CN1169827C - 一种增强多肽在体内稳定性药物的生产方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种增强多肽在体内稳定性药物的生产方法及其应用，本发明是利用有机化学原理将多肽与人血白蛋白在体内或在体外相连的方法，从而增强多肽在体内的稳定性。该方法包括在体外将由5～100个氨基酸组成的多肽用化学分子修饰。修饰后的多肽保持原多肽的生物学活性，并能在体内或体外与人血白蛋白以共价的方式连接，以达到延长多肽在体内的半衰期，提高生物利用度。本发明具有工艺简单，可以根据需要选择在体内或体外实现多肽与人血白蛋白的结合，而且结合过程中没有修饰多肽以外的其它反应产物生成。
Description
技术领域
本发明涉及利用有机化学原理将多肽与人血白蛋白在体内或在体外相连的方法，从而增强多肽在体内的稳定性。
本发明所涉及的多肽可以是从天然或合成多肽中得到的活性部分，具有潜在的治疗作用，有重要的药物开发价值。这些治疗作用可以是直接的，也可以是间接的，包括用于预防、涉及疫苗、药物设计等。这些具有生物学活性的多肽可以是人机体中自然产生的、或者重组合成的、或者是这些多肽的分子异构体。例如：多肽酶、酶抑制剂、抗原、抗体、多肽激素、细胞因子、促红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、等等；他们可以是整个分子，也可以只是一部分；还可以是能与这些多肽的细胞受体结合的其他多肽分子，如从随机多肽文库中筛选出的具有特异生物活性的多肽分子。
本发明所涉及具有生物学活性的多肽也可以不是人源的，可以是从动物中、细菌中、真菌中、或者植物中提取的，或者完全人工合成的蛋白多肽的全部或部分。
背景技术
许多肽类尤其是小分子多肽具有治疗活性但不能开发成药物。原因有多种，包括在体内不稳定、结构不稳定、难以大批量制备等。许多多肽在体内未产生预期的效果是由于给药剂量、方式和药代等问题造成的。本专利可以解决这些问题。多肽与人血白蛋白相连而不破坏多肽的结构和生理功能，但在体内的稳定性可以得到增强，从而达到延长多肽在体内的半衰期，提高生物利用度。
本发明基于这样的发现，人血白蛋白在血清中具有高半衰期，它能提高多肽在血清中的半衰期，使活性维持更长，能更有效地使多肽到达作用位置，从而可以降低多肽的使用剂量，提高药效，减少副作用。另外，小分子多肽没有或只有较弱的抗原性，比大分子蛋白有更大优势。已有提到用基因工程的方法制备多肽与人血白蛋白的融合蛋白，从而增强多肽在体内的半衰期的报道(美国专利5,876,969)。
延长药物在体内的半衰期，提高生物利用度、方便临床用药一直是制药公司和许多药物研究单位进行药物开发的主要方向之一。大分子药物，如蛋白类、DNA及RNA类生物技术产品药物难于经口服途径给药，因为这类大分子很容易经胃肠道降解，因而这些药物多数情况须经皮下、肌肉、静脉或局部注射给药。但由于任何药物在血液中仅停留一定时间，所以大分子药物必须反复注射以保持一定的血浆浓度，从而给临床应用造成很多不变，尤其是许多生物药物均须终生用药。目前研究最多的延长药物体内半衰期的方法有两种。一种是改变制剂组成，通常使用多聚体(Polymer)包埋药物或与药物交联，用得最多的多聚体就是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)；另一种方法就是生产一种体内可以进行控制药物释放的医疗装置。已有PEG交联的生物药物在美国上市，如PEG干扰素，还有许多用PEG包埋的药物正在进行临床试验，如InfiMed Therapeutic公司(Cambridge，MA)的InfitropinCR，即长效生长激素(Growth Hormone)。另外，也有许多能控制释放的医疗装置的临床试验接近完成，如Genetronic Biomedical公司(San Diego，CA)的MedPulser电穿孔系统。然而，鉴于上述两种方法的不完善及复杂性，寻找更好的延长多肽药物体内半衰期的方法将具有极高的开发价值和市场前景。本发明利用化学方法使多肽特异性地与人血白蛋白相连，工艺简单，可以根据需要选择在体内或体外实现多肽与人血白蛋白的结合，并且结合过程中没有修饰多肽以外的其它反应产物生成。
