JPH0215193B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なウロキナーゼ誘導体、その製造
法及び血栓溶解剤に関する。更に詳しくは、本発
明は水可溶性ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸
結合物及びその製造法当該結合物を有効成分とす
る血栓溶解剤に関する。 フイブリンおよび血栓の溶解酵素であるウロキ
ナーゼは各種血栓症や塞栓性疾患の治療および制
癌剤との併用療法等に広く用いられており、優れ
た臨床効果をもたらしている。しかし生体に投与
されたウロキナーゼは、蛋白体としても又酵素活
性としてもいずれも速やかに血中より消失し、こ
のものの血中半減期はわずか１〜２分である。さ
らに投与されたウロキナーゼの酵素活性は血中の
ウロキナーゼ阻害因子による作用を受け、ある閾
値以上の量を投与しないと、血栓溶解能が発現し
ないことが判つている。 ウロキナーゼのこのような血中動態は、十分な
効果を得るためには必然的に大量投与へと進展せ
ざるを得ず、今日の大量投与療法になつていると
理解される。発明者らはかねてより血中における
ウロキナーゼの効力を持続させ、かつ血中の阻割
因子による影響を受けにくくすることを研究し、
実験及び検討を重ねた結果、水可溶性のウロキナ
ーゼ・コンドロイチン硫酸結合物を創製すると共
に当該結合物がウロキナーゼの単独投与時にみら
れる種々の欠点を改善し得ること、及びウロキナ
ーゼの酵素活性を十分にかつ持続的に発揮しうる
ことを見出し、その医薬としての有用性に着目し
て本発明を完成した。 即ち、本発明はウロキナーゼ・コンドロイチ
ン硫酸結合物、ウロキナーゼとコンドロイチン
硫酸の反応性誘導体とを反応させてなるウロキナ
ーゼ・コンドロイチン硫酸結合物及び、ウロキ
ナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物よりなる血栓
溶解剤に関する。 本発明に用いるウロキナーゼは医薬として精製
されたものであれば、人尿、腎組織培養のいずれ
の由来のものでもよく、更に遺伝子工学の手法に
よりヒト由来のウロキナーゼ遺伝子を大腸菌に投
入し、培養後その大腸菌が生産するウロキナーゼ
でもよい。また分子量25000〜60000の範囲のもの
を使用することが好ましい。 本発明に使用されるコンドロイチン硫酸は分子
量4000〜40000の範囲のものから選択することが
好ましい。 本発明のウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結
合物は、活性化コンドロイチン硫酸（たとえば、
コンドロイチン硫酸の水酸基をアルデヒドに活性
化したものなど）とウロキナーゼとを直接結合さ
せたものでもよく、また活性化コンドロイチン硫
酸とウロキナーゼとを他の基を介して間接的に結
合したものでもよい。ここに活性化コンドロイチ
ン硫酸とは、コンドロイチン硫酸分子中の水酸基
をウロキナーゼ分子中のアミノ基などと反応しう
るよう活性化したものであり、活性化コンドロイ
チン硫酸としては、たとえば式 で表わされる化合物などがあげられる。化合物
（）は、たとえばコンドロイチン硫酸を過ヨウ
素酸などで酸化することによつて製造される。化
合物（）はコンドロイチン硫酸をシアンブロマ
イドと反応させることによつて得られる。これら
の活性化法は、J.Biol.Chem.251、1081（1976年）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73、2128（1976年）等
に記載されている。 本発明のウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結
合物の製造法は、たとえば次の如くである。 本反応においては、まずコンドロイチン硫酸を
酸化剤（たとえば過ヨウ素酸ナトリウム）にて酸
化する。この際コンドロイチン硫酸100重量部に
対して酸化剤を10〜40重量部使用する。また反応
