JPS6411043B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はウロキナーゼ・デキストラン誘導体の
改良製造法に関する。 フイブリンおよび血栓の溶解酵素であるウロキ
ナーゼは各種血栓症や塞栓性疾患の治療および制
癌剤との併用療法等に広く用いられており、優れ
た臨床効果をもたらしている。しかし生体に投与
されたウロキナーゼは、蛋白体としても又酵素活
性としてもいずれも速やかに血中より消失し、こ
のものの血中半減期はわずか１〜２分である。さ
らに投与されたウロキナーゼの酵素活性は血中の
ウロキナーゼ阻害因子による作用を受け、ある閾
値以上の量を投与しないと、血栓溶解能が発現し
ないことが判つている。 ウロキナーゼのこのような血中動態は、投与効
果を得るためには必然的に大量投与へと進展せざ
るを得ず、今日の大量投与療法になつていると理
解される。このためウロキナーゼの単独投与時に
みられる種々の欠点を改善し、ウロキナーゼの酵
素活性を十分にかつ持続的に発揮させるためにウ
ロキナーゼ・デキストラン誘導体が提案されてい
る〔特開昭54−113488〕。 当該ウロキナーゼ・デキストラン誘導体は式 （式中、はデキストラン残基を、はウロキ
ナーゼ残基を示す）で表わされ、次の如くして製
造される。即ち、デキストランを酸化剤（たとえ
ば、過ヨウ素酸ナトリウムなど）で酸化してデキ
ストランの水酸基をアルデヒド基に変じて活性化
デキストランを得、この活性化デキストランとウ
ロキナーゼとを反応させて式 （式中、及びは同意義）で表わされる化合
物を得、これを水素化ホウ素金属塩（たとえば水
素化ホウ素ナトリウムなど）で還元することによ
つてウロキナーゼ・デキストラン誘導体（）が
得られる〔特開昭54−113488〕。 これらの反応式は次の通りである。 本発明者らは、上述のウロキナーゼと活性化デ
キストランを用いてウロキナーゼ・デキストラン
誘導体（）を製造する工程において、従来より
更にウロキナーゼ・デキストラン誘導体（）の
収率を上げるため種々検討した。その結果、化合
物（）を還元してウロキナーゼ・デキストラン
誘導体（）を得る工程において水素化ホウ素金
属塩による還元の前に、水素化シアン金属塩で還
元することによりウロキナーゼ・デキストラン誘
導体（）が高収率で得られることを見出した。 本発明は、かかる新知見に基づいて完成された
ものであり、化合物（）を水素化ホウ素シアン
金属塩、次いで水素化ホウ素金属塩で還元するこ
とを特徴とするウロキナーゼ・デキストラン誘導
体（）の製造方法である。 本発明にて用いられるウロキナーゼは医薬とし
て使用しうる程度に精製されたものであれば、そ
の由来に制限はない。たとえ、ヒト尿由来、組織
腎培養由来、遺伝子工学の手法によりヒト由来の
ウロキナーゼ遺伝子を大腸菌に投入し、培養後そ
の大腸菌から生産されるウロキナーゼなどがいず
れも好適に使用される。また、当該ウロキナーゼ
としては2500〜60000の範囲の分子量のものが好
都合に用いられる。 デキストランも医薬として用いうる程度に精製
されたものが好ましく、分子量1000〜200万の範
囲から任意に選ぶことができる。 本発明にて使用される水素化ホウ素シアン金属
塩における金属塩としては、たとえばアルカリ金
属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）などがあ
げられる。また水素化ホウ素金属塩における金属
塩としても上述のごときアルカリ金属塩などがあ
げられる。 水素化ホウ素シアン金属塩は、通常１〜10モル
当量が用いられ、還元温度は０〜10℃であり、還
元時間は15〜20時間である。 水素化ホウ素金属塩も通常１〜10モル当量が用
いられ、還元温度は０〜10℃であり、還元時間は
15〜20時間である。 ウロキナーゼからウロキナーゼ・デキストラン
誘導体（）に至る工程をより具体的に説明すれ
ば次の通りである。 デキストラン１ｇに対して酸化剤としての過ヨ
ウ素酸ナトリウム100〜400mgを蒸留水５mlに溶解
させた過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を滴下し、10
〜60分間室温・暗所で撹拌する。撹拌後、１〜
4Mの水酸化ナトリウムで中和し、水で透析する。
透析後、凍結乾燥する。かくして得られた活性化
デキストラン凍結乾燥物１〜20モル等量を0.1〜
1Mのリン酸緩衝液の如き緩衝液（PH６〜８）に
溶解させ、これに１モル等量のウロキナーゼと１
〜10モル等量の水素化ホウ素シアンナトリウムを
上述の緩衝液に溶解させた溶液を添加し、４℃に
て15〜20時間撹拌する。次に、１〜10モル等量の
水素化ホウ素ナトリウムを上述の緩衝液に溶解さ
せた溶液を添加し、４℃にて４〜８時間更に撹拌
する。撹拌後、上述の緩衝液で透析する。かくし
て得られたウロキナーゼデキストラン誘導体
（）を回収する。 回収には公知のゲルろ過法、分子篩別法、イオ
ン交換法等を使用できるが、ゲルろ過法で分画し
た場合はウロキナーゼ・デキストラン誘導体
（）と未結合のデキストラン及びウロキナーゼ
がきわめて明瞭な差違を持つて挙動するから、目
的とする誘導体（）の回収を容易に行いうる。
回収したウロキナーゼ・デキストラン誘導体
（）は、除菌ろ過及び加熱処理等を行なつたの
ち分注し、凍結乾燥してウロキナーゼ・デキスト
ラン誘導体（）製剤を得ることができる。 ウロキナーゼ・デキストラン誘導体（）にお
けるウロキナーゼとデキストランのモル比は１：
１〜１：20である。 本発明におけるウロキナーゼ・デキストラン誘
導体（）の回収率は、実験例の表１で示したよ
うに従来法では40〜50％であるのに対し、本発明
の製造法では80〜100％であり高回収率で本結合
物を得ることができる。 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
し、本発明の効果を実験例によつて説明するが、
本発明はこれらに何ら限定されるものではない。 実施例 １ デキストラン１ｇに蒸留水20mlを加えて溶か
し、これに過ヨウ素酸ナトリウム144mgを蒸留水
５mlに溶解させた溶液を滴下し、４℃の暗所にて
30分間撹拌した後、反応混合物を1Mの水酸化ナ
トリウムで中和し、水で透析した。透析後、凍結
乾燥し、活性化デキストラン凍結乾燥物を得た。
得られた活性化デキストラン凍結乾燥物33mg
（3.7モル当量）を0.1Mリン酸緩衝液（PH７）0.8
mlに溶解し、これにウロキナーゼ6.75mg（１モル
当量）と水素化ホウ素シアンナトリウム144μｇ
とを上述の緩衝液200μに溶解させた溶液を添
加し、４℃にて18時間撹拌した。次に上述の緩衝
液100μに水素化ホウ素ナトリウム72μｇを溶解
させた溶液を添加して４℃にて６時間更に撹拌を
続けた。撹拌終了後0.1Mリン酸緩衝液（PH７）
で透析した。透析後、従来のセフアロースカラム
を用いるゲルろ過法で回収し、ウロキナーゼ・デ
キストラン誘導体を得た。 実施例 ２ デキストラン５ｇに蒸留水100mlを加えて溶か
し、これに８％の過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を
滴下し、４℃で暗所にて60分間撹拌した後、反応
混合物を4Mの水酸化ナトリウムで中和し、水で
透析した。透析後、凍結乾燥し活性化デキストラ
ン凍結乾燥物を得た。得られた活性化デキストラ
ン凍結乾燥物40mg（4.5モル当量）を0.1Mリン酸
緩衝液（PH７）0.8mlに溶解し、これにウロキナ
ーゼ6.75mg（１モル当量）と水素化ホウ素シアン
ナトリウム150μｇとを上述の緩衝液200μに溶
解させた溶液を添加し、以下実施例１と同様に処
理し、ウロキナーゼ・デキストラン誘導体を得
た。 なお、実施例１及び２で得たウロキナーゼ・デ
キストラン誘導体の各々の特性は第１表に示す通
りである。