如前所述，本发明所涉及的多肽特指由5-100个氨基酸所构成的短多肽。多数酶，或酶的抑制剂，或抗原、或抗体、或激素、或干扰素、或细胞因子、或生长因子、或分化因子等的活性中心均由少于100个氨基酸的多肽构成。另外，由于所有蛋白质均由20种不同的氨基酸组成，所以，不同的氨基酸组合可以构成任何空间结构已实现功能的多样性。由随机的氨基酸组合所得到的多肽随机文库的多样性远远地超出了目前已知的化学物质文库的多样性，而且多肽本身的可朔性也较小分子化合物为好，所以，用小分子多肽文库在一些情况下替代小分子化合物文库也为药物筛选开辟了一条新的路线。
与蛋白质药物和小分子药物一样，小分子多肽药物也可以通过多种方法来增强其体内的稳定性、提高血浆半衰期，如脂质体包埋、缓释装置、以及利用重组DNA技术与其他生物稳定性蛋白(如抗体Fc段，或人血白蛋白)相连。这些方法可以解决多数药物的体内稳定性问题，但存在操作复杂或者有潜在的免疫反应的危险。
本发明所涉及的多肽可以是利用重组DNA技术于大肠杆菌中表达产生的；也可以是利用化学方法人工合成的。在大肠杆菌中表达时，将编导靶多肽的重组DNA克隆入适当的表达载体中，该重组DNA可以利用经典方法人工合成，也可以利用多聚酶链反应(PCR)方法获得。将含有靶多肽重组DNA的表达质粒导入适当的宿主大肠杆菌中，经表达、纯化获得靶多肽。应用化学方法人工合成多肽时，可以应用自动的固相多肽合成仪或应用标准的手工合成方法进行。已知的自动固相多肽合成仪可以是由Applied Biosystems公司生产；也可以由其他相当的厂家生产。标准的手工多肽合成方法利用了t-butyloxycarbonyl(t-BOC)或9-fluorenylmethyloxycarbonyl(FMOC)对氨基酸α-氨基的保护作用，将单个氨基酸从C-段开始一步一步加上，然后再经脱保护，并将合成好的多肽从与其连接的固相上切下，经系列脱盐、萃取、纯化等步骤获得多肽。
小分子多肽在免疫学实验室中应用一直十分广泛。例如可以用于T细胞和B细胞的表型分析，以及与其他免疫增强剂或蛋白结合后用于免疫动物易产生抗体。近几年由于人类基因组计划的进展，人们对多肽的认识与日俱增，小分子多肽的应用也更加广泛，小分子多肽药物的开发于治疗性单克隆抗体的开发一样，成为许多制药公司的重要研究方向之一。例如：SCIOS公司(Sunnyvale，CA)的Natrecor，即B型利尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)，目前已完成III期临床试验，等待药审机构最后的批文。该药为特效的治疗急性充血性心衰的小分子多肽药物。下表(表一)列出了几种具有代表性的治疗多肽的大小、功能及序列：
表一.几种具有代表性的治疗多肽
| 多肽名称 | 氨基酸数 | 序列(N→C) | 功能 |
| B型利尿肽(BNP) | 32 | SPKMVQGSGC FGRKMDRISSSSGLGCKVLR RH | 利尿，治疗急性充血性心衰。 |
| 付甲状腺类多肽(PTHrp) | 34 | CVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRFFLHHLIAE IHTA | 治疗骨质疏松症 |
| EPO类多肽1 | 20 | GGTYSCHFGP LTWVCKPQGG | 与EPO一样，治 |
| (EMP1) | 疗各类贫血。 | ||
| 钙调节素肽(Calcitonin) | 32 | CGNLSTCMLG TYTQDFNKFHTFPQTAIGVG AP | 治疗特类治疗骨质疏松症 |
小分子多肽具有很好的治疗活性但又有其明显的缺陷，即在体内不稳定、结构不稳定，因而极易被降解产生给药剂量、方式和药代等问题。本发明通过多肽与人血白蛋白在体内或体外自然条件下相连来实现增强多肽在体内稳定性，并达到提高治疗作用的目的。这种连接均在温和条件下或体内进行，连接后的多肽保持其原有功能，人血白蛋白也按正常途径进行代谢。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强多肽在体内稳定性药物的生产方法及其应用。