時間は10〜60分であり、室温、暗所で撹拌処理す
ることによつて行われる。かくして得られた活性
化コンドロイチン硫酸は反応終了後、３〜5Mの
水酸化ナトリウムで中和し、水で透析した後凍結
乾燥する。かくして得られた活性化コンドロイチ
ン硫酸の酸化度は10〜50％である。ウロキナーゼ
と活性化コンドロイチン硫酸との反応は通常、ウ
ロキナーゼ100重量部に対して活性化コンドロイ
チン硫酸20〜2000重量部を反応させることによつ
て行われる。この際ウロキナーゼは水溶液とし
て、また活性化コンドロイチン硫酸はリン酸緩衝
液（PH６〜８）溶液として反応に供される。かく
して得られた化合物を還元することによつて目的
物が得られるが、この際還元剤としては、水素化
ホウ素金属塩が使用され、特に好ましくは水素化
ホウ素金属塩による還元の前に水素化シアンホウ
素金属塩にて還元する。水素化ホウ素金属塩及び
水素化シアンホウ素金属塩としては各々アルカリ
金属塩（たとえばナトリウム塩）が好ましいもの
として例示される。当該還元は、通常０〜30℃好
ましくは４℃にて６〜12時間撹拌することによつ
て行われる。 （式中、Ｘ、X′はそれぞれハロゲン原子（たと
えば、クロルなど）を、ｎは１〜６の整数を示
す） コンドロイチン硫酸と臭化シアンとの反応に
は、前者100重量部に対して後者を10〜100重量部
を使用する。 活性化コンドロイチン硫酸に二官能性化合物
（例えばジアミノエタン、ジアミノヘキサン）次
いでハロゲンアセチルハロゲニドたとえば、ブロ
ムアセチルプロミドを作用させて結合させる。次
にこの活性化コンドロイチン硫酸とウロキナーゼ
とを接触させウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸
を得る。この結合反応は、PH7.2〜11に調整し、
温度３〜25℃で12〜48時間接触させことにより行
なう。 かくして得られたウロキナーゼ・コンドロイチ
ン硫酸結合物は公知のゲル過法、分子篩別法、
イオン交換法等にて回収できるが、ゲル過法で
分画した場合はウロキナーゼ・コンドロイチン硫
酸結合物と未結合のコンドロイチン硫酸及びウロ
キナーゼがきわめて明瞭な差異を持つて挙動する
から、目的とする結合物の回収を容易に行いう
る。回収したウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸
結合物は、除菌過及び加熱処理等を行なつたの
ち分注し、凍結乾燥してウロキナーゼ・コンドロ
イチン硫酸結合物を含有する血栓溶解剤が得られ
る。 このようにして得たウロキナーゼ・コンドロイ
チン硫酸結合物の性状は水及び生理的塩類溶液に
容易に溶解する。又、ウロキナーゼ・コンドロイ
チン硫酸結合物のPH安定性、加熱安定性及び血漿
中プロテアーゼ阻害因子に対する安定性を調べる
と、PHについてはウロキナーゼ自体はPH３〜10の
範囲にわたつて比較的安定であるが、ウロキナー
ゼ・コンドロイチン硫酸結合物はさらに安定であ
り、PH２〜11の広い範囲にわたつて力価の低下は
全く認められなかつた。加熱安定性についてはウ
ロキナーゼが最も安定なPH8.0において60℃の加
温を行つたところ、ウロキナーゼ単独のものは２
時間の加熱で完全に失活したのに対し、ウロキナ
ーゼ・コンドロイチン硫酸結合物は加熱10時間後
においてもなお100％の活性残存率を示し、熱に
対して非常に安定であることが認められた。 本発明に係るウロキナーゼ・コンドロイチン硫
酸結合物は、血栓溶解作用を有するので血栓溶解
剤として有用であり、たとえば注射剤として非経
口的に投与される。具体的には、たとえば50〜
30000IUの本品を日本薬局方注射用蒸留水0.5〜５
mlに溶解し、年令、症状および経過に応じて適宜
加減して静脈内注射、点滴静注、点滴注射、結膜
下又は球後注射して用いる。 本発明に係るウロキナーゼ・コンドロイチン硫
酸結合物は血中で極めて安定であつて容易に解離
や分解をせず、熱に対しても著るしく安定であ
り、血中のウロキナーゼ阻害因子の作用を受けに
