CN100478359C - 一种聚乙二醇-干扰素偶联物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有生理活性的聚乙二醇与干扰素的偶联物，它是分子量5000～30000道尔顿的线性聚乙二醇修饰的干扰素，具有如下结构式，式中，mPEG是聚乙二醇链，interferon是干扰素。本发明的聚乙二醇-干扰素，抗病毒活性高，在体内保留时间长，血浆半衰期达到10～60小时。
Description
发明领域
本发明涉及以聚乙二醇(PEG)对干扰素进行化学修饰的PEG-干扰素偶联物及其制备方法。
背景技术
许多天然的和重组蛋白质都具有医疗作用，如果将它们纯化并制成制剂，它们能够进行非肠道给药而用于各种医疗适应症。但是，非肠道途径给药的蛋白质大可能具有免疫原性，并且通常血浆半衰期较短，因此，病人体内药用蛋白质很难达到有效治疗的血药浓度。
通过将蛋白质与高分子聚合物(如聚乙二醇)结合可以克服这些问题。Davis等在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇与蛋白质(酶和胰岛素)结合以获得具有生理活性的偶联物的技术方法。Katre等在美国专利4,766,106和4,917,888中公开了通过聚合物结合蛋白质从而使蛋白质增溶的技术方法。此外，将聚乙二醇等高分子聚合物与蛋白质结合可以降低免疫原性并延长半衰期(参见文献：Nitecki等，美国专利4,902,502；Enzon，国际专利申请PCT/US990/02133；国际专利申请PCT/US85/02572)。
干扰素是一类能够治疗多重疾病的药物，并且，通常需要对病人较长时间给药，提高干扰素的血浆半衰期可以提高对这些疾病的治疗作用，同时减轻病人的痛苦。
目前已有文献报道PEG修饰的干扰素，但有些存在几个问题，一是PEG结合到干扰素中后降低了干扰素的生物活性，在使用中必须提高干扰素的剂量；其次是在形成PEG-干扰素偶联物时，所用的连接键可能会在体内水解断掉，导致半衰期延长不明显。
本发明聚乙二醇-干扰素制备简单，体内半衰期明显延长。
发明内容
本发明的聚乙二醇-干扰素是以共价键方式与聚乙二醇连接的干扰素偶联物。由于聚合物以带有链长分布的混合物制备，因此其分子量通常是指其平均分子量。
本发明的技术方案如下：
一种聚乙二醇-干扰素，它是分子量5000～30000道尔顿的线性聚乙二醇修饰的干扰素，具有如下结构式：
式中，mPEG是聚乙二醇链，interferon是干扰素；W是
上述的聚乙二醇-干扰素偶联物，其中干扰素可以是干扰素α-2a，干扰素α-2b，干扰素α-1b或复合干扰素中任何一种。
上述的聚乙二醇-干扰素偶联物的制备方法由以下步骤组成：
步骤1，配制干扰素溶液。将干扰素以5～20mM pH3.0～5.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为0.2～10mg/ml的溶液；
步骤2，修饰反应。按干扰素∶PEG为1∶3～50的物质的量之比加入mPEG-NHS，以氢氧化钠调节pH到7.0～9.5，在温度0～37℃下反应0.3～24小时，mPEG-NHS的结构如下：
上述结构式中，W是
步骤3，终止反应。加入0.5M甘氨酸终止反应；
步骤4，利用离子交换色谱进行分离。上述修饰反应液用5～10倍体积的20～50mM pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液稀释；然后将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)，以2～6倍体积pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.2～1.0M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含PEG-干扰素的洗脱液；
步骤5，用凝胶色谱进一步分离制备PEG-干扰素。以Superdex 200对PEG-干扰素进一步纯化，洗脱液pH＝6.8～7.2的磷酸缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含PEG-干扰素的洗脱液。
本发明的聚乙二醇-干扰素在体内保留时间长，抗病毒活性高，可以用于制备抗病毒的药物。
由于反应混合物中各组分具有不同的等电点和分子量，因此可以将各种色谱方法组合起来分离制备高纯度的聚乙二醇-干扰素偶联物。
附图说明
图1为实施例5的SDS-PAGE电泳检测谱图，其中第1条带：标准分子量蛋白；第2条带：未修饰干扰素α-2a；第3条带：反应混合物；第4条带：单修饰聚乙二醇-干扰素偶联物(聚乙二醇Mw＝5000)。
具体实施方式
实施例1.聚乙二醇-干扰素α-2a的制备
将干扰素α-2a以5mM pH4.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为8mg/ml的溶液；按干扰素∶PEG为1∶10的物质的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝10000)，以氢氧化钠调节pH到8.5，在25℃下反应5小时，加入0.5M甘氨酸0.5ml终止反应；5分钟后，用6倍体积的20mM pH4.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上(Waterman CM-52)柱，以6倍体积pH4.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.5M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含聚乙二醇-干扰素α-2a的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex200对聚乙二醇-干扰素α-2a进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含聚乙二醇-干扰素α-2a的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。结果见图1。
实施例2.聚乙二醇-复合干扰素的制备
