KR100261657B1 - 룸부로키나제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈전용해제로 사용될 수 있는 롬부로키나제를 효율적으로 정제할 수 있는 룸부로키나제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 룸부로키나제의 제조방법은 (1) 구인제의 일종인 룸브리쿠스 루벨루스로부터 단백질을 추출하는 제 1 단계와, (2) 상기 제 1 단계의 단백질로부터 섬유소분해능이 있는 단백질만을 정제하는 제 2 단계, 및 (3) 상기 제 2 단계의 단백질로부터 순수한 룸부로키나제만를 정제하는 제 3 단계를 포함하고 있다. 상기한 구성에 의하면, 룸브리쿠스 루벨루스로부터 흉막염치료제등 신약을 제조할 수 있을 정도의 순수한 롬부로키나제를 얻을 수 있는 이점이 있다.

Description

룸부로키나제의 제조방법

본 발명은 룸부로키나제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 심근경색증이나 뇌경색증등 혈전질환의 긴급치료에 가장 널리 효과적으로 이용되는 혈전 용해제로 사용될 수 있는 룸부로키나제를 효율적으로 정제할 수 있는 룸부로키나제의 제조방법에 관한 것이다.

혈전용해제란 혈액중에 존재하는 혈병을 저해하는 물질로서, 심근경색증이나 뇌경색증등 혈전 질환의 긴급치료에 가장 널리 효과적으로 이용되고 있다. 혈전용해제 중에는 소변에서 분리된 유로키나아제나 최근 유전공학적 방법으로 합성된 조직형태의 플라스미노겐 활성제(tissue-type plasminogn activator(t-PA))가 대표적이며 미생물인 연쇄상구균에서 분리된 스트렙토키나아제도 광범위하게 사용되고 있다.

폐렴등의 병변으로 생기는 흉막염으로 인한 농이나 물은 튜부 등을 삽입하여 배액 배농을 수행한다. 이러한 배액 배농은 염증으로 발생하는 조직 유착(섬유화)으로 인한 어려움이 많다.

종래에는 이러한 배액 배농을 용이하게 하기 위하여 혈전용해제인 스트렙토키나제와 유로키나제등을 인체에 국소 주사(injection)하거나 잠적하고 있다. 이러한 효소에 의한 처치를 하지 않거나 실패하면 개흉술(thoracotony)을 시도하여야 한다. 이러한 개흉술은 환자의 고통 및 위험부담률이 크기 때문에 혈전용해제의 도입은 각광받고 있다.

그러나 스트렙토키나제의 경우 박테리아 단백질이기 때문에 환자에게 빈번하게 사용할 경우 알러지 반응이 일어날 수 있는 문제점이 있다. 유로키나제는 이러한 알러지 반응은 없으나 스트렙토키나제에 비해 무척 비싸다. 또한 이들 스트렙토키나제와 유로키나제의 처치 부작용으로 내흉부(intrathoracic)의 출혈과 호흡곤란증이 나타날 수 있음이 보고되고 있다.

상기의 문제점을 해결하기 위하여 구인(지렁이)에 함유되어 있는 혈전용해물질인 룸부로키나제에 관한 연구가 있었다.

룸부로키나제는 혈전에만 선택적으로 작용하며, 온도 및 pH변화에 비교적 안정하며, 또한, 룸부로키나제는 다른 혈전용해제와는 달리 직접적으로 혈관내에 주입하는 것이 가능하여 임상에 이용이 용이하다고 여겨진다.

그러나 현재까지 이용되고 있는 구인제재의 항혈전제는 모두 구인을 분말처리한 수준에 그치고 있으며, 유효성분을 추출하여 현대의학에 도입될 수 있는 신약으로서의 개발은 아직 이루어지지 않고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 룸부리쿠스 루벨루스(Lumbricus Rubellus)로부터 혈전용해성분이 있는 단백질인 룸부로키나제만을 효율적으로 정제할 수 있는 롬부로키나제의 제조방법을 제공하는데 있다.

