JP2006511468A - 内因性エリスロポエチンの組織保護活性を維持する長期作用性エリスロポエチン - Google Patents

内因性エリスロポエチンの組織保護活性を維持する長期作用性エリスロポエチン Download PDF

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Abstract

化学修飾した長期作用性エリスロポエチンを含有する医薬化合物の投与により、内因性のエリスロポエチンの組織保護活性を維持しながら個体のヘマトクリットを増加させる方法。また、新たな長期作用性化学修飾型エリスロポエチン類、その長期作用性化学修飾型エリスロポエチン類を製造する方法、およびその長期作用性化学修飾型エリスロポエチン類を含んでなる組成物も開示する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、その全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、2002年9月9日提出の米国仮出願番号60/409,020の利益を主張するものである。
発明の分野
本発明は、修飾により組織保護能力を有利に維持する持続性エリスロポエチン類に関する。特に、本発明は、血清半減期を増大するが、in vivoにて天然タンパク質の組織保護機能も維持する方法で化学修飾された持続性エリスロポエチン類に関する。本発明はまた、本発明の持続性エリスロポエチン類を用いた貧血および貧血関連疾患の治療にも関する。最後に、本発明は、エリスロポエチンが組織保護能力を示すかどうかの判定に有用なアッセイに関する。
発明の背景
天然のエリスロポエチンまたは内因性エリスロポエチン(EPO)は、主に肝臓で生成される糖タンパク質ホルモンである。内因性EPOは165アミノ酸を含有し、その分子量（ヒトにおいて）は約30,000〜約34,000ダルトンである。EPOのグリコシル残基は、3つのN結合オリゴ糖鎖と1つのO結合オリゴ糖鎖で構成され、そのタンパク質総重量の約40パーセントを担っている。N結合オリゴ糖鎖は24、38および83位のアスパラギンのアミド窒素と結合され、一方、O結合オリゴ糖鎖は126位に位置するセリン残基の酸素と結合されている。EPOタンパク質は、3つの形態：α型、β型およびアシアロ型で起こり得る。α型およびβ型は有効性、生物学的活性および分子量が同じであるが、炭水化物成分がわずかに異なっている。一方、アシアロ型は、α型またはβ型のものから末端シアル酸（炭水化物）が除去されたものである。
最近まで、内因性EPOの本質機能は、応答性骨髄赤血球前駆細胞の増殖および成熟を刺激するために他の増殖因子と協調して作用することと、個体のヘマトクリット（赤血球を含む全血に占める割合）を維持することである。赤血球の産生のプロセスは、赤血球産生(造血)と呼ばれ、循環を妨げることなく、組織へ適切に酸素供給するために赤血球数を最適化する正確に制御された生理学的機構である。例えば、赤血球によって運搬される酸素が減少すると、EPOは骨髄の前駆細胞の成熟赤血球への変換を刺激し、それらが循環に放出されて、赤血球産生を高める。循環中の赤血球数が正常組織の循環に必要な数を超えると、循環中のEPOが減少する。このように、身体が健全な状態にあれば、EPOは血漿中非常に低い濃度で存在し、加齢によらず、通常失われる赤血球の置き換えを刺激するのには十分である。血漿EPOレベルは、通常、0.01単位/ml〜0.03単位/mlの間である。
腎臓が個体のEPOの大部分を生産することを考えれば、慢性腎不全(CRF)における場合などの腎臓機能の喪失によりEPOの生産障害が起こり、多くの場合、貧血を引き起こす。同様に、貧血は癌などの他の慢性症状、またはこれらの病気に関連する、化学療法などの治療によっても起こり得る。よって、内因性EPOと実質的に同じ生物学的作用を有する組換えEPO（以下でより詳細に論述する）の投与が赤血球が減少した個体においてヘマトクリットレベルを回復させるのに有用であることは証明されている。
組換えEPOの慢性症状でのヘマトクリットレベルの維持における役割に加え、組換えEPOは、待機または計画された手術の前に、赤血球レベルを高め、それにより、輸血の必要性を少なくするか、またはなくするのに使用されてきた。例えば、組換えEPOを投与することにより、血液供給により患者がウイルスまたは病原体を受けることに対する懸念を解消し得るし、または輸血についての厳正なる制限に対応し得る。
さらに、最近、EPOが、サイトカインスーパーファミリーのメンバーとして、EPO受容体(EPO-R)との相互作用により媒介される他の重要な治療的特質を有することがいくつかの証拠によって示された。例えば、EPOおよびその受容体は、それらの間の相互作用が低酸素性細胞内微小環境を改善するだけでなく、代謝ストレスにより引き起こされるプログラム細胞死を調節する働きをする代償性反応をもたらすことから、組織障害の軽減において重要な役割を果たすと考えられる。実際、慢性腎不全および／または癌を有する患者は、EPOによる治療後に、一般に、健康感の改善と知力の増進を経験しているが、その前に、その効果によって患者のヘマトクリットの増加が生じている。しかしながら、最近、国際公開番号WO/02053580ならびに米国特許公開番号2002/0086816および2003/0072737で論述されているように、これらの改善がEPOの組織保護および増強効果によって起こった。
最近の研究でも、血液脳関門を形成している毛細血管がEPO受容体も発現することから、全身投与されたEPOが無傷の血液脳関門を通過し得ることが示されている。そうであるから、脳への末梢循環から受容体を介したトランスサイトーシスの解剖学的基礎が与えられる。
商標名PROSCRIT（登録商標）(Ortho Biotech Inc., Raritan, Nj製)およびEPOGEN（登録商標）(Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA製)で市販されている組換えEPO（エポエチン・アルファ）は、末期腎不全による貧血の治療に、AZT（ジドブジン）療法と併用したHIV感染患者の治療に、また、化学療法の効果の相殺に使用されている。組換えEPOの治療効果は数多くあるものの、組換えEPOの主たる用途は、今日まで、慢性貧血を解消することにあった。この関連で、患者体内での推奨ヘマトクリット範囲を回復させるために、組換えEPOが、通常、50〜150単位/kgの初回用量にて、週に3回、約6〜8週間、静脈注射または皮下注射のいずれかにより投与される。患者が所望のヘマトクリットレベル、例えば、約30パーセント〜約36パーセント内に入る量に達した後、鉄欠乏および合併症の不在下ではEPO維持療法によりそのレベルを維持させ得る。各患者の必要性に応じて用量要件は異なるが、通常、維持用量が週に約3回投与される（高用量で施与する場合には回数は少ない）。
組換えEPOの投与量および投与回数は、その分子がin vivoに存在する時間によって制限され得るため、一部、分子の半減期をもとに判断される。例えば、静脈内投与されたEPOGEN（登録商標）は一次速度式に従う速度にて消失し、CRFを有する成人および小児患者においては循環半減期が約4〜13時間に及ぶと報告されている。よって、治療上有効であるためには、投与量および投与回数を組換えEPOの比較的短い半減期に合わせる必要がある。