将复合干扰素以5mM pH4.0的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为1mg/ml的溶液；按干扰素∶PEG为1∶20的物质的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝5000，购自Sigma公司，下同)，以氢氧化钠调节pH到8.0，在4℃下反应24小时，加入0.5M甘氨酸0.2ml终止反应；5分钟后，用10倍体积的20mM pH4.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52)，以6倍体积pH4.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.4M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含聚乙二醇-复合干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex 200对聚乙二醇-复合干扰素进一步纯化，洗脱液是pH7.0的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含聚乙二醇-复合干扰素的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。
实施例3.聚乙二醇-干扰素α-2b的制备
将干扰素α-2b以5mM pH4.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为3mg/ml的溶液；按干扰素∶PEG为1∶15的物质的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝20000)，以氢氧化钠调节pH到7.5，在25℃下反应12小时，加入0.5M甘氨酸0.5ml终止反应；5分钟后，用5倍体积的20mM pH4.0的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上羧甲基纤维素柱(WatermanCM-52)，以6倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.35M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含聚乙二醇-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex 200对聚乙二醇-干扰素α-2b进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15M NaCl)，收集含聚乙二醇-干扰素α-2b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。
实施例4.聚乙二醇-干扰素α-1b的制备
将干扰素α-1b以5mM pH4.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为0.5mg/ml的溶液；按干扰素∶PEG为1∶30的物质的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝30000)，以氢氧化钠调节pH到8.0，在25℃下反应7小时，加入0.5M甘氨酸1ml终止反应；5分钟后，用7倍体积的50mM pH4.5的醋酸钠缓冲液稀释反应液；将稀释后的反应液上(Waterman CM-52)柱，以4倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.6M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含聚乙二醇-干扰素α-1b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。以Superdex200对聚乙二醇-干扰素α-1b进一步纯化，洗脱液是pH6.8的磷酸钠缓冲液(含0.15MNaCl)，收集含聚乙二醇-干扰素α-1b的洗脱液，以SDS-PAGE电泳检测。
实施例5 SDS-PAGE电泳法对产物的检测
将收集的各洗脱峰浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶10％，浓缩胶5％。电泳结束后，将胶体浸入装有固定液(30％甲醇、5％乙酸)的培养皿中，在摇动下室温浸泡5分钟；取出胶体，浸入染色液中室温摇动浸泡45分钟(染色液是0.05％考马斯亮蓝G-250，30％甲醇，5％乙酸水溶液)；最后，将胶体移入脱色液中室温摇动浸泡直至样品条带清晰为止(结果见图1)。这里脱色液为：1％戊二醛、30％甲醇、5％乙酸。
Claims (3)
1、一种聚乙二醇-干扰素，其特征是：它是分子量5000～30000道尔顿的线性聚乙二醇修饰的干扰素，具有如下结构式：
式中，mPEG是聚乙二醇链，interferon是干扰素；W是
2、根据权利要求1所述的聚乙二醇-干扰素，其中干扰素是干扰素α-2a，干扰素α-2b，干扰素α-1b或复合干扰素。
3、权利要求1～2所述的聚乙二醇-干扰素的制备方法，其特征是，它是由以下步骤组成：
步骤1，将干扰素以5～20mM pH3.0～5.5的醋酸钠缓冲液溶解，配制成为0.2～10mg/ml的溶液；
步骤2，按干扰素：PEG为1∶3～50的物质的量之比加入mPEG-NHS，以氢氧化钠调节pH到7.0～9.5，在温度0～37℃下反应0.3～24小时，mPEG-NHS的结构如下：
上述结构式中，W是
步骤3，加入0.5M甘氨酸终止反应；
步骤4，上述修饰反应液用5～10倍体积的20～50mM pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液稀释；然后将稀释后的反应液上羧甲基纤维素Waterman CM-52柱，以2～6倍体积pH4.0～6.0的醋酸钠缓冲液冲洗柱子后，用含0.2～1.0M的氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含PEG-干扰素的洗脱液；
步骤5，以Superdex 200对步骤4得到的PEG-干扰素进一步纯化，洗脱液为pH＝6.8～7.2的磷酸缓冲液，且该缓冲液中含有0.15M NaCl，收集含PEG-干扰素的洗脱液。
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