くく、ウロキナーゼ単独では血栓溶解作用を示さ
ない低活性の投与でも血栓溶解作用をもたらし、
生体内に投与したとき血中滞留時間が著るしく延
長し、毒性もほとんど検出されない等の優れた特
性を有し、従来にない極めて有用性の高い医薬を
提供できる効果がある。 以下、実施例及び実験例により本発明をより具
体的に説明する。 実験例 １ ヒト血漿を用いてウロキナーゼ及びウロキナー
ゼ・コンドロイチン硫酸結合物の血漿中プロテア
ーゼ阻害因子に対する抵抗性を調べた。試験方法
は、活性が100IU（国際単位）／ml（国際単位に
ついては、医薬品研究(3)、295−308、1974年参
照）になる様に稀釈したウロキナーゼ単独または
ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物225μ
に18％ヒト血漿アルブミン15μを混合し、次
いでこの混合液20μにヒト血漿80μを混ぜ、
37℃にて１時間インキユベートしたのちヒトフイ
ブリン標準平板法（B.B.A.、24、278−282、
1975年）にてウロキナーゼ活性を測定し、ヒト血
漿とのインキユベート前のウロキナーゼ活性を
100％とし、そのウロキナーゼ残存活性を算出し
た。試験結果は第１図に示す通りであり、ウロキ
ナーゼ単独の残存活性が1.5％であるのに対し、
ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物では23
％であつた。このことから本結合物は血漿中プロ
テアーゼ阻害因子の影響に対して抵抗性を有する
ことが認められた。 実験例 ２ ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物につ
いて高速液体クロマトグラフイー（LC−3A：島
津製作所製）を用いてSomenoら〔J.Chromat.、
188、185−92（1980）〕の方法に従い分析した。担
体としてTSK−Gel 3000SW（東洋ソーダ製）を
用い、PH３の0.2Mリン酸緩衝液を1.2ml／minの
流速で展開したところ、第２図の高速液体クロマ
トグラムを得た。その結果、ウロキナーゼ・コン
ドロイチン硫酸結合物は予想された如く高分子側
に溶出された。 実験例 ３ ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物とウ
ロキナーゼ単独のものの血栓溶解能をチヤンドラ
ループ法を用いて比較した。この試験方法は新鮮
で正常なヒト・クエン酸血液１mlを内径３mm、長
さ270mmのプラスチツク・チユーブに入れ、この
血液にさらに3.8％塩化カルシウム・２水塩液0.1
ml添加したのち、チユーブの両端に内径５mm、長
さ15mmのシリコンチユーブを接合してループにす
る。このチユーブを直ちに水平面より80℃の角度
で毎分12回転するように設計された回転盤に載
せ、37℃の恒温室にて20分間回転させる。これに
より血液カラムの先端に長さ約13mmの人工血栓が
生成する。この人工血栓は病理組織学的にみて人
体にできる混合血栓に極めて近似した組織像を有
するといわれている。 ループをこの装置から取りはずしたのち、ルー
プ状にしたポリビニルチユーブの一端をシリコン
チユーブからはずし、試料液又は生理食塩液0.1
mlをチユーブ内に入れ、再度チユーブをループ状
にし、回転装置に架け、回転を続けた。 第１番目のループに就いて血栓溶解を開始して
から４時間後に、この第１番目のループを回転装
置から抜き取り、チユーブ内の血栓を10mlの蒸留
水にhomogenizeし、遠心し（3600rpm、５分
間）、上清の540nｍに於ける吸光度を測定した。
第２番目以降のループも第１番目のループに引き
続いて抜き取り、先と同様に処理した。 なお、試料液添加群の血栓溶解率Ｙを次式に従
つて求めた。 Ｙ＝（１−Ａ／Ac）×100（％） 担し、 Ａ；試料液を添加したループについての540nｍ
における吸光度 Ac；生理食塩液を添加したループについての
540nｍにおける吸光度の平均値 ウロキナーゼ単独とウロキナーゼ・コンドロイ
