JPS58148824A - 線溶活性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はミミズより新規線溶活性物質を製造する方法に
関する１、詳しくはミミズζこ水性溶媒を加えて適当な
時間、適当な温度に保持して抽出を行い、抽出液をその
まま又は適当な時間、適当な温度（こ保持することによ
り得られる線溶活性物質粗製物と、その精製線溶活性物
の製造法に関する。

近年、血液凝固（こ起因する種々の疾患は壮、老年者（
こ多発することから注目を集め、その疾病、例えば心筋
価基、脳血栓症、播種性血管向凝固症候群等がよく知ら
れている。それらの治療桑としてヒトウロキナーゼ、ス
トレプトキナーゼが使用されていることは周知である。

然しながら、ヒトウロキナーゼは原料（ヒトの尿）の入
手難、ストレプトキナーゼは抗原性を持つ等の欠点を有
する一Ｌに、両治療薬ともに点滴静注で使用されるため
に患者に多大の苦痛を与えている欠点がある。

本発明者等はＥ記欠点を軽減かつ改善するため、特に原
料入手難の除去及び点滴静注の回避を目的にして自然界
より広く探索研究を続けた結果、ミミズ中昏こヒト末梢
血液の線溶活性を上昇させる線溶活性物質が存在するこ
とを見い出し、本発明ｌこ到達した 本発明の製造法により得られた線溶活性物質は経口剤、
非経口剤又は牢剤としての投薬が可能であるが、特（こ
経口投与が好ましい、すなわち、後記に示すように本線
溶活性物質はヒＨこ経口投与で優れた線溶活性効果を示
すことが実証された一ミミズは太古の昔より東洋諸国に
おいては蛤躬１、地竜として呼称され、鎮痛Ｆ熱剤、利
尿薬等として利用されてきた３然りなから、ミミズ中（
二線溶活性物質が存在すること、及びミミズ由来の線溶
活性物質、をヒトζこ投与したとき、特（こ経口投与し
たときＧこヒト末梢血液中の線溶活性をＦ昇させる現象
がある事実を報告した刊行物を見出すことができなかっ
た。

本発明者等はミミズより有益なる線溶活性物質を効率よ
く収得する方法に関し、詳細に研究した。

本発明の製法を詳しく説明する。

ミミズに水性溶媒を加えて適当な時間、適当な温度に保
持して抽出液を得たのち、抽出液をそのまま又は適当な
時間、適当な温度に保持したのち濃縮又は乾燥すること
（こより線溶活性物質粗製物が得られた。原料のミミズ
は新鮮な生ミミズ、新鮮な生くミズから内容物除去後の
本体及びその内容物又はそれらの加温、減圧又は凍結乾
燥したミミズ粉末、もしくはそれらの脱脂粉末等のいず
れの形状のミミズでも使用できる。最も好ましいのは、
生ミミズの凍結乾燥粉末又は凍結乾燥脱脂粉末である。

水性溶媒はｐＨ５〜１０最も好ましいのはｐＨ６〜８の
水性溶媒である。例示すると、水、生理的食塩水、緩衝
液、調製液又はそれらの一種類以−Ｌの水性溶媒、もし
くはそれらの溶媒に極性有機溶剤例えばエタノール、メ
タノール、プロパツール、アセトン、エーテル、ジオキ
サン等を少量加えた水性溶媒が使用できる。最も好まし
い水性溶媒は生理的食塩水、緩衝液である。緩衝液はリ
ン酸・酢酸、ホウ酸、クエン酸、トリス−塩酸などのＩ
）Ｈ５〜１０好ましくはｐＨ６〜８の各種組成の緩衝液
の一種以りが使用できる。本発明に示すｐＨ５〜１０好
ましくはｐＨ６〜８の調製液とは塩酸、硫酸、リン酸・
酢酸、乳酸、クエン酸、コハク酸等の水溶性の無機酸、
有機酸とナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の水酸
化物、炭酸塩及びアンモニアから自家調製した稀薄水溶
液を意味する。

