JPS5925802A - 新規なヘパリン化合物 - Google Patents
新規なヘパリン化合物Info
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- JPS5925802A JPS5925802A JP58101846A JP10184683A JPS5925802A JP S5925802 A JPS5925802 A JP S5925802A JP 58101846 A JP58101846 A JP 58101846A JP 10184683 A JP10184683 A JP 10184683A JP S5925802 A JPS5925802 A JP S5925802A
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- Japan
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- antithrombin
- heparin
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアンチトロンビン■に共有結合せしめられたへ
・ぞリンフラグメントよりなる新規な化学化合物、それ
らの製造法、それらを含有する粂学的組成物、そして治
療におけるそれらの使用に関する。
・ぞリンフラグメントよりなる新規な化学化合物、それ
らの製造法、それらを含有する粂学的組成物、そして治
療におけるそれらの使用に関する。
サルフェート含有多糖体であるヘパリンは血栓症の処置
および予防のだめの非経腸投与剤として広く臨床的に使
用されている。しかしながらへ・ξリン治療における非
常に重大な問題は匍中におけるヘパリンの半減期が短い
こと、すなわちそれが約１．５時間であるという点であ
る。
および予防のだめの非経腸投与剤として広く臨床的に使
用されている。しかしながらへ・ξリン治療における非
常に重大な問題は匍中におけるヘパリンの半減期が短い
こと、すなわちそれが約１．５時間であるという点であ
る。
この故に、へ・ソリンは通常連続的静脈内輸液または２
４時間当り２〜３回の皮下注射により投与されなくては
ならない。
４時間当り２〜３回の皮下注射により投与されなくては
ならない。
抑漿蛋白アンチトロンビン■の存在はヘパリンの抗凝固
活性に対する必要な前提条件である。
活性に対する必要な前提条件である。
アンチトロンビン■は廂液凝固の際に形成されるほとん
どの凝固酸素を阻害する。しかしこれらの阻害反応は遅
くかつ廂液の凝固を阻止するには不充分である。ヘハＩ
Ｊンが存在する場合、それけアンチトロンビン■に結合
しそして前記アンチトロンビン■を活性化して凝固を阻
止させるに充分な大きく上昇した反応性を有する阻害剤
を形成させる。この阻害剤におけるヘパリン−アンチト
ロンビン結合は共有結合ではなく可逆的である。
どの凝固酸素を阻害する。しかしこれらの阻害反応は遅
くかつ廂液の凝固を阻止するには不充分である。ヘハＩ
Ｊンが存在する場合、それけアンチトロンビン■に結合
しそして前記アンチトロンビン■を活性化して凝固を阻
止させるに充分な大きく上昇した反応性を有する阻害剤
を形成させる。この阻害剤におけるヘパリン−アンチト
ロンビン結合は共有結合ではなく可逆的である。
００１１ｅｎ氏ら［： ｒ Ａｂｓｔｒａｏｔａ■工ｎ
ｔ、 ＯＯｎｇｒ。
ｔ、 ＯＯｎｇｒ。
Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、 Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｅ、 Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、Ｊ第４６巻第１８５
頁（１９８１））は標準ヘパリンのアンチトロンビン■
への共有結合カップリングにより得られる生成物を記載
している。得られる生成物は凝固酸素トロンビンを迅速
に阻害しそｌ−てファクターＸを活性化させる性質を有
している。この生成物は兎における試験において標準ヘ
パリンの半減期の２〜６倍の血中半減期を有しているこ
とが示された。しかしながらこれは前進的段階を示して
いるにしても、廂 ５− 中でより長い半減期を有しそして従ってより長い治療活
性持続期間を有するヘパリン製品に対する需要が存在し
ている。本発明は血中で非常に長い半減期を有し、そし
てそれに応じて長い抗凝固活性持続を有するヘパリン生
成物を提供する。
