CN101220084A

CN101220084A - 聚乙二醇修饰的三价铁亚血红素短肽化合物及制备方法

Info

Publication number: CN101220084A
Application number: CNA2008100503077A
Authority: CN
Inventors: 汤钧; 林航; 李惟; 王丽萍
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2028-01-25
Also published as: CN101220084B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯衍生物修饰的亚血红素短肽化合物及制备方法。其是在用亚血红素六肽配制的水溶液中，加入磷酸盐缓冲溶液，然后加入活化的聚乙二醇衍生物固体粉末或聚乙二醇衍生物的乙腈溶液进行反应，将反应混合液采用反相高效液相色谱进行色谱分离，即可得聚乙二醇修饰的亚血红素六肽。本发明的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽能够基本保持亚血红素六肽的生物活性，同时比未修饰的亚血红素六肽有更好的稳定性。本发明的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽的制备方法简单易行。所述的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽，其结构通式如右，R代表去除一个氨基(NH₂)的DhHP－6分子。

Description

聚乙二醇修饰的三价铁亚血红素短肽化合物及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯衍生物修饰的亚血红素短肽化合物及制备方法。

发明背景

亚血素六肽(Deuterohemin-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys，DhHP-6)是以微酶和天然抗坏血酸过氧化物酶结构为依据，设计的一种含亚血红素的短肽，是一种较好的过氧化物酶模拟物。该短肽模拟酶分子量小于3000，可发展成高效的抗氧化药物。但是，其生物利用率低，易受蛋白酶降解。

单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的衍生物，是以聚乙二醇为主链，并具有一个甲氧基端基和一个活化的琥珀酰亚胺酯端基的高分子化合物。其中，聚乙二醇(PEG)是一种亲水性、生物相容性的无毒聚合物，其通式为H(OCH₂CH)_nOH其中n≥4，其分子量为200至20000道尔顿不等。美国食品药品管理局(FDA)已经批准了PEG作为辅料，在食品，化妆品，及静脉注射，口服和经皮给药等药物产品中的应用。同时，其能通过肝肾途径排出体外的特性，使其成为极为理想的药用辅料。大量研究证明：单甲氧基化形式的PEG与蛋白质和/或肽化学偶联后，能显著延长后者的生物作用，许多PEG-蛋白和/或肽偶联物能够避免被蛋白酶酶解，而且/或者能使自身的免疫原性降低。PEG及其衍生物作为药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用。

制备蛋白质和/或肽和聚乙二醇结合物的最常用的方法是利用PEG活化后形成的亲电子基团和蛋白质/多肽上的氨基进行反应，反应后可以在一个蛋白/多肽分子上共价连接数个聚合物链，聚合物链的数目取决于蛋白质/多肽上可供结合的位点数、修饰剂的化学性质，修饰剂的过量比例及反应条件。

发明内容

本发明的目的在于将亚血红素六肽(DhHP-6)用聚乙二醇(PEG)修饰，提供一种聚乙二醇修饰的三价铁亚血红素短肽化合物及制备方法。DhHP-6分子，有如下结构式(I)：

本专利采用的是目前广泛应用且已商品化的活化聚乙二醇衍生物，聚乙二醇的结构式如下(II)：

本专利采用的活化聚乙二醇衍生物的结构通式如下(III)：

其中聚乙二醇(PEG)的重均分子量为2000-20000(相对应的，44≤n≤447)，k＝0～3，(聚乙二醇的分子量过小，其在体内的代谢产物可能对人体有害，太大不利于修饰，同时可能导致肽类药物失活)；

通过亲核取代反应，制备一种聚乙二醇修饰的亚血红素六肽，其结构通式如下(IV)：

R代表去除一个氨基(NH₂)的DhHP-6分子，具有如下结构(V)：

本发明描述的PEG修饰的DhHP-6的制备方法如下：

将DhHP-6溶于去离子水中配制成0.5～5mg/ml的溶液，向其中加入pH为5～8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，稀释至5～10倍体积，然后加入聚乙二醇衍生物或10～40mg/ml聚乙二醇衍生物的乙腈(ACN)溶液，反应温度为0～25℃，反应中聚乙二醇衍生物与DhHP-6的摩尔比为5～20∶1，反应时间为0.5～4小时，反应结束后用甘氨酸终止反应，通过反相高效液相色谱接出PEG修饰的DhHP-6洗脱峰，在40℃下减压下旋转蒸发至无明显气泡产生，将残液冻干，即可得PEG修饰的DhHP-6固体。