適当な時間とは５００日以内の時間であり、特に３０分
、間から約３０日間が好ましい。又、適当な温度とは６
０℃以下の温度であり、特に５℃乃至４０℃が最も好ま
しい一使用する水性溶媒の原料ミミズ（二対する培率は
１〜１００倍であり、最も好ましいのは５〜３０倍であ
る〕 原料ミミズ（こ水性溶媒をカロえて適当な時間及び適当
な温度番こ保持して行う抽出り法は、通常の攪拌、振盪
、向流等の抽出方法のほかに、特番こミミズの組織（細
胞）破壊方法としてホモジナイザー、ブレンダー、音波
処理、加圧型細胞破壊装置、播潰機等の機器を利用する
ミミズ細胞成分の懸濁液（ホモシイ、−ト）を作成し　
インキュベートする抽出り法が好ましい８次に濾過し、
得られた抽出液をそのまま又は適当な時間及び適当な温
度に保持したのち、減圧、加温又は限外濾過等の濃縮方
法番こより濃縮、減圧又は凍結等の乾燥方法により線溶
活性物質粗製物を製造方法である。前記、抽出の際、又
は抽出液のインキュベーションの際に、公知の防腐剤を
僅量添加して使用することが好ましい。その点から水性
溶媒として前記に示すように、極性有機溶媒を少量添加
した水性溶媒の使用の意味があると共ζこ、抽出効果を
高めることかでまた。

次に、ミミズ抽出濃縮液・又はその乾燥物を少量の水性
溶媒をこ溶解した溶液がら線溶活性物質を分画、精製す
る方法は、例えば一般的な高分子蛋白の精製方法が使用
できるａ本発明の好ましい本線溶活性物質の分画、精製
方法は下記の通りであるＯ 前記の操作により得られた抽出濃縮液又は乾燥物を少量
の水性溶媒％を吸着剤、極性有機溶剤、塩析、限外濾過
、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニ
ティクロマトグラフィー、疎水的クロマトグラフィー等
の処理のいずれか一方、もしくはそれらの適時な組合せ
にまり不軸物を除去する。本発明方法（こおいて使用す
る吸７Ｒ剤は活性炭、酸性白土、活性白土、アンパーラ
（トＸＡＤ（商品名）などの合成樹脂系合成吸着剤など
が使用できる。又、本発明方法で分別沈殿番ご用いる極
性有機溶媒としてはエタノール、メタノール、プロパツ
ール、アセトン、エーテル、ジオキサン等が使用できる
。最も好ましいのはエタノーノペアセトン、プロパツー
ルである。塩析に用いる塩類は硫酸アンモニア、硫酸ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウムなどが使
用できるが、最も好ましいのは硫酸アンモニアである。

〕イオン交換クロマトグラフィーとして使用できるイオ
ン交換体はセルロース、デキストラン・アガロース等の
親水性多糖類を基本とするものである。特に、ジエチル
アミノエチルセルロース（以下ＤＥＡＥ−セルロースと
いう。）、トリエチルアミノエチルセルロース（以下Ｔ
ＥＡＥ−セルロースという。）、アミノエチルセルロー
ス（以１−’ＡＥ−セルロースというＩＪ）ｊカルボキ
シメチルセルロース（以下ＣＭ−セルロースというＬＪ
’ｌ、フオスフオセルロース（以下Ｐ−セルロースとい
う、、）フオスフオメチルセルロース（以下ＰＰＭ−セ
ルロースという。）等が好ましい。父、イオン交換樹脂
として好ましいものを商品名で例示するとアンバーライ
トＩＲＣ−５０、アンバーライトＩＲＣ−７５、アンバ
ーライトＩＲＣ−８４、ダウエックスＣＣＲ−２等の弱
酸性陽イオン交換樹脂及びアンバーライトＩＲ−４Ｂ、
同じ（ＩＲ−４５、同じ＜ＩＲＡ−４００、ダウエック
ス３等の弱塩基性陰イオン交換樹脂である。ゲル濾過と
しては、商品名で例示するとセファデックス、セファロ
ース、バイオケル、トヨバールウルトラゲル、セＰファ
イン等カ好ましい。又、アフイニティクロマトグラフィ
ーとしてはアガロースゲル、セファロース又はトヨパー
ルを支持体とする各種のものが使用できる。疎水的クロ
マトグラフィーとしては炭素数２〜２０の脂肪族、脂環
族、芳香族及びそれらをこアミノ基を結有する化合物を
疎水性基としてもつアガロース、セファロース、セルロ
ースの吸着体が用いられる。