제1도는 본 발병의 일실시례인 룸부리쿠스 루벨루스로부터 추출한 단백질의 광학밀도(Optical Density 이하 OD_280nm한다.)및 섬유소분해 활성도를 나타내는 그래프고,

제2도는 본 발명의 일실시례인 정제된 단백질의 OD_280nm및 섬유소분해 활성도를 나타내는 그래프고,

제3도는 본 발명의 일실시례인 룸부로키나제의 정제도를 나타내는 사진이고,

제4도는 본 발명의 일실시례인 룸부로키나제의 섬유소분해능을 나타내는 사진이고,

제5도는 본 발명의 일실시례인 룸부로키나제의 순도를 나타내는 사진이고,

제6도는 본 발명의 실시예인 유글로불린실험 결과를 나타내는 그래프이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제조방법은, 룸부리쿠스 루벨루스로부터 룸부로키나제를 포함하는 단백질을 추출하는 제 1단계와, 상기 단백질로부터 섬유소분해능이 있는 단백질만을 정제하는 제 2단계 및 상기 섬유분해능이 있는 단백질로부터 트립신과 유사한 단백질을 가진 단백질만을 정제하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 의하면, 혈전용해성분이 있는 단백질인 룸부로키나제만을 효율적으로 정제할 수 있는 이점이 있다.

이하에서는 첨부된 도면을 참고로 하여 본 발명의 바람직한 실시례를 상세히 설명한다. 그러나 하기한 실시례는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 본 발며의 일실시례일뿐 본 발명이 하기한 실시례에 한정되는 것은 아니다.

우선, 본 발명에 따른 바람직한 실시례에 따른 룸부로키나제의 제조방법은 룸부리쿠스 루벨루스(Lumbricus Rubellus)의 전처리단계와, DEAE(Diethylaminoethyl)-셀루로스 음이온 교환 크로마토그래피단계 및, 파라(p)-아미노 벤자미딘 세파로스 6B 친화 칼럼 크로마토그래피단계로 구별되어질 수 있다.

룸부리쿠스 루벨루스의 전처리단계는 룸부리쿠스 루벨루스 건조분말과 세라인(saline)을 혼합하여 단백질을 합성하는 단계와, 합성된 단백질을 원심분리하는 단계 및 암모니움염을 단백질과 결합시키는 단계로 세분될 수 있다.

이를 좀더 구체적으로 설명하면, 지렁이의 일종인 동결건조한 룸브리쿠스 루벨루스 건조분말과 세라닌(saline) 혹은 트리스(Tris)를 혼합하여 마그네틱막대로 휘젓어 단백질을 합성한다. 여기에 사용된 세라닌은 0.1%소디움 아자이드(sodium azide)(NaN₃는 방부제 역할)를 포함하고 있으며, 그 양은 건조분말의 대략 4배로 하는 것이 좋다. 그리고 트리스는 pH가 8.0인 것이 바람직하겠다.

또한, 룸부로키나제는 다른 효소에 비해 상대적으로 높은 온도(70℃까지)와 낮은 pH(pH2)에서도 안정하다. 상기의 이유로 인해, 단백질을 합성하는 단계에서 합성온도는 4℃내지 30℃, 바람직하게는 4℃내지 25℃에서 처리하는 것이 바람직하다.

합성된 단백질은 원심분리를 이용하여 불순물을 제거한다. 즉, 원심분리기에 위 시료를 넣고 원심분리하여 흙을 제거한다. 원심분리를 베크만(Beckmann) 초원심분리 JA-14 로터로 한 경우에는 4,500rpm의 속도로 30분간 원심분리하는 것이 적당하다.

상기의 방법을 실행후 남은 부유물을 제거하기 위하여, 상청액을 여과지로 걸러낸다. 여과지는 워터만 여과지(Whatman filter paper) (No.2)를 사용할 수 있다.

원심분리후 남은 침전물을 제거하기 위해 암모니움염(ammonium sulfate)을 사용하여 원심분리하며, 원심분리후 남은 침전물을 수거한다. 암모니움염은 2회에 걸쳐서 사용한다. 1회의 암모니움염 처리 농도는 30%미만으로, 2회의 암모니움염 처리 농도는 30-60%로 하는 것이 바람직하다.