反相高效液相色谱柱的流动相为A：H₂O(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))，B：90％的乙腈水溶液(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))；浓度梯度为B相40％～60％，时间为40分钟，(浓度由机器本身控制，初始状态时，水与乙腈的体积比为6∶4，实验过程中，机器在设定的时间内，这里是40分种内将自动升高乙腈相体积比并降低水相体积比，)，其中11分钟左右出现的洗脱峰为DhHP-6峰，15分钟左右出现的洗脱峰为PEG修饰的DhHP-6的峰。

制备反应如下式进行：

其中R-NH₂代表DhHP-6，聚乙二醇(PEG)的重均分子量为2000～20000(44≤n≤447)，k＝0～3，R代表去除一个氨基(NH₂)的DhHP-6分子；

前文所述的聚乙二醇衍生物是本领域技术人员所熟知的，包括：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯等。

本发明的优点在于：

1.本发明所述的修饰方法简便。反应在室温下既可进行并且具有较高产率。

2.本发明所述的聚乙二醇修饰的DhHP-6的用途是用于制备抗氧化药物，抗衰老药物及治疗白内障的药物。

3.本发明所述的聚乙二醇修饰的DhHP-6能够基本保持DhHP-6的抗氧化活性，同时它又比未修饰的DhHP-6有更好的稳定性。

附图说明

图1：是实施例1中在390nm检测波长下用Edipse XDB-C₁₈柱分析DhHP-6水溶液的层析图，其中，在指定的条件下，DhHP-6保留时间为11.832min和12.116min；

图2：是实施例1中在390nm检测波长下用Edipse XDB-C₁₈柱分析聚乙二醇修饰的DhHP-6的层析图，其中，在指定的条件下，聚乙二醇修饰的DhHP-6保留时间为15.057min；

图3：是实施例2中在390nm检测波长下用Edipse XDB-C₁₈柱分析修饰反应液的层析图，其中，11.887min时流出的为DhHP-6，其峰面积为2734.47，占总峰面积的31.21％；15.257min时流出的为聚乙二醇修饰的DhHP-6的，其峰面积为6835.72，占总峰面积的68.79％；

图4：是实施例2中DhHP-6的飞行时间质谱图，其中1497.5处单峰与DhHP-6的1498的分子量符合；

图5：是实施例2中PEG-DhHP-6的飞行时间质谱图，其中22000左右的连续峰与聚乙二醇修饰的DhHP-6的分子量符合。

具体实施方式

实施例1：

甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸脂(结构见通式，k＝0，PEG的重均分子量为20000，n≈447)(m-SC-PEG20000)对亚血红素六肽(DhHP-6)的修饰：

反应温度的选择：将DhHP-6固体粉末溶于去离子水中，配制成1mg/ml的DhHP-6去离子水溶液，取4份0.1ml DhHP-6的去离子水溶液(1mg/ml)，用pH＝7的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1ml，分别加入20mg m-SC-PEG20000(后面指的是摩尔比，摩尔比约等于(20/20000)/(0.1/1000)＝10∶1)，完全溶解后，分别置于0℃、4℃、15℃、25℃环境中反应1小时后，加入甘氨酸终止反应。用反相高效液相色谱检测转化率，测得其转化率分别为37.1％、38.5％、47.9％和55.1％，结果表明，随着反应温度的升高，转化率有明显提高，其中25℃时转化率最高。

反应PH的选择：取3份0.1ml DhHP-6的去离子水溶液(1mg/ml)，分别用pH＝7、pH＝7.5和pH＝8的PBS稀释至1ml后，分别加入20mg m-SC-PEG20000，完全溶解后，置于25℃环境中反应1小时后，加入甘氨酸终止反应。用反相高效液相色谱检测转化率，测得其转化率分别为55.1％、57.8％和59.9％，结果表明，随着pH值的升高，转化率有明显提高，其中pH＝8时转化率最高。