本発明の製法をフローチャートで示せば表−１〜表−１
６の通りである・〕 表−１ 表−２ 表　　　−３表　　　−４ □□□□□□□□□］ 表　　−５表　　−６ 表　　　−７表　　　−８ 表　　−９表−１０ 表−１３表−１４ 表−１５表−１６ 本発明の実態と効果を四番こ詳しく説明するため、下記
に本発明の製法の具体例と、得られた新規線溶活性物質
の理化学的性質及び薬理活性Ｏこつ（・て述べる。

本発明の製造法の具体例：ミミズ凍結乾燥脱脂粉末（こ
１０倍量の５０ｙｙ＋Ｍリン酸緩衝液（［）Ｈ７，Ｏ）
を加えて、３７℃で２００時間インキユペーショノした
のち線溶活性物質を抽出し、次（３抽出液を限外濾過法
で濃縮した。ＩＩ縮液番こエタノールを添加して分画し
、該沈殿を蒸留本番こ溶解し、ＤＥＡＥ−セルロース処
理して３つの線溶活性区分（Ｆ−１、Ｆ−ｎ、Ｆ−［［
１）を得た０Ｆ−１、Ｆ−１１の区分をそれぞれ硫安塩
析し、次（こセファデックスＧ−７５処理し、活性区分
を凍結乾燥した。Ｆ−ｍ区分はそのまま脱塩濃縮し、凍
結乾燥することζこより精製品を得た。これらの線溶活
性物質Ｆ−１，Ｆ−Ｉｔ、Ｆ−Ｉ［１４二共通する理化
学的性質及び力価について述べる。

ｍ　　作用：フィブリンを可溶化する。

（２）基質特異性：フィブリノをよく分解する。

（３）至適ｐＨｕび安定ｐＨ：本線溶活性物質の至適ｐ
Ｈは８〜１０付近であり、安定ｐＨは５〜１０付近であ
る１、 （４）力価測定：凝固可能性蛋白が０１５％番こなるよ
うＣニフイブリノーゲンを００１Ｍ塩化ナトリウムを禽
む０１７Ｍホウ酸緩衝液 （ｐＨ７，８）ｉこ溶解後１０−を面縁８０−の殺菌／
ヤーレ（こ流しｌへみ、トＩＪ／ビ／溶液（２０４，ｎ
ｉ）を０．５ｒｎｌ加え混和し１．ｌして室温にて１時
間放置する）（標準平板）２被検液０．０３ｍ１’（標
準平板１−（二垂直番二滴丁し、濾紙を蓋の間（３挾み
、１０分間放置後３７℃の恒温器（二人れて１８時間反
応させる。線溶活性は標準平板１−（こできた溶解部分
の長径と短径とを測り、その積（−）をもって表示する
。

（５）安定性二本線溶活性物質を含む水溶液は、ｐＨ７
，５ｉこおいて５０℃、３０分間処理及びｐＨ９，０ｉ
二おいて５０℃、３０分間処理のいずれをこおいても９
２％以−Ｆの残存活性を示す。

（６）阻害剤：本線溶活性物質の線溶活性作用は、トラ
／゛ロール（バイエル社の商品名）、トラ７サミン（第
−製桑社の商品名）、大σトリブシンイ／ヒビター（マ
イルズ社の製品）血清（こよって阻害される。

（７）線溶活性作用二本線溶活性物質はプラスミノーゲ
ン活性化作用を有し、間接的にフィブリ／を溶解すると
共（こ、直接ζこフィブリンＯこ作用しフィブリンを溶
解する。又、ミミズ凍結乾燥粉末３０（ＩＭこ生理的食
塩水３ｔを加えてホモ、゛イーートＬ３７℃で２０日間
インキユベーショノしたのちの抽出液及びその凍結乾燥
したものも前記と同一の性質を示した。

この抽出液（すなわち濾液）の等電点電気泳動を行って
得られるＪ）Ｈ勾配（四角印の線）と各２．５ｉ宛の両
分の７５０　ｎｍの吸光度（ＯＤ７５０ｎｍ１銅−Ｆｏ
ｌｉｎ試薬を用いる。