さらに、組換えEPOは静脈注射または皮下注射のいずれかにより投与されるため、組換えEPOを患者に投与するために看護婦または医師が必要となる場合が多い。これは患者にとってさらに不都合なことであり、分子の半減期を延長することが望まれるなおもう1つの理由となっている。そうであるから、組換えEPOの半減期を増大しようとする取り組みは、長い半減期によって用量要件を減少させる一方で、なお、同じか、または改善された治療上の利益をもたらすという前提に基づいて、過去10年間、研究上の注目を集めてきた。
実際に、ヒトEPOを用いた最近の実験では、EPOのシアル酸含有炭水化物含有量、その循環半減期、およびin vivo生物活性間に直接の因果関係があることが証明されている。PCT公開番号W095/05465で論述されているように、シアル酸残基が糖鎖の末端をキャップし、肝臓によるガラクトースの検出を妨げている。N結合オリゴ糖鎖は、通常、各鎖につき最大4シアル酸を有し、O結合オリゴ糖鎖は各鎖につき最大2シアル酸を有している。そのため、非修飾型EPOポリペプチドは、合計最大14シアル酸を含有し得る。
経時的に、これらのシアル酸残基がそのタンパク質から切断され、そのことによって、ガラクトース鎖が肝臓による検出に曝される。肝臓がひとたびガラクトース鎖を検出すると、血液からそのタンパク質が濾過される。そうであるから、EPO１分子当たりのシアル酸含有量を段階的に増加させるとガラクトース鎖が有利に保護され、それに対応した生物学的活性の段階的な増加（等モル濃度の単離エリスロポエチンイソフォームが正常マウスのヘマトクリットを上昇させる能力により測定される）がもたらされると考えられる。非修飾型EPOは14シアル酸部位しか含有していないため、このアプローチではEPOの半減期を延長する能力は限られる。このことから、追加オリゴ糖鎖を含有するように工学的に操作されたEPO類似体が生物学的活性を高めるという仮説が導かれた。これらのグリコシル化部位が追加されて、追加オリゴ糖鎖が有する末端がシアル酸残基により修飾される。PCT公開番号W091/05867、W094/09257およびWO01/81405を参照。
例えば、修飾型EPO類似体は少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加0結合炭水化物鎖を有する。具体的に言えば、WO01/81405はN結合炭水化物鎖の、30、51、57、69、88、89、136および／または138のアミノ酸にての分子への付加を開示している。修飾型EPO分子は、2〜16シアル酸残基の分子への付加を可能にする1〜4グリコシル化部位がどこかに追加されている。
しかし、EPOの血清半減期を延ばそうとする取り組みは成功したし、また、それらはヘマトクリットレベルの維持に有用ではあるが、これらのグリコシル化部位の追加によっておこり得るEPOの他の機能への影響を全く取り上げていなかった。
よって、内因性EPOの機能性を維持した長い血清半減期（持続性）を有する修飾型EPOを提供することは有益であろう。特に、貧血および／または関連疾患を有する個体を治療するための医薬組成物に用いる、赤血球産生機能と組織保護機能とを有する長期作用性EPO化合物に関するニーズが当技術分野にある。さらに、特定のEPOが内因性EPOの組織保護能力に拮抗するかどうかを判定するアッセイにおいても必要である。
発明の概要
本発明は、ヒトにおけるヘマトクリットレベルを調節する方法であって、組換えヒトエリスロポエチン(rhuEPO)よりも血清半減期が長く、かつ、組織保護機能を含むエリスロポエチン製品を準備する工程、および治療上有効な量のエリスロポエチン製品を投与する工程を含む方法に関する。1つの実施形態では、エリスロポエチン製品を準備する工程が、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖またはO結合オリゴ糖鎖に対する少なくとも1つの化学修飾、すなわち酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその組合せを含む化学修飾、により組換えエリスロポエチンを修飾する工程をさらに含む。匹敵する目的のヘマトクリットを得るためにエリスロポエチン製品をrhuEPOより低いモル量にて投与することを含んでもよい。
1つの実施形態では、血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約20パーセント長い。もう１つの実施形態では、血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約40パーセント長い。
本発明はまた、少なくとも1種のエリスロポエチン誘導体（ここで、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖が酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその混合の結果として少なくとも1つの化学修飾を有し、かつ、そのエリスロポエチン製品の血清半減期がrhuEPOよりも長い）を含む人造エリスロポエチン製品にも関する。そのエリスロポエチン製品は、好ましくは、組織保護機能を有する。
1つの実施形態では、その少なくとも1つの化学修飾が、少なくとも１つのさらなる酸残基を与えるための少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖の酸化を含む。例えば、その少なくとも1つの化学修飾が、EPO製品の負電荷を増強するための少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖の硫酸化を含んでもよい。もう１つの実施形態では、その少なくとも1つの化学修飾が、EPO製品の負電荷を増強するための少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖のリン酸化を含む。さらにもう1つの実施形態では、その少なくとも1つの化学修飾が少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖の少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖への付加を含む。
本発明はまた、長い血清半減期と組織保護活性とを有するエリスロポエチン製品を調製する方法であって、少なくとも1種のエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体を準備する工程、およびその少なくとも１種の内因性エリスロポエチンまたは組換えエリスロポエチンの少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖を酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその組合せにより修飾する工程を含む方法にも関する。