ｍｂｏｅ、 Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、Ｊ第４６巻第１８５
頁（１９８１））は標準ヘパリンのアンチトロンビン■
への共有結合カップリングにより得られる生成物を記載
している。得られる生成物は凝固酸素トロンビンを迅速
に阻害しそｌ−てファクターＸを活性化させる性質を有
している。この生成物は兎における試験において標準ヘ
パリンの半減期の２〜６倍の血中半減期を有しているこ
とが示された。しかしながらこれは前進的段階を示して
いるにしても、廂 ５− 中でより長い半減期を有しそして従ってより長い治療活
性持続期間を有するヘパリン製品に対する需要が存在し
ている。本発明は血中で非常に長い半減期を有し、そし
てそれに応じて長い抗凝固活性持続を有するヘパリン生
成物を提供する。
本発明によれば、アンチトロンビン■に共有結合的に結
合せしめられた５、５００以下の分子針を有するへ７で
リンフラグメントよりなる新規な化合物は標準へＡ Ｉ
Ｊンの半減期の３０倍までのより長いそして従来技術の
０Ｏ１１ｅｎ氏らによりｌ己載されているアンチトロン
ビン■標準ヘパＩＪ ７生成物のものよ−りも約１０倍
より長い血中半減期を有していることが発見された。本
発明のこの新規な化合物は活性化凝固ファクターＸを迅
速に不活性化させる。このことは高い抗凝固活性を意味
する。
合せしめられた５、５００以下の分子針を有するへ７で
リンフラグメントよりなる新規な化合物は標準へＡ Ｉ
Ｊンの半減期の３０倍までのより長いそして従来技術の
０Ｏ１１ｅｎ氏らによりｌ己載されているアンチトロン
ビン■標準ヘパＩＪ ７生成物のものよ−りも約１０倍
より長い血中半減期を有していることが発見された。本
発明のこの新規な化合物は活性化凝固ファクターＸを迅
速に不活性化させる。このことは高い抗凝固活性を意味
する。
６−
本発明の新規な化合物に含有されるヘパリンフラグメン
トは５，５００またはそれ以下、適当には２０００〜５
５００の分子量を有している。そのようなフラグメント
は既知の方法で、例えばヨーロッパ特許出願公告第００
１４１８４号および同第００４８２５１号各明細書に記
載の標準ヘパリンの亜硝酸分解により製造される。
トは５，５００またはそれ以下、適当には２０００〜５
５００の分子量を有している。そのようなフラグメント
は既知の方法で、例えばヨーロッパ特許出願公告第００
１４１８４号および同第００４８２５１号各明細書に記
載の標準ヘパリンの亜硝酸分解により製造される。
本発明の新規な化合物は次のように３段階で製造するこ
とができる。
とができる。
第１の段階ではアミノ基をヘパリンフラグメント中に導
入する。これはヘパリンフラグメント中に存在するカル
ボキシル基を適当なアミン例えばヘキサメチレンジアミ
ンと反応させることにより実施することができる。この
反応は適当なカップリング剤、例えばカルボジイミド例
えば１−エチル−６−（６−シメチルアｔノゾロビル）
カルボジイミドの存在下に実施される。
入する。これはヘパリンフラグメント中に存在するカル
ボキシル基を適当なアミン例えばヘキサメチレンジアミ
ンと反応させることにより実施することができる。この
反応は適当なカップリング剤、例えばカルボジイミド例
えば１−エチル−６−（６−シメチルアｔノゾロビル）
カルボジイミドの存在下に実施される。
すべてのカルボキシル基を反応させないように注意が払
われなくてはならない。得られた変性ヘパリンフラグメ
ントは１個のフラグメント当り平均１〜２個のアミン基
を含有している。
われなくてはならない。得られた変性ヘパリンフラグメ
ントは１個のフラグメント当り平均１〜２個のアミン基
を含有している。
あるいはまた、限定されたＮ−脱硫酸によりまたはヘパ
リンフラグメントをそれらがアルデヒド官能性を有する
ように変換させることによってヘパリンフラグメント中
にアミノ基を導入することができる。
リンフラグメントをそれらがアルデヒド官能性を有する
ように変換させることによってヘパリンフラグメント中
にアミノ基を導入することができる。
第２段階においては、ヘパリンフラグメント上に導入さ
れたアミノ基を、アンチトロンビン■のアミノ基と反応
しうる置換へｌξミリンフラグメント与えるに適当な二
官能性試薬と反応せしめる。適当なそのよりな二官能性
試薬はトリレン−２，４−：）イソチオ７アネートであ
る。この試薬は適当には過剰で使用される。トリレン−
２，４−）インチオシアネートの使用は反応性インチオ
シアネート置換へノセリンフラグメントを与える。
れたアミノ基を、アンチトロンビン■のアミノ基と反応