黒丸印の線）曲線は、図−１に示すようＱこ等電点１．
５．３．４及び５６を示す蛋白質類似又は蛋白質の存在
が認められｔニ一方、この抽出液（すなわち濾液）その
まま（白丸印の線）及びその透析後の抽出液（−モ角印
の線）の線溶活性曲線を図−１に示した。この結果より
透析前の抽出液（濾液月こは等電点３４付近の両分に高
い線溶活性を示す物質の存在が認められた。史（こそれ
よりも線溶活性は劣るが等電点１５付近叉は４０付近（
こも線溶活性を示す物質の存在が認められた。−ｈ、等
重点５６付近の物質は線溶活性を有していないことがわ
かる　又、抽出液の透析により等電点１５付近の線溶活
性物質は除去され、等電点３４付近に線溶活性が表われ
る。すなわち、図−１ζこ示す結果より等電点３４付近
の物質が線溶活性を示し、等電点５６付近の物質は線溶
活性を示さないことが明らかであるっ本発明の製造法ζ
こよる本線溶活性物質の薬効試験二本物質を治療桑とし
てヒト（こ経［Ｊ投与−する場合ｌ二は最終段階の精製
品が最も好ましいことは言うまでもないが、ｉｌ記精製
の各段階のものも使用が可能である。本物質はヒトに経
［］投与番こより優れた薬効を示すことが期待でざる。

後記の実施例１の製法にて分取、精製した本線溶活性物
質の凍結乾燥品製剤６００ｑを試験薬としく０６０才；
？）７３才；・１５９才の３名の動脈硬化症を有する男
性患者各人（こ経［１投与し、経時的（こ各人の末梢血
液を採血し、オイグロブリ／各分画によるフィブリ７溶
解力（ｒ４ｊ　）を調べたところ図−２の結果が得られ
た２゛′　　　−図−２中 の白抜きの丸印は完全溶解を、黒塗りの丸印は不完全溶
解を示す７この活眼まり本試験薬投与後、２時間で末梢
血液中の線溶活性がＩ−昇し、かっ血液中の線溶活性は
投与後４〜６時間で最大となることがわか−１た−６ 実施例　１ ミミズ凍結乾燥品をアセト７番こて脱脂乾燥粉末ｌ　Ｋ
９＋こｐＨ７，０の５０ｍＭリン酸緩衝液１０ｔを加え
、３７℃で１００時間攪拌抽出したのち、濾過し、残渣
に３ｔの同リン酸緩衝液で洗浄し、抽出液と洗浄液とを
合した清澄抽出合液１２．８　ｔ　（線溶活性は１０倍
希釈で４９０ｉｊ／ｍｌ）を得、次番こ限外濃縮して液
量を１．７５７．（線溶活性は６０倍希釈で５５０　ａ
　、”ｍｅ　）とし、これにエタノールを１〜４倍量〔
第一回目にエタノール１．７５ｔを如えて沈殿分別後の
１液に第２回目のエタノール７、ＯＬをυｎえる。］添
加して分画した。この分別沈殿を集め、これを同リン酸
緩衝液１．１ｔに溶解（線溶活性は６０ｆｌ’ｆ希釈で
６９４　ｃｊ　／ｍｌ　）　ＬＩユ次に、これｋＤＥＡ
Ｅ−セファローズ（ファルマシア社製）（こて処理して
線溶活性物質Ｆ−ＩＸＦ−■、Ｆ−１ｔこ３分画Ｌ７’
二それぞれを硫安０６飽和塩析後、セファデックスＧ−
７５処理して凍結乾燥してＦ’−１分画より１２３００
ｄ／ｑの線溶活性を有する粉末６２５岬を得、Ｆ−ｎ分
画より１０７００ｙｊ／Ｉｌの線溶活性を有する粉末６
６５〜を得たつ更（二Ｆ−Ｉｌ１分画は脱塩濃縮後、凍
結乾燥して１１５００ａｊ／Ｑの線溶活性を有する粉末
１２００〜を得た。

実施例　２ 生きたミミズ８４７番二生理食塩水を加え３００ｄとし
、次（こ懸濁液化し、３７℃で１００時間イ／午ユベー
／ヨンしたのち遠心分離した。Ｂ渣を１５０−の生理食
塩水で洗浄し、抽出液と洗浄液の合液４００ｍ７（線溶
活性は１０倍希釈で３７５ｍＡ　／　ｍｌ　）を得たつ
この合液を凍結乾燥したのこの乾燥物の線溶活性は１４
２ｙｊ／Ｑであった。