本发明的目的是这样实现的：该方法是指先在体外将多肽用化学分子修饰：即将多肽溶解在10-200mmol/Lol/L的盐类缓冲液中，再将修饰用化学分子溶解在10-200mmol/Lol/L的溶液中，将溶解后的化学分子加入多肽溶液中，在室温下反应30-60分钟或在4℃下反应2-20小时，也可以在37℃反应20-40分钟；将上述反应混合液通过脱盐柱，用盐类缓冲液洗脱，收集洗脱的多肽进行冷冻干燥或不冷冻干燥；并且在体外使修饰后的多肽直接加入含有5-20mmol/Lol/LEDTA的人血白蛋白的溶液中，在室温下反应30-60分钟或在4℃下反应2-20小时，也可以在37℃反应20-40分钟，反应终止时加入终浓度30-200mmol/Lol/L含有自由巯基的化合物或者含有自由氨基的化合物。
将多肽溶解在10-200mmol/Lol/L的磷酸盐缓冲液中，缓冲液的pH值为6-9，缓冲液可以是HEPES，也可以是碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，还可以是硼酸盐缓冲液。对一些疏水性较强而造成溶解度较差的多肽，还可以加入一些诸如非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或变性剂的助溶剂，如吐温20、吐温60、吐温80、Triton、十二烷基硫酸钠、尿素或盐酸胍等。这些缓冲液实例并不以任何方式限制在本发明中应用其他缓冲液。
将修饰用化学分子溶解在10-200mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，缓冲液的pH值为6-9，缓冲液可以是HEPES，也可以是碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，还可以是硼酸盐缓冲液，还可以是注射用水，还可以是DMSO，还可以是DMF。这些缓冲液实例并不以任何方式限制在本发明中应用其他缓冲液。
本发明所涉及的修饰用化学分子可以是NHS马来酰亚氨酯类，也可以是SMCC，还可以是Sulfo-SMCC，还可以是SIAB，还可以是Sulfo-SIAB，还可以是BMPA，还可以是Sulfo-KMUS，还可以是EMCA，还可以是EDC，还可以是DMP，还可以是DMA，还可以是DMS，还可以是DSG，还可以是DSS，还可以是BS3。这些化学分子实例并不以任何方式限制在本发明中应用其他适当的修饰用化学分子，来同样达到将靶多肽与人血白蛋白连接，从而增加靶多肽体内稳定性的目的。上述化学分子实例的分子代号与其相应的名称及化学组成可参见后面附表(表二)。
将溶解后的化学分子加入多肽溶液中，在室温下反应30-60分钟或在4℃下反应2-20小时，也可以在37℃反应20-40分钟。
将反应混合液过D-Dextran脱盐柱，用10-200mmol/L的磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液可以是HEPES，也可以是碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，还可以是硼酸盐缓冲液；缓冲液的pH值为6-9；脱盐柱还可以是KwikSep Dextran，还可以是Excellulose GF-5，或者是PD-10柱(Pharmacia#17-0851-01)，收集洗脱的多肽峰通过直冷式或复叠式冷冻干燥机进行冷冻干燥。这些脱盐柱实例并不以任何方式限制在本发明中应用其他合适的脱盐柱。
冷冻干燥后的多肽给药前用注射用水溶解，以静脉注射的方式体内应用。也可以根据多肽的特异功能进行局部注射给药，例如肿瘤部位的局部注射用药。
与修饰用化学分子反应后收集的多肽峰也可以不通过冷冻干燥而直接加入含有5-20mmol/L EDTA的人血白蛋白的溶液中，在室温下反应30-60分钟或在4℃下反应2-20小时，也可以在37℃反应20-40分钟，使修饰后化学分子与人血白蛋白以二硫键或亚氨酯键的形式结合，反应终止时加入终浓度30-200mmol/L的半胱氨酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇等含有自由巯基的化合物，或者加入20-200mmol/L的Tris、甘氨酸、赖氨酸、乙醇氨等含有自由氨基的化合物。本发明所用体外连接的人血白蛋白可以是从市场上获得的从人血中分离出来的不均一的白蛋白制剂；也可以是利用重组DNA技术生产的均一白蛋白亚型。