암모니움염은 단백질과 결합하여 단백질을 침전시키는 역할을 한다. 본 단계에서 필요로 하는 단백질은 암모니움염의 비율이 30-60%인 경우에 암모니움염과 잘 결합한다. 즉 상기의 단백질을 30%미만의 암모니움염으로 처리하여 원심분리하여 불필요한 단백질을 침전하여 제거한다. 이때 원심분리는 8,300rpm으로 하고 그 시간은 30분이 적당하겠다. 암모니움염을 1회 처리한후 암모니움염을 다시 한번 더 처리하여 필요한 단백질만을 수거한다. 이때 원심분리는 10,000rpm의 속도로 50분간 실행하는 것이 바람직하다.

상기의 처리후, 불필요하게된 암모니움염을 제거하기 위해 투석막(dialysis membrane)을 사용한다. 투석막은 암모니움염의 분자량이 10,000이하이기 때문에 절단(cut)용의 크기가 10,000이하인 것이 바람직하다. 상기의 투석막을 사용할 때 트리스를 이용해서 암모니움염을 제거한다. 트리스의 pH는 8.0인 것이 적당하다.

DEAE-셀루로스 음이온 교환 크로마토그래피단계는 DEAE-셀루로스 음이온 교환 크로마토그래피단계는 및 염화나트륨을 이용한 농도경사법을 시행하는 단계로 세분될 수 있다.

본 단계는 상기의 룸브리쿠스 루벨루스의 전처리 단계를 거친 침전물에서 단백질만을 분리하기 위해 실시한다. 이를 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

우선 DEAE(Diethylaminoethyl)-세룰로스 음이온 교환 크로마토그래피단계를 시행한다. 본 과정은 일반적으로 pH8.0에서 음이온을 띠는 단백질의 성질을 이용한 단계로서, 본 칼럼을 완충용액을 이용하여 양이온으로 만든 후 상기의 침전물을 통과시킨다.

즉, cellulose 지지대에 디에틸아미노에틸(Dieethylaminoethyl)기가 붙어있는 칼럼의 충진제가 양이온을 띠게 하기 위하여 완충용액으로 칼럼을 충분히 씻어 평형화시킨후, 상기 단계에서의 단백질 용액을 칼럼에 붙인다. 이때 완충용액으로 트리스-염산을 사용하며, 이것의 pH는 8.0이 적당하다.

칼럼을 양이온으로 만든후 완충용액으로 uv-스펙트로포토메터(spectrophotometer)의 280nm 파장에서 흡광도가 0에 가깝도록 씻어서, 이온결합으로 결합되지 않은 물질을 제거하여, 칼럼에 붙어있는 단백질만을 수거한다.

즉 완충용액에 염화나트륨(NaCl)을 녹인 용액을 각각 만들어 농도 경사법으로 단백질을 추출시킨다. 이때의 추출 속도는 1㎖/min 의 속력으로 하는 것이 좋다.

상기 염화나트륨의 농도는 0.5M로 하는 것이 바람직하다. 일반적으로 염화나트륨은 pH가 0.8일 때 강한 음이온으로 작용하므로, 양이온을 띤 칼럼에 붙은 약한 음이온의 단백질을 대신하여 칼럼에 결합하게 된다.

상기와 같이 처리한 단백질분획을 OD_280nm및 섬유화 분해 활성도를 측정하여 수거한다. 이 때, OD_280nm를 이용하는 이유는, 280nm의 빛만을 특이적으로 흡수하는 단백질의 성질을 이용하여 단백질을 모으기 위한데 있다.

OD_280nm실험에서 반응한 단백질 중, 본 발명에서 얻고자하는 특징인 섬유소분해능을 가진 단백질만을 얻기 위하여, 섬유화 분해 활성도 실험을 실시한다. 섬유화 분해 활성도 실험은 섬유소 평판 방법(fibrin plate method)을 사용한다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에서 점선은 단백질 분획의 280nm에서의 흡광도를 나타낸 것이며, 실선은 섬유화분해 활성도를 나타낸 것이다. 도 1에서 나타낸 플랙션 넘버(fraction number, 이하 F.N라 한다.)는 상기에서 실험한 단백질 분획의 번호이다.

즉, 룸부로키나아제는 크게 FⅠ, FⅡ, FⅢ의 3가지 종류로 나누어지는데, 상기 F.N에서 F.N 60미만까지는 FⅠ으로 분류되고, F.N 60-124까지는 FⅡ로 분류되며, F.N 125-180까지는 FⅢ로 분류된다. 이 중 섬유소분해 활성도가 가장 높은 단백질 분획은 FⅢ분획이다. 상기 도 1에서 섬유소분해 활성도가 가장 높은 FⅢ 분획을 수거한다.