実施例　３ 生きたミミズ８４１こ蒸留水５００．ｎｔとフェノール
０．３９を加えて懸濁液とし、３０℃で７６時間インキ
ユペーンヨノしたのち、濾過し、残渣を２００−の蒸留
水で洗浄し、抽出液と洗浄水とを合した抽出液６５０−
を得た。この抽出液の線溶活性は１０倍希釈で２２０ｉ
ｊ／−であったっ実施例　４ 生きたミミズ８４月こ水４００ｍＪ、エタノール３０−
を加えて懸濁液としたのち、２５℃で２４０時間インキ
ュベーションする。その後、遠心分離し、得られた抽出
液の豐曲→寺線溶活性は１０倍希釈で３５０ｉｊ／−で
あった。

実施例　５ ミミズ減圧乾燥粉末５０９に生理食塩水４００ｄと、１
．８％のリン酸水溶液と１．８％アンモニア水で中和調
製したｐＨ６，５の水溶液１００−を加えて懸濁液とし
、３８℃で１００時間インキユベーショノしたのち、濾
過した。この抽出液の線溶活性は１０倍希釈で７２５−
ｊ／−であり、ミミズ乾燥物当りの線溶活性は７２．５
ｆｆ／ｑであった。

実施例　６ ミミズ凍結乾燥粉末５０ハこ２％酢酸水溶液と２％の水
酸化すトリウーム水溶液で中和調製したｐＨ６３の稀薄
水溶液２５０−１生理食塩水２００ゴ、水５０ゴ及びア
ジ化ナトリウム０．５ｆを加えて懸濁液とし、次ζ二３
７℃で７２時間インキユベーンヨンしたのち、濾過した
。この抽出液の線溶活性は１０倍希釈で４６０−／−で
あった。

実施例　７ ミミズ凍結乾燥脱脂粉末５０１こｐＨ７，０の酢酸緩衝
液２００−１ｐＨ７，０のホウ酸緩衝液２００ｍ１、水
１００−、プロパツール１０−、ノオキサン１０ｍ１の
混合液を加えて懸濁液とし、次に３２℃で２４０時間イ
ノキュベーシヲンしたのち、濾過Ｌｔユこの抽出液の線
溶活性は１０倍希釈で７７２ａｊ／−であった。

実施例　８ ミミズから内容物除去した凍結乾燥脱脂粉末５０２に、
１．８％す／酸、３．５％塩酸と水酸カリウムで調製し
たｐＨ６，８の稀薄水溶液２５０−１生理食塩水２２５
−、アセトン２５−を加えて懸濁液とし、次Ｑこ２５℃
で９６時間インキュベーションしたのち減圧濾過した。

この抽出液の線溶活性は１０倍希釈で６００−／−であ
った。

実施例　９ ミミズ瞬間高温高速乾燥脱脂粉末１０２にｐＨ６４のリ
ン酸緩衝液５０−とｐ　Ｈ４，’４のクエン酸緩衝液５
０−を加えて懸濁液とし、次に３７℃で７時間インキユ
ベーンヨンしたのち、濾過し、残渣を生理食塩水で洗浄
し、抽出液と洗浄液との合１１２０−を得た。この合液
ζこアジ化ナトリウム０１２を加えて３７℃で１０時間
インキュベーションしたのちの線溶活性は１０倍希釈で
２８０ＩＩｊ／ｒｎｌであった。

実施例１０ ミミズｔ”Ｒ結乾燥説指粉末１０月こｐＨ７，４のリン
酸緩衝液５０ｍ１と生理食塩水５０ｍｒン加えて２２℃
で４時間攪拌抽出したのち、遠心分離した１、得られた
抽出液（こアノ化ナトリウム０．０７９を加えて３７℃
で５時間インキユベーンヨノした樟の線溶活性は１０倍
希釈で１９０　ａ　／　ｍｌであ、ｔユ実施例１１ 生きたミミズ１０ハこｐＨ７，０の酢酸緩衝液７０−と
水３０ｍ１を加え懸濁化したのち、２０℃で２時間攪拌
抽出して遠心分離した・残渣を水洗し、抽出液と洗浄水
との合液１８０−を得た。

