CN101002944A - 支链聚乙二醇－干扰素结合物及其制备方法 - Google Patents

支链聚乙二醇－干扰素结合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有生理活性的水溶性新型支链聚乙二醇与干扰素的结合物，它是分子量10000～60000道尔顿的支链聚乙二醇修饰的干扰素，具有如下结构式，式中，mPEG是聚乙二醇链，interferon是干扰素。本发明的支链聚乙二醇－干扰素，抗病毒活性高，在体内保留时间长，血浆半衰期达到40～80小时。

Description

支链聚乙二醇-干扰素结合物及其制备方法
发明领域
本发明涉及以支链聚乙二醇(简称：支链PEG)对干扰素进行化学修饰的支链PEG-干扰素结合物，及其制备方法。
背景技术
许多天然的和重组蛋白质都具有医疗作用，如果将它们纯化并制成制剂，它们能够进行非肠道给药而用于各种医疗适应症。但是，非肠道途径给药的蛋白质大可能具有免疫原性，并且通常血浆半衰期较短，因此，病人体内药用蛋白质很难达到有效治疗的血药浓度。
通过将蛋白质与高分子聚合物(如聚乙二醇)结合可以克服这些问题。Davis等在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇与蛋白质(酶和胰岛素)结合以获得具有生理活性的结合物的技术方法。Katre等在美国专利4,766,106和4,917,888中公开了通过聚合物结合蛋白质从而使蛋白质增溶的技术方法。此外，将聚乙二醇等高分子聚合物与蛋白质结合可以降低免疫原性并延长半衰期(参见文献：Nitecki等，美国专利4,902,502；Enzon，国际专利申请PCT/US990/02133；国际专利申请PCT/US85/02572)。
干扰素是一类能够治疗多重疾病的药物，并且，通常需要对病人较长时间给药，提高干扰素的血浆半衰期可以提高对这些疾病的治疗作用，同时减轻病人的痛苦。
目前已有文献报道PEG修饰的干扰素，但有些存在几个问题，一是PEG结合到干扰素中后降低了干扰素的生物活性，在使用中必须提高干扰素的剂量；其次是在形成PEG-干扰素结合物时，所用形成的连接键可能会在体内水解断掉，导致半衰期延长不明显。
本发明中的支链聚乙二醇是两条mPEG链与一分子赖氨酸以酰胺键连接，体内不易水解。
发明内容
本发明的支链聚乙二醇-干扰素是以共价键方式与支链聚乙二醇连接的干扰素，本发明中的支链聚乙二醇是两条mPEG链与一分子赖氨酸以酰胺键连接，体内不易水解。该支链聚乙二醇是带有两条线性聚乙二醇长链的分子，由于聚合物以带有链长分布的混合物制备，因此其分子量通常是指其平均分子量。
本发明的技术方案如下：
一种支链聚乙二醇-干扰素结合物，它是分子量10000～60000道尔顿的支链聚乙二醇修饰的干扰素，具有如下结构式：
Figure A20061001120700051
式中，mPEG是聚乙二醇链，interferon是干扰素，R0是 R是
Figure A20061001120700053
或
Figure A20061001120700054
(其中R1是氢原子，或者是一种烷烃，其碳原子数为1～16)。
上述的支链聚乙二醇-干扰素结合物中，其中干扰素可以是干扰素α-2a，干扰素α-2b，干扰素α-1b或复合干扰素中的任何一种。
上述的支链聚乙二醇-干扰素的制备方法由以下步骤组成：
步骤1，配制干扰素溶液。将干扰素以5～20mM pH3.0～5.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为0.2～10mg/ml的溶液；
步骤2，修饰反应。按干扰素∶PEG为1∶0.8～50的物质的量之比加入mPEG2-NHS，以氢氧化钠调节pH到6.0～10.0，在温度0～37℃下反应0.2～24小时，mPEG2-NHS的结构如下：
步骤3，终止反应。加入0.5M甘氨酸终止反应；
步骤4，利用离子交换色谱进行分离。将步骤3得到的修饰反应液用5～10倍体积的20～50mMpH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液稀释；然后将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)柱，以2～6倍体积pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.2～1.0M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含支链PEG-干扰素的洗脱液；
步骤5，用凝胶色谱进一步分离制备PEG-干扰素。将步骤4所得PEG-干扰素溶液以Superdex 200凝胶色谱进一步纯化，洗脱液为pH＝6.8～7.2的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含支链PEG-干扰素的洗脱液。
本发明的支链聚乙二醇-干扰素在体内保留时间长，抗病毒活性高，可以用于制备抗病毒的药物。
由于反应混合物中各组分具有不同的等电点和分子量，因此可以将各种色谱方法组合起来分离制备高纯度的支链聚乙二醇-干扰素结合物。另外，可以通过控制反应条件(包括反应温度、时间、修饰剂与干扰素配比、缓冲液pH以及离子强度等)来获得单修饰的支链聚乙二醇-干扰素产物(即一分子的支链聚乙二醇与一分子干扰素结合的产物)。
由于支链聚乙二醇空间位阻大，容易控制生成单修饰的支链聚乙二醇-干扰素，并且在体内的半衰期显著延长。本发明制备的支链聚乙二醇-干扰素体内血浆半衰期可达到40～80小时。
附图说明
图1为实施例1的SDS-PAGE电泳检测谱图，其中第1条带：标准分子量蛋白；第2条带：未修饰干扰素α-2a；第3条带：单修饰支链聚乙二醇-干扰素偶联物(聚乙二醇Mw＝10000)；第4条带：反应混合物。
具体实施方式
实施例1.支链聚乙二醇-复合干扰素的制备