反应混合液上样D-Dextran脱盐柱，用10-200mmol/L的缓冲液洗脱，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液，还可以是HEPES，还可以是碳酸盐缓冲液，还可以是硼酸盐缓冲液，还可以是柠檬酸盐缓冲液；缓冲液的pH值为6-8；脱盐柱还可以是KwikSep Dextran，还可以是Excellulose GF-5。收集洗脱的蛋白峰。这些脱盐柱实例并不以任何方式限制在本发明中应用其他合适的脱盐柱。
附图说明
下面将通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明
图1是本发明的钙调节素肽的Sulfo-MBS修饰
图2是本发明钙调节素肽的Sulfo-SMCC修饰
图3是本发明钙调节素肽的SIAB修饰
图4是本发明钙调节素肽的EDC修饰
图5A是本发明EPO类多肽1的DMA修饰
图5B是本发明EPO类多肽1(EMP1)结构
图6是本发明EPO类多肽1的DSG修饰
图7是本发明低压氧红细胞增多小鼠模型生物活性法测定促红细胞素活性图
图8是本发明外周血网织红细胞计数法
具体实施方式
下面借助实施例进一步举例描述本发明，但这些实施例并不以任何方式限制本发明。如前所述，本发明所涉及的多肽均是应用标准的重组表达或化学合成方法经纯化获得。
实施例一：付甲状腺类多肽(PTHrp)的NHS马来酰亚氨酯修饰
应用化学方法合成由34个氨基酸构成的付甲状腺类多肽(PTHrp)。化学合成时，最后一步受t-BOC保护的氨基不经三氟乙酸(TFA)脱保护，直接经脱盐、有机溶剂萃取、反相-HPLC纯化获得高纯度付甲状腺类多肽，溶解于100mmol/L的磷酸盐缓冲液中，缓冲液的pH值为7.0，付甲状腺类多肽的终浓度为100μM。
将NHS马来酰亚氨酯Sulfo-MBS溶解在10mmol/L的磷酸盐缓冲液中，缓冲液的pH值为7.0，NHS马来酰亚氨酯的终浓度为2mmol/L。。按厂家指导于使用前1小时内配制。
溶解后的Sulfo-MBS加入付甲状腺类多肽溶液中，在室温下反应30分钟或在4℃下反应2小时，并轻轻地搅拌混匀(见图1)。MBS为应用最为广泛的双功能交联剂。在中性pH，MBS可与多肽上的巯基或氨基交联。本发明中的连接工艺是通过两个分开的反应达到的，从而避免了相同分子的连接。该游离巯基(SH)是由付甲状腺类多肽N-端的半胱氨酸残基所提供，在第一个反应中，MBS与付甲状腺类多肽连接；而在第二个反应中(见后面实例)，MBS可将付甲状腺类多肽与人血白蛋白上的赖氨酸残基的氨基交联。
Sulfo-MBS交联后的付甲状腺类多肽混合液进行TFA脱保护，然后按‘实例七’中方法进行脱盐及纯化以去除游离化学分子和未交联的付甲状腺类多肽，计算交联效率。分装成品以进行稳定性试验、毒性试验、药效和药代动力学试验等实验室开发研究。
实施例二：付甲状腺类多肽的Sulfo-SMCC修饰
同实例一的方法准备高纯度的付甲状腺类多肽，溶解在20mmol/L的磷酸盐缓冲液中，缓冲液的pH值为7.0，付甲状腺类多肽的终浓度为50μM。
在上述溶液中加入1mg Sulfo-SMCC，在室温下反应60分钟或在37℃下反应30分钟，并轻轻地搅拌混匀(见图2)。SMCC为应用非常广泛的双功能交联剂，Sulfo-SMCC保留了SMCC的反应特性，同时具有良好的水溶性。在中性pH，Sulfo-SMCC可使蛋白或多肽之间交联。本发明中的连接工艺是通过两个分开的反应达到的，从而避免了相同分子的连接。首先Sulfo-SMCC与付甲状腺类多肽上的半胱氨酸的巯基反应，在第一个反应中，Sulfo-SMCC与付甲状腺类多肽连接；而在第二个反应中(见实例八和九)，Sulfo-SMCC可将付甲状腺类多肽与人血白蛋白上的赖氨酸残基的氨基交联。
Sulfo-SMCC交联后的付甲状腺类多肽混合液脱去保护基团，按‘实例七’中方法进行脱盐及纯化以去除游离化学分子和未交联的付甲状腺类多肽，计算交联效率。分装成品以进行稳定性试验、毒性试验、药效和药代动力学试验等实验室开发研究。
