI: 5' - CGG TTC ACG CGT ATC AAG GCG AGT TAC ATG - 3'
Se cultivaron células HeLa-t en
medio completo de DMEM (500 ml de DMEM + 50 ml de FKS + 5 ml de
L-glutamina + 5 ml de AB/AM) a 37ºC/CO_{2} al 5%.
Se sembraron 5 x 10^{5} células por frasco T25 (T25) en 5 ml de
medio completo. Se incubaron las células durante 16 - 24 h a
37ºC/CO_{2} al 5%. Después se cambió el medio usado por 3 ml de
medio nuevo, sin gasificar, calentado.
Por cada T25 se mezclaron 2 \mug de
pVAA-GFP con 4 \mug de ADN de pSVori y 150 \mul
de CaCl_{2} 260 mM y posteriormente se mezclaron con cuidado con
150 \mul de 2 x BBS. Se dejó reposar la disolución durante 15 min
a temperatura ambiente. Después se pipetearon por cada T25
respectivamente 300 \mul de la mezcla de ADN - CaPi rápidamente a
los 3 ml de medio en el frasco.
Se incubaron las muestras sin cambio de
temperatura y sin gasificación de CO_{2} en una incubadora a 37ºC
sin gasificación de CO_{2}. Además de esto se cerraron las tapas
adicionalmente con parafilm de tres capas. Se incubaron las otras
mezclas básicas durante 16 - 20 h a 35ºC/CO_{2} al 3% y sólo
después a 37ºC/CO_{2} al 5%.
Tras un total de 40 - 48 h de incubación se
infectaron las células con adenovirus. Además de esto se eliminó el
medio de los frascos y se sustituyó por 1,5 ml de medio nuevo. Se
diluyó la disolución de adenovirus hasta 2 x 10^{9} partículas/ml.
En cada frasco se le añadieron 50 \mul del virus diluido a los
1,5 ml de medio. Se cerraron los frascos y se incubaron
correspondientemente durante 2 h. Después se añadieron 3 ml de
medio completo nuevo y se incubó durante 20 h adicionales. Siguió
un nuevo intercambio del medio usado por 5 ml de medio nuevo.
Posteriormente se incubó durante 60 - 70 h
adicionales (correspondientemente con o sin CO_{2}, o sea con y
sin cierre de parafilm adicional). Después se recogieron las
células y el residuo. Además de esto se lavaron del suelo de los
frascos las últimas células aún adheridas y se llevaron a un tubito
de centrifugación de base puntiaguda de 15 ml. Finalmente se
lisaron las células mediante una congelación y descongelación de
las células tres veces seguidas (en N_{2} líquido o a 37ºC en
baño de agua).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación del título se sembraron
1,5 x 10^{5} células HeLa-t en respectivamente
un pocillo de una placa de 12 pocillos y se incubaron en 1 ml de
medio completo durante 16 - 20 h (37ºC/CO_{2} al 5%). Después se
inactivaron las células mediante radiación \gamma o UV. Se
inactivó por calor el lisado de virus durante 10 min a 60ºC,
posteriormente se centrifugó y se utilizó el residuo para la
titulación del virus. Además de esto se infectaron las células con
cantidades distintas del lisado y se incubaron durante 40 - 48 h a
37ºC/CO_{2} al 5%. Después de recogieron las células,
absorbiéndose el residuo, lavándose las células con PBS y
separándose del recipiente de cultivo celular mediante el
tratamiento con EDTA/tripsina. Por medio de la "citometría de
flujo activada por fluorescencia" (FACS/fluorescence activated
cell sorting) se determinó finalmente el porcentaje de las células
GFP positivas y así el título de virus.