チン硫酸結合物のチヤンドラループ法による血栓
溶解試験の結果は、第３図に示す如くである。第
３図のグラフの横軸は、試料液0.1mlをループ内
に注入した時の最終力価を表示しており、且つ力
価はフイブリン平板法で測定した値である。 このグラフより、ウロキナーゼ・コンドロイチ
ン硫酸結合物の血栓溶解曲線がウロキナーゼ単独
の同曲線よりも左側に移動しており、本結合物の
血栓溶解能がウロキナーゼ単独よりも強くなつて
いる事が分る。 実験例 ４ 次にビーグル犬（雄、体重12〜15Kg）を用いて
ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の血中
維持効果を実験し、ウロキナーゼの単独投与と比
較した。ウロキナーゼはクロラミンＴ法
（Biochem J.89、114、1963年）により ¹²⁵Iで標
識した。すなわちウロキナーゼ10万単位をリン酸
緩衝液0.5mlに溶解したのちこのウロキナーゼ水
溶液0.1mlに１ｍCi／mlNa¹²⁵I0.1mlを加え、さら
に0.05％クロラミン−T0.1mlを加えて室温にて５
分間反応させたのち、0.1％重亜硫酸ナトリウム
0.1mlを加えて反応を止め、この反応混液をセフ
アデツクスＧ−25カラムに通して ¹²⁵I−ウロキ
ナーゼと遊離のNaI¹²⁵を分別過した。 このようにして得た ¹²⁵I−ウロキナーゼを２
分し、１つはそのまま動物実験用試料とし、他は
分子量４万の活性化コンドロイチン硫酸と反応さ
せ、 ¹²⁵I−ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸
結合物を得て動物実験用試料とした。 ¹²⁵I−ウ
ロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物及び
¹²⁵I−ウロキナーゼのそれぞれ２×10⁶cpmをビー
グル犬に静脈内投与し、それぞれの血中濃度を10
分おきに求めた。実験結果は第１表に示す通りで
あり、本結合物はウロキナーゼ単独に比較して血
中半減期は第１次減衰曲線からは5.7倍に、第２
次減衰曲線からは５倍にそれぞれ延長し、ウロキ
ナーゼにコンドロイチン硫酸を結合させると著る
しい血中維持効果が得られることを認めた。 【表】 実験例 ５ 急性毒性試験をウイスター系ラツトの尾静脈内
投与により調べるため、体重１Kgにつき本結合物
のウロキナーゼ50万IUを静注し投与後７日間に
わたつて一般症状の観察と体重測定を行つたとこ
ろ、体重は順調に増加して全く異常所見は認めら
れなかつたし、部検ならびに組織学的検査の結果
も全く異常を認めなかつた。 実施例 １ コンドロイチン硫酸（分子量４万）１ｇを秤取
し、これに蒸留水20mlを加え溶解させ、350mgの
過ヨウ素酸ナトリウメを蒸留水５mlに溶解させた
ものを添加し、室温で暗所にて30分間撹拌した。
撹拌後、4Mの水酸化ナトリウム溶液で中和し、
水で充分透析した。透析後、凍結乾燥する。次に
ウロキナーゼ10mg（100万IU）を含有する水溶液
４mlに上記の活性化コンドロイチン硫酸28mg
（3.5モル当量）を0.1Mリン酸緩衝液（PH７）に
溶解させたものを加え、更に水素化シアノホウ素
ナトリウムを1.22mg添加し、４℃にて18時間撹拌
する。撹拌後、水素化ホウ素ナトリウムを3.3mg
を0.1Mリン酸緩衝液（PH７）に溶解させたもの
を加え、４℃にて18時間撹拌する。撹拌後、上記
緩衝液にて透析する。得られた反応混合物をセフ
アデツクスＧ−200のカラムにかけてゲルロ過し、
ウロキナーゼと上記のコンドロイチン硫酸の結合
物と未反応のウロキナーゼとを分別する。分別し
て得られた結合物を集め、ミリポアフイルターに
よる除菌過を行いウロキナーゼ力価を測定して
分注量を決めたのち、所定量を小分けして分注
し、凍結乾燥してウロキナーゼ・コンドロイチン
硫酸結合物の製剤を得る。この結合物は前述した
ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の種々