これ１こアジ化ナトリウム０１２を加えて３７℃で７時
間インキュペーンヨノしｔ：ユこの液の線溶活性は１０
倍希釈で４０−／−であった。

【図面の簡単な説明】

図−１は本発明の線溶活性物質抽出液の等電点電気泳動
と線溶活性物質の分離状態を示すものである０図−２は
本発明の線溶活性物質を経口投与したときのヒト末梢血
液中の線溶活性の１−昇を示したものである（図中ｆｌ
）は６０才、■は７３才、β）は５９才の男性高血圧患
者（こ本発明の線溶活性物質製剤６００ｑ（５２ＩＵ／
ツ）を経口投与し、経時的（こ各人の末梢血液のオリグ
ロブリンによるフィブリノ溶解力（、Ｒｊ）の変化曲線
を示したものである。）、 図−２ （ｈｒｌ 本発明の線溶活性物質服用後 手　続　補　＋Ｅ　　書（方式） ％式％ １　事件の表示 昭和５７年特願第３１４６７号 ２　発明の名称 Ｉｗ溶溶性性物質製造法 ５　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　愛知県名古屋市中区錦−Ｔ目２番７号４　補
正命令の日付 昭和５７年６月２９日 ５　補正の対象 ６？ｌ１ｉｌ′Ｅの内容 １［ｆｉの浄書（内容に変更なし）」 手続補正書 昭和５７年８月１６日 特許庁長官　若　杉　和　夫　　殿 Ｌ　事件の表示 昭和５７年特許願第３１４６７号 ２　発明の名称 線溶活性物質の製造法 ＆　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号屯　補正に
よって増加する発明の数　　〇五　補正の対象 Ｇ　補正の内容 （１）明細書第８頁第３行目 「ロースという。）等が好ましい。」とあるを［ロース
という。）ジエチルアミノエチルセルロファイン（以下
ＤＥＡＥ−セルロファインという。９等が好ましい。」
とする。 （２）　　明細書第２８頁第１５行と第１６行の間に下
記の全文を挿入する。 ナトリウムを含むａ９チ塩化ナトリウ声盲液を添加し、
３０℃で７２時間攪拌抽出したのち、戸通し、残液を３
１のα１チ１Ｃヤトリウムを含む０９％塩化ナトリウム
水溶液で洗浄し、抽出液と洗浄液とを合した清澄抽出液
（線溶活性は１０倍希釈で４５０ｍ／ｍｊ）１３１を得
た。この抽出液を限外濃縮して液量をα７１１とし、こ
れにエタノール０７１１を加えて沈澱分別後の戸液に終
濃度テエタノール濃度か８０％になるようにエタノール
を添加し、得られた沈澱をさらにエタノールで洗浄後、
真空乾燥し、乾燥粉末４２１を得た（このものの線溶活
性は１３２２ｍ１３１’／　ｍＦｌ　であった。）。 該粉末を精製水１０００１／に溶解し、これをＤＦＪＬ
Ｅ−セルロファイノ（チソノ株式会社製品）カラムクロ
マトグラフィーにて処理し図−３に示す様に線溶活性物
質Ｆ−１、Ｆ−１１，Ｆ−厘の３分画を得た。それぞれ
の画分を硫安０６飽和塩析後、得られた沈ｆＩｌを少量
の１０　ｆｆ１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨａｏ　）に溶解し
、セファクリルＳ−２００によるゲル濾過処理、ウルト
ラフィルトレーショ／による脱塩濃縮処理した後、凍結
乾燥することによって、Ｆ　−１分画ｎ６２９＃　、　
Ｆ−ＩＪ分画Ｑ８７９＃　、　Ｆ−１１分分画Ｏ７０Ｉ
の精製＃溶油性物質を得た。これら各分画の線溶活性は
Ｆ−１が１３７８０真ｆｍＪ？、　Ｆ　−ＩＩが９２９
０ｄｌ＋ｒｌ？　、　Ｆ−一が１７６２００／ｍＦＩで
あった。 又これら各分画のグラスミノーゲン活性化活性を調べた
。すなわち、プラスミノーゲン（／グマ社製）５Ｘ／Ｍ
Ｌ／のもの１０μｔ、各画分の線溶活性溶液（０１ｍＦ
ｌＩＩ（１）　２０　ｔｔｔ、００１Ｍ塩化ナトリウム
を含むＱ１７Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ７８）３０μｔを混