反应时间的选择：取4份0.1ml DhHP-6的去离子水溶液(1mg/ml)，用pH＝8的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1ml后，分别加入20mg m-SC-PEG20000，完全溶解后，置于25℃环境中，分别反应0.5h、1h、2h和4h后，加入甘氨酸终止反应。用反相高效液相色谱检测转化率，用反相高效液相色谱检测转化率，测得其转化率分别为20.6％、38.5％、59.9％和60.4％，结果表明，随着反应时间的延长，转化率有明显提高，至2小时时基本达到最大转化率，进一步延长反应时间未见转化率有明显变化。

m-SC-PEG20000同DhHP-6的摩尔比的选择：取4份0.1ml DhHP-6的去离子水溶液(1mg/ml)，用pH＝8的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1ml后，分别加入10mg、20mg、30mg、40mg m-SC-PEG20000(m-SC-PEG20000∶DhHP-6的摩尔比分别为5∶1、10∶1、15∶1和20∶1)，完全溶解后，置于25℃环境中，分别反应2h后，加入甘氨酸终止反应。用反相高效液相色谱检测转化率，测得其转化率分别为38.1％、59.9％、62.4％和65.7％，结果表明，随着m-SC-PEG20000投料量的增加，转化率有明显提高，当PEG与DhHP-6的摩尔比为10时转化率已达到最高，进一步增加m-SC-PEG20000的投料量未见转化率有明显增加。

乙腈对反应的影响：取2份0.1ml DhHP-6的去离子水溶液(1mg/ml)，用pH＝8的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至0.5ml后，加入用0.5ml乙腈溶解的20mgm-SC-PEG20000的溶液中，置于25℃环境中，分别反应2h后，加入甘氨酸终止反应。用反相高效液相色谱检测转化率，测得其转化率分别为59.9％和65.0％，结果表明，乙腈的使用能够使转化率提高5-10个百分点。

实施例2：修饰产物的分离纯化与鉴定

将DhHP-6固体粉末溶于去离子水中，配制成1mg/ml的DhHP-6去离子水溶液，取0.1ml DhHP-6的去离子水溶液(1mg/ml)，用pH＝8的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1ml后，加入20mg m-SC-PEG20000，完全溶解后，置于25℃环境中，反应2h后，加入甘氨酸终止反应。

将上述反应液上柱分离，色谱条件如下：

色谱仪：BioCAD 700E；

柱规格：prepLC，25mmModule；

流速：10ml/min；

流动相：A：H₂O(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))，B：90％的乙腈水溶液(含0.5％三氟乙酸(TFA，v/v))；

浓度梯度：洗脱时间0-5min，100％A相，洗脱时间5-45min，B相梯度从40％到60％；

检测波长：390nm；

收集：每管10ml。

结果得到两个洗脱峰，分别为PEG修饰的DhHP-6和DhHP-6，结果见图3。将上述洗脱峰相应的溶液，用飞行时间质谱检测。第一个洗脱峰对应的是一个分子量为1497.5的单峰，为DhHP-6，结果见图4。第二个洗脱峰对应的是一个宽峰，其平均分子量在22000左右，为PEG修饰的DhHP-6，结果见图5。将得到的淋洗液在40℃下减压下旋转蒸发至无明显气泡产生，将残液冻干，即可得PEG修饰的DhHP-6固体。

实施例3：修饰产物的生物活性(比活力)测定

用细胞色素c水解得到的微酶，M P-9作为标准品对照，以抗坏血酸(V_C)和H₂O₂为底物，测定了DhHP-6和PEG-DhHP-6的过氧化物酶活性，其中DhHP-6比活为4.0×10³U/μmol，而PEG-DhHP-6的比活为3.1×10³U/μmol(定义每分钟氧化1μgVC所需酶量为一个活力单位U)，结果见表1：从表中可以看出，经过PEG修饰的DhHP-6仍具有较高的活性，说明这一修饰方法是可行的。

表1：DhHP-6与PEG-DhHP-6的比活力

样品	比活力(U/μmol)	相对MP-9的活力(100％)
样品	比活力(U/μmol)	相对MP-9的活力(100％)	MP-9	4.2×10³	100
DhHP-6	4.0×10³	95	MP-9	4.2×10³	100
DhHP-6	4.0×10³	95	PEG-DhHP-6	3.1×10³	77