将复合干扰素以5mM pH4.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为2mg/ml的溶液；按干扰素：PEG为1∶5的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝10000，实验室自制，下同)，以氢氧化钠调节pH到9.0，在4℃下反应24小时，加入0.5M甘氨酸0.2ml终止反应；5分钟后，用10倍体积的20mM pH4.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)，以6倍体积pH4.0的醋酸钠(或磷酸钠)缓冲液冲洗柱子后，用含0.3M的氯化钠的醋酸钠(或磷酸钠)缓冲液洗脱，收集含支链聚乙二醇-复合干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex 200对支链聚乙二醇-复合干扰素进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含支链聚乙二醇-复合干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。结果见图1。
实施例2.支链聚乙二醇-干扰素α-2a的制备
将干扰素α-2a以5mM pH4.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为5mg/ml的溶液；按干扰素：PEG为1∶35的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝20000)，以氢氧化钠调节pH到8.0，在25℃下反应12小时，加入0.5M甘氨酸0.5ml终止反应；5分钟后，用6倍体积的20mM pH4.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上(Waterman CM-52)柱，以6倍体积pH4.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.3M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含支链聚乙二醇-干扰素α-2a的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex 200对支链聚乙二醇-干扰素α-2a进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含支链聚乙二醇-干扰素α-2a的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。
实施例3.支链聚乙二醇-干扰素α-2b的制备
将干扰素α-2b以5mM pH4.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为3mg/ml的溶液；按干扰素∶PEG为1∶15的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝10000，实验室自制，下同)，以氢氧化钠调节pH到8.0，在25℃下反应5小时，加入0.5M甘氨酸0.5ml终止反应；5分钟后，用6倍体积的20mM pH4.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上(Waterman CM-52)柱，以6倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.3M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含支链聚乙二醇-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex 200对支链聚乙二醇-干扰素α-2b进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含支链聚乙二醇-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。
实施例4.支链聚乙二醇-干扰素α-1b的制备
将干扰素α-1b以5mM pH4.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为3mg/ml的溶液；按干扰素∶PEG为1∶40的物质的量之比加入mPEG2-NHS(Mw＝40000，实验室自制，下同)，以氢氧化钠调节pH到8.0，在25℃下反应10小时，加入0.5M甘氨酸1ml终止反应；5分钟后，用8倍体积的50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上(Waterman CM-52)柱，以6倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.4M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含支链聚乙二醇-干扰素α-1b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex 200对支链聚乙二醇-干扰素α-1b进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含支链聚乙二醇-干扰素α-1b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。
实施例5SDS-PAGE电泳法对产物的检测
将收集的各洗脱峰浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶10％，浓缩胶5％。电泳结束后，将胶体浸入装有固定液(30％甲醇、5％乙酸)的培养皿中，在摇动下室温浸泡5分钟；取出胶体，浸入染色液中室温摇动浸泡45分钟(染色液是0.05％考马斯亮蓝G-250，30％甲醇，5％乙酸水溶液)；最后，将胶体移入脱色液中室温摇动浸泡直至样品条带清晰为止(结果见图1)。这里脱色液为：1％戊二醛、30％甲醇、5％乙酸。

Claims (6)

