KR102369119B1

KR102369119B1 - 우수한 펩티드 및 단백질 결합 성질을 갖는 그래프트 공중합체 부형제의 제조 방법

Info

Publication number: KR102369119B1
Application number: KR1020177015065A
Authority: KR
Inventors: 신시아 씨. 존스; 조슈아 에프. 알파로; 제라르도 엠. 카스틸로
Original assignee: 파마인 코포레이션
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2022-02-28
Also published as: BR112017009308A2; EP3215567A1; BR112017009308B1; US20180312642A1; CA2966333C; HK1246333A1; CA2966333A1; EP3215567B1; CN107531994B; AU2015343207A2; EP3215567A4; US10035885B2; AU2015343207B2; US10882961B2; JP2020076111A; JP6793641B2; KR20170109526A; US20160362523A1; ES2875727T3; WO2016073518A1

Abstract

본 발명은 화학적으로 충분히 특징화하기 곤란한 생성물인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법을 제공한다. 본 개시내용의 생성물은 1) 펩티드로의 결합 및 2) 생성물 및 펩티드의 동물에게의 동시투여시 생성물은 본 개시내용의 생성물을 사용하지 않은 펩티드 단독에 비하여 혈액 순환 시간을 연장시키며, 펩티드의 레벨을 상승시키는 독특하며, 유용한 성질을 갖는다.

Description

우수한 펩티드 및 단백질 결합 성질을 갖는 그래프트 공중합체 부형제의 제조 방법{METHOD OF PRODUCTION OF GRAFT CO-POLYMER EXCIPIENT WITH A SUPERIOR PEPTIDE AND PROTEIN BINDING PROPERTY}

생리적 활성 펩티드 및 단백질에 대한 신규한 약물 제제의 개발은 생물학적 활성을 유지하는 것에 촛점이 맞춰져 있으나, 이들은 체내에서 펩티드 및 단백질의 고유하게 짧은 반감기 또는 불안정성에 의하여 제한된다. 이는 특히 약 5 ㎚ 미만의 유체역학 직경을 갖는 작은 펩티드 및 단백질에 대하여 그러하다. 신속하게 분해되는 펩티드 또는 단백질 약물을 끊임없이 전달하는 주입 디바이스의 사용에 의하여 또는 약물의 침식(eroding)되는 저장소를 피부 아래에 제공하여 체내에 펩티드 및 단백질의 짧은 반감기 또는 불안정성을 완화시키고자 하는 요구가 오랫 동안 존재하였다. 반감기를 연장시킬 수 있으며 및/또는 체내 또는 혈액 중에서의 펩티드 및 단백질의 안정성을 제공할 수 있는 부형제의 개발은 연구의 새로운 분야가 되었다.

불안정한 또는 짧은 반감기 약물을 포획하는 리포좀은 약물이 방출되기 이전에 리포좀 구조의 분해에 의존한다. 폴리락트-co-글리콜산 입자는 약물을 방출하는 중합체의 효소 분해에 의존하는 또 다른 포획 기술이다. 약물을 포획하기 보다는 결합시키는 공중합체를 유도하는 2종 이상의 중합체의 세미-랜덤 그래프팅이 이루어졌다 (미국 출원 번호 11/613183, 11/971482 및 문헌[Castillo et al., Pharm. Res. 2012 Vol 29(1) p 306-318]). 그러한 공중합체는 혈액 안정성, 반감기의 연장 및 투여된 펩티드 및 단백질의 연장되고 증가된 혈중 농도를 제공한다 (미국 출원 번호 11/613183, 11/971482 및 문헌[Castillo et al., Pharm. Res. 2012 Vol 29(1) p 306-318]).

그러나, 그래프팅된 공중합체 생성물의 제조 방법 및 효력에 대하여 개선된 능력 (체중 기준으로 펩티드를 결합시키는 용량)은 존재할 경우 2종의 중합체가 다른 중합체에 및 서로에 대하여 그래프팅된 정확한 구성 및 주기성을 결정할 수 있는 기술의 부재에 의하여 제한된다. 최종 공중합체 생성물의 조성 및 성질을 정의하는 공중합체 분자의 성분 구성의 공정-유도된 결정요인이 존재하는 것으로 보인다. 최종 생성물의 조성 구성은 기존의 기술을 사용하여 평가될 수 없으므로, 생성물은 동일하지는 않지만 유사한 공정을 사용하여 생성된 기타 생성물과는 구별되는 생성물-관련된 성질을 갖는 상기 생성물을 제조하는데 사용되는 공정에 의하여서만 생성물을 정의할 수 있다. 우수한 생성물을 생성하는 상기 공정의 확인은 생성물의 원자 구성을 설명하는 분석 기술의 결여로 인하여 명백하지 않으며, 다양한 공정의 실험에 의존하며, 최종 생성물의 효력을 평가하는 것은 수년간의 상세한 시행착오 실험에 이를 수 있다. 최종 생성물의 조성에서의 차이는 이들이 생성되는 공정에 의하여 정의될 수 있는 그의 효력에 의하여서만 결정될 수 있다. 이는 중합체가 크며, 공중합 반응이 랜덤이며, 그리하여 반응이 진행됨에 따라 그래프팅되는 중합체의 형태는 변경되어 반응 타임라인의 임의의 주어진 순간에서 형태에 의하여 결정되는 비-랜덤 분배를 초래할 수 있기 때문이다. 형태에서의 변화는 특히 환경에 의존하여 알파 나선 내지 랜덤 코일로부터 베타 시트로 및 그 반대로의 변화로 알려진 폴리리신에 대하여서도 그러하다 (Arunkumar et al., 1997 Int . J. Biol . Macromol. 21(3):223-230). 형태는 또한 기타 시약 (Mirtic and Grdadolnik 2013 Biophys. Chem. 175-176 p. 47-53) 및 잠재적으로 촉매에 의하여 영향을 받을 수 있다. 이러한 영향은 반응이 종료될 때까지 역학을 유지할 수 있다.

이미 합성된 중합체의 일부 예는 하기에 기재될 것이다.

미국 출원 번호 11/613183의 실시예 6에는 폴리리신을 22%로 포화시키는 MPEG 숙신이미딜-숙시네이트 또는 사전-활성화된 N-히드록시숙신이미딜 폴리에틸렌 글리콜 (NHS-PEG)을 사용하여 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) (MPEG)로 22% 포화된 폴리리신이 개시되어 있으며, 이는 50-60%로 포화된 폴리리신을 생성하는 용액 B를 생성하기 위한 NHSS (N-히드록시숙신이미드술페이트) 및 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드)를 사용한 새로이 활성화된 MPEG-카르복실을 사용하는 본 개시내용 (하기 참조)과는 실질적으로 상이하다. 추가로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 6은 정제 후 잔존하는 1차 아미노를 라우르산으로 포화시켜 상기 생성물의 22% 포화에 기초하여 0.0228 mmol (20 ㎎) 1차 아미노 당량 또는 0.104 mmol 초기의 1차 아미노를 변형시켰다. 포화 공정은 초기의 1차 아미노의 1.1xmol에 해당하는 NHSS 및 초기의 1차 아미노의 5xmol에 해당하는 EDC로 활성화된 초기의 1차 아미노의 2.4xmol에 해당하는 라우르산을 사용하였다. 그러므로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 6은 사용된 시약 및 그의 비율에 기초하여 본 개시내용 (하기 참조)에 비하여 완전하게 상이한 공정이다. 그러한 생성물은 또한 22% PEG 포화만을 생성하는 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS)을 사용하는 1차 아미노 기의 결정을 분석적으로 측정할 수 있는 것에 기초하여 완전히 상이한 생성물이 된다.

미국 출원 번호 11/613183의 실시예 7은 폴리리신을 22%로 포화시키는 MPEG 숙신이미딜-숙시네이트 또는 사전-활성화된 NHS-PEG를 사용하여 MPEG로 22% 포화된 폴리리신이 기재되어 있으며, 이는 50-60%로 포화된 폴리리신을 생성하는 NHSS 및 EDC (용액 B)를 사용하여 새로이 활성화된 MPEG-카르복실을 사용하는 본 개시내용 (하기 참조)과는 실질적으로 상이하다. 추가로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 7은 정제후 스테아르산으로 잔존하는 1차 아미노를 포화시켜 상기 생성물의 22% 포화에 기초하여 0.0228 mmol (20 ㎎) 1차 아미노 당량 또는 0.104 mmol 초기의 1차 아미노를 변형시켰다. 포화의 공정은 초기의 1차 아미노의 1.1xmol에 해당하는 NHSS로 활성화된 초기의 1차 아미노의 1.71xmol에 해당하는 스테아르산 및 초기의 1차 아미노의 5xmol에 해당하는 EDC를 사용하였다. 그러므로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 7은 사용된 시약 및 그의 비율에 기초하여 본 개시내용 (하기 참조)에 비하여 완전히 상이한 공정이다. 생성물은 또한 22% PEG 포화만을 생성하는 TNBS와 같이 분석적으로 측정될 수 있는 것에 기초하여 완전 상이한 생성물이 된다.

미국 출원 번호 11/613183의 실시예 8은 폴리리신을 22%로 포화시키는 MPEG 숙신이미딜-숙시네이트 또는 사전-활성화된 NHS-PEG를 사용하여 MPEG로 22% 포화된 폴리리신이 기재되어 있으며, 이는 50-60%로 포화된 폴리리신을 생성하는 NHSS 및 EDC (용액 B)를 사용하여 새로이 활성화된 MPEG-카르복실을 사용하는 본 개시내용 (하기 참조)과는 실질적으로 상이하다. 추가로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 8은 정제후 잔존하는 1차 아미노를 카프릴산으로 포화시켜 상기 생성물의 22% 포화에 기초하여 0.0228 mmol (20 ㎎) 1차 아미노 당량 또는 0.104 mmol 초기의 1차 아미노를 변형시켰다. 포화 공정은 초기의 1차 아미노의 1.1xmol에 해당하는 NHSS 및 초기의 1차 아미노의 5xmol에 해당하는 EDC로 활성화된 초기의 1차 아미노의 3.36xmol에 해당하는 카프릴산을 사용하였다. 그러므로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 8은 사용된 시약 및 그의 비율에 기초하여 본 개시내용 (하기 참조)에 비하여 완전 상이한 공정이다. 생성물은 또한 22% PEG 포화만을 생성하는 TNBS와 같은 것을 분석적으로 측정할 수 있는 것에 기초하여 완전 상이한 생성물이 된다.

미국 출원 번호 11/613183의 실시예 9는 폴리리신을 55%로 포화시키는 MPEG 숙신이미딜-숙시네이트 또는 사전-활성화된 NHS-PEG를 사용하여 MPEG로 55% 포화된 폴리리신이 기재되어 있으며, 이는 50-60%로 포화된 폴리리신을 생성하는 NHSS 및 EDC (용액 B)를 사용한 새로이 활성화된 MPEG-카르복실을 사용하는 본 개시내용 (하기 참조)과는 실질적으로 상이하다. 추가로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 9는 정제후 상기 PLPEG 생성물의 잔존하는 1차 아미노를 라우르산으로 포화시켜 상기 PLPEG 생성물의 55% 포화에 기초한 0.0318 mmol (40 ㎎) 1차 아미노 당량의 폴리리신-폴리에틸렌 글리콜 (PLPEG) 또는 0.450 mmol 초기의 1차 아미노를 변형시켰다. 포화의 공정은 초기의 1차 아미노의 0.34xmol에 해당하는 NHSS 및 초기의 1차 아미노의 1.16xmol에 해당하는 EDC로 활성화되는 초기의 1차 아미노의 1.8xmol에 해당하는 라우르산을 사용하였다. 그러므로, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 9는 사용된 시약 및 그의 비율에 기초하여 본 개시내용 (하기 참조)에 비하여 완전히 상이한 공정이다. 생성물 또한 라우르산 또는 C12의 존재에 기초하여 완전히 상이한 생성물이다.

미국 출원 번호 11/613183의 실시예 12는 용액 A를 생성하기 위하여 1 g의 폴리리신을 사용하였다. MPEG-숙시네이트 (5 g, 초기의 1차 아미노의 0.59xmol 당량)는 용액 B를 생성하기 위하여 18-20 분 동안 250 ㎎ NHSS (1.15 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 0.68xmol 당량) 및 EDC (2.6 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 1.53xmol 당량)를 사용하여 활성화되었다. 용액 C는 용액 A 및 B를 혼합하여 생성하였다. 4 시간 후, 제2의 용액 B을 생성하고, 용액 C에 첨가하고, 반응을 밤새 인큐베이션되도록 하였다. 이는 폴리리신의 엡실론 1차 아미노 기의 55%로의 포화를 초래한다. 용액 C 중에 함유된 MPEG-숙시네이트, NHSS 및 EDC의 최종량은 초기의 1차 아미노의 1.18xmol, 1.36xmol 및 3.06xmol 당량이다. 본 개시내용 (하기 참조)에 비하여, 공정의 이와 같은 단계는 시약 첨가의 상이한 비율 및 타이밍을 갖는다. PLPEG 생성물을 정제하고, 동결건조시키고, 정제된 PLPEG를 2 mmol 트리에틸아민 (초기의 1차 아미노의 0.76xmol 당량)을 갖는 143 ㎖ 디클로로메탄 중에 용해시키고, 디메틸포름아미드 중의 2 mmol (초기의 1차 아미노의 0.76xmol 당량)의 새로이 활성화된 미정제 C18-NHS를 첨가하여 잔존하는 1차 아미노 기를 스테아르산으로 포화시켰다. 생성된 생성물을 정제하고, GLP-1 결합에 대하여 테스트하고, 10% 로딩에서 33% 유리된 상태를 갖는 것으로 밝혀졌다 (미국 출원 번호 11/613183의 도 37 참조). 본 개시내용의 생성물을 10% 로딩에서 GLP-1로 로딩시킬 때 유리 GLP-1이 관찰되지 않았으며 (하기 표 61 참조), 이는 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 12에 상술된 공정이 본 개시내용의 것과는 상이한 생성물을 생성한다는 것을 나타낸다.

미국 출원 번호 11/613183의 실시예 13에서, 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 12에 사용된 1차 아미노 기의 55% 포화를 갖는 정제된 PLPEG (3 g)는 미국 출원 번호 11/613183의 실시예 12와 유사한 공정을 사용하여 리그노세르산으로 포화시켰다. 다시, 이와 같은 공정 및 그러한 공정의 생성물은 리그노세르산의 존재에 기초하는 본 개시내용과는 상이하다.

미국 출원 번호 11/971482의 실시예 1-3은 사전-활성화된 NHS-PEG를 사용하는 공정을 상술하며, 그리하여 이는 본 개시내용과는 상이한 공정이다. 게다가, 실시예 1 및 3은 각각 27% 및 22% 포화를 가지므로, 생성물은 본 개시내용의 공정과는 상이하다. 실시예 2는 55% 포화를 갖지만, 본 개시내용에서와 같이 NHSS 대신에 NHS를 사용하여 생성되며, 그리하여 이는 상이한 공정이 되며, 그 생성물은 폴리리신 골격과 함께 상이한 PEG 분포를 가질 수 있다.