【表】

【表】 実験例 活性化デキストランとウロキナーゼとを化学結
合させたウロキナーゼ・デキストラン結合物〔化
合物（）〕を水素化ホウ素ナトリウム還元に付
して本発明の誘導体（）を製造する従来法と、
上述の結合物に対して水素化ホウ素シアンナトリ
ウムの温和な還元をし、更に水素化ホウ素ナトリ
ウム還元をして本誘導体（）を製造する本発明
について、回収率の点から比較検討する。 従来法としては、実施例１と実施例２において
水素化ホウ素シアンナトリウムによる温和な還元
を省略し、実施例１及び実施例２と同様にして本
誘導体（）を得た（それぞれ実験１及び２とす
る）この結果を実施例１及び２の本発明製造法と
比較するため回収率を表２に示した。

【表】 この表１の実験結果から分るように、従来法で
は回収率が約40〜50％であるのに対し、本発明の
製造法では約80〜100％という高回収率であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、はデキストラン残基を、はウロキ
   ナーゼ残基を示す）で表わされる化合物を水素化
   ホウ素シアンナトリウム、次いで水素化ホウ素ナ
   トリウムで還元することを特徴とする式 （式中、及びは前記と同意義）で表わされ
   るウロキナーゼ・デキストラン誘導体の製造法。