修飾する工程が、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖上の少なくとも1つの隣接する(vicinal)ヒドロキシルを少なくとも1つの酸残基と置き換える工程をさらに含んでもよい。1つの実施形態では、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖上の少なくとも1つの隣接するヒドロキシルを少なくとも1つの酸残基と置き換える工程が、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖上の複数の隣接するヒドロキシルを複数の酸残基と置き換えることをさらに含む。
もう１つの実施形態では、修飾する工程が、有機溶媒を準備する工程、そのエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体を有機溶媒に溶かして溶液を作る工程、少なくとも１種の縮合剤を準備する工程、少なくとも１種の硫酸供与体を準備する工程、およびその少なくとも１種の縮合剤とその少なくとも１種の硫酸供与体とをその溶液中で混合する工程をさらに含む。なおもう1つの実施形態では、修飾する工程が、有機溶媒を準備する工程、そのエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体をその有機溶媒に溶かして溶液を作る工程、少なくとも１種の縮合剤を準備する工程、リン酸を準備する工程、および少なくとも１種の縮合剤と少なくとも１種のリン酸とをその溶液中で混合する工程をさらに含む。
さらにもう1つの実施形態では、修飾する工程が、有機溶媒を準備する工程、そのエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体をその有機溶媒に溶かして第1溶液を作る工程、少なくとも１種の酸化剤を準備する工程、その少なくとも１種の酸化剤を第1溶液に添加して第2溶液を作る工程、少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖を準備する工程、およびその少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖を第2溶液に混ぜる工程をさらに含む。少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖を準備する工程が、少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖に、その鎖の末端にて、少なくとも１つの第1級アミノ部分を付与することを含んでもよい。
本発明はまた、組織損傷の危険性がある患者における貧血を治療する方法であって、エリスロポエチン製品に、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖またはO結合オリゴ糖鎖に対する少なくとも1つの化学修飾（ここで、その化学修飾が酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化、またはその組合せを含む）を付与する工程、治療上有効な量のエリスロポエチン製品を投与する工程（ここで、そのエリスロポエチン製品が匹敵する目的のヘマトクリットを得るためにrhuEPOより低いモル量にて投与される）を含む、ここで、そのエリスロポエチン製品が組織保護機能を有する、方法にも関する。
本発明のこの態様において、エリスロポエチン製品の血清半減期がrhuEPOよりも長いことが好ましい。1つの実施形態では、血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約20パーセント長い。もう１つの実施形態では、血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約40パーセント長い。
本発明はさらに、治療上有効な量の少なくとも1種のエリスロポエチン誘導体（ここで、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖が酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその混合の結果として少なくとも1つの化学修飾を有する）を含む、ここで、その少なくとも1種のエリスロポエチン誘導体の血清半減期が組換えエリスロポエチンよりも長く、かつ、その誘導体が組織保護機能を有する、医薬組成物に関する。1つの実施形態では、その医薬組成物が少なくとも1種の製薬上許容される担体をさらに含む。その少なくとも1種の製薬上許容される担体が少なくとも1種の希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビヒクル、またはその混合物を含んでもよい。
もう１つの実施形態では、その医薬組成物が少なくとも1つの湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、またはその組合せをさらに含む。なおもう1つの実施形態では、その医薬組成物が少なくとも1種の組織保護サイトカインをさらに含む。
図面の簡単な説明
本発明のさらなる特徴および利点は、以下に記述する図面とともに与える以下の詳細な説明によりさらによく理解されよう。
(後述の「図面の簡単な説明」を参照のこと。)
発明の詳細な説明
本発明は、内因性EPOの機能が維持されるように、炭水化物鎖が化学修飾されている、血清半減期の長い（長期作用性）EPO分子の使用に関する。背景技術で述べたように、EPOの半減期を延ばそうとする取り組みは、一般に、ガラクトース鎖を曝露から保護するため追加炭水化物鎖のEPO分子への付加に的を絞ったものであった。しかしながら、付加された炭水化物鎖がEPO類似体の機能をもたらすと考えられているが、例えば、より長い半減期を達成するためにその機能が弱められるというものである。赤血球産生活性を有する組換えEPOよりも半減期が長い既知のEPO類似体は存在するが、これらの類似体は、最近見つけられたEPOの他の治療上の利益、例えば、組織保護活性、を保有していない。
例えば、アミノ酸30〜47に対応するEPOの17アミノ酸断片は、O'Brienペプチドとも呼ばれており、in vitroでは組織保護活性を示すがin vitroでは赤血球産生活性がないことが分かっている。Campana, W. M., Misasi, R. & O'Brien, J. S., Int. J. Mol. Med., 1, 235-41 (1998). そのため、O'Brienペプチド内にグリコシル化部位が追加された修飾型EPO分子は、他のin vitroアッセイにおいては組織保護活性がないこともあると考えられる。さらに、EPO分子の三次元配置が該機能にとって重要であるため、グリコシル化部位の分子への追加が全機能を妨げることになるかもしれない。
よって、本発明は、赤血球産生活性、組織保護活性、トランスサイトーシス能力の少なくとも１つ、またはその組合せを有する長期作用性EPOに関する。好ましくは、本発明の長期作用性EPOが赤血球産生活性と組織保護活性またはトランスサイトーシス能力の少なくとも１つを有する。