미국 출원 번호 11/971482의 실시예 4-5는 2.4 mmol 1차 아민을 갖는 1 g의 폴리리신을 사용하여 200 mM HEPES 중의 용액 A를 생성하였다. MPEG-카르복실 (5 g, 초기의 1차 아미노의 0.42xmol 당량)을 20 분 동안 250 ㎎ NHSS (1.15 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 0.48xmol 당량) 및 500 ㎎ EDC (2.6 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 1.1xmol 당량)로 활성화시켜 용액 B를 생성하였다. 활성화된 용액 B를 용액 A에 첨가하여 용액 C를 생성하였다. 2 시간 후, 제2의 용액 B를 생성하고, 용액 C에 첨가하고, 반응을 밤새 인큐베이션 처리하였다. 이는 폴리리신의 엡실론 1차 아미노 기를 56%로 포화시켰다. 용액 C 중에 함유된 MPEG-카르복실, NHSS 및 EDC의 최종량은 각각 초기의 1차 아미노의 0.84xmol, 0.96xmol 및 2.2xmol 당량이다. 본 개시내용 (하기 참조)에 비하여 공정의 이들 단계는 시약 첨가의 상이한 타이밍 이외에 상이한 용액 C 최종 비율을 갖는다. 56% 포화를 갖는 PLPEG 생성물을 정제하고, 일부분을 하기 기재된 바와 같이 베헨산 및 스테아르산으로 포화시켰다.

미국 출원 번호 11/971482의 실시예 5는 베헨산 또는 C22 포화를 위한 공정이 기재되어 있으며, 여기서 PLPEG는 본 개시내용 (하기 참조)과는 상이한 공정을 사용하여 생성하였으며; 30 ㎖ 디메틸포름아미드:디클로로메탄 중의 200 ㎕ 또는 1.44 mmol 트리에틸아민 (초기의 1차 아미노의 1.3xmol 당량) 및 2.5 mmol (초기의 1차 아미노의 2.3xmol 당량)의 새로이 활성화된 미정제 C22-NHS와 함께 초기의 1차 아민의 1.1에 해당하는 PLPEG를 53 ㎖ 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 이러한 C22의 첨가를 다시 반복하고, 밤새 반응시키고, 생성물을 정제하였다. 이러한 공정은 사용된 시약 및 그의 비율에 기초하여 본 개시내용 (하기 참조)과는 상이하며, 이는 본 개시내용 (하기 참조)의 생성물과는 상이한 베헨산을 갖는 생성물을 초래한다.

미국 출원 번호 11/971482의 실시예 5는 스테아르산 또는 C18 포화 방법이 기재되어 있으며, PLPEG는 본 개시내용 (하기 참조)과는 상이한 공정을 사용하여 생성되며; 30 ㎖ 디메틸포름아미드:디클로로메탄 중의 200 ㎕ 또는 1.44 mmol 트리에틸아민 (초기의 1차 아미노의 1.3xmol 당량) 및 2.5 mmol (초기의 1차 아미노의 2.3xmol 당량)의 새로이 활성화된 미정제 C18-NHS와 함께 초기의 1차 아민의 1.1에 해당하는 PLPEG를 53 ㎖ 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 이러한 C18의 첨가를 다시 반복하고, 밤새 반응되도록 하고, 생성물을 정제하였다. 이러한 공정은 사용된 시약 및 그의 비율에 기초하여 본 개시내용과는 상이하다. 기능적으로, GLP-1을 2%로 로딩시 상기 공정의 생성물은 5% 유리 펩티드를 생성하는 반면 (미국 출원 번호 11/971482의 표 1 및 문헌[Castillo et al., Pharm . Res. 2012 Vol 29(1) p 306-318] 참조), 본 개시내용은 2% 로딩에서 0% 유리 펩티드를 생성하며; 사실상 5 및 10% 로딩에서조차 본 개시내용의 생성물은 여전히 0% 유리 상태를 나타내며, 이는 본 개시내용의 생성물이 GLP-1 결합에 대한 매우 높은 용량을 갖는다 (하기 참조)는 것을 나타낸다. 성질 또는 결합 효력에서의 차이점이 조성에서의 상이점에 의하여서만 설명될 수 있다는 점은 확실하다.

미국 출원 번호 11/971482의 실시예 6은 2.4 mmol 1차 아민을 갖는 1 g의 폴리리신을 사용하여 200 mM HEPES 중의 용액 A를 생성하였다. MPEG-숙시네이트 (5 g, 초기의 1차 아미노의 0.42xmol 당량)는 20 분 동안 250 ㎎ NHSS (1.15 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 0.48xmol 당량) 및 500 ㎎ EDC (2.6 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 1.1xmol 당량)와 함께 활성화시켜 용액 B를 생성하였다. 활성화된 용액 B를 용액 A에 첨가하여 용액 C를 생성하였다. 2 시간 후, 제2의 용액 B를 생성하고, 용액 C에 첨가하고, 반응을 밤새 인큐베이션 처리하였다. 이는 14 ㎚의 유체역학 직경을 갖는 폴리리신의 엡실론 1차 아미노 기의 57%로의 포화를 초래하였다. 용액 C 중에 함유된 MPEG-카르복실, NHSS 및 EDC의 최종량은 각각 초기의 1차 아미노의 0.84xmol, 0.96xmol 및 2.2xmol 당량이었다. 본 개시내용 (하기 참조)에 비하여 이러한 공정은 용액 C 중의 상이한 최종 비율뿐 아니라, 시약 첨가의 상이한 타이밍을 가지며, 그리하여 PL 골격에 대한 PEG의 정확한 구성이 스테아르산 포화 후 최종 생성물의 성질에 기초하여 상이하여야 한다. 57% 포화를 갖는 PLPEG 생성물을 동결건조시키고, 50 ㎖ 디클로로메탄으로 4회 추출하고, 400 ㎕ 또는 2.88 mmol 트리에틸아민 (초기의 1차 아미노의 2.6xmol 당량)의 첨가 후 30 ㎖의 1:2 vol/vol의 디메틸포름아미드:디클로로메탄 중에 용해된 2×2.5 mmol (초기의 1차 아미노의 2xmol 당량) C18-NHS로 포화시켰다. 이러한 생성물은 본 개시내용 (하기 참조)과는 상이한 공정을 사용하여 생성되며, 본 개시내용의 생성물 (2%, 5% 및 10% 로딩에서 GLP-1로의 결합은 0% 유리상태를 가짐)에 비하여 상이한 효력을 갖는 생성물 (2% 로딩에서 GLP-1로의 결합은 5% 유리 상태를 가짐, 미국 출원 번호 11/971482의 표 1 참조)을 생성한다. 성질에서의 차이점이 생성물의 조성에서의 차이에 의하여서만 설명될 수 있다는 점이 확실하다.

문헌[Castillo et al., Pharm . Res. 2012 Vol 29(1) p 306-318]은 25 ㎖의 1 M HEPES, pH 7.4 중에 용해된 2.6 mmol 1차 아미노를 갖는 1 g 폴리리신을 사용하여 용액 A를 생성하였다. 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 카르복시메틸 (2 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 0.77xmol 당량)을 25 ㎖의 10 mM MES pH=4.7 중에 4 mmol NHSS (초기의 1차 아미노의 1.54xmol 당량)와 함께 용해시키고, 일단 용해되면 EDC (6 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 2.3xmol 당량)를 교반하면서 첨가하여 용액 B를 생성하였다. 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하고, 활성화된 MPEG-CM을 20PL 용액에 직접 첨가하여 용액 C를 생성하였다. 용액의 pH는 NaOH를 사용하여 7.7으로 조절하고, 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 분획을 취하고, 1차 아미노 기를 TNBS에 의하여 측정하고, 14.4 ㎚의 유체역학 직경으로 54% MPEG-CM 포화에서 발견되었다. 미정제 PLPEG 생성물을 동결건조시키고, ~100 ㎖ 디클로로메탄 중에 용해시키고, 불용성 침전물을 제거하고, ~50 ㎖ 디클로로메탄으로 추가로 추출하였다. 상청액을 풀링하고, 20 ㎖ 디클로로메탄 중의 C18-NHS (초기의 1차 아미노의 1.4xmol 당량)를 자기 교반하면서 풀링된 상청액에 첨가한 후, N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 초기의 1차 아미노의 2.3xmol 당량)을 첨가하고, 4 시간 동안 반응되도록 하였다. 추가의 C18-NHS (3.6 mmol 또는 초기의 1차 아미노의 1.4xmol 당량; 초기의 1차 아미노의 2.8xmol 당량의 첨가된 전체 C18-NHS와 함께)를 첨가하고, 밤새 반응하도록 하여 미정제 공중합체 생성물을 얻고, 용매를 에탄올-물로 변경한 후 이를 한외여과에 의하여 정제하였다. 문헌[Castillo et al., in Pharm . Res. 2012 Vol 29(1) p 306-318]에 의하여 기재된 이러한 공정은 본 개시내용에 비하여 상이하며, 완전 상이한 비율의 시약을 갖는다. 게다가, 생성된 정제된 공중합체 생성물은 본 개시내용의 생성물 (2%, 5% 및 10% 로딩에서 GLP-1로의 결합이 0% 유리 상태를 가짐, 표 59 참조)에 비하여 상이한 결합 성질 또는 효력 (2% 로딩에서 GLP-1로의 결합은 5% 유리 상태를 가짐)을 가지며, 이는 독특한 생성물 조성을 나타낸다.

발명의 개요

한 구체예에서, 본 발명은

(a) W 양의 유리 1차 아미노 기를 함유하는 선형 폴리아민 골격을 pH 7-8에 걸친 완충 범위를 가지며 6.5 초과의 pH를 갖는 수성 완충제 중에 용해시켜 부피 Y를 갖는 용액 A를 얻으며;

(b) W/(Y+Z)=30-55 mM이 되도록 Z의 최종 부피를 갖는 용액 B를 얻기 위해 수성 완충제, pH 4-5.5 중에서 1.7-7.0xW의 NHSS 및 1.5-3.6xW의 EDC와 혼합시킴으로써 0.5-1.2xW 말단 카르복실 기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 보호 쇄를 활성화시키고 활성화를 0-30 분 동안 진행시키며;

(c) 용액 B를 용액 A와 혼합하여 용액 C를 얻고;

(d) 필요할 경우 용액 C의 pH를 6.5 초과로 조절하며;

(e) 0.5-1.5xW의 추가의 EDC를 작은 부분으로 나누어 또는 동시에 용액 C에 2-3 시간 후 첨가하고, 잔존하는 1차 아미노가 초기의 1차 아미노의 55-40% (45 내지 60% 포화)가 될 때까지 대기하며;

(f) 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%가 될 때 1.0-2.5 부피 당량 (용액 C 부피에 대하여)의 아세토니트릴을 첨가하여 용액 C의 총 부피를 증가시켜 용액 D를 얻고, 용액 D를 40-70℃로 가열시키며;

(g) 0.5-6xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하며;

(h) 적어도 0.75xW 당량의 C18-NHS를 40-70℃ 아세토니트릴 중에 첨가하여 용액 E를 얻고, 용액을 실온에서 2 시간 이상 동안 또는 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 최종 생성물을 얻는 단계를 포함하는, 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의하여 얻을 수 있는 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 특징으로 한다. 세미-랜덤 그래프트 공중합체는 글루카곤 유사 펩티드-1 및/또는 심방 나트륨이뇨 펩티드 및 그의 유도체로부터 선택된 펩티드와 혼합되어 세미-랜덤 그래프트 공중합체 및 펩티드(들)의 비공유 복합체를 포함하는 조성물을 형성할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의하여 얻을 수 있는 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 화학적으로 충분히 특징화하기가 곤란한 생성물인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생성물은 1) 펩티드로의 결합 및 2) 생성물 및 펩티드의 동물에게의 동시 투여시 생성물은 본 발명의 생성물 없이 펩티드 단독에 비하여 혈액 순환 시간을 연장시키고, 펩티드의 농도를 증가시키는 독특하며 유용한 성질을 갖는다. 생성물에 상기 성질을 부여하는 공정은 본 개시내용에 기재된 방법과는 상당히 상이한 임의의 기타 공정에 의하여서는 반복될 수 없다. 아마도, 화학 반응이 본 개시내용의 공정에서 발생함에 따라 골격 중합체의 혼동스러운 형태 변화로 인하여, 골격을 따른 그래프트 공중합체 위치는 공정에 의하여 주로 결정된다. 생성된 생성물은 공정 및 공정 중에 발생하는 가능한 형태 변화를 모니터링할 수 있는 새로운 기술 개발의 도전 없이 기타 공정을 사용하여 생성된 생성물과는 확실하게 화학적으로 구별될 수 없다. 그러한 기술은 오늘날까지 존재하지 않는다. 그러나, 생성물은 1) 펩티드로의 그의 우수한 결합 및 2) 동물에게 투여시 상기 펩티드에게 증가된 농도 수준 및 연장된 혈액 순환 시간을 부여하는 능력의 성질에 기초하여 가장 유사한 종래 기술의 생성물과는 구별될 수 있다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 방법에 의하여 생성된 생성물에 관한 것이다. 본 개시내용에서 청구된 제법 한정 생성물은 공정 또는 이를 생성하는데 사용된 사용된 방법 (조종 단계)에 관하여 생성물을 정의한다. 생성물 및 그의 공지의 성질은 하기 기재된 바와 같이 다수의 실험 및 실행하고자 하는 시도에도 불구하고 지금까지 임의의 기타 공지의 공정에 의하여서는 생성될 수 없다. 미국 출원 번호 11/613183 및 미국 출원 번호 11/971482의 생성물의 성질을 본 개시내용과 비교하였다. 미국 출원 번호 11/613183 및 미국 출원 번호 11/971482의 생성물이 본 개시내용이 생성물과 동일한 펩티드에 결합되기는 하나, 본 발명의 생성물은 동물에게 투여시 동일한 펩티드에 결합되고 그러한 펩티드에 증가된 수준 및 연장된 혈액 순환 시간을 부여하는 훨씬 더 우수한 성질을 갖는다.

상세한 설명

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법을 제공한다.

예를 들면, 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법은 종종 (a) W 양의 유리 1차 아미노 기를 함유하는 선형 폴리아민 골격을 pH 7-8에 걸친 완충 범위를 가지며 6.5 초과의 pH를 갖는 수성 완충제 중에 용해시켜 부피 Y를 갖는 용액 A를 얻으며; (b) W/(Y+Z)=30-55 mM이 되도록 Z의 최종 부피를 갖는 용액 B를 얻기 위해 수성 완충제, pH 4-5.5 중에서 0.5-1.2xW 말단 카르복실 기를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 보호 쇄를 1.7-7.0xW의 NHSS 및 1.5-3.6xW의 EDC와 혼합시킴으로써 활성화시키고, 활성화를 0-30 분 동안 진행되도록 하며; (c) 용액 B를 용액 A와 혼합하여 용액 C를 생성하며; (d) 필요할 경우 용액 C의 pH를 6.5 초과로 조절하고; (e) 0.5-1.5xW의 추가의 EDC를 작은 부분으로 나누어 또는 동시에 용액 C에 2-3 시간 후 첨가하고, 잔존하는 1차 아미노가 초기의 1차 아미노의 55-40% (45 내지 60% 포화)가 될 때까지 대기하며; (f) 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%가 될 때 1.0-2.5 부피 당량 (용액 C 부피에 대한)의 극성 유기 용매 (예, 아세토니트릴)를 첨가하여 용액 C의 총 부피를 증가시켜 용액 D를 얻고, 용액 D를 40-70℃로 가열하며; (g) 0.5-6xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하고; (h) 극성 유기 용매 (예, 아세토니트릴) 중의 적어도 0.75xW 당량의 C18-NHS를 40-70℃에서 첨가하여 용액 E를 얻고, 용액을 실온에서 2 시간 이상 동안 또는 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 최종 생성물을 얻는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 선형 폴리아민 골격의 반응을 포함한다. 폴리아민 골격은 본원에서 정의된 바와 같은 복수의 1차 아민 기를 포함한다. 폴리아민 골격의 반응에 사용하고자 하는 상이한 시약의 양은 본원에 기재된 바와 같이 폴리아민 골격 상의 아민 기의 총 몰량을 참조하여 정량화된다. 이와 같은 폴리아민 기의 총수는 W"로 나타내며, 몰 단위 (mol)로 제시한다.