の特性を有していた。 実施例 ２ コンドロイチン硫酸（分子量４万）１ｇに蒸留
水49mlを加えて溶かし、これに臭化シアン150mg
をシアン化メタン1.5mlに溶かした液を滴加して
十分に撹拌する。この間1M水酸化ナトリウムに
てPH10.2〜10.5に維持する。反応開始より５分経
過後に濃塩酸にてPH2.2に下げ、ジアミノエタン
２mlを加えてPH9.5に上げ、PH9.5に保つて４℃で
１夜静置する。この後蒸留水に対して透析したの
ち凍結乾燥してアミノエチルアミノコンドロイチ
ン硫酸を得る。次にこれを0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）25mlに溶解し、ブロムアセチルブロミド
１mlを滴下し、約２時間1M水酸化ナトリウムで
PH7.0に保つたのち蒸留水で透析し、凍結乾燥し
て活性化コンドロイチン硫酸末を得る。その50mg
を0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）0.4mlに溶かし、ウロ
キナーゼ５mg（50万IU）を加え、約５℃にて50
時間静置して結合反応を行う。 次いで反応混合物をセフアデツクスＧ−200の
カラムにかけてゲル過し、ウロキナーゼ・コン
ドロイチン硫酸結合物を得る。得られたウロキナ
ーゼ・コンドロイチン硫酸結合物は前述の諸特性
を有していた。 実施例 ３ 実施例２と同様に臭化シアンで活性化したコン
ドロイチン硫酸に、ジアミノヘキサン２mlを加え
てPH9.5にし、PH9.5に保て４℃で一夜放置する。
この後蒸留水で透析し、凍結乾燥してアミノヘキ
シルアミノコンドロイチン硫酸を得る。これを実
施例２と同様に、ブロムアセチルブロマイドで処
理してＮ−ブロモアミノ−ヘキシルアミノ−コン
ドロイチン硫酸を得た。この50mgを0.1M炭酸緩
衝液（PH9.5）１mlに溶かし、ウロキナーゼ５mg
（50万IU）を加え、同様に処理する。得られたウ
ロキナーゼ・コンドロイチン硫酸は前述の諸特性
を有していた。 なお、実施例１〜３における生成物の特性は次
の通りである。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は血漿中プロテアーゼ阻害因子に対する
抵抗性を示す図、第２図１はウロキナーゼ、第２
図２はウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物
におけるそれぞれの高速液体クロマトグラムであ
り、実線は280nｍにおける吸光度であり、破線
は屈折率を示すものである。第３図はウロキナー
ゼとウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の
血栓溶解曲線を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水可溶性ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸
   結合物。 ２ ウロキナーゼとコンドロイチン硫酸の反応性
   誘導体とを反応させることを特徴とする水可溶性
   ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の製造
   法。 ３ コンドロイチン硫酸の分子量が４千から４万
   である特許請求の範囲第２項記載の水可溶性ウロ
   キナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の製造法。 ４ ウロキナーゼ１モルに対してコンドロイチン
   硫酸１〜10モルの割合で反応させることを特徴と
   する特許請求の範囲第２項または第３項記載の水
   可溶性ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物
   の製造法。 ５ 水可溶性ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸
   結合物を有効成分とする血栓溶解剤。