1つの実施形態では、本発明の長期作用性EPOが、組換えEPOの血清半減期よりも少なくとも約20パーセント長い血清半減期を有する。もう１つの実施形態では、本発明の長期作用性EPOの血清半減期が、組換えEPOの半減期よりも少なくとも約30パーセント長い。さらにもう1つの実施形態では、本発明の長期作用性EPOが、組換えEPOの血清半減期よりも少なくとも約40パーセント長い血清半減期を有する。
要するに、本発明の長期作用性EPO類としては、天然（内因性）EPOと比べて、好ましくは、天然のヒトEPOと比べて、少なくとも１つの修飾によって改変されている炭水化物鎖を有するEPO分子を含む。1つの実施形態では、本発明の長期作用性EPO類が炭水化物鎖に対して複数の修飾を受けている。
1つの実施形態では、天然EPOの炭水化物鎖の隣接するヒドロキシルが酸残基へと酸化されて、本発明の長期作用性EPO分子が生成する。もう１つの実施形態では、EPOのシアル酸残基がそれほど不安定でない酸残基と置き換えられる。なおもう1つの実施形態では、EPOの炭水化物鎖の硫酸化および／またはリン酸化によって、本発明の長期作用性EPOが得られる。さらにもう1つの実施形態では、本発明の長期作用性EPOが、ポリエチレングリコールのEPOの炭水化物鎖への付加によって得られる。また、上述の修飾のあらゆる組合せも本発明により意図されている。さらに、上述のように、本発明は、上述の長期作用性EPO分子の１種以上を含む、医薬組成物をはじめとする組成物も包含する。
本発明の長期作用性EPO分子は、貧血および関連疾患、特に、病気、例えば、限定されるものではないが、急性腎不全、敗血症、HIV、化学療法などによる合併症を伴うもの、を治療するための医薬組成物へ含有させることが意図されている。
本発明はまた、貧血および関連疾患を治療する方法、ならびに治療手法に用いるキットにも向けられる。本明細書において、「治療」とは、治療的処置および予防的(prophylactic or preventative)処置の両方を指し、ここで、その目的は対象となる病的状態または疾病を予防するか、または遅らせる（軽減する）ことである。治療を必要とする者としては、すでにその疾病を患っている者、ならびにその疾病を患いやすい者またはその疾病を予防しようとする者が挙げられる。本発明は、長期投与、急性期治療および／または間欠投与のための長期作用性EPO類の使用を意図する。本開示内容においては、「長期投与」とは、緊急的な投与ではなく、最初の治療効果（活性）を長期間維持するための連続的な薬剤の投与を指し、「間欠投与」とは、中断することなく連続して行われる処置ではなく、むしろ事実上周期的な処置である。
本発明の長期作用性EPO類およびその使用はどんな哺乳類にも適用できる。本明細書において、「哺乳類」とは、ヒト、食用および農業用家畜、ならびに動物園の動物、スポーツ動物または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む、哺乳類として分類されるあらゆる動物を指す。好ましくは、哺乳類がヒトである。本発明の長期作用性EPO類の投与としては、限定されるものではないが、経口投与、静脈内投与、経鼻投与、局所投与、腔内投与、吸入または非経口投与が挙げられ、後者のものとしては、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹膜内、粘膜下、皮内、およびその組合せを含む。
本発明はさらに、本発明の長期作用性EPO分子の、EPO受容体を有する身体の部位への他の分子の担体としての使用に関する。例えば、特定の分子は血液脳関門を通過しにくいため、これらの分子を本発明の長期作用性EPO類と結合することによって、これらの分子の脳への安全かつ効果的な輸送系を提供する。さらに、後でより詳細に論述するように、網膜、心臓および肺などの身体の他の部位はEPO受容体を発現するため、本発明の長期作用性EPO分子がこのような部位を通過しにくい分子の輸送系の役割を果たし得る。
さらに、本発明は、特定のEPOが内因性EPOの機能を維持しているかどうかを判定するためのアッセイに関する。例えば、本発明のアッセイは、修飾型EPOが組織を保護するもの、すなわち、内因性EPOに関するアゴニストであるかどうかを判定し得る。本明細書において、「アゴニスト」とは、広義に用いられ、天然EPOの生物学的活性に類似した分子を含む。同様に、「アンタゴニスト」も広義に用いられ、天然EPOの生物学的活性を部分的または完全にブロックするか、抑制するか、または中和するあらゆる分子を含む。1つの実施形態では、特定のEPOの試験がP19細胞および／またはラット運動ニューロンアッセイなどのin vitroアッセイにおいて行われる。もう１つの実施形態では、本発明のアッセイが、ラット限局性虚血モデル、ラット網膜虚血モデル、脊髄損傷モデルおよびビククリン発作モデルなどの種々のアッセイを用いたin vivoの特定EPOの評価を含む。
機能性
背景技術の節で論述したように、EPOの半減期を延ばそうとする様々な試みは、EPO類似体がより長い半減期を有し、かつ、赤血球産生活性を維持しているという点において成功であった。さらに、論述したように、半減期の長いEPO類似体は、主として、追加炭水化物鎖がアミノ酸配列に付加されているEPO分子を含むものであった。しかしながら、これらの追加炭水化物鎖がEPOの他の治療上の利益、例えば、その分子の組織保護機能およびトランスサイトーシス能力を妨げ得ると思われる。特定の理論にとらわれずに、O'Brienペプチド内に追加される炭水化物鎖の位置は、組織保護機能に関してのこのペプチドの重要性に基づいて機能性に影響を及ぼし得る。さらに、追加される炭水化物鎖は、O'Brienペプチド内、O'Brienペプチド外を問わず、分子の三次元配置に影響を及ぼすと思われる。例えば、分子の三次元構造において、追加された炭水化物鎖がその機能に不可欠な分子の領域をブロックする可能性がある。さらに、グリコシル化（または炭水化物鎖の追加）方法も糖タンパク質の機能に影響を及ぼし得ると思われる。
組織保護能力
追加炭水化物鎖が糖タンパク質の機能に影響を及ぼす可能性を評価するため、本発明者らは5つのN結合炭水化物鎖を有するEPO類似体の形態を調査した（組換えEPOの3つのN結合炭水化物鎖と比較）。特に、本発明者らは、組換えEPO（エポエチン・アルファ)よりも約3倍長い半減期を与える、32アミノ酸における追加グリコシル化部位を有するEPO類似体を使用した。
全身投与後、そのEPO類似体は脳脊髄液内に現れた（図1A）が、その後のP19 in vitroアッセイで評価すると、驚くべきことにこれは組織を保護するものではなかった（図1B）。このような組織保護活性の欠如は予想外であった。さらに、貧血患者における治療に用いる場合、それらの患者が組織保護能力を必要とするその他の症状を有するならば、組織保護活性が欠如していることで合併症が起こすかもしれない。例えば、非組織保護的EPO類似体が組織保護応答を引き起こす受容体に対して組織保護的内因性EPOと競合するならば、このようなEPO類似体の使用によって損傷による障害の程度が実質的には悪化するであろう。実際、このようなEPO類似体がもとで患者が卒中を起こしたならば、卒中によって生じる梗塞の体積はEPO類似体による治療を受けていない個体よりも実質的に大きいと思われる。