しうる置換へｌξミリンフラグメント与えるに適当な二
官能性試薬と反応せしめる。適当なそのよりな二官能性
試薬はトリレン−２，４−：）イソチオ７アネートであ
る。この試薬は適当には過剰で使用される。トリレン−
２，４−）インチオシアネートの使用は反応性インチオ
シアネート置換へノセリンフラグメントを与える。
第３段階では第２段階で得られた反応性置換ヘパリンフ
ラグメントをアンチトロンビン■と反応させる。この反
応においてはアンチトロンビン■の分子中に含有されて
いるアミノ基がイソチオシアネート置換フラグメント中
のイソチオシアネート基と反応しそして安定な同定可能
でそして新規な化合物である反応生成物を生成させる。
ラグメントをアンチトロンビン■と反応させる。この反
応においてはアンチトロンビン■の分子中に含有されて
いるアミノ基がイソチオシアネート置換フラグメント中
のイソチオシアネート基と反応しそして安定な同定可能
でそして新規な化合物である反応生成物を生成させる。
この第３の段階においては、ヘパリンフラグメントは１
：１の化学量論関係でアンチトロンビン■と結合してい
る。
：１の化学量論関係でアンチトロンビン■と結合してい
る。
当業者は本発明の範囲から逸脱することなしに前記一連
の反応で使用される特定の試薬を変更させそして選択で
きることが理解されよう。
の反応で使用される特定の試薬を変更させそして選択で
きることが理解されよう。
例えば第１反応段階中で使用されるべきカップリング剤
中にはジアミン付加の前のへ・ソリンの ９− ブロムシアン活性化をあげることができる。ヘパリンフ
ラグメントの末端アルデヒド基とアンチトロンビン■中
のアミノ基との間のシッフ塩基形成によるへ・（リンフ
ラグメントの直接的なアンチトロンビン■へのカップリ
ングもまた実現させることができる。
中にはジアミン付加の前のへ・ソリンの ９− ブロムシアン活性化をあげることができる。ヘパリンフ
ラグメントの末端アルデヒド基とアンチトロンビン■中
のアミノ基との間のシッフ塩基形成によるへ・（リンフ
ラグメントの直接的なアンチトロンビン■へのカップリ
ングもまた実現させることができる。
臨床的実施においては、本発明の新規な化合物は一般に
は臨床的使用に対して市場的に入手可能なヘパリンと同
一の方法および同一の薬学的製剤の形で使用される。す
なわち本発明の新規なへ／Ｊ ＩＪン誘導体は注射用水
性溶液中にかまたは皮膚または粘膜を介しての投与のた
めの軟膏製剤中に包含させることができる。
は臨床的使用に対して市場的に入手可能なヘパリンと同
一の方法および同一の薬学的製剤の形で使用される。す
なわち本発明の新規なへ／Ｊ ＩＪン誘導体は注射用水
性溶液中にかまたは皮膚または粘膜を介しての投与のた
めの軟膏製剤中に包含させることができる。
アミノ基含有へ７署リンフラグメントよりなる得られた
中間生成物もまた新規である。それらは本発明のその他
の態様を表わす。またヘパリンフラグメントのアルデヒ
ド形態もまた新規なｌＯ− 化合物でありそして本発明の一態様を表わす。
中間生成物もまた新規である。それらは本発明のその他
の態様を表わす。またヘパリンフラグメントのアルデヒ
ド形態もまた新規なｌＯ− 化合物でありそして本発明の一態様を表わす。
前記のアルデヒド形態においてはヘパリンフラグメント
の１個の末端基がアルデヒド官能分を含有している。
の１個の末端基がアルデヒド官能分を含有している。
次の実施例によって本発明を更に説明する。
例 １
亜硝酸による標準ヘパリンの解重合による出発物質とし
て使用されるヘノでリンフラグメントの製造 豚の小腸から単離されそして１５０＋ｄの水に溶解され
たヘノセリン（０，５Ｆ ）を＋４℃に冷却し、そして
ダウニックｘ”５ｎｗ−ｘｓ（ａ＋型）２ｏｏ〜４０゜
メツシュの５Ｘ７３のカラムに通した。このカラムをそ
の後で１００−の水で洗い、その後で洗液を精製ヘパリ
ン含有溶出液と合した。合した流体に一２０℃に冷却し
た２５０ｔＴｔｔのジメトキシエタン（グライム）およ
び１０−のイソアミルニトリドを加え、そして約＋１０
′Ｃの温度を有するこの混合物を２分間放置した。その
後でこの反応を１０−の１０ ％ Ｎａ アセテート
の添７Ｊｌｌにより中断させた。５．２２のエタノール
を加えた後、沈殿した炭水化物（ヘパリン誘導体）を遠
心により集めた。この生成物を５００ｍ１の０．０５Ｍ
Ｎａ０ｆｉ −０，０５Ｍ ）リスＨＯＡ （ｐＨ・
７．４ ）に溶解させた。この溶液を７５ｍ１．のアン
チトロンビン−アガロース−セファロース■（ファルマ
シア！ファインケミカルズ社製品）を含有するカラム上
での約５１１ｖ蛋白／ｌｎｔゲルでのアフィニティーク