통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, 본원에 기재된 방법에 사용된 시약의 양은 폴리아민 골격에서 1차 아민 기의 양에 따라 규모를 조정할 수 있다. 그래서, 본원에 기재된 바와 같은 공정에서 사용된 다양한 시약의 양은 본원에서 정의된 바와 같은 복수의 "W"에 관하여 제공되며, 표기 "ZxW"를 사용하여 나타내며, 여기서 Z는 W를 곱하여야 하는 인자이다.

본 발명의 공정은 규모를 조정할 수 있다. 그래서, 당업자는 W의 값이 구체적으로 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 종종, W는 약 0.1 μmol 내지 1,000 mol 범위내일 것이며, 보다 종종 W는 약 10 μmol 내지 약 1 mol이며, 보다 종종 W는 약 100 μmol 내지 약 100 mmol이다.

본 발명의 방법에서, 선형 폴리아민 골격은 통상적으로 수성 완충제 중에 용해된다. 선형 폴리아민 골격은 본원에 기재된 바와 같은 폴리리신인 것이 바람직하다.

수성 완충제는 구체적으로 제한되지 않는다. 완충제는 임의의 적절한 완충제일 수 있다. 적절한 완충제는 예를 들면, PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)), BES ((N,N-비스[2-히드록시에틸]-2-아미노에탄술폰산), MOPS ((N-모르폴리노)프로판술폰산), HEPES (본원에서 정의됨), DIPSO (N,N-비스(2-히드록시에틸)-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산), TEOA (본원에서 정의됨) 등을 포함한다. 특히 적절한 완충제는 하기 정의된 바와 같은 HEPES 및 TEOA를 포함한다. 적절한 완충제는 통상적으로 pH 7-8 범위내로 완충시킬 것이다. 완충제 중의 완충제 염의 통상의 농도는 50 내지 250 mM, 예를 들면 100 mM이다. 예를 들면, 완충제는 250 mM HEPES 또는 50 mM HEPES 또는 100 mM TEOA일 수 있다.

본 발명의 공정의 단계 (a)에서, 선형 폴리아민 골격을 수성 완충제 중에 용해시켜 용액 A를 얻는다. 용액 A의 부피는 "Y"로 표기한다. 용액 A의 pH는 표준 기술, 예컨대 완충제 염의 콘쥬게이트 염기 또는 산의 첨가를 사용하여 원하는 최종 pH를 갖도록 조절될 수 있다. 용액 A의 최종 pH는 통상적으로 pH 6.5 초과, 예컨대 pH 6.5 내지 pH 9, 예를 들면 약 pH 7 내지 약 pH 8이다.

공정은 단계 (B1) 또는 단계 (B2)를 더 포함한다. 단계 B1 및 단계 B2 각각은 단계 (b) 내지 (d)를 포함한다. 단계 B1에서 본 발명의 공정은 용액 A에 첨가하여 용액 C를 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 용액 B의 형성을 포함한다. 단계 B2에서, 단계 B1의 용액 B를 형성하는데 사용되는 시약은 용액 A에 직접 첨가되어 용액 C를 형성하며, 용액 B는 생성되지 않는다. 하기 논의는 다른 의미로 명시되지 않는다면 단계 B1 및 단계 B2 둘다에 적용된다.

본 발명의 공정의 단계 (b)에서, 보호 쇄는 EDC 및 NHSS (술포-NHS)로 활성화된다. 보호 쇄는 본원에서 기재된 바와 같은 임의의 적절한 중합체일 수 있다. 보호 쇄로서 사용하기에 적절한 통상의 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체를 포함한다. 보호 쇄는 쇄의 한 말단에서 카르복실 모이어티를 지닌다. 보호 쇄는 쇄의 다른쪽 말단에서 알콕실화, 예를 들면 메톡실화 또는 에톡실화될 수 있거나 또는 되지 않을 수 있다. 바람직한 보호 쇄는 메톡실화 폴리에틸렌글리콜 (MPEG)을 포함한다. 보호 쇄의 평균 분자량은 구체적으로 제한되지 않는다. 종종, 보호 쇄의 분자량은 2 내지 20 kDa 또는 4 내지 12 kDa 또는 보다 종종 4 내지 6 kDa이다. 통상적으로, 평균 분자량은 본원에 기재된 바와 같이 겔 투과 기술을 사용하여 측정된다.

통상적으로, 단계 (b)에 사용된 보호 쇄의 양은 0.5xW 내지 1.2xW 말단 카르복실 기에 해당하며; 보다 종종 보호 쇄의 양은 0.5xW 내지 1.1xW 말단 카르복실 기, 보다 종종 0.5xW 내지 1.0xW 말단 카르복실 기에 해당한다. 예를 들면, 보호 쇄의 양은 0.85xW 내지 0.95xW (예, 0.9xW) 또는 0.75xW 내지 0.85xW (예, 0.8xW) 또는 0.65xW 내지 0.75xW (예, 0.7xW) 또는 0.55xW 내지 0.65xW (예, 0.6xW)일 수 있다. 가장 통상적으로, 보호 쇄의 양은 0.8xW 내지 1xW, 예컨대 0.82xW 내지 0.95xW, 예컨대 0.83xW 내지 0.93xW이다.

보호 쇄는 EDC 및 NHSS와의 반응에 의하여 활성화된다.

통상적으로, 사용된 EDC의 양은 1.5xW 내지 3.6xW, 예컨대 1.5xW 내지 3.3xW, 예를 들면 1.5xW 내지 3.0xW이다. 예를 들면, 단계 (b)에 사용된 EDC의양은 2.5xW 내지 2.9xW (예, 2.7xW) 또는 2.3xW 내지 2.6xW (예, 2.4xW) 또는 2.0xW 내지 2.3xW (예, 2.1xW) 또는 1.7xW 내지 2.0xW (예, 1.8xW)일 수 있다. 가장 통상적으로, 사용된 EDC의 양은 2.5xW 내지 2.9xW, 예컨대 2.5xW 내지 2.8xW이다.

통상적으로, 사용된 NHSS의 양은 1.7xW 내지 7.0xW, 예컨대 1.7xW 내지 4.0xW, 예를 들면 1.7xW 내지 3.7xW, 일반적으로 1.7xW 내지 3.4xW이다. 예를 들면, 단계 (b)에 사용된 NHSS의 양은 2.6xW 내지 3.2xW (예, 2.7xW) 또는 2.3xW 내지 2.8xW (예, 2.4xW) 또는 2.0xW 내지 2.5xW (예, 2.1xW) 또는 1.7xW 내지 2.2xW (예, 1.8xW)일 수 있다. 가장 통상적으로, 사용된 NHSS의 양은 2.3xW 내지 2.8xW, 예컨대 2.5xW 내지 2.8xW이다.

그래서, 예를 들면, 사용된 보호 쇄의 양은 0.5-1.2xW일 수 있으며, EDC의 양은 1.5-3.6xW일 수 있으며, NHSS의 양은 1.7-7.0xW 또는 1.7-4.0xW일 수 있다. 보다 통상적으로, 사용된 보호 쇄의 양은 0.5-1.1xW일 수 있으며, EDC의 양은 1.5-3.3xW일 수 있으며, NHSS의 양은 1.7-3.7xW일 수 있다. 보다 통상적으로, 사용된 보호 쇄의 양은 0.5-1.0xW일 수 있으며, EDC의 양은 1.5-3.0xW일 수 있으며, NHSS의 양은 1.7-3.4xW일 수 있다. 가장 통상적으로, 보호 쇄의 양은 0.8xW 내지 1xW일 수 있으며, EDC의 양은 2.5xW 내지 2.9xW일 수 있으며, NHSS의 양은 2.3xW 내지 2.8xW일 수 있다.

단계 B1에서, 본 발명의 공정의 단계 (b)에서 보호 쇄의 활성화는 수성 완충제 중에서 수행되어 용액 B를 얻는다. 사용될 수 있는 완충제는 구체적으로 한정되지 않으며, 임의의 적절한 완충제를 사용할 수 있다. 적절한 완충제는 통상적으로 pH 4-5.5 범위내로 완충시킨다. 적절한 완충제 시스템은 예를 들면 MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산)을 포함할 할 수 있다. 용액의 pH는 일반적으로 4.0 내지 5.5, 예를 들면 pH 4.2 내지 pH 5.2, 예컨대 pH 4.4 내지 pH 5.0, 예를 들면 4.5 내지4.9이다. 완충제 중의 완충제 염의 통상의 농도는 1 내지 100 mM, 예를 들면 10 mM이다. 예를 들면, 완충제는 10 mM MES 완충제, pH 4.7일 수 있다.

수성 완충제 용액 중의 활성화된 보호 쇄의 부피는 부피 Z로서 나타낸다. 부피 Z는 통상적으로 W/(Y+Z)가 약 30 mM 내지 약 55 mM, 예를 들면 약 40 mM 내지 약 50 mM, 예컨대 약 45 mM가 되도록 한다. 부피 Y 및 Z는 통상적으로 동일한 단위로 제시된다. 예를 들면, Y 및 Z 둘다는 통상적으로 리터 (ℓ) 단위로 제시된다. 당업자는 용어 "리터"가 표준 변형, 예컨대 ㎕ (10^-6 ℓ), ㎖ (10^-3 ℓ), cL (10^-2 ℓ) 등을 포함한다는 것을 이해할 것이다.

활성화 공정에 대한 반응 시간은 통상적으로 30 분 미만, 예컨대 0 내지 30 분, 예를 들면 2 내지 25 분, 종종 10 내지 24 분, 예컨대 18 내지 22 분, 예를 들면 약 20 분이다.

본 발명의 공정의 단계 (c)에서, 본원에서 기재된 바와 같은 용액 A는 용액 B와 또는 본원에 기재된 바와 같이 본원에 포함된 시약과 혼합하여 용액 C를 얻는다. 시약은 종종 침전을 방지하는 방식으로 격렬한 교반 하에서 첨가된다. 일반적으로, 연속 교반을 사용하여 용액을 진탕시킨다. 연속 교반은 임의의 적절한 기술에 의하여, 예컨대 자기 교반기 또는 혼합기에 의하여 또는 예를 들면 교반 로드를 사용한 수동 교반에 의하여 달성될 수 있다. 통상의 교반 (회전) 속도는 50 내지 2,000 rpm (예, 200 내지 1,500 rpm)이다. 격렬한 교반은 종종 침전 (본원에 기재된 바와 같음)을 피하는 것이 요구되며, 상승된 회전 속도, 예컨대 500 내지 2,000 rpm (예, 1,000 내지 2,000 rpm)을 사용한다. 시약 및 용액은 통상적으로 서서히, 예컨대 0 내지 50 ㎖/분, 보다 통상적으로 0 내지 20 ㎖/분 (예, 0 내지 10 ㎖/분) 첨가된다. 용액의 느린 첨가는 표준 기법, 예컨대 적하 피펫 또는 연동 펌프를 사용하여 달성될 수 있다. 기타 적절한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 고체 시약의 느린 첨가는 임의의 단계에서 첨가되는 전체 시약의 일부분의 첨가에 의하여 달성되며, 그 다음 부분의 첨가 전 시간 (예컨대 10 초 내지 10 분)이 경과되도록 한다. 대안으로, 고체 시약의 점진적인 공급은 예를 들면 깔때기 또는 기타 당업자에게 익숙한 기타 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다.

본 발명의 공정의 단계 (d)는 임의적인 것이며, 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 존재할 경우, 단계 (d)는 용액 C의 pH를 표준 기술, 예컨대 완충제 염의 콘쥬게이트 염기 또는 산의 첨가를 사용하여 조절하여 원하는 최종 pH를 갖는 것에 해당한다. 용액 C의 최종 pH는 통상적으로 pH 6.5 초과, 예컨대 pH 6.5 내지 pH 9, 예를 들면 약 pH 7 내지 약 pH 8이다.

본 발명의 단계 (e)에서, 추가의 EDC를 용액 C에 첨가한다. 추가의 EDC를 첨가하는 방식은 구체적으로 한정되지 않는다. 예를 들면, 추가의 EDC를 하나의 투여로 첨가할 수 있거나 또는, 최종 원하는 양의 EDC를 용액 C에 첨가할 때까지 EDC의 복수의 분액을 별도로 첨가할 수 있다. 그래서, 추가의 EDC는 하나 이상의 부분으로 첨가될 수 있다. 추가의 EDC는 통상적으로 용액 C의 형성 직후 용액 C에 첨가하지 않으며; 그보다는 용액 C를 종종 본원에 기재된 바와 같은 그의 형성 후 추가의 EDC를 첨가하기 전 2 내지 3 시간, 예컨대 약 2.5 시간 (예, 약 2 시간) 동안 반응하도록 한다.

통상적으로, 0.5xW 내지 1.5xW의 추가의 EDC를 용액 C에 첨가하며, 보다 통상적으로 0.5xW 내지 1.2xW 추가의 EDC를 첨가하며, 보다 통상적으로 0.5xW 내지 1.1xW, 예컨대 0.5xW 내지 1.0xW 추가의 EDC를 첨가한다. 예를 들면, 추가의 EDC의 첨가된 양은 0.85xW 내지 0.95xW (예, 0.9xW) 또는 0.75xW 내지 0.85xW (예, 0.8xW) 또는 0.65xW 내지 0.75xW (예, 0.7xW) 또는 0.55xW 내지 0.65xW (예, 0.6xW)일 수 있다. 그래서, 몰 단위로 용액 C 중의 EDC의 총량은 통상적으로 2xW 내지 5.1xW, 보다 통상적으로 2xW 내지 4.8xW, 보다 통상적으로 2xW 내지 4.4xW, 보다 통상적으로 2xW 내지 4xW, 예컨대 3xW 내지 3.9xW, 예를 들면 약 3.4xW 내지 약 3.8xW이다.

추가의 EDC를 첨가하면, 선형 폴리아민 골격 상의 잔존하는 1차 아미노 기의 양이 초기의 1차 아미노의 55-40% (45 내지 60% 포화)가 되는 것이 요구될 수 있는 임의의 추가의 반응 단계로 진행되기 이전에 충분한 시간이 통상적으로 허용된다. 일반적으로, 추가의 EDC를 첨가하기 전 또는 추가의 EDC를 첨가한 직후 용액 C를 냉동 또는 동결건조시키는 것은 바람직하지 않다. 그러나, 용액 C는 추가의 EDC를 첨가한 후 냉동 또는 동결건조될 수 있으며, 선형 폴리아민 골격 상의 잔존하는 1차 아미노 기는 초기의 1차 아미노의 55-40% (45 내지 60% 포화)이다. 그래서, 용액 C는 선형 폴리아민 골격 상의 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40% (45 내지 60% 포화)가 될 때까지 추가의 EDC를 첨가하기 전 또는 추가의 EDC를 첨가한 후 동결건조 또는 냉동되지 않는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 단계 (a) 내지 (e)를 포함하며, 본원에 기재된 바와 같은 단계 (f) 내지 (h)를 더 포함하는 방법을 제공한다.