상기 DEAE-셀루로스 음이온 교환 크로마토그래피단계를 시행한후 파라-아미노 벤자미딘 세파로스 6B 친화 칼럼 크로마토그래피단계를 시행한다. 본 단계는 상기에서 수거한 단백질중에서 룸부로키나제만을 수거하기 위한 것으로서, 파라-아미노 벤자미딘 세파로스 6B 친화 칼럼 크로마토그래피 및 알지닌을 녹인 아세테이트 완충용액을 이용하는 단계로 세분될 수 있다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

우선 파라-아미노 벤자미딘 세파로스 6B 친화 칼럼 크로마토그래피를 시행한다. 여기에서 사용한 벤자미딘(benzamidine)은 트립신과 유사한 단백질과 결합하는 성질을 가지며, 이 성질을 이용하여 룸부로키나제만을 정제할 수 있다. 즉 룸부로키나제는 트립신과 유사한 단백질을 가지므로 벤자미딘과 결합하게 되어 다른 단백질로부터 정제될 수 있다.

즉, 벤자미딘 칼럼을 충분히 씻어 평형화시킨다. 완충용액은 트리스-염산을 사용할 수 있으며, 그 pH는 8.0으로 하는 것이 바람직하다.

칼럼을 완충용액으로 평형화시킨후 상기의 DEAE컬럼에 의해 분리한 FⅢ분획을 농축하여 당해 칼럼에 붙인다. FⅢ분획의 농축방법은 초여과(ultrafiltration)방법을 이용하는 것이 좋다.

FⅢ분획을 칼럼에 붙인후, 염화나트륨이 녹아 있는 완충용액으로 280nm파장에서 흡광도가 0에 가깝도록 씻는다. 이때 염화나트륨의 농도는 0.5M로 하며, 완충용액은 pH가 8.0인 트리스-염산을 사용하는 것이 바람직하다.

칼럼은 완충용액으로 씻은후 알지닌을 완충용액에 녹여 칼럼에 붙어 있는 단백질을 추출한다. 상기의 알지닌은 벤자미딘과 강하게 결합하는 성질을 가지므로, 칼럼에 결합되어 있는 단백질을 대신하여 벤자미딘과 결합하게 된다.

완충용액으로 아세테이트(acetate)를 사용하며, 아세테이트의 농도는 20mM내지 50mM이 적당하다. 상기의 완충용액의 pH는 5.0으로 하는 것이 적당하므로, 알지닌의 농도는 0.3M내지 0.5M, 바람직하게는 0.5M로 하는 것을 특징으로 한다.

상기 단계에서 시행한 단백질의 OD_280nm실험결과와 벤자미딘과의 친화력(Benzamidine Affinity)을 실험하였다. 그 결과는 도 2에서 나타내었다.

상기의 단계를 거친 후, 룸부로키나제의 정제도와 정제된 룸부로키나제의 순도를 확인하기위해 하기의 실험을 실행하였다.

[룸부로키나제의 정제도 확인]

룸부로키나제의 정제도 확인을 위하여 하기의 실험을 하였다.

상술한 단계에 의해 용출된 단백질을 50볼트에서 SDS 폴리아크릴아마이드 겔전기영동(polyacrylamide gel electropholesis)(SDS PAGE)을 시행하여, 표준 단백질과의 비율로써 분자량(MW) 34,000Da, 34,200Da인 더블밴드와 34,200인 단일밴드의 정제된 단백질임을 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 세로에 표시된 M(low molecular weight size marker)은 표준단백질 분자량의 표시이며, 가로에 표시된 16,17,19,21은 파라-벤자미딘 칼럼에서 분리된 단백질 분획의 표시이다. 제3도에서 나타낸 바와 같이 16, 17단백질은 단일밴드를 형성하고, 19,21단백질은 더블밴드를 형성하므로 순수하게 정제된 것임을 알수 있다.