1、一种支链聚乙二醇-干扰素结合物，其特征是：它是分子量10000～60000道尔顿的支链聚乙二醇修饰的干扰素，具有如下结构式：
Figure A2006100112070002C1
式中，mPEG是单甲氧基聚乙二醇链，interferon是干扰素，R0是
Figure A2006100112070002C2
R是 或
Figure A2006100112070002C4
(其中R1是氢原子，或者是一种烷烃，其碳原子数为1～16)。
2、权利要求1所述支链聚乙二醇-干扰素结合物中的R0是
Figure A2006100112070002C5
3、权利要求1所述支链聚乙二醇-干扰素结合物中的R是
Figure A2006100112070002C6
或
Figure A2006100112070002C7
其中R1是氢原子，或者是一种烷烃，其碳原子数为1～10。
4、根据权利要求1所述的支链聚乙二醇-干扰素结合物，其中干扰素是干扰素α-2a，干扰素α-2b，干扰素α-1b或复合干扰素。
5、权利要求1～2所述的支链聚乙二醇-干扰素的制备方法，其特征是，它是由以下步骤组成：
步骤1，将干扰素以5～20mM pH3.0～5.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为0.2～10mg/ml的溶液；
步骤2，按干扰素∶PEG为1∶0.8～50的物质的量之比加入mPEG2-NHS，以氢氧化钠调节pH到6.0～10.0，在温度0～37℃下反应0.2～24小时，mPEG2-NHS的结构如下：
Figure A2006100112070002C8
步骤3，加入0.5M甘氨酸终止反应；
步骤4，将步骤3得到的修饰反应液用5～10倍体积的20～50mM pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液稀释；然后将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)，以2～6倍体积pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.2～1.0M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含支链PEG-干扰素的洗脱液；
步骤5，将步骤4得到的PEG-干扰素溶液以Superdex 200凝胶色谱进一步纯化，洗脱液为pH＝6.8～7.2的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含支链PEG-干扰素的洗脱液。
6、根据权利要求1所述的干扰素结合物，该结合物用作抗病毒的药物中。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8143214B2 (en) 2007-08-16 2012-03-27 Pharmaessentia Corp. Protein-polymer conjugates
CN102453076A (zh) * 2010-10-14 2012-05-16 中国科学院过程工程研究所 一种金属螯合介质辅助peg修饰蛋白质药物的方法
CN103113466A (zh) * 2013-03-01 2013-05-22 中国科学院过程工程研究所 聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-1b及制备方法
CN107446037A (zh) * 2016-06-01 2017-12-08 湖南华腾制药有限公司 一种聚乙二醇修饰干扰素蛋白质的方法
CN107670051A (zh) * 2017-10-28 2018-02-09 湖南华腾制药有限公司 一种聚乙二醇修饰的蛋白质的制备方法
WO2021013204A1 (zh) * 2019-07-22 2021-01-28 厦门特宝生物工程股份有限公司 一种基于干扰素的疾病治疗方法
US11559567B2 (en) 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP1562634B1 (en) * 2002-11-15 2006-08-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Positional isomers of pegylated interferon alpha 2a
CN1234729C (zh) * 2003-02-28 2006-01-04 中国科学院过程工程研究所 一种蛋白质交联剂及其交联方法
CN100355784C (zh) * 2004-02-12 2007-12-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法
CN1673230A (zh) * 2004-03-24 2005-09-28 中国科学院过程工程研究所 重组人复合干扰素－聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8143214B2 (en) 2007-08-16 2012-03-27 Pharmaessentia Corp. Protein-polymer conjugates
CN102453076A (zh) * 2010-10-14 2012-05-16 中国科学院过程工程研究所 一种金属螯合介质辅助peg修饰蛋白质药物的方法
CN103113466A (zh) * 2013-03-01 2013-05-22 中国科学院过程工程研究所 聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-1b及制备方法
CN103113466B (zh) * 2013-03-01 2015-06-03 中国科学院过程工程研究所 聚乙二醇修饰的重组人干扰素β-1b及制备方法
US11559567B2 (en) 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon
CN107446037A (zh) * 2016-06-01 2017-12-08 湖南华腾制药有限公司 一种聚乙二醇修饰干扰素蛋白质的方法
CN107670051A (zh) * 2017-10-28 2018-02-09 湖南华腾制药有限公司 一种聚乙二醇修饰的蛋白质的制备方法
WO2021013204A1 (zh) * 2019-07-22 2021-01-28 厦门特宝生物工程股份有限公司 一种基于干扰素的疾病治疗方法

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