단계 (f)는 존재할 경우 본원에 기재된 바와 같은 용액 C로부터 용액 D를 얻는 것을 포함한다. 단계 (f)는

i) 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%인 용액 C (즉, 본원에 기재된 바와 같은 단계 (e)로부터 얻은 용액)을 냉동 및 동결건조시키며, 동결건조된 물질을 유기 용매(들) 중에서 재구성하여 용액 D를 얻거나; 또는

ii) 적어도 W의 강 친핵체 (예컨대 히드록실 아민)를 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%인 용액 C (즉, 본원에 기재된 바와 같은 단계 (e)로부터 얻은 용액)에 첨가하고, 생성물을 한외여과에 이어서 동결건조에 의하여 정제하고, 생성물을 유기 용매(들) 중에 용해시켜 용액 D를 얻거나; 또는

iii) 1.0-2.5 부피 당량의 유기 용매(들)를 첨가하여 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%인 용액 C (즉 본원에 기재된 바와 같은 단계 (e)로부터 얻은 용액)의 총 부피를 증가시켜 용액 D를 얻고, 용액 D를 40-70℃ (40℃ 및 70℃ 포함)로 적어도 10 분 동안 가열하고, 강 친핵체를 첨가한 후, 생성물을 한외여과 및 동결건조에 의하여 정제한 후 순수한 PLPEG 생성물을 갖는 용액 D를 유기 용매(들) 중에서 재구성하거나; 또는

iv) 1.0-2.5 부피 당량의 유기 용매(들)를 첨가하여 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%인 용액 C (즉, 본원에 기재된 바와 같은 단계 (e)로부터 얻은 용액)의 총 부피를 증가시켜 용액 D를 얻고, 용액 D를 40-70℃ (40℃ 및 70℃ 포함)로 가열하는 것을 포함할 수 있다.

적절한 유기 용매는 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 및 1-메틸-2-피롤리디논을 포함하며, 아세토니트릴이 특히 적절하다. 용매로서 아세토니트릴은 물 또는 기타 적절한 용매 중에서 100% 미만의 아세토니트릴, 예를 들면 10% 내지 90% 아세토니트릴, 예컨대 30% 내지 70% 아세토니트릴, 통상적으로 50% 내지 70% 아세토니트릴, 예컨대 60% 내지 70% 아세토니트릴의 최종 농도로 희석될 수 있으며, 예를 들면 약 66% 아세토니트릴 (즉 물 중의 66% 아세토니트릴)을 종종 사용한다. 일부 실시양태에서, 아세토니트릴은 물 중에서 64%의 최종 농도로 희석될 수 있다.

단계 (f)가 선택사항 (i)을 따를 경우, 적절한 유기 용매는 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 및 1-메틸-2-피롤리디논을 포함하며, 아세토니트릴이 특히 적절하다. 동결건조된 물질을 재구성하여 용액 D를 얻는데 사용된 용매의 양은 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 종종, 동결건조된 물질이 재구성되는 용매의 양은 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%인 용액 C (즉, 본원에 기재된 바와 같은 단계 (e)로부터 얻은 용액)의 부피의 1.0 내지 2.5 부피 당량이다.

단계 (f)가 선택사항 (ii)를 따를 경우, 사용된 강 친핵체는 구체적으로 제한되지 않으며, 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 임의의 강 친핵체를 포함할 수 있다. 특히 적절한 강 친핵체는 NH₂OH, NaOR, LiR, NaOH 또는 KOH, NaCN 또는 KCN, NaCCR (아세틸리드 음이온), NaNH₂, NaNHR, NaNR₂, NaI, LiBr, KI 및 NaN₃을 포함한다. 일부 실시양태에서, R은 본원에서 정의된 바와 같은 C₁-C₆ 알킬 기 또는 C₂-C₆ 알케닐 기이다. 단계 (f)가 선택사항 (ii)를 따를 경우, 한외여과가 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 종종, 동결건조된 물질이 재구성되는 아세토니트릴의 양은 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%인 용액 C (즉, 본원에 기재된 바와 같은 단계 (e)로부터 얻은 용액)의 부피의 1.0 내지 2.5 부피 당량이다.

단계 (f)가 선택사항 (iii)을 따를 경우, 본원에서 얻은 용액 D는 통상적으로 40 내지 70℃, 예컨대 50 내지 65℃, 예를 들면 55 내지 60℃로 가열된다. 가열은 통상적으로 10-60 분, 예컨대 10 내지 30 분, 예를 들면 10-20 분 동안 수행된다. 강 친핵체는 구체적으로 제한되지 않으며, 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 임의의 강 친핵체, 예컨대 상기 단계 (f)의 선택사항 (ii)에 대하여 기재된 강 친핵체를 포함할 수 있다. 용액 D를 구성하는데 사용되는 아세토니트릴의 양은 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 종종, 동결건조된 물질이 재구성되는 아세토니트릴의 양은 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%인 용액 C (즉, 본원에 기재된 바와 같은 단계 (e)로부터 얻은 용액)의 부피의 1.0 내지 2.5 부피 당량이다. 혼동을 피하기 위하여, 단계 (f)가 선택사항 (iii)을 따를 경우, 용어 PLPEG 생성물은 동결건조 단계의 생성물을 지칭한다.

단계 (f)가 선택사항 (iv)를 따를 경우, 본원에서 얻은 용액 D는 통상적으로 40-70℃, 예컨대 50 내지 65℃, 예를 들면 55 내지 60℃로 가열된다. 가열은 통상적으로 10 내지 60 분, 예컨대 10 내지 30 분, 예를 들면 10 내지 20 분 동안 수행한다.

단계 (g)는 존재할 경우 0.5-6xW 3차 아민을 용액 D에 첨가하는 것을 포함한다. 임의의 적절한 3차 아민은 예컨대 트리메틸아민 (TEA), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 트리페닐아민을 사용할 수 있다. DIPEA가 특히 적절하다.

단계 (h)는 존재할 경우 40-70℃ 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 및/또는 1-메틸-2-피롤리디논 중의 적어도 0.75xW 당량의 장쇄 지방산-NHS를 단계 (g)의 생성물에 첨가하여 용액 E를 얻으며, 용액을 실온에서 2 시간 이상 동안 또는 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 최종 생성물을 얻는 것을 포함한다.

통상적으로, 0.75xW 내지 2xW 당량의 장쇄 지방산-NHS를 첨가하며, 보다 통상적으로 0.8xW 내지 1.5xW를 첨가하며, 보다 통상적으로 0.85xW 내지 1.2xW를 첨가하며, 예컨대 약 0.9xW 내지 약 1.1xW, 예를 들면 약 1xW 당량의 장쇄 지방산-NHS를 첨가할 수 있다.

장쇄 지방산-NHS는 카르복실 기를 NHS로 에스테르화시킨 임의의 적절한 장쇄 지방산일 수 있다. 적절한 장쇄 지방산은 본원에 기재되어 있으며, 13 내지 21개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 꼬리를 갖는 것을 포함한다. NHS로 에스테르화되어 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 장쇄 지방산-NHS 기를 생성할 수 있는 장쇄 지방산의 예는 본원에 기재된 것을 포함한다.

장쇄 지방산-NHS는 유기 용매, 예컨대 극성 유기 용매, 예를 들면 아세토니트릴 중의 단계 (g)의 생성물에 첨가된다. 유기 용매는 통상적으로 40-70℃, 예컨대 50 내지 65℃, 예를 들면 55 내지 60℃이다. 지방화(fatylation) 반응은 2 시간 이상, 예를 들면 2 내지 24 시간, 예컨대 2 시간 내지 12 시간, 예를 들면 6 내지 12 시간 동안 진행되도록 한다. 반응은 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 5% 미만이 될 때까지 진행되어 미정제 최종 생성물을 생성한다.

본원에 기재된 바와 같은 최종 미정제 생성물은 표준 기술을 사용하여 정제 및 단리될 수 있다. 예를 들면, 최종 생성물 중의 잔존하는 유기 용매 및/또는 과잉의 지방산은 용매, 예컨대 에틸 아세테이트를 사용하여 추출될 수 있다. 통상적으로 상기 추출은 1회 초과, 예컨대 2회 이상 수행된다. 그 후, 추출된 생성물은 한외여과에 의하여 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최종 미정제 생성물은 유기 용매를 물 중에서 교환하고, 최종 생성물을 에탄올 및 물의 적어도 10 부피 교환으로 한외여과에 의하여 통상적으로 세정하여 정제될 수 있다. 최종 생성물은 냉동될 수 있으며 및/또는 동결건조될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 단계 "b"에서의 용액 B는 0.5-1.2xW 카르복실 기; 1.7-6.0xW의 NHSS; 및 1.5-3.6xW의 EDC를 갖는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 단계 "b"에서의 용액 B는 0.5-1.2xW 카르복실 기; 1.7-5.0xW의 NHSS; 및 1.5-3.6xW의 EDC를 갖는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 단계 "b"에서의 용액 B는 0.5-1.2xW 카르복실 기; 1.7-4.0xW의 NHSS; 및 1.5-3.6xW의 EDC를 갖는다.

하기 표 1은 공정의 규모와 무관하게 서로에 대한 시약의 통상의 관계를 제시한다. 표 1은 아세토니트릴, DIPEA 및 C18-NHS 각각에 대한 단계 (f), (g) 및 (h)에서의 본 발명의 예시의 구체예를 지칭하지만, 그러나, 당업자는 이들 성분이 예로서 제시되며, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 기타 적절한 성분과 함께 이들 성분으로 한정되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 유사한 언급은 하기 표 2 내지 12에도 적용된다.

<표 1>

종종, 선형 폴리아민 골격은 광 산란 또는 핵 자기 공명 (NMR) 분석에 기초하여 35-150의 중합도를 갖는 폴리리신이다. 일반적으로, 선형 폴리아민 골격은 광 산란 또는 핵 자기 공명 (NMR) 분석에 기초하여 35-85의 중합도를 갖는 폴리리신이다.

통상적으로, PEG 보호 쇄는 단일의 카르복실 말단을 갖는 메톡시 PEG (MPEG)이며, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 기초하여 4-12 kDa 수 평균 분자량 또는 Mn을 갖는다. 종종, PEG 보호 쇄는 단일의 카르복실 말단을 갖는 메톡시 PEG 쇄이며, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 기초하여 4-6 kDa 수 평균 분자량 또는 Mn을 갖는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "e"에서 0.5-1.2xW의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 단계 "f"에서 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%에 도달할 때 1.5-2.0 부피 당량의 극성 유기 용매 (예, 아세토니트릴)를 첨가하도록 한다. 하기 표 2는 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 2>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.5-1.1xW 카르복실 기; 1.7-3.7xW의 NHSS; 및 1.5-3.3xW의 EDC를 가지며; 단계 "e"에서 0.5-1.1xW의 EDC를 용액 C에 첨가하도록 한다. 하기 표 3은 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 3>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.5-1.0xW 카르복실 기; 1.7-3.4xW의 NHSS; 1.5-3.0xW의 EDC를 가지며; 활성화는 5-25 분 동안 진행되도록 하며; 단계 "e"에서 0.5-1.0xW 추가의 EDC를 용액 C에 첨가하도록 한다. 하기 표 4는 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 4>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.85-0.95xW 카르복실 기; 2.6-3.2xW의 NHSS; 2.5-2.9xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 단계 "e"에서 0.85-0.95xW의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 "g"에서 1-3xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하도록 한다. 하기 표 5는 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 5>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.9xW 카르복실 기; 2.7xW의 NHSS; 2.7xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 "e"에서 0.9xW 추가의 EDC를 용액 C에 첨가하도록 한다. 하기 표 6은 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 6>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.75-0.85xW 카르복실 기, 2.3-2.8xW의 NHSS 및 2.3-2.6xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 "e"에서 0.75-0.85xW의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 단계 "g"에서 1-3xW DIPEA 또는 기타 3차 아민이 용액 D에 첨가되도록 한다. 하기 표 7은 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 7>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.8xW 카르복실 기; 2.4xW의 NHSS; 2.4xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 "e"에서 0.8xW 추가의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 단계 "e"에서 적어도 0.75xW C18-NHS를 첨가하도록 한다. 하기 표 8은 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 8>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.65-0.75xW 카르복실 기, 2.0-2.5xW의 NHSS, 2.0-2.3xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 "e"에서 0.65-0.75xW의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 단계 "g"에서 1-3xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하도록 한다. 하기 표 9는 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 9>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.7xW 카르복실 기; 2.1xW의 NHSS; 2.1xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 "e"에서 0.7xW 추가의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 단계 "g"에서 1-3xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하도록 한다. 하기 표 10은 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 10>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.55-0.65xW 카르복실 기, 1.7-2.2xW의 NHSS, 1.7-2.0xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 e에서 0.55-0.65xW의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 단계 "g"에서 1-3xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하도록 한다. 하기 표 11은 공정의 규모와 무관하게 기재된 공정에서 서로에 대한 시약의 관계를 제시한다.

<표 11>

본 발명의 또 다른 구체예에서, 전술한 공정은 단계 "b"에서의 용액 B가 0.6xW 카르복실 기; 1.8xW의 NHSS; 1.8xW의 EDC를 가지며; 용액 B의 pH는 4.4-5.0이며; 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며; 용액 C의 pH는 7-8로 조절되며; 단계 "e"에서 0.6xW 추가의 EDC를 용액 C에 첨가하며; 단계 "e"에서 적어도 0.75xW C18-NHS를 첨가하도록 한다. 하기 표 12는 공정의 규모와 무관하게 서로에 대하여 기재된 공정에서 시약의 관계를 제시한다.

<표 12>

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 (f) 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 55-40%가 될 때 용액 C를 냉동 및 동결건조시키고, 동결건조된 물질을 수-비혼화성 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄 또는 수-혼화성 및 수-비혼화성 유기 용매의 혼합물로 재구성시켜 용액 D를 얻는 것을 포함하며; (g) 0.5-6xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하는 것을 포함하며; (h) 적어도 0.75xW 당량의 C18-NHS를 직접 또는 적절한 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 첨가하여 용액 E를 얻고, 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 5% 미만이 될 때까지 용액을 실온에서 2 시간 이상 동안 교반하여 미정제 최종 생성물을 얻는 것을 포함하는, 전술한 공정의 단계 (f), (g) 및 (h)에서의 대안예를 포함한다.

용액 E 중의 최종 생성물이 유기 용매 중에 있는 전술한 공정은 단계 (i) 미정제 생성물 중의 유기 용매를 물로 교환하고, 생성물을 한외여과에 의하여 에탄올 및 물의 적어도 10회의 교환을 사용하여 세정하는 것을 더 포함할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 (f) 강 친핵체 (초기의 1차 아미노의 적어도 1xW 당량), 예컨대 히드록실 아민을 용액 C에 첨가하고, 생성물을 하기 기재한 바와 같은 한외여과에 의하여 정제한 후, 동결건조시키고, 극성 유기 용매 (예, 아세토니트릴) 중에 용해하여 용액 D를 얻는 것을 포함하며, (g) 0.5-6xW DIPEA 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하는 것을 포함하며; (h) 적어도 0.75xW 당량의 C18-NHS를 첨가하여 용액 E를 얻고, 용액을 실온에서 2 시간 이상 동안 또는 잔존하는 1차 아미노 기가 초기의 1차 아미노의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 최종 생성물을 얻는 것을 포함하는, 전술한 공정의 단계 (f), (g) 및 (h)에서의 대안예를 더 포함한다.

용액 E 중의 최종 생성물이 물 및 수-혼화성 유기 용매의 혼합물 중에 존재하는 전술한 공정은 수-혼화성 유기 용매 및 과잉의 지방산을 용액 E 중의 미정제 최종 생성물로부터 극성 유기 용매 (예, 에틸 아세테이트)를 사용하여 추출하고, 극성 유기 용매 (예, 에틸 아세테이트) 층을 버리고, 물 층의 추출을 적어도 1회 반복한 후, 생성물을 한외여과에 의하여 에탄올 및 물의 적어도 10회 교환을 사용하여 세정하는 단계 (i)을 더 포함할 수 있다.