[정제된 단백질의 섬유화분해능 확인]

정제된 단백질이 섬유화분해능이 있음을 확인하기위해 도 3면에서 나타낸 사진을 그대로 섬유소평판에 올려놓고 사진(fibrin autography)을 찍었다. 그 결과 16, 17단백질은 34,000Da와 34,200Da모드에서 크리어존(clear zone)을 형성하였고, 34,200Da인 19,21 단백질도 크리어존을 형성하였다. 이와 같은 크리어존의 형성을 통해 섬유화분해 활성을 확인하였다.

도 3의 사진은 SDS PAGE한 겔을 염색하지 않고 2.5% 트리톤(Triton) X 100으로 45분간 2번씩 씻어주고 물기를 제거한 후 섬유소 평판위에 올려놓아 37℃ 휴미디티 쳄버(humidity chamber)에서 관찰하였다. 그 결과는 도 4에서 나타내었다.

도 4에서 하얗게 나타난 부분이 크리어존이다.

[정제된 룸부로키나제의 순도 확인]

상기와 같은 실험을 통해 얻은 룸부로키나제의 순도를 확인하기 위해, 19,21단백질 이하의 단백질을 농축하여 SDS PAGE를 통해 정제된 단백질을 분석용 HPLC(High-Pressure Liquid Chromatography)를 시행하였으며 이때 사용한 칼럼은 분석용 Mono-Q컬럼이다. 그 결과는 도 5에서 나타내었다.

도 5는 HPLC상에서 12.25분에서 단 하나의 피크(peak)가 나옴을 나타내고 있다. 상기의 피크에 의해 정제된 룸부로키나제가 순수한 성분임을 알 수 있다.

[동물실험]

상기와 같이 정제된 룸부로키나제를 액상제재로 만들어 동물실험을 거쳐 인체에 무독성임을 결정하였고 혈전용해능을 검사하였다.

혈병 형성 시간(thrombin clotting time 이하 TCT라 한다)과 피브린 분해 물질(fibrin degradation produc 이하 FDP라 한다)등을 측정한다.

[실험방법]

여러농도의 트롬빈을 0.35U/g백서 체중에 투여하여 산 것과 죽은 것을 스크린(screening)한다. 즉 사망후와 생존후 모두 즉시 15분후에 희생시켜 폐조직을 얻어 현미경하에서 병리소견을 조사한다.

상기에서 스크린한 트롬빈 중 혈전증을 일으키는 적정양을 결정하고 이 양을 단독 투여한 군, 룸부로키나제를 장기간 먹인 후 이 양의 트롬빈을 투여한 군, 그리고 룸부로키나제와 트롬빈을 동시에 투여한 군으로 나누어 혈전용해능을 검사하였다.

혈전용해능은 마우스(mouse)의 심장채혈을 통하여 혈액을 채취한후 측정하였다. 혈전용해능 결과 FDP의 증가와 TCT지연을 관찰하였다.

본 발명의 또 다른 목적인 룸부로키나제를 구성요소로 하는 액상제재의 개발에 있어서, 상기의 룸부로키나제의 제조방법중 어느 한 단계에 따른 방법으로 제조된 룸부로키나제를 구성요소로 하는 것을 특징으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 우선 동물실험을 통하여 룸부로키나제의 무독성 및 혈전용해능을 측정한 결과를 바탕으로 효과적인 적정 룸부로키나제의 양을 정한다. 룸부로키나제의 적정량을 첨가하거나, 단삼을 끊여시킨 물을 첨가한후, 섬유소용해능 및 안정성을 평가한다. 상기와 같은 방법으로 제조된 액상제재는 경구투여가 가능한 항혈전 액상제재로 사용될 수 있다.

본 발명의 의해 제조된 롬부로키나제는 액상제재로 제조하여, 룸부로키나제를 구성요소로 하는 흉막염 치료제의 용도로 이용할 수 있다.

즉, 상기의 룸부로키나제 제조방법에 의해 제조된 룸부로키나제를 이용하여 흉막염 치료제로 사용할 수 있다. 더욱 상세하게는 본 발명은 흉막염으로 인해 생기는 배농을 용이하게 하기 위하여 이용한다.

또한, 상기 흉막염 치료제는 흉막염으로 인한 조직 유착 현상을 저해하는데 이용될 수 있다.

상기 흉막염 치료제는 국소 주사하는 (injection)하는 방법에 의해 흉막염을 치료하는데 이용하는 용도를 특징으로 하는 용도 및 6일내지 8일간 잠적하는 방법에 의해 흉막염을 치료하는데 이용하는 용도를 특징으로 할 수 있다.