实施例三：付甲状腺类多肽的SIAB修饰
同实例一的方法准备高纯度的付甲状腺类多肽，并溶解在20mmol/L的硼酸盐缓冲液中，缓冲液的pH值为7.0，付甲状腺类多肽的浓度为0.1mg/ml。
将1.4mg SIAB溶解在1ml DMSO中，按厂家指导于使用前1小时内配制。
取10μl SIAB溶液加入到1ml付甲状腺类多肽溶液中，室温下反应30-60分钟，并轻轻地搅拌混匀(见图3)。SIAB为应用非常广泛的双功能交联制剂。在中性pH，SIAB可使蛋白或多肽之间交联。本发明中的连接工艺是通过两个分开的反应达到的，从而避免了相同分子的连接。首先SIAB与付甲状腺类多肽的半胱氨酸的巯基发生反应，在第一个反应中，SIAB与付甲状腺类多肽连接；而在第二个反应中(见实例八和九)，SIAB可将付甲状腺类多肽与人血白蛋白上的赖氨酸残基的氨基交联。
SIAB交联后的付甲状腺类多肽混合液脱去保护基团，按‘实例七’中方法进行脱盐及纯化以去除游离化学分子和未交联的付甲状腺类多肽，计算交联效率。分装成品以进行稳定性试验、毒性试验、药效和药代动力学试验等实验室开发研究。
实施例四：钙调节素肽的EDC修饰
利用化学方法制备钙调节素肽，制备完成后，暂时不脱去氨基端和赖氨酸残基上的保护基团。将其溶解在0.5ml、100mmol/L的MES溶液中，pH值为4.5。肽的浓度为1.0mg/ml。
在进行反应前1小时内，将10mg EDC溶解在1ml去离子水中，取100μl加入钙调节素肽溶液中，室温下反应120分钟，并轻轻地搅拌混匀(见图4)。EDC为应用非常广泛的双功能交联制剂。在酸性条件下，EDC可使蛋白或多肽之间交联。本发明中的连接工艺是通过两个分开的反应达到的，从而避免了相同分子的连接。在第一个反应中，EDC与钙调节素肽的羧基端残基反应与其连接；而在第二个反应中(见实例八和九)，EDC可将钙调节素肽与人血白蛋白上的赖氨酸残基的氨基交联。
EDC交联后的钙调节素肽混合液脱去保护基团，按‘实例七’中方法进行脱盐及纯化以去除游离化学分子和未交联的钙调节素肽，计算交联效率。分装成品以进行稳定性试验、毒性试验、药效和药代动力学试验等实验室开发研究。
实施例五：EPO类多肽1(EMP1)的DMA修饰
应用化学方法合成由20个氨基酸构成的EPO类多肽1(EPOmimetic peptide 1，EMP1)。经脱盐、有机溶剂萃取、反相-HPLC纯化获得高纯度EMP1，经HPLC分析证实纯度达＞95％，质谱分析证实结构正确。EMP1的两个半胱氨酸之间形成二硫键使EMP1呈半环形(见图5B)。DMA与EMP1的N端游离氨基反应连接(见图5A)。简要反应如下：
将5mg EMP1以0.5ml含1％DMSO的0.1M磷酸盐缓冲液溶解，缓冲液的pH值为7.4，然后上样到10ml已平衡好的Sephadex G-10柱(Pharmacia#17-0010-02)，缓冲液系统仍为0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.4，收集多肽峰，并调节EMP1浓度至2mg/ml。
按供应厂家指导配制DMA，使其终浓度为100mmol/L，将EMP1溶液缓慢地滴加到DMA溶液中，滴加的同时充分混合均匀，在室温下反应60分钟。反应结束时，加入相当于四分之一样品体积的冰乙酸终止反应，并按‘实例七’中方法进行脱盐及纯化以去除游离DMA分子、反应副产物和未交联的EMP1。然后计算交联效率，分装成品以进行稳定性试验和体内活性的验证。
实施例六：EMP1多肽的DSG修饰
同上述实例五准备EMP1多肽。然后按供应厂家指导配制DSG，将EMP1多肽溶液缓慢地滴加入DSG溶液中，滴的同时充分混合均匀，使EMP1多肽的摩尔浓度为DSG摩尔浓度的50-100分之一，室温下反应30分钟或在冰浴中反应120分钟(见图6)。
向混合反应液中加入20mmol/L的Tris，或甘氨酸，或赖氨酸，或含有自由氨基的溶液终止反应。同上述实例五，按‘实例七’中方法进行脱盐及纯化以去除游离DSG分子、反应副产物和未交联的EMP1。然后计算交联效率，分装成品以进行稳定性试验和体内活性的验证。
实施例七：修饰后多肽的脱盐和保存