特定の理論にとらわれずに、この知見は、シグナル伝達が赤血球前駆体とは異なる神経組織には、機能上、少なくとも１つのさらなる種類のEPO受容体が存在し、特定のEPO類似体が内因性EPOのこの種類の受容体に対する結合能力をアンタゴナイズするかもしれないという危険性が伴うことを示唆している。内因性EPOとこれらのEPO類似体とで生物学的活性が明らかに異なっていることから、受容体のシグナル伝達がEPO分子の異なるドメインに反応する機能的に異なるEPO受容体を介して起こることが示唆される。実際には、EPO受容体遺伝子タンパク質配列が赤血球前駆細胞により発現されるものと同じであることが報告されているが、神経型受容体のin vitroにおけるEPOに対する結合親和性は前赤血球のEPO受容体よりもかなり低い。例えば、Masuda, S., ら, J Biol Chem, 268, 11208-16 (1993)を参照のこと。これらの違いはアクセサリータンパク質に起因すると思われ、赤血球成熟プログラムで活性化されたものとは異なるシグナル伝達経路が採用されることが分かる。興味深いことに、この親和性の違いはEPOの完全な脱グリコシル化によっても変わらず、神経活性結合がEPOの通常グリコシル化されていないABループ領域で起こるならば、予想外でもない結果であった。同文献。さらに、神経膠星状細胞により生成されるEPO（ニューロンなどの他の細胞によって生成されるものと同じ産物と思われる）もまた、腎臓で生成されるものよりも小さな種である。Masuda, S., J Bio Chem, 269, 19488-93 (1994)。その違いは、グリコシル化程度の差によるものと思われる。同文献。脱シアル酸化(desialiated)天然リガンドがこれらの既知の受容体タンパク質との親和性において違いがあるかどうかはまだ分かっていないが、関連性があることは明らかである。
EPO受容体は、EPO受容体を修飾するアクセサリータンパク質が存在するほか、末端切断型の可溶性受容体を含む多数の編集型が存在する複合遺伝子である。Yamaji, R., ら, Eur J Biochem, 239, 494-500; Yamaji, R., ら, Bichim Biophys Acta, 1403, 169-78 (1998); Barron, C., ら, Gene, 147, 263-8 (1994); Chin, K., ら, Brain Res Mol Brain Res, 81, 29-42 (2000); Fujita, M., ら, Lukemia, 11 Suppl 3, 444-5 (1997); Westenfelder, C., Biddle, D. L. & Baranowski, R. L., Kid. Internat., 55, 808-820 (1999). これらの型のいずれかもがEPOの神経作用を助けるかどうかもまだ分かっていない。
さらに、背景技術にて論述したように、O'Brienペプチドはin vitroでは組織保護活性を有するが、in vitroでは赤血球産生活性がないことが分かっている。実際、O'Brienペプチド内に炭水化物鎖が追加されたEPO類似体で実施したアッセイでそのEPO類似体が組織保護能力を欠いていることが証明された。この結果は、O’Brienペプチドに対する特定の修飾、例えば、炭水化物鎖の付加、がそのタンパク質の機能を妨げることを示唆している。O’Brienペプチドに対する修飾を有するEPO類似体は内因性EPOのEPO受容体への結合能力を部分的または完全にブロックするため、該EPO類似体は体内にある内因性EPOに対するアンタゴニストとして作用するようである。そうであるから、このようなEPO類似体の使用によって損傷による障害の程度が高まる危険性があると予測される。このように、O’Brienペプチドに対する修飾を有するEPO類似体は、ラット運動ニューロンアッセイなどの他のin vitroアッセイにおいて、ならびにラット限局性虚血アッセイ、ビククリン発作アッセイ、ラット網膜虚血アッセイおよび脊髄損傷アッセイなどのin vivoアッセイにおいても組織保護能力を欠いていると思われる。
受容体が媒介するトランスサイトーシス
上記と同じEPO類似体、すなわち、5つのN結合炭水化物鎖を有するEPO類似体（組換えEPOの3つのN結合炭水化物鎖と比較）を用いて、本発明者らはその類似体の血液脳関門を通過する能力を調査した。全身注射後、そのEPO類似体は脳脊髄液内に現れた（図1Aおよび1B）。特定の理論にとらわれずに、そのEPO類似体は、血液脳関門を形成している毛細血管がそのEPO受容体も発現し、また、該毛細血管が末梢循環から脳への受容体を介したトランスサイトーシスのための解剖学的基礎を与えることから、無傷の血液脳関門を通過できると思われる。そうであるから、全身投与された他のEPO類似体もまた、血液脳関門、ならびにEPO受容体を発現している毛細血管の他のバリアーを通過できると思われる。
要約して言えば、先行技術のEPO類似体は内因性EPOの少なくともいくつかの機能を犠牲にして赤血球産生活性を維持することが示されているため、当技術分野では内因性EPOの既知機能の全てを維持する長期作用性EPOが必要である。
有利には、本発明は、組換えEPOと比べて血清半減期を増大するだけでなく、内因性EPOの機能、すなわち組織保護機能およびトランスサイトーシス能力、も維持する本発明の長期作用性EPOに関する。このような有益なタンパク質を提供するためのEPOを修飾する種々の方法を次節で示す。
天然EPOの修飾
本発明の長期作用性EPO類は、種々の方法によって作製し得る。一般に、長期作用性EPO類は、EPOと結合された炭水化物（糖）鎖を化学修飾することによって得られる。本明細書において、「炭水化物鎖」とは、内因性EPOに見られるN結合およびO結合オリゴ糖鎖、EPO類似体に見られる追加N結合およびO結合オリゴ糖鎖、および他の炭水化物鎖、具体的に言えば、EPOと結合された糖鎖を指す。
1つの実施形態では、内因性EPOの組織保護能力への干渉を防ぐために、内因性または組換えEPOが修飾に使われる。さらに、O’Brienペプチド、すなわち30〜47アミノ酸配列、付近にグリコシル化部位の追加がない限り、EPO類似体が本発明の修飾に向けて意図される。本明細書において、「EPO類似体」とは、少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有する修飾型EPO分子を指す。1つの実施形態では、修飾に使われるEPO類似体が、O’Brienペプチドの約5アミノ酸内に追加グリコシル化部位を含まない。もう１つの実施形態では、EPO類似体が、O’Brienペプチドの約3アミノ酸内に追加グリコシル化部位を含まない。さらにもう1つの実施形態では、EPO類似体が、O’Brienペプチド内に追加グリコシル化部位を含まない。