ロマトグラフィーにより１００＋＋＋ｅ区分に分画させ
た。このカラムを塩濃度勾配で溶出させた（混合溶量中
５００−の０．０５Ｍ Ｎａ０ｎ−０，０５Ｍ）リスＨ
ａ１１． 、レザボア中５００−の３ＭＮａ０１−０．
０５ＭトリスＨＯλ）。この際適用された物質の大部分
はカラムによって遅延化されることなく溶出されるかあ
るいは低いイオン強度（０，４Ｍ ＩＪａＯＩｔ）で溶
出される。この物質は生物活性を有していない。活性成
分（精製ヘパリン誘導体）は０．５ＭＭａｉｎと３ＭＮ
ａ０βとの間の広い分画に溶出される。
て使用されるヘノでリンフラグメントの製造 豚の小腸から単離されそして１５０＋ｄの水に溶解され
たヘノセリン（０，５Ｆ ）を＋４℃に冷却し、そして
ダウニックｘ”５ｎｗ−ｘｓ（ａ＋型）２ｏｏ〜４０゜
メツシュの５Ｘ７３のカラムに通した。このカラムをそ
の後で１００−の水で洗い、その後で洗液を精製ヘパリ
ン含有溶出液と合した。合した流体に一２０℃に冷却し
た２５０ｔＴｔｔのジメトキシエタン（グライム）およ
び１０−のイソアミルニトリドを加え、そして約＋１０
′Ｃの温度を有するこの混合物を２分間放置した。その
後でこの反応を１０−の１０ ％ Ｎａ アセテート
の添７Ｊｌｌにより中断させた。５．２２のエタノール
を加えた後、沈殿した炭水化物（ヘパリン誘導体）を遠
心により集めた。この生成物を５００ｍ１の０．０５Ｍ
Ｎａ０ｆｉ −０，０５Ｍ ）リスＨＯＡ （ｐＨ・
７．４ ）に溶解させた。この溶液を７５ｍ１．のアン
チトロンビン−アガロース−セファロース■（ファルマ
シア！ファインケミカルズ社製品）を含有するカラム上
での約５１１ｖ蛋白／ｌｎｔゲルでのアフィニティーク
ロマトグラフィーにより１００＋＋＋ｅ区分に分画させ
た。このカラムを塩濃度勾配で溶出させた（混合溶量中
５００−の０．０５Ｍ Ｎａ０ｎ−０，０５Ｍ）リスＨ
ａ１１． 、レザボア中５００−の３ＭＮａ０１−０．
０５ＭトリスＨＯλ）。この際適用された物質の大部分
はカラムによって遅延化されることなく溶出されるかあ
るいは低いイオン強度（０，４Ｍ ＩＪａＯＩｔ）で溶
出される。この物質は生物活性を有していない。活性成
分（精製ヘパリン誘導体）は０．５ＭＭａｉｎと３ＭＮ
ａ０βとの間の広い分画に溶出される。
これは出発物質の約４チに相当する。これら分画をプー
ルし、濃縮しそしてゲルクロマトグラフィーにより脱塩
した。このようにして製造されそして１Ｆ１１製された
ヘパリン誘導体は３００ｏ〜５０００の分子量を有して
いた。
ルし、濃縮しそしてゲルクロマトグラフィーにより脱塩
した。このようにして製造されそして１Ｆ１１製された
ヘパリン誘導体は３００ｏ〜５０００の分子量を有して
いた。
例 ２
ヘパリンフラグメントのアンチトロンビン■への共有結
合 〔第１段階〕 前記のように製造された１５〜のへノ９リンフラグメン
トを４．５ ｔｎｔの水に溶解させ、次いで１−のへキ
サメチレンジアミン溶液（２１ａｖ／−）および２−の
１−エチル−３−（５−ジメチル１３− アミノゾロビル）−カルボジイミド塩酸塩（７６ｍｙ／
ｒｎｅ ）の溶液を加えることによって前記のようにし
て得られたヘパリンフラグメント中にアミノ基を導入し
た。この溶液のｐＨを４．７５に調整しそしてこの反応
混合物を攪拌しつつ２０分放置したがこの間０．１ＭＨ
ＯＪｌの添加によってｐＨを一定に保持した。２ＭＮａ
ＯＨを使用してそのｐＨを９５に上昇させることにより
この反応を停止させた。この反応混合物を０．１ Ｍ
ＮａＨＯ（Ｊ バッファー （ｐＨ９，５）を使用して
最初の容量の６倍に希釈しそして次いで０．０５Ｍ Ｎ
ａＯＲを含有する０、０５Ｍ燐酸バッファー（ｐＨ７，
５）に対して透析させた。
合 〔第１段階〕 前記のように製造された１５〜のへノ９リンフラグメン
トを４．５ ｔｎｔの水に溶解させ、次いで１−のへキ
サメチレンジアミン溶液（２１ａｖ／−）および２−の
１−エチル−３−（５−ジメチル１３− アミノゾロビル）−カルボジイミド塩酸塩（７６ｍｙ／
ｒｎｅ ）の溶液を加えることによって前記のようにし
て得られたヘパリンフラグメント中にアミノ基を導入し
た。この溶液のｐＨを４．７５に調整しそしてこの反応
混合物を攪拌しつつ２０分放置したがこの間０．１ＭＨ
ＯＪｌの添加によってｐＨを一定に保持した。２ＭＮａ
ＯＨを使用してそのｐＨを９５に上昇させることにより
この反応を停止させた。この反応混合物を０．１ Ｍ
ＮａＨＯ（Ｊ バッファー （ｐＨ９，５）を使用して
最初の容量の６倍に希釈しそして次いで０．０５Ｍ Ｎ
ａＯＲを含有する０、０５Ｍ燐酸バッファー（ｐＨ７，