将实例一、二、三、四、五、以及实例六中的交联反应混合液上样5ml D-Dextran脱盐柱，用100mmol/L的磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液的pH值为7.0。紫外检测器检测洗脱液在280nm的吸收值，收集多肽峰并用洗脱液做适当稀释，分装西林瓶，每支装入1ml，进行冷冻干燥保存。上述6个实例中的最终修饰后多肽的浓度均为1.0mg/ml。
实施例八：修饰后多肽在体内与血白蛋白结合
冻干后的多肽给药前用1ml注射用水溶解，以静脉注射的方式给药。
实施例九：修饰后多肽在体外与人血白蛋白结合
测定按实例七中收集的修饰多肽峰的摩尔含量，加入等摩尔含量的含有10mmol/L EDTA的人血白蛋白的溶液中，在室温下反应30-60分钟，使修饰后化学分子与人血白蛋白以二硫键或亚氨酯键的形式结合，反应终止时加入终浓度50mmol/L的、含有半胱氨酸的Tris或甘氨酸缓冲液，并将反应混合液上样10ml的D-Dextran脱盐柱，用10mmol/L的磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液的pH值为7.0。紫外检测器检测洗脱液在280nm的吸收值，收集蛋白峰。脱盐后的多肽-白蛋白峰可用于稳定性试验和体内活性的验证研究；同时也可进行进一步的层析分离，以将未结合的修饰多肽和白蛋白与多肽-白蛋白交联产物彻底分离，从而进一步提高多肽在体内的稳定性。高分辨率的Q离子交换层析和Superose凝胶过滤(Pharmacia#17-0510-01，17-0536-01)可做为这一步层析分离的首要选择。
实施例十：EMP1-白蛋白交联产物仍保留原促红细胞生成活性
应用小鼠模型是检测促红细胞素体内活性的重要方法，为增加这一方法的敏感度，可以选择低压氧红细胞增多小鼠模型生物活性法(Hypoxic-Polycythemic Mouse Bioassay)，通过对同位素标记的氯化铁(59-FeCl3)整合入血红蛋白的百分比来评估试验样本促红细胞生成的体内活性。具体试验如下：实验雌性小鼠(16-18g)首先饲养在0.6大气压的低压氧仓中3天，然后进一步降低低压样仓中的气压至0.4-0.5大气压，继续饲养11天后转移至正常气压下饲养，并于3天后进行试验。同时准备同位素标记的氯化铁(59-FeCl3)，即将由市场上获得的同位素标记的氯化铁以磷酸盐缓冲液稀释至3.7×10exp4Bq/ml。随机将实验小鼠分3大组，每组12只小鼠，每个剂量组3只小鼠，按标准EPO给药方法分别注射0.25-1.0IU/mouse促红细胞生成素(本申请人生产的)，0.01-0.2mg/mouse未经修饰EMP1，以及0.01-1μg/mouse的EMP1-白蛋白交联产物，每组均有对照剂量组用同体积的生理盐水(0.2lml)替代样品。注射2天后，再给每只动物腹腔内注射0.2ml的同位素标记的氯化铁溶液，注射顺序与给药相同。再48小时后，以Avertin麻醉动物，称体重，从每只小鼠体内主动脉弓收集0.65ml血液标本，并测出沉降细胞体积和同位素量。应用下列公式计算出每只小鼠对药物的反应(即总循环血中的59-Fe整合百分比)：
cpm(s)×0.075bw(g)×1/cpm(t)×1/v(s)
其中： cpm(s)＝样品中同位素量
cpm(t)＝注射的同位素总量
bw(g)＝体重(克)，小鼠循环血总体积按体重的7.5％计算
v(s)＝样品体积(ml)
以标准常用的统计学方法进行数据处理。当沉降细胞体积小于54％，或者小鼠体重超过24克时，放弃该单项数据。
实验结果表明，EPO给药最高剂量组(1.0IU/mouse)可见59-Fe整合入血红蛋白的百分比有20倍以上的增高(P＜0.0001)；未经修饰EMP1给药组在用药剂量达0.2mg/mouse时，也可见同59-Fe血红蛋白的百分比有显著的增高(20倍左右，P＜0.0001)；同样，在EMP1-白蛋白交联产物用药组，各剂量组均可见不同程度的59-Fe血红蛋白的百分比增高，最高剂量组(1.0μg/mouse)59-Fe血红蛋白的百分比增高可达40倍以上(图7)。
实施例十一：DMA修饰的EMP1的体内稳定性