和し３７°ＣＩＯ分間放置したのち、この反応液の００
３ｍ１をマＩ　Ｙ’％１％−１１％　プラスミノーゲン
フリーの１１Ｗ板（マイルズ社製品）に垂直に滴下し、
３７°Ｃ１８時間反応させ、溶解部分の面積を測定した
値（−でもって表示する）を囚とし、同じよ４式ら 液１０μｔを〜を同じように測定して得られた値を（１
３）とするとプラスミノーゲン活性化活性は囚４−■で
表示される。こうしてＦ−１は２０２５ｔｘＶｍｌ　。 ）−川は１７２１ｔｌ／Ｊ？　ｌ　Ｆ−題は１２８３ｍ
１７ｍｌのそれぞれの活性を示すことが分った。 実施例１３ 実施例１２に準じて得られた各精製線溶活性物質につい
てフィブリ／、フイブノーゲ７に対する作用を調べた。 即ち、ヒト血清α１８１と２５０重ＭのＣａＣ４Ｉ水溶
液００２１に７．各濃度の精製線溶活性物質溶液００２
１を３７°Ｃで３０分反応させ生じるＦＤＰ（フィブリ
７分解ペプタイドＭをラテックス凝集反応によるトロン
ボウェルコテスト（ウェルカム社製）キットを用いて測
定した。その結果表＝１７のＣａＣ１ＩＣ士）の欄に示
される結果が得られた。表中＜十）　、　（＋＋）　、
（ｍ）はフィブリンがらＦＤＰを生成することを示し、
十の増加はＦＤＰ生成の強さを示す。（−）はフィブリ
ンがらのＦＤＰ生成がないことを示す。 一万、ＣａＣｌ２溶液の非存在下即ちＣａＣｌ２水溶液
に代えて生理食塩水を用いて上記と同様の反応を行なっ
たところ、いずれの種類またいずれの濃度の線溶活性画
分も表−１７のＣａ０４　（−）欄に示されるようにＦ
ＤＰの生成は認められなかった。このことは本願発明の
線溶活性物質はフィブリンに作用するものの、フィブリ
ノーゲンには作用しないことを示すものである。 表−１７ 実施例１４ 実施例１２に準じて得られた各精製線溶活性物質を健康
人にそれ七れ経口投与（１μＩＩ／ｋｙ）Ｌ、経時的に
末梢血液を採血し、オイグロプリン分画をれを測定した
。その結果は図−４（ＡＪおよびＵに示した。 ’ｔ”（％（ｕより明らかなように、Ｆ−１，Ｆ−厘画
分Ｏｆ′＃製線溶油性物質は経口投与後、約２時開俵に
ふ・いてオイグロプリン溶解に要する時間が著しく短か
くなり、かつ持続時間も長時間ｌｔｖことを示している
。又、Ｆ−ｎの画分から得られた精製線溶活性物質の場
合も経ロ投与後６時間頃からオイグロプリン溶解時間か
しだいに短かくなっていくことを示している。 Ｆ−１，１および歴のいずれの画分の本発明の線溶活性
物質もヒトへ経口投与することにより末梢血液中のＩ溶
油性を上昇せしめることがわかった。 さらに又、財イ場［Ｆ］）より明らかなようＫ、ヒトに
より個人差があるものの経ロ投与後２〜７時間後（３）
　　明細書第２９頁第７行目に下記の全文を挿入する。 １図−３は本発明の線溶活性物質のＩ）　Ｅ　Ａ　Ｅ−
セルロファイン力ラムクロマトグラフィーによる溶出パ
ターンを示すものである。図−４囚、山）は本発明の各
分画の線溶活性物質をヒトに経口投与した場合の効果を
示したものである。すなわち、図−４中囚はオイグロプ
リン溶解時間を経口投与後の各時間毎に、（Ｅ３＋は線
溶活性を経口投与後の各時間毎にみたものである。」 （４）　　図面に図−３１図−４囚および図−４ＣＢＩ
を挿入する。 −−−ＳａＬｌ濃ＬＩＩ　　Ｆむび） （”ｌ　’ａ’ｎ１１４Ｊ６ｆ：　ｒ１７−ｋ　Ｌ　　
Ｈ１４〜４ 本発明の−だ活性′ａＪ質服用後（ｈｒ１手続補正書 １、事件の表示　昭和５７年特許願第３１４６７号３、
［正をする者 ４、補正によって増加する発明の数　　０５、補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 ＋１）明細書第５頁第８行の「培率」とあるを「倍率」
とする。 （２）明細書第８頁第１４行の「アガロースゲル、」を
削除する。 （３）明細書第８頁第１９行の「セファロース、」を削