实施例4：PEG-DhHP-6的体外酶稳定性研究

取0.1％(w/w)的木瓜蛋白酶溶液(PH＝6.5)2.7ml，分别加入0.3ml(1mg/ml)DhHP-6和PEG-DhHP-6的样品，40℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取样0.3ml，测定样品生物活性。结果表明：DhHP-6在1小时内活性迅速降为原来的50％以下，而PEG-DhHP-6在1小时内活性仅降到原来的70％。因此，聚乙二醇修饰的DhHP-6能明显增加DhHP-6抵抗木瓜蛋白酶水解的能力。

实施例5：

用与实施例1中具有不同聚乙二醇主链分子量的活化聚乙二醇衍生物，甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸脂2000(m-SC-PEG2000，结构见通式，k＝0，PEG的重均分子量为2000，n≈44)，甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸脂5000(m-SC-PEG5000，结构见通式，k＝0，PEG的重均分子量为5000，n≈112)或甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸脂10000(m-SC-PEG10000，结构见通式，k＝0，PEG的重均分子量为10000，n≈226)，代替实例1中的m-SC-PEG20000，得到与实施例1-4中相似的结果。

实施例6：

用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SPA-2000，结构见通式，k＝2，PEG的重均分子量为2000，n≈44)，丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000，结构见通式，k＝2，PEG的重均分子量为5000，n≈112)，丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SPA-10000，结构见通式，k＝2，PEG的重均分子量为10000，n≈226)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SPA-20000，结构见通式，k＝2，PEG的重均分子量为20000，n≈447)代替实施例1中的m-SC-PEG20000，得到与实例1-4中相似的结果。

实施例7：

用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SBA-2000，结构见通式，k＝3，PEG的重均分子量为2000，n≈44)，丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SBA-5000，结构见通式，k＝3，PEG的重均分子量为5000，n≈112)，丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SBA-10000，结构见通式，k＝3，PEG的重均分子量为10000，n≈226)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SBA-20000，结构见通式，k＝3，PEG的重均分子量为10000，n≈447)代替实施例1中的m-SC-PEG20000，得到与实例1-4中相似的结果。

实施例8：

用乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SCM-2000，结构见通式，k＝1，PEG的重均分子量为2000，n≈44)，乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SCM-5000，结构见通式，k＝1，PEG的重均分子量为5000，n≈112)，乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SCM-10000，结构见通式，k＝1，PEG的重均分子量为10000，n≈226)或乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SCM-20000，结构见通式，k＝1，PEG的重均分子量为10000，n≈447)代替实施例1中的m-SC-PEG20000，反应也得到的聚乙二醇修饰的DhHP-6，但由于mPEG-SCM非常易于水解，同等条件下反应转化率只有用其它反应物所得的转化率的一半。

Claims

1.聚乙二醇修饰的三价铁亚血红素短肽化合物，其结构通式如(IV)所式：

其中，聚乙二醇的重均分子量为2000～20000，k＝0～3，R代表去除一个氨基的DhHP-6分子，具有如(V)式结构，

2.权利要求1所述聚乙二醇修饰的亚血红素六肽的制备方法，其步骤为：将亚血红素六肽溶于去离子水中配制成0.5～5mg/ml的溶液，向其中加入pH为5～8的磷酸盐缓冲溶液，稀释至5～10倍体积，然后加入如式(III)所示的聚乙二醇衍生物或10～40mg/ml聚乙二醇衍生物的乙腈溶液，反应温度为0～25℃，反应时间为0.5～4小时，反应结束后用甘氨酸终止反应，反应中聚乙二醇衍生物与亚血红素六肽的摩尔比为5～20∶1，通过反相高效液相色谱接出聚乙二醇修饰的亚血红素六肽洗脱峰，将洗脱峰减压下旋转蒸发至无明显气泡产生，将残液冻干，即得聚乙二醇修饰的亚血红素六肽，

其中，44≤n≤447，k＝0～3。

3.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽的制备方法，其特征在于：聚乙二醇衍生物为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸脂。

4.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽的制备方法，其特征在于：聚乙二醇衍生物为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。

5.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽的制备方法，其特征在于：聚乙二醇衍生物为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。

6.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的亚血红素六肽的制备方法，其特征在于：聚乙二醇衍生物为乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。