５）に対して透析させた。
〔第２段階〕
第１Ｒ階で得られた物質を例１記載と同一の方法でマト
リックス結合アンチトロンビン■上でのアフィニティー
クロマトグラフィーによって低アフィニティー分画と高
アフィニティー分１４− 画とに分けた。その後で２．２■の高アフィニティー分
画に、４−のＮ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−アリルアミンバッ
ファー（ｐＨ９，２）と１００■のトリレン−２，４−
’）イソシアネートを加えた。その後で窃素ガスを１分
間泡としてこの溶液に通１−１そしてこの溶液を４５℃
で１時間培養した。その後で２ ｍｌの水を加え、そし
てこの懸濁液を過剰の試薬の除去のために４回４−のば
ンゼンで、そして３回へブタン／酢酸エチル（２／１）
で抽出した。
リックス結合アンチトロンビン■上でのアフィニティー
クロマトグラフィーによって低アフィニティー分画と高
アフィニティー分１４− 画とに分けた。その後で２．２■の高アフィニティー分
画に、４−のＮ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−アリルアミンバッ
ファー（ｐＨ９，２）と１００■のトリレン−２，４−
’）イソシアネートを加えた。その後で窃素ガスを１分
間泡としてこの溶液に通１−１そしてこの溶液を４５℃
で１時間培養した。その後で２ ｍｌの水を加え、そし
てこの懸濁液を過剰の試薬の除去のために４回４−のば
ンゼンで、そして３回へブタン／酢酸エチル（２／１）
で抽出した。
〔第６段階〕
第２段階で得られた水相をその後で直ちに５０■のアン
チトロンビン■を含有する２０ｒｄの０．１ Ｍ Ｎａ
ＨＯ０３バッファー（ｐｍ８．６ ）に加えた。
チトロンビン■を含有する２０ｒｄの０．１ Ｍ Ｎａ
ＨＯ０３バッファー（ｐｍ８．６ ）に加えた。
得られた混合物を攪拌しつつ１時間６０℃で培養しそし
て次いで１晩０．０２ Ｍイミダゾール−ａｏｊｔバッ
ファー（ｐＨ７，３５）に対して透析した。次いで形成
された生成物をこの透析反応混合物をＤＥ／Ｊｌセファ
デクスカラムに通しこれを次いで０〜０．５ＭＮａ０λ
塩濃度勾配で溶出させることにより精製した。得られた
ヘノ署リンフラグメントーアンチトロンビン化合物を、
０．１Ｍ）リス−Ｈ０Ｌバツフアー（ｐＨ７，６）で平
衡化させたヘノソリンーウルトロゲル（Ｕ１ｔ’ｒＯｇ
ｅｌ ）カラム上でのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより未反応アンチトロンビンから分離させた。溶出
は塩濃度勾配（０，１〜１．０ＭＮａ０λ）により実施
された。
て次いで１晩０．０２ Ｍイミダゾール−ａｏｊｔバッ
ファー（ｐＨ７，３５）に対して透析した。次いで形成
された生成物をこの透析反応混合物をＤＥ／Ｊｌセファ
デクスカラムに通しこれを次いで０〜０．５ＭＮａ０λ
塩濃度勾配で溶出させることにより精製した。得られた
ヘノ署リンフラグメントーアンチトロンビン化合物を、
０．１Ｍ）リス−Ｈ０Ｌバツフアー（ｐＨ７，６）で平
衡化させたヘノソリンーウルトロゲル（Ｕ１ｔ’ｒＯｇ
ｅｌ ）カラム上でのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより未反応アンチトロンビンから分離させた。溶出
は塩濃度勾配（０，１〜１．０ＭＮａ０λ）により実施
された。
得られた精製生成物はドデシル硫酸ナトリウムノ存在下
のポリアクリルアミド電気泳動では均質であった。既知
の分子量の蛋白の分子量との比較によるとこの得られた
生成物の分子量は６５０００〜８００００であり、平均
約７０，０００であった。この得られた生成物は０．９
２ｘｌＯｄＭ ｓの二次速度定数をもって活性化された
ファクターＸを阻害した。ヘパリンフラグメント−アン
チトロンビン■化合物に関する収率は２４チであった。
のポリアクリルアミド電気泳動では均質であった。既知
の分子量の蛋白の分子量との比較によるとこの得られた
生成物の分子量は６５０００〜８００００であり、平均
約７０，０００であった。この得られた生成物は０．９
２ｘｌＯｄＭ ｓの二次速度定数をもって活性化された
ファクターＸを阻害した。ヘパリンフラグメント−アン
チトロンビン■化合物に関する収率は２４チであった。
例 ６
化合物に対する生物学的半減期
例２記載のようにして得られたそしてそのヘパリンフラ
グメントを１５Ｈで標識したヘパリンフラグメント−ア
ンチトロンビン■化合物２〜を１−のＱ、ＩＭＭａＯｆ
ｉ溶液に溶解させそして兎の耳の静脈に注射した。その