\vskip1.000000\baselineskip
| + CO_{2} + cambio de temperatura | - CO_{2} - cambio de temperatura | |
| Partículas transducidas por célula | 12 | 14 |
| Índice de rendimiento | 100% | 117% |
Según esto el empaquetamiento de
rVAA-GFP sin gasificación de CO_{2} y sin cambio
de temperatura es comparablemente eficaz como con gasificación de
CO_{2} y cambio de temperatura (véase la tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células HeLa-t en
frascos de cultivo celular T185 a 37ºC/CO_{2} al 5%. Se recogieron
las células con EDTA/tripsina y se resuspendieron en medio completo
de DMEM (500 ml de DMEM + 50 ml de FKS + 5 ml de
L-glutamina 200 mM) (posible adición de 50
\mug/ml de gentamicina). Se absorbieron de 0,9 x 10^{8} a 1,4 x
10^{8} células HeLa-t en 900 ml de medio
completo. Con esta suspensión celular se rellenó un apilamiento de
cubas. Para la transfección sin gasificación de CO_{2} ni cambio
de temperatura se cerraron las dos conexiones de los apilamientos
de cubas con parafilm o una pieza de filtro de aire que puede
cerrarse herméticamente. La incubación tuvo lugar durante 22 - 30 h
a 37ºC sin CO_{2}. Se incubaron las mezclas básicas con
gasificación de CO_{2} y con cambio de temperatura durante el
mismo periodo de tiempo a 37ºC/CO_{2} al 5%.
Tras la incubación se absorbió el residuo.
Siguió la primera transfección con el plásmido auxiliar
correspondiente (véase la tabla 4). Además de esto se disolvieron
1.800 \mug de ADN en 45 ml de CaCl_{2} 270 mM y se mezclaron
bien. Después se añadieron 45 ml de 2 x BBS y se mezclaron con
cuidado. Se dejó reposar la mezcla de ADN - CaPi durante 20 +/- 5
min a temperatura ambiente. Posteriormente se añadieron los 90 ml
de la disolución de ADN - CaPi rápidamente a 900 ml de medio
completo de DMEM precalentado (con o sin gentamicina). Se traspasó
el medio con los precipitados al apilamiento de cubas y se
incubaron de nuevo las células durante 20 - 30 h a 37ºC sin
gasificación.
gasificación.
Después tuvo lugar la transfección del plásmido
transgénico correspondiente (véase la tabla 4). Ésta tuvo lugar
exactamente tal como se describió para el plásmido auxiliar.
| Plásmido auxiliar | Plásmido transgénico | Número de experimentos |
| pUC"rep/fs/cap"(RBS)\Delta37 | pVAA-GFP | 1 |
| pUC"rep/fs/cap"(RBS)\Delta37 | PVAA-(B7.2) | 1 |
| pUC"rep/cap"(RBS)\Delta37 | pVAA-(B7.2libre/GMCSF) | 1 |
| pUC"rep/cap"\Delta37 | pVAA-(B7.2libre/GMCSF) | 2 |
Tras 20 - 30 h de incubación se añadió a las
células adenovirus con una unidad de infección (multiplicidad de
infección (MOI)) de 2 - 3. Tras 20 - 30 h adicionales de incubación
a 37ºC sin gasificación se cambió el residuo por 900 ml de medio
nuevo sin FKS. Tras este ultimo cambio de medio de incubó el
apilamiento de cubas durante 60 - 68 h adicionales a 37ºC. Después
tuvo lugar la recogida del virus mediante la lisis por
congelación/descongelación de las células.
En comparación con esto en el método habitual no
tuvo lugar antes de la transfección con el plásmido auxiliar ningún
intercambio de medio. Además a este respecto se gasificaron las
células mediante un filtro de aire de 0,2 \mum. Tras la adición
de las mezclas de ADN - CaPi se incubaron las células en primer
lugar durante una noche a 35ºC/CO_{2} al 3%, antes de que se
cambiaran a 37ºC/CO_{2} al 5%. Excepto por estas diferencias los
métodos fueron idénticos.
| + CO_{2} + cambio | - CO_{2} - cambio | |
| de temperatura | de temperatura | |
| Número de experimentos | 5 | 5 |
| AC/partículas transducidas en promedio | 9,75 x 10^{9} | 10,01 x 10^{9} |
También en apilamientos de cubas, que son
adecuados para el cultivo a escala industrial de células con
crecimiento adherente, los rendimientos en la producción de VAA
recombinante sin gasificación de CO_{2} y sin cambio de
temperatura son comparables con los del método habitual con
gasificación de CO_{2} y con cambio de temperatura (véase la
tabla 5).