정의

편의성을 위하여, 본 개시내용의 추가의 기재 이전에, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정한 용어를 여기에 모았다. 이들 정의는 본 개시내용의 나머지를 고려하여 숙독하여야 하며, 당업자에 의하여 이해되어야 한다. 다른 의미로 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다른 의미로 나타내지 않는다면 수치의 반올림의 일반적인 수학적 규칙은 비-다분산 분자, 예컨대 H₂O, NHSS, EDC 등의 분자량을 제외하고, 본 명세서에서 모든 수치에 적용된다. 중합체는 다분산 분자이다. 수치가 제시될 경우 수치의 마지막 자리는 확실성의 한계가 되는 것으로 이해하며, 주어진 수치의 가장 근접한 마지막 자리로 수치 범위를 반올림한 결과이다. 예를 들면, "5 kDa 중합체"는 가장 근접한 1,000으로 4.51-5.49 kDa의 반올림이 5 kDa이므로 4.5 kDa 내지 5.5 kDa 사이의 범위를 의미한다. 또 다른 예는 2.05 내지 2.15 mmol 사이의 범위인 2.1 mmol이다. 또 다른 예는 4.95 내지 5.05 kDa 사이의 범위인 5.0 kDa 중합체이다.

단수형은 물건의 문법적 목적어의 1개 또는 1개 초과 (즉, 적어도 1개)를 지칭하는데 사용된다. 예를 들면, "보호 쇄"는 1개의 보호 쇄 또는 1개 초과의 보호 쇄를 의미한다.

용어 "ANP"는 심방 나트륨이뇨 펩티드이다 (당업계에서 공지된 규약에 기초한 서열: 인트라펩티드 디술피드 결합을 갖는 서열식별번호: 1 - SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY). 이러한 펩티드는 본 명세서의 목적을 위하여 다양한 공정에 의하여 생성된 그래프트 공중합체 사이의 차이를 구별하는데 사용되었다.

용어 "BNP"는 B형 나트륨이뇨 펩티드이다 (당업계에 공지된 규약에 기초한 서열: 인트라펩티드 디술피드 결합을 갖는 서열식별번호: 2 - SPKMVQGSGCFGR KMDRISSSSG LGCKVLRRH). 이러한 펩티드는 본 명세서의 목적을 위하여 다양한 공정에 의하여 생성된 그래프트 공중합체 사이의 차이를 구별하는데 사용되었다.

용어 "C12-NHS", "C13-NHS", "C14-NHS", "C15-NHS", "C16-NHS", "C17-NHS", "C18-NHS", "C19-NHS", "C20-NHS", "C21-NHS" 등은 카르복실 기가 NHS로 에스테르화된 12 내지 21개의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 지방산을 지칭하며, 하기 "지방산"을 참조한다. 다른 의미로 명시하지 않는다면, C12는 라우르산을 지칭하며, C14는 미리스트산을 지칭하며, C16은 팔미트산을 지칭하며, C18은 스테아르산을 지칭하며, C20은 아라키드산을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "유도체" 또는 "유사체"는 코어 구조가 상이한 또는 추가의 기와 같은 화학적 또는 물리적 변형을 갖는 것을 제외한 모화합물과 동일하거나 또는 근접하게 유사한 화합물을 지칭한다. 용어는 또한 모펩티드와 적어도 80% 서열 동일성 (즉 아미노산 치환이 20% 미만임)을 갖는 펩티드를 포함한다. 용어는 또한 지방산 및/또는 추가의 아미노산과 같은 모펩티드에 비하여 이에 부착된 추가의 기를 갖는 펩티드를 포함한다. 용어는 또한 모중합체에 비하여 이에 부착된 추가의 기(들), 예컨대 보호기의 경우 알콕시 기를 갖는 중합체를 포함한다. 용어는 또한 모보호 쇄에 비하여 이에 부착된 추가의 메톡시 또는 에톡시 기(들)를 갖는 메톡실화 또는 에톡실화 보호 쇄를 포함한다.

용어 "DIPEA"는 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 휘니그(Hunig) 염기 또는 DIEA, 유기 화합물 및 아민을 지칭한다. 이는 유기 화학에서 염기로서 사용된다. 질소 원자는 2개의 이소프로필 및 에틸 기에 의하여 차폐되므로, 양성자만이 이에 들어맞기에 충분히 작다. 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘과 같이, 이러한 화합물은 우수한 염기이기는 하나 불량한 친핵체이며, 이는 유용한 유기 시약이 되게 한다.

용어 "EDC"는 또한 EDAC 또는 EDCI로서 지칭될 수 있는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 HCl을 지칭하며, 분자량: 191.70Da를 갖는다. 이러한 카르보디이미드 시약은 카르복실 기의 활성화에 필요한 화학식 N=C=N으로 이루어진 작용기를 함유하며; 이러한 기는 지방산 및 보호 쇄에서의 카르복실 기를 활성화시키는데 중요하다. 커플링 반응의 공정 중에서, 활성화된 카르복실 기 O-아실이소우레아-중간체는 N-히드록시숙신이미드 또는 N-히드록시술포숙신이미드로 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 형성하여 안정화될 수 있다.

용어 "지방산"은 포화 또는 불포화된 장쇄 지방족 꼬리 또는 쇄를 갖는 카르복실산이다. 대부분의 천연 지방산은 4 내지 28개의 짝수의 탄소 원자의 꼬리를 갖는다. 이들이 다른 분자에 부착되지 않는다면, 이들은 "유리" 지방산으로서 공지되어 있다. 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방산은 불포화로서 공지되며, 이중 결합을 갖지 않는 것은 포화로서 공지되어 있다. 지방산 쇄는 길이에 의하여 상이하며, 종종 짧거나 또는 매우 긴 것으로 분류된다. 단쇄 지방산은 6개 미만의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 지방산 (즉, 부티르산)이다. 중쇄 지방산은 6 내지 12개의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 지방산이다 (또한 C₆-C₁₂ 지방산으로 지칭하며, 여기서 개수는 탄소의 개수를 지칭한다). 장쇄 지방산은 13 내지 21개의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 지방산이다 (또한 C₁₃-C₂₁ 지방산으로 지칭한다). 매우 긴 쇄 지방산은 22개보다 긴 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 지방산이다 (또한 ≥C₂₂ 지방산으로 지칭한다). 본 명세서의 경우, 용어 "지방산"은 상기 전부를 포함하며, 지방산의 각각의 종은 1개 초과의 관용명을 가질 수 있다. 포화 지방산의 예는 카프릴산 (CH₃(CH₂)₆COOH), 카프르산 (CH₃(CH₂)₈COOH), 라우르산 (CH₃(CH₂)₁₀COOH), 미리스트산 (CH₃(CH₂)₁₂COOH), 팔미트산 (CH₃(CH₂)₁₄COOH), 스테아르산 (CH₃(CH₂)₁₆COOH), 아라키드산 (CH₃(CH₂)₁₈COOH), 베헨산 (CH₃(CH₂)₂₀COOH), 리그노세르산 (CH₃(CH₂)₂₂COOH), 세로트산 (CH₃(CH₂)₂₄COOH)을 포함한다. 불포화 지방산의 예는 미리스톨산 (CH₃(CH₂)₃CH=CH(CH₂)₇COOH), 팔미톨산 (CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₇COOH), 사피엔산 (CH₃(CH₂)₈CH=CH(CH₂)₄COOH), 올레산 (CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇COOH), 엘라이드산 (CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇COOH), 박센산 (CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₉COOH), 리놀레산 (CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇COOH), 리노엘라이드산 (CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇COOH), α-리놀렌산 (CH₃CH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇COOH), 아라키돈산 (CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₃COOH), 에이코사펜타엔산 (CH₃CH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₃COOH), 에루스산 (CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₁₁COOH), 도코사헥사엔산 (CH₃CH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₂COOH)을 포함한다.

용어 "지방산-NHS"는 카르복실 기를 NHS로 에스테르화한 지방산을 지칭한다. 용어 "장쇄 지방산-NHS"는 카르복실 기가 NHS로 에스테르화된 장쇄 지방산 또는 13 내지 21개의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 지방산을 지칭한다 (또한 C₁₃-C₂₁ 지방산으로 지칭하며, 여기서 개수는 탄소의 개수를 지칭한다). 유사한 명명은 지방산이 6 내지 12개의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 "짧은 장쇄 지방산-NHS"에도 적용된다. 다시, 유사한 명명은 지방산이 22개 이상의 탄소의 지방족 꼬리를 갖는 "매우 긴 쇄 지방산-NHS"에 적용된다.

용어 "지방화"는 지방산을 폴리아민 골격에 첨가하는 단계 또는 화학적 공정을 지칭한다.

용어 "GLP-1"은 글루카곤 유사 펩티드-1 (서열 서열식별번호: 3 - HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G)을 지칭한다. 이러한 펩티드는 본 명세서에서 각종 공정에 의하여 생성된 그래프트 공중합체 사이의 차이를 확인하기 위하여 사용하였다.

용어 "HEPES"는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산을 지칭하며, pH 6.5 및 8.5 사이의 높은 완충 용량을 갖는 쯔비터이온 유기 화학적 완충제이다.

용어 "선형 폴리아민 골격"은 반복하는 1차 아미노 기를 갖는 직쇄형 비-단백질성 호모- 또는 헤테로-중합체를 지칭하며, 천연 또는 합성 기원을 가질 수 있다. 비-단백질성은 세포 활성과 관련된 3차원 형태를 갖는 살아있는 유기체에 의하여 생성된 단백질이 아니라는 것을 의미한다. "선형 폴리아민 골격"은 "선형 중합체 골격"과 번갈아 사용되며, 본 명세서에서 용액 A의 성분이다. 바람직한 직쇄 "선형 폴리아민 골격"은 폴리리신이며, 또한 본 명세서에서 PL로서 지칭된다. "선형 폴리아민 골격"은 D- 또는 L- 키랄성 또는 둘다를 가질 수 있는 기타 폴리아미노산일 수 있으며, 아미노산의 측쇄 기 (R-기로서 공지됨)는 1차 아민을 함유한다. 종종, 중합체 골격은 광 산란 또는 핵 자기 공명 분석에 기초하여 5-95 kDa의 수평균 분자량 (Mn) 또는 22-450의 중합도 (DPn)를 가질 수 있다. 바람직한 중합체 골격은 광 산란 또는 핵 자기 공명 분석에 기초하여 7-32 kDa의 Mn 또는 35-150의 DPn을 갖는다. 가장 바람직한 중합체 골격은 광 산란 또는 핵 자기 공명 분석에 기초하여 7-18 kDa의 Mn 또는 35-85의 DPn을 갖는다. 점도 측정에 의하여 상기 제시된 DPn은 어떠한 표준을 사용하였느냐에 의존하여 동일한 물질에 대하여 2배 높을 수 있다. 반복하는 1차 아미노 기를 갖는 기타 중합체 골격은 또한 상기 탄수화물 중합체 또는 기타 합성 중합체를 사용할 수 있다. 중합체 골격은 보호 쇄 및 지방산을 부착시킬 수 있는 복수의 1차 아미노 기를 제공한다.

용어 "% 로딩"은 생리학적 또는 거의 생리학적 완충제 중에서 펩티드:공중합체의 정의된 중량-대-중량 비로 세미-랜덤 그래프트 공중합체 생성물과 펩티드를 혼합한 결합 특징으로서 정의되며, 예를 들면 10% 로딩은 1 중량부의 펩티드 및 10 중량부의 공중합체로 이루어진다, 특정한 로딩에서 유리 펩티드의 퍼센트는 다양한 공정에 의하여 생성된 그래프트 공중합체 사이의 차이를 구별하는데 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "보호 측쇄"는 쇄를 따라 광범위하게 결합 또는 흡수(imbibe)하는 능력을 가지며, 용액 B의 성분인 친수성 중합체 분자를 지칭한다. 결합 또는 흡수(imbibe)는 커다란 분자 구조, 예컨대 스폰지, 수지 또는 겔의 공간 또는 채널로 빨아들이는 것을 지칭하는 흡수(absorb)와는 상이하다. 물 분자와의 광범위한 결합으로 인하여, 보호 쇄는 높은 수용해성을 가지며, 또한 이것이 연결되는 다른 중합체의 수용해성을 증가시킨다. 보호 측쇄는 상당량의 하전을 갖지 않으며, 일반적으로 비-면역원성이다. 이는 또한 보호 쇄는 친수성 성질을 조성물에 제공하며, 그렇지 않을 경우 덜 수용성이 된다는 것을 의미한다. 용어 "보호 쇄" 및 "보호 측쇄"는 본 명세서에서 번갈아 사용된다. 본 발명의 조성물의 보호 쇄는 통상적으로 한 단부에서는 알콕실화될 수 있거나 또는 알콕실화되지 않을 수 있으나 (예컨대 메톡시 또는 에톡시), 다른쪽 단부에서는 카르복실 모이어티로 종결되는, 폴리에틸렌 글리콜로도 지칭되는 폴리옥시에틸렌 글리콜을 포함한다. 보호 쇄는 또한 또는 대안으로 한 단부에서는 알콕실화될 수 있거나 또는 알콕실화되지 않을 수 있으나 (예컨대 메톡시 또는 에톡시), 모두 카르복실 모이어티로 종결되는 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체일 수 있다. 바람직한 보호 쇄는 동일하거나 또는 유사한 물질로 표준화된 겔 투과 크로마토그래피에 기초하여 그 크기가 2 내지 20 kDa 범위내이며, 카르복실 말단을 갖는 선형 메톡실화 폴리에틸렌글리콜 (MPEG 또는 메톡시PEG)이다. 더욱 바람직한 크기는 4-12 kDa이며, 가장 바람직한 크기는 4-6 kDa이다. 본 발명의 조성물의 보호 쇄는 또한 비하전된 다당류 및 그의 유도체, 예컨대 에톡실화 또는 메톡실화 다당류를 포함한다. 이와 같은 문맥에서, 비하전은 쇄의 주요 바디가 양전하 또는 음전하를 갖지 않는다는 것을 의미한다.

용어 "MPEG-CM"은 메톡시폴리에틸렌글리콜-카르복실을 지칭하며, 한 단부에서는 메톡시 기, 다른 단부에서는 카르복실 기를 갖는 선형 PEG이다. 이는 PEG의 비-사전-활성화된 형태이다.

용어 "MPEG-SCM"은 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜 숙시네이트를 지칭하며, 한 단부에서는 메톡시 기, 다른 단부에서는 NHS 연결된 카르보닐 기를 갖는 선형 PEG의 NHS 사전-활성화된 형태이다.

용어 "NHS"는 N-히드록시숙신이미드를 지칭하며, 분자량: 115.10 Da를 갖는다.

용어 "NHSS"는 N-히드록시술포숙신이미드를 지칭하며, 분자량: 217.14 Da를 갖는다.

용어 "비-수혼화성 유기 용매"는 유기 용매가 물과 혼합되며, 물 중에 50% wt/wt 미만에서 용해된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 디클로로에탄, 벤젠, 부틸 아세테이트, 사염화탄소, 클로로벤젠, 클로로포름, 시클로헥산, 디에틸 에테르, 디이소프로필에테르, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 에틸벤젠, 메틸 에틸 케톤, 메틸 부틸 에테르, n-부탄올, 펜탄, n-헥산, 헵탄, 톨루엔, 테트라클로로에틸렌 및 크실렌.

용어 "PEG화"는 PEG 또는 그의 유도체를 폴리아민 골격에 첨가하는 단계 또는 화학적 공정을 지칭한다.

용어 "1차 아민"은 하나의 알킬 또는 방향족 고리 및 2개의 수소 원자에 결합된 질소를 지칭한다. 환언하면, 이는 3개의 수소 부위 중 하나가 유기 치환기에 의하여 대체된 질소이다. 본 명세서에 대하여 중요한 1차 아민은 선형 폴리아민 골격을 따른 반복하는 1차 아민 모이어티이다. 폴리리신의 경우, 이는 폴리리신 중합체를 따른 리신의 엡실론 1차 아미노 기이다.

용어 "졸"은 용액을 지칭하며, 본 명세서에서는 졸 A 내지 졸 E로 지칭한 다양한 액체 용액 A 내지 E를 지칭한다.