後で一連の怖液試料を次の１０時間の間に採取し、そし
て放射能および活性化ファクターＸの阻害を測定した。
グメントを１５Ｈで標識したヘパリンフラグメント−ア
ンチトロンビン■化合物２〜を１−のＱ、ＩＭＭａＯｆ
ｉ溶液に溶解させそして兎の耳の静脈に注射した。その
後で一連の怖液試料を次の１０時間の間に採取し、そし
て放射能および活性化ファクターＸの阻害を測定した。
このようにして試験化合物に対する生物学的半減期を得
た。この半減期を次いで同一の様式で投与された標準ヘ
パリンに対する半減期と比較した。
た。この半減期を次いで同一の様式で投与された標準ヘ
パリンに対する半減期と比較した。
この試験結果は、本発明のヘパリンフラダメ１７−
ントーアンチトロンビン化合物の半減期が７８時間であ
るということであった。この値は放射能測定ならびに生
物学的活性の測定すなわちファクターＸａ阻害を使用し
て得られた。同一の方法で測定された標準へ７２リンに
対する半減期は０．３時間である。すなわちヘパリンフ
ラグメント−アンチトロンビン■化合物に対する半減期
は標準へ・々リンに対する半減期よりも２６倍長い。
るということであった。この値は放射能測定ならびに生
物学的活性の測定すなわちファクターＸａ阻害を使用し
て得られた。同一の方法で測定された標準へ７２リンに
対する半減期は０．３時間である。すなわちヘパリンフ
ラグメント−アンチトロンビン■化合物に対する半減期
は標準へ・々リンに対する半減期よりも２６倍長い。
本発明の新規な化合物に対して得られた生物学的半減期
のこの大なる上昇は臨床的に非常に価値がある。へＡリ
ンによるこの処置においては、手術後面栓症の予防的処
置においては１日当り２回または３回の注射を与えなく
てはならないのが普通である。本発明の新規な化合物を
使用すれば２日または６日に一度の注射で充分である。
のこの大なる上昇は臨床的に非常に価値がある。へＡリ
ンによるこの処置においては、手術後面栓症の予防的処
置においては１日当り２回または３回の注射を与えなく
てはならないのが普通である。本発明の新規な化合物を
使用すれば２日または６日に一度の注射で充分である。
このことは患者の観点からそしてより１８−
良く利用された薬物資源から由来する実際的および経済
的利点の故に臨床の観点からも犬なる改善である。
的利点の故に臨床の観点からも犬なる改善である。
本発明のヘノミリンフラグメント−アンチトロンビン■
化合物のウニスラー兎体液流停止モデルにおける抗廂栓
形成効釆に関する研究は、この化合物の静脈内注射が有
効に兎の面栓形成を阻害することを示す。
化合物のウニスラー兎体液流停止モデルにおける抗廂栓
形成効釆に関する研究は、この化合物の静脈内注射が有
効に兎の面栓形成を阻害することを示す。
特許出願人 カビヴイトラム・アクチェボラーグｌ
９−
９−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）アンチトロンビン■に共有結合的に結合された分子
ｔ２０００〜５５００のへ７ぞリンフラグメント。 ２）アンチトロンビン■に共有結合的に結合された分子
量２０００〜５５００のへ７署リンフラグメントを製造
するにあたり、 （ａ） ２０００〜５５００の分子量を有するヘノミ
リンフラグメント中にアミノ基を導入すること、（ｂ）
前記アミノ基をアンチトロンビン■中のアミノ基と反応
しうる反応性誘導体を与えるような二官能性試薬と反応
させること、（０） 得られた生成物をアンチトロン
ビン■と反応させその後で所望により得られた反応生成
物を精製させること を特徴とする、方法。 ５）段階（ａ）においてヘパリンフラグメントラヘキサ
メチレンジアミンと反応させることによりアミノ基を導
入しそして段階（ｂ）において二官能性反応成分がトリ
レン−２，４−’）インチオシアネートであることを特
徴とする、前記特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４）薬学的担体との組合せにおいて前記特許請求の範囲
第１項記載の化合物を活性成分として含有している薬学
的製剤。 ５）注射用水性溶液の形または軟膏の形の前記特許請求
の範囲第４項記載の薬学的製剤。 ６）２０００〜５５００の分子量を有しそして１フラグ
メント当り１〜２個のアミノ基を有しているヘパリン７
ラグメント。 ７）２０００〜５５００の分子量を有しそして１個の末
端基がアルデヒド官能性を有しているへバリン７ラグメ
ント。 ８）人における廂液の高い凝固活性に関連する疾病の予
防的および治療的処置における前記特許請求の範囲第１