<110> MediGene Sociedad Anónima
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento in vitro para
la introducción de ácido nucleico en una célula (transfección) por
medio de fosfato de calcio
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M32752PC
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP 01/05531
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-05-15
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10024334.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-05-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatccatc actagtatgg tgagcaagg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacgaccc aacaccacgc gttttattct gtc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatttgtgc tagcactatg ggactgag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggttcacgc gtatcaaggc gagttacatg
\hfill30
Claims (14)
1. Procedimiento in vitro para la
introducción de al menos un ácido nucleico en al menos una célula
por medio de fosfato de calcio (CaPi), que comprende las
etapas:
- (a)
- mezclar el (los) ácido(s) nucleico(s) mencionado(s) con al menos una disolución de reacción, que presenta iones Ca^{2+} y PO_{4}^{3-};
- (b)
- incubar la(s) disolución(ones) de reacción, mediante lo cual se forma un precipitado, que presenta al menos ácido nucleico, calcio y fosfato;
- (c)
- añadir el precipitado a la célula mencionada;
- (d)
- incubar la célula de la etapa (c) con aire en sistema cerrado sin dióxido de carbono (CO_{2}) adicional, mediante lo cual se absorbe(n) el (los) ácido(s) nucleico(s) en la célula.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza como ácido nucleico ARN o
ADN, preferiblemente ADN genómico, ADNc, ADN lineal o ADN de
plásmido, especialmente ADN de plásmido circular.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque se utiliza el ácido nucleico en una
cantidad de 0,2 \mug - 20 \mug, preferiblemente de 1 \mug - 20
\mug, especialmente de 2 - 10 \mug, sobre todo de 6 \mug por
cada 10^{6} células.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utilizan
simultánea o sucesivamente dos o más ácidos nucleicos diferentes,
preferiblemente dos o tres ácidos nucleicos diferentes,
especialmente dos o tres ADN de plásmido diferentes.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el valor de pH
de la disolución de reacción en la etapa (b) a temperatura ambiente
asciende a 6,8-7,1, preferiblemente a
6,86-7,05, especialmente a 7,05.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la incubación
de la disolución de reacción tiene lugar en la etapa (b) a
temperatura ambiente durante 5 - 30 min, preferiblemente durante 10
- 20 min, especialmente durante 15 min.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la incubación
de las células tiene lugar en la etapa (d) a 37ºC durante 20 - 72
h, preferiblemente 30 - 72 h, especialmente durante 24 - 48 h,
sobre todo 40 - 48 h.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido
nucleico absorbido presenta un origen de replicación, se mantiene
de manera episomal en la célula transfectada y se transmite durante
la división celular a la célula hija de manera controlada.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido
nucleico absorbido no presenta ningún origen de replicación y se
integra de manera de una manera dirigida o no dirigida en el genoma
de la célula y porque se transmite durante la división celular a la
célula hija.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido
nucleico absorbido no presenta ningún origen de replicación y por
consiguiente no se transmite durante la división celular
directamente a la célula hija.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se utiliza
como célula una célula eucariota, preferiblemente una célula de
mamífero, especialmente una célula humana.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la célula
crece y se multiplica en contacto constante con el recipiente de
cultivo en el medio de cultivo celular.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la célula
crece y se multiplica sin contacto constante con el recipiente de
cultivo en el medio de cultivo celular.
14. Procedimiento in vitro para la
producción de un célula transfectada, caracterizado porque
se introduce al menos un ácido nucleico en al menos una célula por
medio de CaPi según el procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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