その類似体を三次元空間で再検討して、O’Brienペプチドをブロックしないか、または組織保護機能を喪失させない追加炭水化物鎖がないことが確認される場合には、EPO類似体もまた、本発明の修飾に使われ得る。もう1つの態様において、グリコシル化方法がそのペプチドの組織保護機能を阻害しない限り、EPO類似体が本発明の修飾のために意図されている。さらにもう1つの態様において、O’Brienペプチド内に存在する炭水化物鎖が1つ（又はそれ以下）である限り、EPO類似体が本発明の修飾に使われ得る。例えば、内因性EPOが38アミノ酸に1炭水化物鎖を含有し、また、O’Brienペプチド内の追加炭水化物鎖がタンパク質の組織保護活性を阻害することが示されている。よって、O’Brienペプチド内に1炭水化物鎖を有するEPO類似体またはO’Brienペプチド内に炭水化物鎖を有さないEPO類似体が修飾用に意図されている。1つの実施形態では、38アミノ酸と結合した炭水化物鎖がそのタンパク質のどこか別の場所に配置転換され得る。
本発明の修飾の非限定的な例が、(1)隣接するヒドロキシルの酸化を通じて炭水化物鎖にさらなる酸残基を与えること、(2)シアル酸残基をそれほど不安定でない残基と置き換えること、(3)硫酸化および／またはリン酸化によりエリスロポエチンの負電荷を増強すること、ならびに／または(4)より複雑な分子によってそれらの炭水化物鎖を末端化することを含む。このように、EPOの炭水化物鎖の修飾としては、数ある手法の中でも、酸化、硫酸化、リン酸化および／またはペグ化を含み得る。これらの手法については、以下により詳細に記述し、また、予言的な実施例1でさらに例示する。
糖鎖の酸化およびシアル酸残基の置換
本発明の化学修飾型長期作用性EPOは、さらなる酸残基を与えるように炭水化物（糖）が酸化されているEPOを含んでよい。もう１つの実施形態では、シアル酸残基がそれほど不安定でない酸残基と置き換えられている。肝臓が関連タンパク質についてスクリーニングし、そのタンパク質を循環から除去するためのガラクトース鎖が検出から保護されるため、この種の修飾によって、その分子の半減期が内因性EPOと比べて延長されることになる。EPOの炭水化物鎖に対する化学修飾がより実質的なものであるほど、本発明の長期作用性EPO類の血清半減期がより長く延長される。例えば、より多くの隣接するヒドロキシルが酸に置き換えられると、血清半減期のより長い延長がなされる。
当業者ならば、エリスロポエチンのガラクトース単位を変換するためのいくつかの好適な方法を認識しているが、1つの好適な方法は、(1)隣接するヒドロキシルを有する糖分子を過ヨウ素酸塩により修飾してアルデヒドを形成すること、および(2)アルデヒドを酸化して酸を生成することを含む。糖鎖を酸化してアルデヒドを形成するのに好適な試薬は当業者に公知であり、また、それらの試薬としては、限定されるものではないが、過ヨウ素酸塩、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、および糖オキシダーゼ、例えば、ガラクトースオキシダーゼが挙げられる。さらに、当業者ならば、アルデヒドの変換に好適な試薬、例えば、定量ベネジクト液（Fisherから商業的に入手可能）についても理解しているであろう。1つの実施形態では、糖分子を過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化し、アルデヒドを酸へと変換する定量ベネジクト液(Fisher)でさらに処理する。
もう１つの実施形態では、EPO異性体、約0〜13シアル酸残基を有するもの、またはシアル酸残基を含まない少なくとも１つの炭水化物鎖を有するEPO類似体を、ガラクトースオキシダーゼを用いて酸化に付す。アシアロ型EPO、すなわち、α型またはβ型EPOから末端の炭水化物（シアル酸）が除去されたものを、本発明のこの態様に従って使用してもよい。好ましくは、アシアロエリスロポエチンを使用する。一度酸化すれば、EPOを別の酸化剤、例えば、アルデヒドを酸へと変換する定量ベネジクト液に付す。
なおもう1つの実施形態では、四酸化ルテニウム系を用いて糖鎖において酸を生成してもよい。これらの修飾がガラクトース鎖と関係するものであることを考えれば、たとえこれらの変換に関与する酸がEPO分子から失われても、肝臓がスクリーニングする構成要素であるガラクトース鎖が露出しないため、その分子は肝臓による除去を回避できるはずである。
負電荷の増強
本発明のもう1つの態様において、本発明の長期作用性EPOは、硫酸塩および／またはリン酸塩をEPO分子に添加することにより作製され、そのEPO分子は分子の負電荷が増強することで、分子の半減期が延びる。言い換えれば、EPO分子の負電荷は、タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカンおよびステロイドをはじめとする硫酸供与体からのスルフリル基の移動を伴う硫酸化により増強され得る。さらに、その負電荷は、炭水化物へのリン酸基の導入によっても増強され得る。
インスリンの硫酸化に好適な1つの方法が、S. Pongor ら, Preparation of High-Potency, Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diabetes, 第32巻, No. 12, 1983年12月にて論述されている。例えば、インスリンの硫酸化は、ジメチルホルムアミド(DMF)などの有機溶媒中、N, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)などの縮合剤と硫酸供与体の存在下で実施された。硫酸化の程度は、縮合剤の量を変えることにより8倍の範囲にわたって制御することができる。従来どおりに調製された硫酸化インスリンは、主要なインスリンの生物活性が失われたが、Pongerの方法により作製された硫酸化インスリンの生物活性は非修飾型インスリンの78パーセント〜87パーセント間で変動した。
EPOに対して同様の手法を用いることにより、当業者は硫酸化の量を制御し得、その結果、化学修飾したEPOの血清半減期を制御し得る。例えば、EPOの負電荷を、EPOまたはEPO類似体を少なくとも１種の水溶性カルボジイミド、好ましくは、DCCに約4℃の温度にて溶かすことにより、タンパク質に硫酸塩を添加して増強してもよい。硫酸供与体としてはDCCが好ましいが、当業者ならば、本発明に用いられる他の好適な硫酸供与体についても容易に認識するであろう。
同様の手法を用いて、リン酸供与体としてリン酸(H3PO4)を用いるEPOのリン酸化を制御することができる。また、リン酸が好ましいが、当業者ならば、EPOのリン酸化を達成する他のリン酸供与体を容易に選択することができるであろう。
PEGでの炭水化物鎖の末端化
EPOの炭水化物鎖はまた、以下の一般式：
Figure 2006511468
を有する、長く安全な臨床史を有する化合物である、少なくとも1種のポリエチレングリコール(PEG)の付加により修飾してもよい。
PEGが以下の一般式：
Figure 2006511468
を有するメトキシPEG(mPEG)であってもよい。