有两种相对简单的方法可以测定EMP1的体内稳定性。一种仍然是外周血网织红细胞计数法，正常小鼠外周血网织红细胞计数是检测促红细胞素体内活性的最重要指标，通过体内活性的测定来间接评估多肽的体内稳定性。另一种方法是直接标记EMP1，测定其在血浆中的半衰期，从而直接比较其在体内的稳定性。选择正常小鼠外周血网织红细胞计数法测定EMP1体内稳定性时，实验纯种正常小鼠(16-18g)随机分成3大组，每组7个鼠笼，每个鼠笼6只小鼠，并分别稀释试验样品使其达下列浓度：200IU/ml促红细胞生成素(沈阳三生生产)，10mg/ml未经修饰EMP1，以及1.0mg/ml的修饰后EMP1-DMA。实验时，每只小鼠分别注射0.2ml上述样品，每大组有一个鼠笼为对照，仅注射0.2ml生理盐水。注射当日取对照鼠笼进行外周血网织红细胞计数，之后第2、4、6、8、10、12天分别于各大组取一鼠笼进行外周血网织红细胞计数。结果表明，EPO给药组(40IU/mouse)可见外周血网织红细胞计数有20％左右的增高(P＜0.0001)，计数于第2-4天达最高，一周后恢复正常水平；未经修饰EMP1给药组也可见到外周血网织红细胞计数有显著的增高(约5％，P＜0.001)，于第2天即达最高，3-4天后即恢复正常水平；同样，在修饰EMP1-DMA用药组也可见外周血网织红细胞计数增高可达110％，也于第2-4天达最高，10天后才逐渐恢复正常水平(图8)。由此可推断，经DMA修饰的EMP1具有较高的体内稳定性。未经修饰EMP1虽然在体内还具有一定的意想不到的活性，但毕竟十分短暂，可能是由已确知的经肝、肾、和组织的排泄机制对多肽的迅速清除造成的。
如前所述，修饰EMP1-DMA也可应用直接标记EMP1法测定其在血浆中的半衰期，从而评估其在体内的稳定性。初步实验已证实修饰EMP1-DMA的体内半衰期远远大于未经修饰的EMP1(半衰期约为8小时)，确切的EMP1-DMA的体内半衰期有待进一步实验获得。
表二 化学分子结构检索表(1)
表二 化学分子结构检索表(2)
表二 化学分子结构检索表(3)
表二 化学分子结构检索表(4)
表二 化学分子结构检索表(5)
Claims (15)
1、一种增强多肽在体内稳定性药物的生产方法，该方法是指先在体外将多肽用化学分子修饰：即将多肽溶解在10-200mmol/Lol/L的盐类缓冲液中，再将修饰用化学分子溶解在10-200mmol/Lol/L的溶液中，将溶解后的化学分子加入多肽溶液中，在室温下反应30-60分钟或在4℃下反应2-20小时，也可以在37℃反应20-40分钟；将上述反应混合液通过脱盐柱，用盐类缓冲液洗脱，收集洗脱的多肽进行冷冻干燥或不冷冻干燥；并且在体外使修饰后的多肽直接加入含有5-20mmol/Lol/LEDTA的人血白蛋白的溶液中，在室温下反应30-60分钟或在4℃下反应2-20小时，也可以在37℃反应20-40分钟，反应终止时加入终浓度30-200mmol/Lol/L含有自由巯基的化合物或者含有自由氨基的化合物。
2、根据权利要求1的生产方法，所指的多肽由5-100个氨基酸组成。
3、根据权利要求1的生产方法，所指的多肽含有酶，或酶的抑制剂，或抗原、或抗体、或激素、或干扰素、或细胞因子、或生长因子、或分化因子等的全部或部分结构。
4、根据权利要求1或3的生产方法，所指的多肽是天然蛋白中部分结构的变异体。
5、根据权利要求1的生产方法，所指的盐类缓冲液是磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。
6、根据权利要求1的生产方法，所指的溶液是磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或注射用水，还可以是DMSO或DMF。
7、根据权利要求1、5或6的生产方法，所指的盐类缓冲液或溶液中的pH值为6-9。
8、根据权利要求1的生产方法，所指的脱盐柱是D-Dextran脱盐柱、KwikSep Dextran脱盐柱、Excellulose GF-5脱盐柱、或者是PD-10脱盐柱Pharmacia#17-0851-01。
9、根据权利要求1的生产方法，所指修饰多肽的化学分子可以是NHS马来酰亚氨酯类MBS、Sulfo-MBS、SMPB、Sulfo-SMPB、GMBS、Sulfo-GMBS、EMCS、Sulfo-EMCS、SMCC、Sulfo-SMCC、SIAB、Sulfo-SIAB、BMPA、Sulfo-KMUS、或者是EMCA；还可以是EDC、DMP、DMA、DMS、DSG、DSS、或者是BS3。