용어 "강 친핵체"는 용이하게 탈양성자화되어 완전 음전하를 갖는 음이온을 생성하며, 나트륨, 리튬 또는 칼륨 반대이온의 존재에 의하여 용이하게 인지 가능하며, SN2형 치환에 참여하는 시약을 지칭한다. 강 친핵체의 예는 NH₂OH, NaOCH₃ (임의의 NaOR), LiCH₃ (임의의 LiR), NaOH 또는 KOH, NaCN 또는 KCN, NaCCR (아세틸리드 음이온), NaNH₂, NaNHR, NaNR₂, NaI, LiBr, KI 및 NaN₃을 포함한다. 강 친핵체는 중간체의 정제 및/또는 평가를 위하여 특정한 단계에서 공정을 방해하기 위하여 본 개시내용의 졸 C 중에서의 반응을 중단시키는데 사용될 수 있다.

용어 "TEA"는 통상적으로 Et₃N으로 약칭하는 화학식 N(CH₂CH₃)₃을 갖는 화학적 화합물인 트리에틸아민을 지칭한다. 또한 이는 TEA로 약칭되는데, 이러한 약칭은 TEA가 또한 통상의 약어가 되는 트리에탄올아민 또는 테트라에틸암모늄과의 혼동을 피하기 위하여 주의하여 사용되어야 한다. 디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기)과 같이, 트리에틸아민은 유기 합성에서 흔하게 접한다.

용어 "TEOA"는 또한 TEA로서 약칭되는 트리에탄올아민 또는 2,2',2"-트리히드록시-트리에틸아민 또는 트리스(2-히드록시에틸) 아민을 지칭하며, 3차 아민 및 트리올 둘다가 되는 점성 유기 화합물이다.

용어 "3차 아민"은 3개의 수소 부위가 3개의 유기 치환기에 의하여 대체되는 질소를 지칭한다. 그의 예는 트리메틸아민 (TEA), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 트리페닐아민을 포함한다.

용어 "TNBS"는 니트로-아릴 산화성 산인 트리니트로벤젠술폰산 (C₆H₃N₃O₉S)을 지칭한다. 본 명세서의 경우, TNBS를 사용한 검정은 용액 A, C 및 E 중에서 문헌[Spadaro, A.C., et al., A convenient manual trinitrobenzenesulfonic acid method for monitoring amino acids and peptides in chromatographic column effluents, Anal. Biochem., 1979, 96(2): p. 317-21]에 따른 1차 아민을 측정하는데 사용된다. 1차 아민에 대한 TNBS 검정의 사용은 반응이 그 다음 단계로 진행될 수 있도록 용액 C의 1차 아미노 기 포화를 측정하기 위함이다.

용어 "수-혼화성 유기 용매"는 유기 용매가 물과 혼합되거나 또는 50% wt/wt 이상에서 물 중에 용해되는 것을 의미하며, 예를 들면 아세트산, 아세토니트릴, 아세톤, 디메틸 포름아미드, 디메틸 술폭시드, 디옥산, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 메탄올 및 테트라히드로푸란이다.

용어 "W"는 용액 A 중의 출발 폴리아민 골격 중에 존재하는 1차 아미노 기 또는 공정의 용액 A 중의 초기의 아미노 기의 총 몰수를 지칭한다. 이러한 용어의 사용은 공정을 공업용 규모로 증가시키는 것을 허용한다. 명확성을 위하여, 본 명세서에서 중요 시약은 "W"의 분수 또는 배수로서 나타낸다.

용어 "xW"는 W의 배수를 지칭하며, 일반적으로 필요한 중요 시약의 특정한 값 또는 양을 생성하기 위하여 W로 곱할 수의 뒤에 있다. 예를 들면, W가 2.6 mmol이며, 보호 쇄가 0.9xW의 카르복실 당량을 갖는 경우, 그 양은 0.9×2.6 mmol 또는 2.34 mmol이 될 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, C₁ 내지 C₆ 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 알킬 기이다. 통상적으로 C₁ 내지 C₆ 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 알킬 기인 C₁ 내지 C₄ 알킬 기이다. C₁ 내지 C₄ 알킬 기는 종종 C₁ 내지 C₃ 알킬 기이다. C₁ 내지 C₆ 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸 및 헥실을 포함한다. C₁ 내지 C₃ 알킬 기는 통상적으로 C₁ 내지 C₂ 알킬 기이다. C₁ 내지 C₂ 알킬 기는 메틸 또는 에틸이며, 통상적으로 메틸이다. 혼동을 피하기 위하여, 2개의 알킬 기가 존재하는 경우, 알킬 기는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, C₂ 내지 C₆ 알케닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 함유하며, 1개 이상, 예를 들면 1 또는 2개의 이중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 알케닐 기이다. 통상적으로 C₂ 내지 C₆ 알케닐 기는 C₂ 내지 C₄ 알케닐 기이며, 예를 들면 C₂ 내지 C₃ 알케닐 기이다. C₂ 내지 C₆ 알케닐 기의 예는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐 및 헥세닐을 포함한다. 혼동을 피하기 위하여, 2개의 알케닐 기가 존재할 경우, 알케닐 기는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 방법에서, 선형 폴리아민 골격은 종종 광 산란 또는 핵 자기 공명 분석에 기초하여 22-450, 보다 종종 35-150, 보다 종종 35-85의 중합도를 갖는 폴리리신이며; 보호 쇄는 종종 겔 투과 크로마토그래피에 기초하여 2-20 kDa, 보다 종종 4-12 kDa, 보다 종종 4-6 kDa 수 평균 분자량 또는 Mn을 갖는 단일 카르복실 말단을 갖는 메톡시 PEG 쇄이며; 장쇄 지방산-NHS는 종종 C18-NHS이다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 그러나, 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 이와 관련하여, 실시예 부문에 사용된 특정한 검정은 펩티드의 결합 용량의 표시를 제공하기 위하여서만 설계된 것으로 이해하는 것이 중요하다. 그러한 용량을 측정하기 위하여 이용 가능한 다수의 검정이 존재하며, 임의의 하나의 특정한 검정에서의 음성 결과는 결정적인 것은 아니다.

실시예

본원의 실시예는 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP; 당업계에 공지된 규약에 기초한 서열: 인트라펩티드 디술피드 결합을 갖는 서열식별번호: 1 SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY)로 지칭되는 모델 펩티드의 효율적인 결합제인 세미-랜덤 그래프트 공중합체 생성물을 생성하는 합성 방법을 기재한다. 용어 "효율적인 결합제"는 생리학적 또는 거의 생리학적 완충제 중에서 1:10의 중량비 (펩티드:공중합체, wt:wt)에서 세미-랜덤 그래프트 공중합체 생성물과 펩티드가 혼합될 때 유리 펩티드의 양 (하기 기재된 바와 같이 평가함)은 12% 미만이 되도록 하는 결합 특징으로서 정의된다. 그러한 결합제는 본 개시내용의 개시 이전에는 존재하지 않는다.

임의의 주어진 공중합체 결합제의 경우, 펩티드 대 공중합체의 중량 비가 증가함에 따라 유리 펩티드의 양은 증가되며, 그 반대로 펩티드 대 공중합체의 중량 비가 감소함에 따라 유리 펩티드의 양은 감소된다는 점에 유의하여야 한다. 이는 본 개시내용의 주제인 공중합체가 용량을 포함한 성질을 갖는 가역적 결합제이기 때문이다. 용량이 더 높은 로딩으로 인하여 펩티드에 의하여 포화될 경우, 임의의 추가의 펩티드는 결합되지 않을 것이다. 본 개시내용의 주제인 공중합체의 기의 구조의 복잡성으로 인하여, 조성물에서의 차이를 구별하는 유일한 방법은 그의 측정 가능한 성질을 비교하는 것이다.

개론

시약

다른 의미로 나타내지 않는다면, 시약은 추가의 정제 없이 사용하였다. 게다가, 사용한 시약은 시판 중이며, 그의 합성은 당업계에 공지되어 있다.

폴리-L-리신 히드로브로마이드 (PL), NMR에 의한 DPn 55, NMR에 의한 Mm 11,500, GPC에 의한 PDI 1.04는 알라만다 폴리머즈(Alamanda Polymers) (미국 앨라바마주 헌츠빌 소재); 메톡시폴리에틸렌글리콜-카르복실 (MPEG-CM), MW 5 kDa는 라이산 바이오 인코포레이티드(Laysan Bio Inc) (미국 앨라바마주 아랍 소재); N-히드록시숙신이미드술페이트 (NHSS), MW 217 Da는 켐펩(ChemPep) (미국 플로리다주 웰링턴 소재); 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜 숙시네이트 (MPEG-SCM), MW 5 kDa는 젠켐 테크놀로지 유에스에이(JenKem Technology USA) (미국 텍사스주 플라노 소재); 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), MW 192 Da는 피어스(Pierce) (미국 일리노이주 락포드 소재)로부터 입수한다. 스테아르산(C18), MW 284 Da는 알파 에이서(Alfa Aesar) (미국 매사츄세츠주 워드 힐 소재); N-히드록시숙신이미드 (NHS), MW 115 Da는 아크로스 오개닉스(Acros Organics) (미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재); 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), MW 206 Da는 아크로스 오개닉스 (미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재)로부터 입수한다.

일반적인 기술

문헌[Lapidot et al., Lapidot, Y., Rappoport, S. and Wolman, Y. (1967) J. Lipid Res., 8, 142]로부터 변형된 방법을 사용하여 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (C18-NHS), MW 382 Da를 생성하였다. 230 ㎖ 에틸 아세테이트 중의 스테아르산 (MW 284 Da, 17 gm, 60 mmol)을 NHS (MW 115 Da, 6.9 g, 60 mmol) 및 DCC (MW 206 Da, 9.6 ㎖, 12.4 g, 60 mmol)로 활성화시키고, 밤새 인큐베이션 처리하였다. 우레아 침전물은 여과에 의하여 제거하였다. 그 후, 여과액을 건조시키고, 에탄올을 사용하여 재결정시켰다. 생성물 C18-NHS를 여과에 의하여 수집하고, 진공 하에서 건조시키고, 냉동 건조된 상태로 보관하였다.

완충제를 탈이온화된 증류수 중에서 생성하였다. 반응 pH의 조절은 pH 미터를 사용하여 실시하였다.

PEG 및 C18에 의한 PL 변형도는 유리 1차 아미노 기의 소비를 TNBS 검정 (Sparado et al., (1979) Anal. Biochem. 96, 317)을 사용하여 평가하여 측정하였다. 샘플의 가시광 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.

생성물을 한외여과에 의하여 100 kDa 또는 50 kDa 컷오프 멤브레인을 통하여 세정하였다. 한외여과는 퀵스스탠드(QuixStand) 시스템 (지이-애머샴 바이오사이언시즈 코포레이션, 미국 매사츄세츠주 웨스트보로 소재) 상에 장착된 멤브레인 카트리지 (UFP-100-E 또는 UFP-50-E, 지이-애머샴 바이오사이언시즈 코포레이션(GE-Amersham Biosciences Corp), 미국 매사츄세츠주 웨스트보로 소재)를 사용하여 수행하였다. 통상의 세정 조건은 (세정되는 용액 부피에 대한) 10 부피-당량의 90% 알콜, 10-15 부피의 80% 알콜 및 10 부피의 물을 사용한다. 그 후, 생성물을 여과-살균하고, 동결건조하였다.

그래프트 공중합체의 유체역학 직경은 겔 투과 크로마토그래피에 의하여 구상 단백질 표준물을 사용하여 보정한 토소(Tosoh)G4000WXL HPLC 컬럼을 사용하여 평가하였다. 다양한 공정의 그래프트 공중합체 생성물의 펩티드로의 결합은 인산염 완충된 염수 중의 해당 펩티드와 함께 pH 7.35에서 또는 100 mM HEPES 완충제 pH 7.35에서 공중합체의 2-시간 인큐베이션에 이어서 100 kDa 분자량 컷오프 멤브레인 필터 (재생 셀룰로스 필터, YM-100, 밀리포어(Millipore), 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재)를 통하여 원심분리에 의하여 여과하여 평가하였다. 그래프트 공중합체 생성물로의 펩티드 결합에서의 차이는 이들 2종의 완충제 사이에서 관찰되지 않았다.

유리 (미결합) 펩티드를 함유하는 여과액을 1 분 동안 0% B 및 1-5 분 동안 25-50% B의 구배를 사용하여 1.5 ㎖/분의 유량으로 실시하여 220 ㎚에서 모니터링한 역상 HPLC (시너기(Synergi) 2.5 um Max, 0.4×2 cm)에 의하여 정량화하고, A는 0.1% TFA를 갖는 5% 아세토니트릴이며, B는 0.1% TFA를 갖는 100% 아세토니트릴이다. 공중합체가 없는 펩티드를 함유하는 대조용 시험관으로부터의 여과액을 결합에 이용 가능한 펩티드의 총량으로서 취하였다. 결합된 펩티드의 양은 필터를 통과한 유리 펩티드의 농도를, 그래프트 공중합체가 없는 것을 제외하고 동일한 농도의 펩티드를 수용한 해당 대조군으로부터 빼서 계산할 수 있다. 결합은 2, 5 및 10% 로딩이 1:50, 1:20 및 1:10 펩티드 중량 대 공중합체 중량 비를 나타내도록 하는 다양한 비에서 테스트하였다.

방법

다른 의미로 나타내지 않는다면, 그래프트 공중합체의 합성은 일련의 용액 (졸 A, 졸 B, 졸 C, 졸 D 및 졸 E)을 준비하고, 화학적 공정의 PEG화 및 지방화 단계 중에 이들을 합하거나 또는 시약을 이에 첨가하여 수행하였다. 졸 A는 완충제 (250 또는 50 mM HEPES; 또는 100 mM TEOA) 중에 용해된 PL을 함유하였으며, 졸 B는 MES 완충제 (10 mM, pH 4.7) 중에서 실온에서 NHSS 및 EDC로 활성화된 mPEG-CM을 함유하였다. 졸 C는 PL의 PEG화가 발생하며, 실온에서 졸 A 및 졸 B를 합하거나 또는 시약 (NHSS, EDC 또는 PEG-SCM)을 직접 졸 A에 첨가하여 0 분 사전-활성화를 가지며, 졸 B를 갖지 않고 생성된 반응 용액이다. 용액 B는 0분 사전-활성화를 갖는 용액 B와 상이하지 않다. TNBS에 의하여 측정시 1차 아미노 기가 41-62%인 것으로 밝혀질 경우 졸 D는 유기 용매 (아세토니트릴, 아세톤 또는 디클로로메탄)를 용액 C에 첨가하고, 55-60℃로 가열하여 생성하였다. 졸 E는 지방화가 발생되며, C18-NHS 및 DIPEA를 졸 D에 첨가하여 생성한 반응 용액이다. 졸 E는 실온으로 냉각시키고, 2 시간 내지 밤새 교반되도록 하였다. 대략 졸 E에 해당하는 부피의 물을 졸 E에 첨가하고, 용액을 2 부피의 극성 유기 용매 (예, 에틸 아세테이트)로 2-3회 추출하였다. 그 후, 생성물을 함유하는 수성 상을 증류 탈이온수로 희석하고, 상기 기재된 한외여과에 의하여 세정하였다. 일부 경우에서, 화학적 공정은 PEG-SCM, EDC 또는 NHSS를 졸 A에 첨가하여 졸 C를 생성하는 경우에서와 같이 졸 B를 필요로 하지 않는다. 모든 경우에서, 시약의 당량은 PL의 출발 1차 아미노 함량에 대하여 보고한다.