1つの実施形態では、PEGがアミノPEGであり、好ましくは、末端に第1級アミノ基を有するメトキシPEG(mPEG-NH2)である。末端に第1級アミノ基を有するポリエチレングリコール鎖は、非常に有用な官能化ポリマーである。mPEG-NH2のアミノ末端基は、従来のPEGに存在するヒドロキシル基よりもアシル化剤とよく反応し、それらは容易に還元的アミノ化反応を受ける。もう１つの実施形態では、PEGが親電子的に活性化されたPEG、例えば、いずれもNektar Therapeutics of Birmingham, Alabamaから商業的に入手可能であるmPEG-プロピオン酸スクシンイミジル(mPEG-SPA)またはmPEG-ブタン酸スクシンイミジル(mPEG-SBA)である。なおもう1つの実施形態では、PEGがメトキシPEG-ヒドラジドである。
1つの実施形態では、その少なくとも１種のPEGの付加は、過ヨウ素酸塩による酸化（上で開示）、続いて、シアノホウ水素化物とアミノPEGの使用を介して行われる。例えば、溶液中のEPOを、まず、過ヨウ素酸塩、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、室温にて所定時間酸化し、炭水化物鎖においてアルデヒドを得る。好適な過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、これはSigmaから商業的に入手可能である。その後、過ヨウ素酸塩をバッファー交換により除去し、その時点で、EPOのN結合オリゴ糖基の酸化されたシアル酸基をシアノホウ水素化物の存在下で少なくとも１種のアミノPEGに付す。使用に好適なPEGとしては、限定されるものではないが、Nektar Therapeuticsから商業的に入手可能であるメトキシ-PEG-ヒドラジドが挙げられる。
もう１つの実施形態では、その少なくとも１種のPEGの付加は、ガラクトースオキシダーゼによる酸化後にPEG基を末端ガラクトース残基と結合することにより行われる。例えば、バッファー中のアシアロ型EPO（末端ガラクトース残基が露出している）を、まず、ガラクトースオキシダーゼ（Sigmaから商業的に入手可能である）に付して炭水化物鎖においてアルデヒドを得る。その後、バッファーをバッファー交換により除去し、その時点で、酸化されたガラクトース残基をシアノホウ水素化物の存在下で少なくとも１種のアミノPEGに付してもよい。
上で示した方法は、これらまたはその他の方法を限定するものではなく、本発明の化合物の調製に使用し得る。例えば、当業者ならば、持続性型の他のEPO誘導体、例えば、それらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開番号WO/02053580ならびに米国特許公開番号2002/0086816および2003/0072737に開示されている組織保護サイトカイン、の作製に対するこれらの化学修飾の適用可能性を認識するであろう。
EPO分子の製造
種々の宿主発現ベクター系を利用して、本発明の長期作用性EPOおよびEPO関連分子を製造し得る。このような宿主発現系は、目的の長期作用性EPO類を作製し、その後、精製するためのベヒクルであるが、好適なヌクレオチドコード配列で形質転換したか、またはトランスフェクトしたときに、in situで修飾型エリスロポエチン遺伝子産物を提示し得る細胞でもある。これらの系としては、限定されるものではないが、細菌、昆虫、植物、ヒト宿主系を含む哺乳類、例えば、限定されるものではないが、長期作用性EPO製品コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）に感染したか、もしくはエリスロポエチン関連分子コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ti プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーター、もしくは哺乳類ウイルス由来のプロモーター、例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス 7. 5K プロモーターを含む組換え発現構築物を収容する、ヒト細胞系、例えば、HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3を含む哺乳類細胞系が挙げられる。
さらに、挿入配列の発現をモジュレートするか、または遺伝子産物を所望の特異な様式で修飾し、プロセシングする宿主細胞株が選択してもよい。タンパク質産物のこのような修飾およびプロセシングは、タンパク質の機能にとって重要なことである。当業者には公知のように、異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実に行われるように、好適な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的を達するために、一次転写物の適正なプロセシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化に関する細胞機構を有する真核生物の宿主細胞を用い得る。ヒト宿主細胞を含む、このような哺乳類宿主細胞としては、限定されるものではないが、HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3およびWI38が挙げられる。
組換えタンパク質の長期にわたる大量生産には、安定した発現が好ましい。例えば、組換え組織保護サイトカイン関連分子遺伝子産物を安定して発現する細胞系を操作してもよい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主細胞を、好適な発現制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などによって制御されるDNAおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作した細胞を富栄養培地で1〜2日間増殖させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定して組み込み、増殖してフォーカスを形成することを可能にする。そのフォーカスをクローニングし、増殖させて、細胞系とすることができる。この方法は、EPO突然変異タンパク質（ムテイン）関連分子遺伝子産物を発現する細胞系の操作に用いることが有利である。このように操作された細胞系は、EPO関連分子遺伝子産物の内因性活性に作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であろう。
あるいは、細胞系または微生物内の内因性EPO突然変異タンパク質遺伝子に特徴的な発現を、挿入された調節エレメントが内因性エリスロポエチン突然変異タンパク質遺伝子に機能しうる形で結合されるように、異種DNA調節エレメントを安定な細胞系またはクローニングされた微生物のゲノムに挿入することにより改変してもよい。例えば、通常は「転写に関してサイレント」である内因性EPO突然変異タンパク質遺伝子、すなわち、細胞系において通常は発現されないか、または非常に低いレベルでしか発現されないEPO遺伝子を、発現される遺伝子産物の発現を促進することができる調節エレメントをその細胞系または微生物内に挿入することにより活性化してもよい。あるいは、転写に関してサイレントである内因性EPO遺伝子を、細胞型を越えて機能する無差別の(promiscuous)調節エレメントを挿入することにより活性化してもよい。