10、根据权利要求1的生产方法，所指的修饰方式可以是酰氨键、亚氨酰氨键，或者是酯键。
11、根据权利要求1的生产方法，对于溶解度较差的多肽，可加入非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或变性剂。
12、根据权利要求1的生产方法，所指的用化学分子修饰后的多肽在体外与人血白蛋白的特异氨基酸通过共价键结合。
13、根据权利要求12的生产方法，所指的特异氨基酸是半胱氨酸，也可以是赖氨酸，还可以是其它含有自由氨基的氨基酸。
14、根据权利要求12的生产方法，所指的共价键是二硫键、或者是亚氨酯键。
15、根据权利要求1的生产方法，所指的含有自由巯基的化合物或者合有自由氨基的化合物是半胱氨酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇、Tris、甘氨酸、赖氨酸或乙醇氨。
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| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SHENYANG SANSHENG PHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: SANSHENG PHARMACY CO., LTD., SHENYANG CITY |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 1 No. 3, ten, road 110027, Shenyang economic and Technological Development Zone, Liaoning, China Patentee after: Shenyang Sansheng Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 1 No. 3, ten, road 110027, Shenyang economic and Technological Development Zone, Liaoning, China Patentee before: Shenyang Sunshine Pharmaceutical Co.,Ltd. |
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| CI01 | Publication of corrected invention patent application |
Correction item: Patentee Correct: Shenyang Sunshine Pharmaceutical Co., Ltd. False: Shenyang Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd. Number: 05 Volume: 23 |
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| ERR | Gazette correction |
Free format text: CORRECT: PATENTEE; FROM: SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO., LTD.. TO: SHENYANG SANSHENG PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
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| CX01 | Expiry of patent term | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20041006 |