실시예 1 (샘플 1-A, 1-B 및 1-C)

PEG화 반응을 위한 MPEG-CM을 사용한 그래프트 공중합체 1-A, 1-B 및 1-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG로의 아미노 기의 59, 53 및 54% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 2 및 3 시간 후, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고한 총 EDC). 하기 표는 생성물의 성질 및 합성 중에 사용된 각각의 시약의 비를 제공한다.

<표 13>

합성된 그래프트 공중합체의 중간의 결합은 10% 펩티드 로딩에서 13% 이하의 유리 ANP에 대하여 허용 가능한 함량의 범위내에 포함되지 않는다. 그래서, 본 공정에 사용된 시약의 비는 본 개시내용에서의 공정에 의하여 생성된 생성물에 비하여 불량한 생성물을 제공하였다.

<표 14>

<표 15>

<표 16>

실시예 2 (샘플 2-A, 2-B 및 2-C)

PEG화 반응을 위한 MPEG-CM을 사용한 그래프트 공중합체 2-A, 2-B 및 2-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 45, 44 및 44% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 2 및 3 시간 후, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고한 총 EDC).

<표 17>

<표 18>

<표 19>

<표 20>

실시예 3 (샘플 3-A, 3-B 및 3-C)

PEG화 반응을 위한 MPEG-CM을 사용한 그래프트 공중합체 3-A, 3-B 및 3-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 54, 60 및 56% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 2 및 3 시간 후, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고한 총 EDC).

<표 21>

<표 22>

<표 23>

<표 24>

실시예 4 (샘플 4-A, 4-B 및 4-C)

PEG화 반응에 대하여 MPEG-CM을 사용하고, 사전활성화를 실시하지 않은 그래프트 공중합체 4-A, 4-B 및 4-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 53, 51 및 47% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B는 생성하지 않았으며; 시약을 졸 A에 직접 첨가하였다.

<표 25>

합성된 그래프트 공중합체의 중간의 결합은 10% 펩티드 로딩에서 13% 이하의 유리 ANP에 대하여 허용 가능한 함량의 범위내에 포함되지 않는다. 그래서, 본 공정에 사용된 시약의 비 및 첨가 방법은 본 개시내용에서의 공정에 의하여 생성된 생성물에 비하여 불량한 생성물을 제공하였다.

<표 26>

<표 27>

<표 28>

실시예 5 (샘플 5-A, 5-B 및 5-C)

PEG화 반응에 대하여 MPEG-CM을 사용하고, 사전활성화를 실시하지 않은 그래프트 공중합체 5-A, 5-B 및 5-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 57, 61 및 55% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B는 생성하지 않았으며; 시약은 졸 A에 직접 첨가하였다.

<표 29>

<표 30>

<표 31>

<표 32>

실시예 6 (샘플 6-A, 6-B 및 6-C)

PEG화 반응에 대하여 MPEG-CM을 사용하고, 사전활성화를 실시하지 않은 그래프트 공중합체 6-A, 6-B 및 6-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 99, 98 및 97% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시하지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B는 생성하지 않았으며; 시약은 졸 A에 직접 첨가하였다.

<표 33>

합성된 그래프트 공중합체의 중간의 결합은 10% 펩티드 로딩에서 13% 이하의 유리 ANP에 대하여 허용 가능한 함량의 범위내에 포함되지 않는다. 실험 6의 샘플에 사용된 시약의 비는 허용 가능한 결합 특징을 생성하는 그래프트 공중합체 로트에 대하여 사용된 시약의 비와 유사하지만 (실험 7, 8 및 9의 샘플 참조), 6C만이 ANP 결합 기준을 충족하는데 근접하였다. 추가로, % PEG 포화는 침전으로 인하여 제어가 곤란하였으며, 일반적인 절차에 기재된 62% 범위 초과로 도달하였으며; PL이 침전될 경우 PL의 아미노 기는 TNBS에 의한 검출에 대하여 이용 가능하지 않으므로 겉보기 포화는 침전의 인공산물이 될 수 있다. 아마도 졸 B의 제조 (pH 4.0 내지 5.5에서 MES 완충제 중에서 NHSS 및 EDC를 사용한 PEG-SCM의 사전활성화)는 적절한 결합 특징을 갖는 그래프트 공중합체를 재현 가능하게 생성하는데 필요하다. 그래서, 분말 시약을 격렬한 교반 조건 하에서 용액 A에 첨가하여 침전을 초래하는 조건을 방지할 경우 허용 가능한 생성물을 생성할 수 있는 것으로 여겨지기는 하나, 실패한 실시예 6 (샘플 6-A, 6-B 및 6-C)과는 상이한 공정인 상기 공정은 본 개시내용에서의 공정에 의하여 생성된 생성물에 비하여 불량한 생성물을 제공하였다.

<표 34>

<표 35>

<표 36>

실시예 7 (샘플 7-A, 7-B 및 7-C)

PEG화 반응을 위한 MPEG-CM을 사용한 그래프트 공중합체 7-A, 7-B 및 7-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 58, 55 및 55% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 2 시간 후, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고한 총 EDC).

<표 37>

합성된 그래프트 공중합체는 10% 펩티드 로딩에서 13% 이하의 유리 ANP에 대하여 허용 가능한 양의 결합 결과를 생성하였다. 그래서, 본 개시내용에서의 공정에 사용된 시약의 비는 허용 가능한 생성물을 제공하였다.

<표 38>

<표 39>

<표 40>

실시예 8 (샘플 8-A, 8-B 및 8-C)

PEG화 반응을 위한 MPEG-CM을 사용한 그래프트 공중합체 8-A, 8-B 및 8-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 59, 51 및 41% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 2 시간 후, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고한 총 EDC).

<표 41>

<표 42>

<표 43>

<표 44>

실시예 9 (샘플 9-A, 9-B, 9-C, 9-D, 9-E 및 9-F)

PEG화 반응을 위한 MPEG-CM을 사용한 그래프트 공중합체 9-A, 9-B, 9-C, 9-D, 9-E 및 9-F (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 62, 58, 55, 53, 56 및 56% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 2 시간 후, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고한 총 EDC).

<표 45>

<표 46>

<표 47>

<표 48>

<표 49>

<표 50>

<표 51>

실시예 10 (샘플 10-A, 10-B 및 10-C)

PEG화를 위한 MPEG-CM 및 PEG화 이후의 추출을 사용한 그래프트 공중합체 10-A, 10-B 및 10-C (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 49, 56 및 56% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시되지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 2, 3 및 4 시간 후, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고한 총 EDC). PEG화 반응 후, 졸 C를 극성 유기 용매 (예, 에틸 아세테이트)로 추출하였으며, 졸 D는 추출의 수성 상으로부터 생성하였다.

<표 52>

합성된 그래프트 공중합체의 불량한 결합은 10% 펩티드 로딩에서 13% 이하의 유리 ANP에 대하여 허용 가능한 함량의 범위내에 포함되지 않는다. 합성된 그래프트 공중합체의 불량한 결합 특징은 졸 C를 극성 유기 용매 (예, 에틸 아세테이트)로 추출하여 공정을 방해하는 것에 기인할 수 있다. 이와 같은 가설은 중간의 결합 특징을 갖는 그래프트 공중합체를 생성하는 동일한 비의 시약을 사용하는 유사한 공정 (실험 1, 2 및 3의 샘플 참조)과 비교하여 뒷받침된다. 그래서, 본 공정에 사용된 시약의 비 및 졸 C의 추출을 사용한 공정의 붕괴는 본 개시내용에서의 공정에 의하여 생성된 생성물에 비하여 불량한 생성물을 제공하였다.

<표 53>

<표 54>

<표 55>

실시예 11 (샘플 11-A)

PEG화 반응에 대하여 MPEG-CM을 사용하고, 지방화 이전에 공정을 중지시키는 그래프트 공중합체 11-A (5 kDa MPEG-CM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 1차 아미노 기의 57% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 1차 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시하지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. 졸 B의 활성화는 20 분 동안 진행되도록 하였다. 졸 C를 얼음 상에 1.75 시간의 반응 시간에 두었다. 2 시간에, 졸 C를 다시 실온이 되게 하고, 추가의 EDC를 졸 C에 첨가하였다 (총 EDC는 개개의 로트에 대하여 표에 비로 보고함). 졸 C는 1차 아미노 기의 57%의 포화가 3.75 시간의 총 시간에 도달될 때까지 반응을 지속하였다. 졸 C를 냉동 및 동결건조시켰다. 졸 C로부터의 동결건조된 물질을 디클로로메탄에 용해시켜 졸 D를 생성하고, 졸 D를 가열하지는 않았다.

<표 56>

합성된 그래프트 공중합체의 중간의 결합은 10% 펩티드 로딩에서 13% 이하의 유리 ANP에 대하여 허용 가능한 함량의 범위내에 포함되지 않는다. 합성된 그래프트 공중합체의 중간의 특징은 졸 C의 동결건조에 의하여 공정을 방해하는 것에 기인할 수 있다. 이러한 가설은 허용 가능한 결합 특징을 갖는 그래프트 공중합체를 생성하는 동일한 비의 시약을 사용한 유사한 공정 (실험 7, 8 및 9의 샘플 참조)과 비교하여 뒷받침되며; C18-NHS 및 DIPEA의 비는 본 개시내용의 공정과 유사하지는 않지만, 공정의 일부는 제시된 로트 모두가 충족하는 최소의 요건을 갖는다는 점에 유의한다. 그래서, 졸 C의 동결건조에 의하여 및 졸 D를 가열하지 않는 공정의 중단은 본 개시내용에서의 공정에 의하여 생성된 생성물에 비하여 불량한 생성물을 제공하였다.

<표 57>

실시예 12 (샘플 12-A, PEG-SCM)

PEG화 반응을 위한 MPEG-SCM을 사용한 그래프트 공중합체 12-A (5 kDa MPEG-SCM; 20 kDa PL; PEG를 사용한 아미노 기의 53% 포화 및 스테아르산으로 변형된 잔존하는 아미노 기)의 합성. 합성은 다른 의미로 명시하지 않는다면 일반적인 부문에 기재된 바와 같이 수행하였다. PL을 50 mM 트리에탄올아민, pH 7.7 중에 용해시켰다. PEG-SCM을 졸 A에 직접 첨가하였으므로 졸 B는 사용하지 않았다. 졸 C를 PEG화 후 냉동시켰다. C18-NHS를 아세톤 중에 용해시켰다.

<표 58>

합성된 그래프트 공중합체의 불량한 결합은 10% 펩티드 로딩에서 13% 이하의 유리 ANP에 대하여 허용 가능한 함량의 범위내에 포함되지 않는다. 합성된 그래프트 공중합체의 예외적으로 불량한 결합 특징은 PEG-CM을 NHSS 및 EDC로 사전활성화시키는 것과는 반대로 PEG-SCM (5 kDa PEG의 NHS 에스테르) 시약의 사용에 기인할 수 있다. 이러한 가설은 유사한 수준의 PEG 포화를 갖는 그래프트 공중합체를 생성하며, 중간 내지 허용 가능한 결합 특징을 갖는 그래프트 공중합체를 초래하는 상이한 공정 (샘플 1-B, 4-A 및 9-C 참조)과 비교하여 뒷받침된다. 잠재적으로, PEG-CM보다 상이한 비율에서 PEG-SCM 아크릴레이트 PL은 NHSS 에스테르로서 활성화되며, PL 상의 PEG 구성에 영향을 미치며, 이는 궁극적으로 ANP의 결합에 충격을 준다. 그래서, PEG화를 위한 시약으로서 PEG-SCM을 사용한 공정은 본 개시내용에서의 공정에 의하여 생성된 생성물에 비하여 불량한 생성물을 제공하였다. ANP 결합은 MPEG-CM의 NHS 활성화를 사용하여 합성된 그래프트 공중합체에 대하여서는 관찰되지 않았다.

GLP-1 및 BNP 펩티드의 결합에서의 PGC의 평가

본 개시내용의 공정을 사용하여 합성된 PGC는 또한 GLP-1 및 BNP로의 그의 결합에서 평가하였으며, 하기 표를 참조한다. ANP로의 허용 가능한 결합 이외에, PGC는 또한 10% 로딩에서 0-6% 유리 펩티드 및 각각 5% 및 2% 로딩에서 0% 유리 펩티드로 GLP-1 및 BNP 둘다로의 허용 가능한 결합을 제공하였다. 이러한 데이타는 본 개시내용에서의 공정이 종래의 문헌 (Castillo et al.: GLP-1의 경우 2% 로딩에서 5% 유리 상태를 나타냈음)에 기재된 공정과는 상이하며, 이보다 우수하다는 것을 지지한다. 게다가, 본 발명의 데이타는 본 개시내용에서의 공정이 미국 출원 번호 11/613183 및 미국 출원 번호 11/971482 특허 출원에 기재된 공정과는 상이하며 (GLP-1에 대하여 10% 로딩에서 33% 유리 상태를 나타냄), 이보다 우수하다는 것을 뒷받침한다.

<표 59>

2 단계 공정 ( EDC 켄칭 , PL -PEG 단리)

그래프트 공중합체의 합성은 PEG화 반응이 중지되는 공정을 변경시켜 달성될 수 있으며, 생성된 PL-PEG 생성물은 지방화 반응 이전에 정제될 수 있다. 이러한 공정은 일련의 용액 (졸 A, 졸 B, 졸 C, 졸 D 및 졸 E)을 생성하고, 이를 합하거나 또는 시약을 화학적 공정의 PEG화 및 지방화 단계 중에 첨가하여 이루어진다. 졸 A는 완충제 (HEPES 또는 TEOA) 중에 용해된 PL을 함유하며, 졸 B는 MES 완충제 중의 NHSS 및 EDC로 활성화된 mPEG-CM을 함유한다. 졸 C는 PL의 PEG화가 발생되는 반응 용액이 되며, 졸 A 및 졸 B를 합하거나 또는 시약 (NHSS, EDC 또는 PEG-SCM)을 졸 A에 직접 첨가하여 생성되어 0분 사전활성화를 가지며, 졸 B는 갖지 않게 된다. 일부 경우에서, 화학적 공정은 PEG-SCM을 졸 A에 첨가하여 졸 C를 생성하는 경우에서와 같이 졸 B를 필요로 하지 않는다. 졸 D는 유기 용매 (아세토니트릴, 아세톤 또는 디클로로메탄)를 용액 C에 첨가하고, 55-60℃로 가열하여 생성된다. 그 후, 강 친핵체는 졸 D에 첨가되어 잔존하는 EDC를 켄칭시킨다. 졸 D 중의 아세토니트릴은 (지방화 후 아세토니트릴의 제거를 위한 일반적인 절차에서와 같이) 수성/유기 추출에 의하여 제거된다. 그 후, PL-PEG 생성물을 함유하는 수성 상은 물로 희석하고, 한외여과에 의하여 정제될 수 있다. 그 후, 정제된 PL-PEG 생성물은 C18-NHS 및 DIPEA를 첨가한 후 생성물을 66% 아세토니트릴 중에 용해시키고, 55-60℃로 가열하여 용액 E를 생성하는데 사용될 수 있다.

PEG화 반응을 켄칭 또는 중지시키기 전 졸 D를 가열하는 것은 본 개시내용에서의 공정과 유사한 반응률을 보존하고, 허용 가능한 결합 특징을 갖는 생성물을 생성하는데 있어서 필수적이다. 실시예 10 및 11에서의 PGC를 합성하는데 사용된 공정 (샘플 10-A, 10-B, 10-C 및 11-A 참조)은 유기 용매의 첨가 및 가열 이전에 PEG화 반응을 중지시킬 때 불량한 결과를 예시하며; 이러한 공정은 허용 가능한 결합을 갖지 않는 PGC를 초래하였다. 그래서, 성공적이게 되는 PGC 합성을 위한 2-단계 절차의 경우, PEG화 반응을 켄칭시키기 이전에 졸 D를 가열하는 것은 공정의 일부가 되어야만 한다.