룸부로키나제를 흉막염에 이용하여 생기는 효과를 하기의 동물실험을 통해 나타내었다.

[실험례]

흉막염을 유발시킨 ICR백서(mouse)에 섬유화가 일어나기 전 후의 백서군으로 나누어 정제한 룸부로키나제를 흉부에 튜부를 삽입해 국소에 점적하거나 천천히 주사한다.

룸부로키나제의 양은 유로키나제기준 1,000에서 2,500 U/ml을 100에서 500ml 세라인용액에 희석하여 사용한다. 이 양을 30분에서 180분간 투여하고 배농이 성공적으로 이루어지고 있나 측정한다.

이러한 과정을 6일에서 8일간 반복적으로 시행한다. 측정된 결과를 하기한 (표1)에 나타내었다.

(표1)은 4개의 국소 흉막액에 룸부로키나제의 점적 결과이다.

본 발명에 따른 룸부로키나제의 제조방법은, 혈전을 특이적으로 용해하고 종래의 혈전용해제에 수반되는 출혈합병증의 부작용을 감소시키는 룸부로키나제를 현대의학의 수준에 부합된 신약을 제조할 수 있는 수준으로 추출할 수 있다는데 그 우수성이 있다.

또한, 룸부로키나제를 이용한 액상제재는 경구투여가 가능하여, 주사제로만 사용가능한 종래의 혈전용해제가 수반하고 있는 부작용을 줄일수 있다는데 그 우수성이 있다.

또한, 액상제재를 흉막염의 합병증인 조직 유착(섬유화)을 예방 및 치료하고, 농양이나 액체를 효과적으로 배농하거나 배액하기 위해, 외과적인 시술없이 약(drug)을 가지고 사용할수 있다는데 그 우수성이 있다.

또한, 액상제재를 항혈전상 인공혈관에 사용할수 있다는데 그 우수성이 있다. 그리고, 룸부로키나제를 여드름 치료제 및 화장품에 사용할수 있다는데 그 우수성이 있다.

Claims (10)

1. 룸부로키나제의 제조방법에 있어서, 룸브리쿠스 루벨루스로부터 룸부로키나제를 포함하는 단백질을 추출하는 제 1 단계; 상기 단백질로부터 섬유소분해능이 있는 단백질만을 정제하는 제 2 단계; 및 상기 섬유분해능이 있는 단백질로부터 트립신과 유사한 단백질을 단백질만을 정제하는 제 3 단계를 포함하는 룸부로키나제의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제 1 단계는 룸브리쿠스 루벨루스 건조분말과 세라인(saline)을 혼합하여 단백질을 합성하는 단계; 합성된 단백질을 원심분리하는 단계; 및 암모니움염을 단백질과 결합시키는 것을 특징으로 하는 룸부로키나제의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 단백질을 합성하는 단계에서, 합성 온도는 4℃ 내지 30℃, 바람직하게는 4℃ 내지 25℃에서 처리하는 것을 특징으로 하는 룸부로키나제의 제조방법.
4. 제2항에 있어서, 단백질과 암모니움염을 결합시킬때 암모니움염을 2회 처리하는 것을 특징으로 하는 룸부로키나제의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 1회의 암모니움염 처리 농도는 30%미만으로, 2회의 암모니움염 처리 농도는 30-60%로 하는 것을 특징으로 하는 룸부로키나제의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 제 2단계는 DEAE(Diethylaminoethyl)-셀루로스 음이온 교환 크로마토그래피단계; 및 염화나트륨을 이용한 농도경사법을 시행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 룸부로키나제의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도는 0.5M로 함을 특징으로 하는 룸부로키나제의 제조방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 제 2 단계는 정제된 단백질을 OD_280nm및 섬유화 분해활성도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로하는 룸부로키나제의 제조방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 제 3 단계는, 파라-아미노 벤자미딘 세파로스 6B 친화 칼럼 크로마토그래피단계; 및 알지닌을 녹인 아세테이트 완충용액을 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 룸부로키나제의 제조방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 알지닌의 농도는 0.3M내지 0.5M, 바람직하게는 0.5M로 하는 것을 특징으로하는 룸부로키나제의 제조방법.

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