項記載の化合物の使用。 ９）血栓症の処置および防止における前記特許請求の範
囲第１項記載の化合物の使用。 １０）前記特許請求の範囲第１項記載の化合物を投与す
ることを特徴とする哺乳動物および人の血中の高い凝固
活性に関連する疾病の処置のための方法。 １１）前記特許請求の範囲第１項記載の化合物を投与す
ることを特徴とする哺乳動物および人の血栓症の処置お
よび防止のための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE82036112 | 1982-06-10 | ||
| SE8203611 | 1982-06-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5925802A true JPS5925802A (ja) | 1984-02-09 |
Family
ID=20347038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58101846A Pending JPS5925802A (ja) | 1982-06-10 | 1983-06-09 | 新規なヘパリン化合物 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4623718A (ja) |
| EP (1) | EP0098814B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5925802A (ja) |
| AT (1) | ATE22899T1 (ja) |
| CA (1) | CA1205011A (ja) |
| DE (2) | DE3366933D1 (ja) |
| DK (1) | DK258283A (ja) |
| NO (1) | NO157783C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6169802A (ja) * | 1984-06-16 | 1986-04-10 | インタ−メデイカツト・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | ヘパリン誘導体 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4859581A (en) * | 1986-03-10 | 1989-08-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Endoglycosidase assay |
| EP0337327A1 (en) * | 1988-04-09 | 1989-10-18 | Bioiberica, S.A. | Process for the preparation of new oligosaccharide fractions by controlled chemical depolimerization of heparin |
| US5252557A (en) * | 1988-07-25 | 1993-10-12 | Kiyoshi Kita | Administration method of antithrombin |
| US7045585B2 (en) | 1995-11-30 | 2006-05-16 | Hamilton Civic Hospital Research Development Inc. | Methods of coating a device using anti-thrombin heparin |
| US6491965B1 (en) * | 1995-11-30 | 2002-12-10 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Medical device comprising glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates |
| US6562781B1 (en) * | 1995-11-30 | 2003-05-13 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates |
| US7498130B2 (en) * | 2003-05-13 | 2009-03-03 | Massachusetts General Hospital | Method of reducing viral load |