본원에 언급된 모든 특허 및 공보는 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.

당업자는 본원에 기재된 개시내용의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 균등예를 인지하거나 또는 단지 통상의 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 그러한 균등예는 하기의 청구범위에 의하여 포함시키고자 한다. 다른 의미로 나타내지 않는다면, 수치 반올림의 일반적인 수학적 규칙은 비-다분산 분자, 예컨대 H₂O, NHSS, EDC 등의 분자량을 제외하고 본 명세서에서 모든 수치에 적용된다. 중합체는 다분산 분자이다. 수치가 제시되면, 수치의 마지막 자리는 확실성의 한계가 되는 것으로 이해하며, 주어진 수치의 가장 근접한 마지막 자리로 수치 범위를 반올림한 결과이다. 예를 들면, "5 kDa 중합체"는 가장 근접한 1,000으로 4.51-5.49 kDa의 반올림이 5 kDa이므로 4.5 kDa 내지 5.5 kDa 사이의 범위를 의미한다. 또 다른 예는 2.05 내지 2.15 mmol 사이의 범위인 2.1 mmol이다. 또 다른 예는 4.95 내지 5.05 kDa 사이의 범위인 5.0 kDa 중합체이다.

SEQUENCE LISTING <110> PHARMAIN CORPORATION <120> METHOD OF PRODUCTION OF GRAFT CO-POLYMER EXCIPIENT WITH A SUPERIOR PEPTIDE AND PROTEIN BINDING PROPERTY <130> N410736EP <140> EP15857011.9 <141> 2015-11-03 <150> US 62/074,356 <151> 2014-11-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrial natriuretic peptide <400> 1 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 2 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B type natriuretic peptide <400> 2 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon like peptide-1 <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30

Claims

단계 (a): W 몰의 유리 1차 아미노 기를 함유하는 선형 폴리아민 골격을 수성 용매 중에 용해시켜 부피 Y를 갖는 용액 A를 제공하는 단계; 및
B1 또는 B2
를 포함하는 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법으로서,
B1은
단계 (b): 30-55mM의 W/(Y+Z) 비율의 최종 부피 Z에서, pH 4-5.5의 수성 용매 중에서, 0-30분의 시간 동안 0.5-1.2xW, 0.5-1.1xW, 또는 0.5-1.0xW 몰의 카르복실 기를 함유하는 보호 쇄를, 1.7-7.0xW, 1.7-3.7xW, 또는 1.7-3.4xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트 및 각각 1.5-3.6xW, 1.5-3.3xW, 또는 1.5-3.0xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드로 활성화시켜 용액 B를 제공하는 단계;
단계 (c): 용액 B를 용액 A에 연속 혼합하면서 첨가하여 용액 C를 제공하는 단계;
단계 (d): 용액 C의 pH를 6.5 초과로 조절하는 단계; 및
단계 (e): 0.5-1.5xW, 0.5-1.2xW, 0.5-1.1xW, 또는 0.5-1.0xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 2 내지 3 시간 후 용액 C에 첨가하고; 1차 아미노 기가 W 몰의 55-40%가 될 때까지 대기하는 단계
를 포함하며;
B2는
단계 (b-d): 0.5-1.2xW, 0.5-1.1xW, 또는 0.5-1.0xW 몰의 카르복실 기를 함유하는 보호 쇄; 1.7-7.0xW, 1.7-3.7xW, 또는 1.7-3.4xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트; 및 1.5-3.6xW, 1.5-3.3xW, 또는 1.5-3.0xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 용액 A에 첨가하여 용액 C를 제공하는 단계; 및
단계 (e): 0.5-1.5xW, 0.5-1.2xW, 0.5-1.1xW, 또는 0.5-1.0xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 2 내지 3 시간 후 용액 C에 첨가하고; 1차 아미노 기가 W 몰의 55-40%가 될 때까지 대기하는 단계
를 포함하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제1항에 있어서, C1, C2, C3 또는 C4를 더 포함하고, 여기서
C1은
단계 (f): 1차 아미노 기가 W 몰의 55-40%가 될 때 용액 C를 냉동 및 동결건조시켜 동결건조된 물질을 제공하고, 동결건조된 물질을 하나 이상의 유기 용매(들) 중에서 재구성하여 용액 D를 제공하는 단계;
단계 (g): 0.5-6xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하는 단계; 및
단계 (h): 0.75xW 몰 이상의 장쇄 지방산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 첨가하여 용액 E를 제공하고, 용액 E를 2 시간 이상 동안 또는 1차 아미노 기가 W 몰의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 생성물을 얻은 후, 정제하여 최종 생성물을 제공하는 단계
를 포함하고;
C2는
단계 (f): 적어도 W 몰의 강 친핵체를 용액 C에 첨가하고, 생성된 중간 반응 생성물을 정제하고, 상기 중간 반응 생성물을 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 또는 1-메틸-2-피롤리디논 중에 용해시켜 용액 D를 제공하는 단계로서, 강 친핵체는 히드록실 아민, NaOR, NaOH, KOH, NaNH₂, NaNHR, NaNR₂, NaI, LiBr, KI, 및 NaN₃ 중 어느 하나를 포함하고, R은 C₁-C₆ 알킬 또는 C₂-C₆ 알케닐인 단계;
단계 (g): 0.5-6xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하는 단계; 및
단계 (h): 0.75xW 몰 이상의 장쇄 지방산-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 첨가하여 용액 E를 제공하고, 용액 E를 2 시간 이상 동안 1차 아미노 기가 W 몰의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 생성물을 얻은 후, 정제하여 최종 생성물을 얻는 단계
를 포함하고;
C3은
단계 (f): 1차 아미노 기가 W 몰의 55-40%가 될 때 1.0-2.5 부피 당량의 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 또는 1-메틸-2-피롤리디논을 첨가하여 용액 C의 총 부피를 증가시켜 용액 D를 얻고, 용액 D를 40-70℃로 10 분 이상 동안 가열하고, 강 친핵체를 첨가한 후, 메톡시폴리에틸렌글리콜 그래프팅된 폴리리신(PLPEG) 생성물을 한외여과 및 동결건조에 의하여 정제하는 단계로서, 강 친핵체는 히드록실 아민, NaOR, NaOH, KOH, NaNH₂, NaNHR, NaNR₂, NaI, LiBr, KI, 및 NaN₃ 중 어느 하나를 포함하고, R은 C₁-C₆ 알킬 또는 C₂-C₆ 알케닐인 단계;
66% 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 또는 1-메틸-2-피롤리디논 중에서 순수한 메톡시폴리에틸렌글리콜 그래프팅된 폴리리신(PLPEG) 생성물을 갖는 용액 D를 재구성시키는 단계;
단계 (g): 0.5-6xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 재구성된 용액 D에 첨가하는 단계; 및
단계 (h): 0.75xW 몰 이상의 장쇄 지방산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 첨가하여 용액 E를 제공하고, 용액 E를 2 시간 이상 동안 또는 1차 아미노 기가 W 몰의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 생성물을 얻은 후, 정제하여 최종 생성물을 얻는 단계
를 포함하고;
C4는
단계 (f): 잔존하는 1차 아미노 기가 W 몰의 55-40%가 될 때 1.0-2.5 또는 1.5-2 부피 당량의 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 또는 1-메틸-2-피롤리디논을 첨가하여 용액 C의 총 부피를 증가시켜 용액 D를 얻고, 용액 D를 40-70℃로 가열하는 단계;
단계 (g): 0.5-6xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하는 단계; 및
단계 (h): 0.75xW 몰 이상의 장쇄 지방산-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 첨가하여 용액 E를 제공하고, 용액 E를 2 시간 이상 동안 또는 1차 아미노 기가 W 몰의 5% 미만이 될 때까지 교반하여 미정제 생성물을 얻은 후, 정제하여 최종 생성물을 얻는 단계
를 포함하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제2항에 있어서, 선형 폴리아민 골격이 광 산란 또는 핵 자기 공명 분석으로 측정하였을 때 35-150의 중합도를 갖는 폴리리신이며;
보호 쇄가 단일 카르복실 말단, 및 겔 투과 크로마토그래피로 측정하였을 때 4-12 kDa 수 평균 분자량을 갖는 메톡시폴리에틸렌글리콜 쇄이고;
용액 A에서, 수성 용매가 pH 7 내지 pH 8의 완충 범위를 갖는 완충제이고;
미정제 생성물의 정제는 S1 또는 S2를 포함하고;
S1은
단계 (i): 에틸 아세테이트 및 물을 사용하여 수용액 중에서 미정제 생성물로부터 유기 용매(들) 및 과잉의 지방산을 추출하고, 에틸 아세테이트 추출물을 버리고, 수용액의 추출을 1회 이상 반복하여 생성물을 함유하는 수용액을 제공하는 단계;
단계 (j): 생성물을 함유하는 수용액을, 에탄올 및 물의 적어도 10 부피 교환으로 한외여과에 의하여 세정하여 최종 생성물을 제공하는 단계; 및
단계 (k): 최종 생성물을 냉동 또는 동결건조시키는 단계
를 포함하고;
S2는
단계 (i): 용액 E 중의 유기 용매를 교환하여 수중에서 생성물을 제공하는 단계;
단계 (j): 생성물을 에탄올 및 물의 적어도 10 부피 교환으로 한외여과에 의하여 세정하여 최종 생성물을 제공하는 단계; 및
단계 (k): 최종 생성물을 냉동 또는 동결건조시키는 단계
를 포함하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 방법은 C3을 포함하고;
폴리리신의 중합도가 광 산란 또는 핵 자기 공명 분석으로 측정하였을 때 35-85이며;
보호 쇄가 겔 투과 크로마토그래피로 측정하였을 때 4-6 kDa 수 평균 분자량을 갖는 메톡시폴리에틸렌글리콜이고;
장쇄 지방산 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 존재할 경우 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제3항에 있어서, 단계 (a)에서, 용액 A가 0.1-0.14 M 사이의 1차 아민 기의 농도를 가지며;
단계 (b)에서, 용액 B가 0.8-1xW 몰의 카르복실 기, 1.7-3.4xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트, 및 2.5-2.9xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
용액 B의 pH가 4.5-4.9이며;
단계 (b)에서, 보호 쇄의 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며;
용액 C의 pH가 7-8로 조절되며;
단계 (e)에서, 0.8-1.1xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 용액 C에 첨가하며;
단계 (g)에서, 1-3xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하고;
장쇄 지방산 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제5항에 있어서, 단계 (b)에서, 용액 B가 0.9xW 몰의 카르복실 기, 2.7xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트, 및 2.7xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
단계 (e)에서, 0.9xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 용액 C에 첨가하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제3항에 있어서, 단계 (b)에서, 용액 B가 0.75-0.85xW 몰의 카르복실 기, 2.3-2.8xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트 및 2.3-2.6xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
용액 B의 pH가 4.5-4.9이며;
단계 (b)에서, 보호 쇄의 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며;
용액 C의 pH가 7-8로 조절되며;
단계 (e)에서, 0.75-0.85xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 용액 C에 첨가하고;
단계 (g)에서, 1-3xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제7항에 있어서, 단계 (b)에서, 용액 B가 0.8xW 몰의 카르복실 기, 2.4xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트, 및 2.4xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
용액 B의 pH가 4.5-4.9이며;
단계 (b)에서, 보호 쇄의 활성화가 18-22 분 동안 진행되도록 하며;
용액 C의 pH가 7-8로 조절되며;
단계 (e)에서, 0.75-0.85xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 용액 C에 첨가하고;
단계 (h)에서, 0.75xW 몰 이상의 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 용액 D에 첨가하고;
장쇄 지방산 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제3항에 있어서, 단계 (a)에서, 용액 A가 0.10-0.14 M의 1차 아민의 농도를 가지며;
단계 (b)에서, 용액 B가 0.65-0.75xW 몰의 카르복실 기, 2.0-2.5xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트, 및 2.0-2.3xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
활성화가 15-25 분 동안 진행되도록 하며;
단계 (e)에서, 0.65-0.75xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 2-3 시간 후 용액 C에 첨가하며;
단계 (g)에서, 1-3xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하며;
단계 (h)에서, 0.75-1.25xW 몰의 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 용액 D에 첨가하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제9항에 있어서, 단계 (b)에서, 용액 B가 0.7xW 몰의 카르복실 기, 2.1xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트, 및 2.1xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
단계 (b)에서, 보호 쇄의 활성화가 15-25 분 동안 진행되도록 하며;
단계 (e)에서, 0.65-0.75xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 2-3 시간 후 용액 C에 첨가하며;
단계 (h)에서, 0.75-1.25xW 몰의 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 용액 D에 첨가하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제3항에 있어서, 단계 (a)에서, 용액 A가 0.10-0.14 M의 1차 아민의 농도를 가지며;
단계 (b)에서, 용액 B가 0.55-0.65xW 몰의 카르복실 기, 1.7-2.2xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트, 및 1.7-2.0xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
단계 (b)에서, 보호 쇄의 활성화가 15-25 분 동안 진행되도록 하며;
단계 (e)에서, 0.55-0.65xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 2-3 시간 후 용액 C에 첨가하며;
단계 (f)에서, 1.6-1.9 부피 당량의 아세토니트릴, 아세톤, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸 술폭시드 또는 1-메틸-2-피롤리디논을 첨가하여 용액 C의 총 부피를 증가시키고;
단계 (g)에서, 1-3xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하며;
단계 (h)에서, 0.75-1.25xW 몰의 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 용액 D에 첨가하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제11항에 있어서, 단계 (b)에서, 용액 B가 0.6xW 몰의 카르복실 기, 1.8xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트 (NHSS), 및 1.8xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
단계 (e)에서, 0.6xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 2-3 시간 후 용액 C에 첨가하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제3항의 방법에 따라 제조되는 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 조성물.
제13항에 있어서, 세미-랜덤 그래프트 공중합체가 글루카곤 유사 펩티드-1, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 그의 유도체, 및 그의 임의의 조합에 결합할 수 있는 것인 조성물.
제14항에 기재된 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 단계 (a)에서, 용액 A가 0.10-0.14 M의 1차 아민의 농도를 가지며;
단계 (b)에서, 용액 B가 0.65-0.75xW 몰의 카르복실 기, 2.0-2.5xW 몰의 N-히드록시숙신이미드술페이트, 및 2.0-2.3xW 몰의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 가지며;
단계 (b)에서, 보호 쇄의 활성화가 15-25 분 동안 진행되도록 하며;
단계 (e)에서, 0.65-0.75xW 몰의 추가의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드를 2-3 시간 후 용액 C에 첨가하며;
단계 (g)에서, 1-3xW 몰의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 기타 3차 아민을 용액 D에 첨가하며;
단계 (h)에서, 0.75-1.25xW 몰의 스테아르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 용액 D에 첨가하는 것인 세미-랜덤 그래프트 공중합체의 제조 방법.
제3항의 방법에 따라 제조되는 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 조성물로서, 미정제 생성물의 정제는 S1을 수행하는 것을 포함하는 조성물.
제3항의 방법에 따라 제조되는 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 조성물로서, 미정제 생성물의 정제는 S2를 수행하는 것을 포함하는 조성물.
제2항의 방법에 따라 제조되는 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 조성물.
제19항에 기재된 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 약학적 조성물.
제19항에 있어서, 세미-랜덤 그래프트 공중합체가 글루카곤 유사 펩티드-1, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 그의 유도체 및 그의 임의의 조합에 결합할 수 있는 것인 조성물.
제4항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 조성물.
제22항에 기재된 세미-랜덤 그래프트 공중합체를 포함하는 약학적 조성물.
제22항에 있어서, 세미-랜덤 그래프트 공중합체가 글루카곤 유사 펩티드-1, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 그의 유도체 및 그의 임의의 조합에 결합할 수 있는 것인 조성물.
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