除する。 （４）明細書Ｗ４２１頁第３行の［（マイルズ社の製品
）血」とあるを［（マイルズ社の製品）及び血」とする
。 （５）明細書第２２頁第８行から第９行の「いないこと
がわかる。」とあるを「いなかった。」とする。 （６）明細書第２２頁第１１行の「表われる。」とある
を「残った。」とする。 （７１明細書第２７頁第４行の「水酸カリ」とあるを［
水酸化カリ」とする。 （８）昭和５７年８月１６日付手続補正書第６頁第５行
と第６行の間に下記の全文を挿入する。 ［実施例１５ ミミズ凍結乾燥粉末１賭にＩＯＡの０．１％安息香酸ナ
トリウムを含む０．９％塩化ナトリウム水溶液を添加し
３２℃、９６時間攪拌した後、濾過し、残渣を３１の０
．１％安息香酸ナトリウムを含む０．９％塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄し、抽出液と洗浄液を合せた清澄抽出液
（線溶活性は１０倍希釈液で４９０馴−２／鹸）　１２
．！Ｍを得た。 抽出液を限外濾過法でａ縮し、液量を０．５Ｊとし、こ
れにエタノール０．５ｉを加えて沈澱分別した後、濾液
に終濃度としてエタノール濃度が８０％になるように添
加し得られた沈澱をさらにエタノールで洗浄後真空乾燥
し乾燥粉末４０．５ｇを得た。 このものの線溶活性は１２８５ｍｍ’　／　ｑであった
。 該粉末を１０−Ｍリン＠緩衝液（ｐＨ８，０＞　　１１
に熔解し、これをエピクロルヒドリンで活性化したアガ
ロース（？ｆｉＭ［セファロース：ファルマシアファイ
ンケミカル社製）にヘキシルアミンを結合させ調製した
ヘキシルセファロースカラムに通液し、同リン酸緩衝液
にて洗浄を行った後、０．２５Ｍ−ＮａＣＩを含む同リ
ン酸緩衝液にて溶出を行い、溶出液１７！を得た。該溶
出液を透析後、凍結乾燥を行い精製線溶活性物質５．７
５ｇを得た。このものの線溶活性は７２４１−ｍ’／■
であった。 実施例１６ 実施例１５と同様に操作し、エタノール沈澱法により得
た真空乾燥粉末４７ｇ（線溶活性１１００ｍｓ’／■）
を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）！　７．０）　　１１に
熔解し、エピクロルヒドリンで活性化したアガロースに
卵白トリプシンインヒビター（シグマ社製）を結合させ
調製したＥＴＩ（卵白トリプシンインヒビター）−セフ
ァロースカラムに通液し、同リン酸緩衝液にて洗浄後、
さらに０．１Ｍ酢＃！１．緩衝液（ｐＨ５，０）で洗浄
後、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，０，５Ｍアルギニンを含む同酢
酸緩衝液にて溶出を行い溶出液０．８１を得た。 該溶出液を透析後凍結乾燥を行い精製線溶活性物質２２
５■を得た。このものの線溶活性は７０９６０１Ｉｌｌ
／■であった。」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　ミミズに水性溶媒を加えて適当な時間、適当な温度
   に保持して抽出を行い、抽出液をそのまま又は適当な時
   間、適当な温度に保持したのち濃縮又は乾燥することを
   特徴とする線溶活性物質含有粗製物の製造法。 ２　ミミズに水性溶媒を加えて適当な時間・適当な温度
   に保持して抽出を行い、抽出液をそのまま又は適当な時
   間、適当な温度に保持したのち濃縮又は乾燥したのち吸
   着剤、極性有機溶媒、塩析、限外濾過、イオン交換クロ
   マトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティー　クロマト
   グラフィー又は疎水的クロマトグラフィーのいｆれか又
   はそれらの組合せで処理することを特徴とする線溶活性
   物質の製造法１゜