| US20040229778A1 (en) * | 2003-05-13 | 2004-11-18 | Elmaleh David R. | Pharmaceutical compositions of antithrombin III for the treatment of retroviral diseases |
| CA2535446A1 (en) * | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Methods for preventing neurological events |
| CN103743837B (zh) * | 2013-12-24 | 2015-01-21 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 人抗凝血酶ⅲ肝素结合比例检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5788125A (en) * | 1980-09-30 | 1982-06-01 | Cutter Lab | Anti-thrombin-heparin complex and manufacture |
-
1983
- 1983-05-24 EP EP83850140A patent/EP0098814B1/en not_active Expired
- 1983-05-24 DE DE8383850140T patent/DE3366933D1/de not_active Expired
- 1983-05-24 AT AT83850140T patent/ATE22899T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-05-24 DE DE198383850140T patent/DE98814T1/de active Pending
- 1983-06-07 DK DK258283A patent/DK258283A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-06-08 CA CA000429939A patent/CA1205011A/en not_active Expired
- 1983-06-09 JP JP58101846A patent/JPS5925802A/ja active Pending
- 1983-06-09 NO NO832092A patent/NO157783C/no unknown
- 1983-06-10 US US06/503,105 patent/US4623718A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5788125A (en) * | 1980-09-30 | 1982-06-01 | Cutter Lab | Anti-thrombin-heparin complex and manufacture |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6169802A (ja) * | 1984-06-16 | 1986-04-10 | インタ−メデイカツト・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | ヘパリン誘導体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK258283D0 (da) | 1983-06-07 |
| DE98814T1 (de) | 1984-06-20 |
| NO157783B (no) | 1988-02-08 |
| ATE22899T1 (de) | 1986-11-15 |
| EP0098814B1 (en) | 1986-10-15 |
| NO157783C (no) | 1988-05-18 |
| EP0098814A1 (en) | 1984-01-18 |
| US4623718A (en) | 1986-11-18 |
| CA1205011A (en) | 1986-05-27 |
| DE3366933D1 (en) | 1986-11-20 |
| NO832092L (no) | 1983-12-12 |
| DK258283A (da) | 1983-12-11 |
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