異種調節エレメントは、当業者には周知であり、また、それらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、仏国特許第2646438号、米国特許第4,215,051号および第5,578,461号ならびに国際公開番号W093/09222およびW091/06667にも記述されている、標的相同組換えなどの技術を用いて、それが内因性エリスロポエチン遺伝子に機能しうる形で結合されるように、安定な細胞系またはクローニングされた微生物に挿入され得る。
医薬組成物
本発明はまた、本発明の長期作用性EPO分子を含む医薬組成物にも関する。本発明の長期作用性EPO類が、有利に、赤血球産生活性、ならびに組織保護能力およびトランスサイトーシス能力を有することから、それらは卒中および心筋梗塞などの種々の組織障害の危険性もある個体における貧血および関連疾患の治療用に意図される。さらに、本発明の長期作用性EPO類は、知的能力の減退、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病など、も起こしている個体における貧血および関連疾患の治療用に意図される。さらに、本発明の長期作用性EPO類は、正常な老化プロセスによって起こる状態、例えば、転倒や打撲しやすいなどにつながる体の平衡の問題を抱える個体における貧血の治療用に意図される。さらに、本発明は、本発明の長期作用性EPO類の、EPO受容体を有する毛細血管のバリアーを通過しにくい他の分子の担体としての使用に関する。
例えば、上で論述した長期作用性EPO類のいずれも本発明の医薬組成物に含め得る。さらに、種々のEPO類似体を、下でより詳細に論述する少なくとも1種の組織保護サイトカインとブレンドして、本発明の医薬組成物に含めてもよい。
本発明の医薬組成物は、治療上有効な量の修飾型EPOを、好ましくは、精製形態で含む。製剤は投与様式に合わせる必要がある。言い換えれば、本発明の医薬組成物は、適正な投与量および方針が採用されたならば、対象となる状態が治療可能であるように、本発明の修飾型EPOをある量で含む。さらに、下でより詳細に論述するように、医薬組成物は毒性のない投与量で送達されるべきである。
本発明の医薬組成物は、患者に適切に投与するための形態を与えるために、治療上有効な量の長期作用性EPO化合物と好適な量の製薬上許容される担体を含み得る。特定の実施形態では、「製薬上許容される」とは、動物、特にヒトでの使用に向けて連邦政府または州政府の監督官庁の認可を受けているか、または米国薬局方または他の一般に認識されている外国の薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」とは、治療用物質が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、滅菌液、例えば、水中の生理食塩液、および石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油などを含む油中の生理食塩溶液であってよい。医薬組成物を静脈内投与する場合には、生理食塩溶液が好ましい担体である。また、生理食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として、特に、注射可能溶液用に使用することができる。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
また、本発明の医薬組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、エマルション剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形をとることができる。
本発明の化合物は、中性または塩形態として製剤することができる。製薬上許容される塩としては、遊離アミノ基とともに形成されたもの、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたもの、ならびに、遊離カルボキシル基とともに形成されたもの、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものが挙げられる。
長期作用性EPOを含む組成物
上で簡潔に記述したように、本発明の長期作用性EPO類のいずれもが医薬組成物用に意図される。1つの実施形態では、隣接するヒドロキシルの酸化によって生成された長期作用性EPOが、本発明の医薬組成物に含められる。もう１つの実施形態では、本発明の医薬組成物が、シアル酸残基をあまり不安定でない残基と置き換えることによって得られた少なくとも１種の長期作用性EPOを含む。なおもう1つの実施形態では、医薬組成物に含める長期作用性EPOが、硫酸化および／またはリン酸化によってEPOの負電荷を増強することによって得られたものである。さらにもう1つの実施形態では、炭水化物鎖をより複雑な分子、例えば、PEG鎖で末端化することによって生成された長期作用性EPOが、本発明の医薬組成物に含められる。
さらに、本発明は、本発明の医薬組成物における本発明のいずれかの方法によって生成された長期作用性EPO類の混合物の使用を意図する。例えば、本発明の医薬組成物が、シアル酸残基をあまり不安定でない残基と置き換えることによって得られた少なくとも１種の長期作用性EPOと硫酸化および／またはリン酸化によってEPOの負電荷を増強することによって得られた少なくとも１種の長期作用性EPOを含んでもよい。
輸送系
上に記載したように、本発明の長期作用性EPO類は、有利に、EPO受容体を有する毛細血管のバリアーを通過することができる。よって、本発明のもう1つの態様が、本発明の長期作用性EPO類を、EPO受容体を有する身体の目的の部位へのバリアー通過が難しい分子の担体として使用する輸送系である。このような輸送系が、有利に、無傷のバリアーを超えて送達する新規でかつ安全な方法を提供する。
1つの実施形態では、輸送系が本発明の長期作用性EPO類と無傷の血液脳関門を超えて送達する新規でかつ安全な方法を提供するための、脳に侵入しにくい少なくとも１種の分子を含む。言い換えれば、小分子もしくは大分子の診断用薬または治療分子の脳摂取を高めるために、本発明の長期作用性EPO類が、脳に侵入しにくい分子を分子の「トロイの木馬」として作用させうる。
実際には、ヒト脳腫瘍の治療における重大な問題が、治療薬を脳の特定の領域に送達し、それらが内部に行き渡り、それらを脳腫瘍へターゲッティングする必要性から生じる。そうでなければ、診断法および治療法に有効である可能性がある分子は、腫瘍近傍の脳内の血液脳関門(BBB)を通過しないか、または十分な量では血液腫瘍関門(BTB)を通過しない。そのため、脳に特有であり、かつ、脈管構造をバイパスする新規な送達戦略が必要である。例えば、診断または治療分子のいずれかとして使用できる抗体は、それらの大きさから有効に作用するのに十分な量ではBTBを通過しない。そうであるから、本発明の長期作用性EPO類を、BBBまたはBTBの通過を可能にするために、このような分子の担体として使用してもよい。本発明の長期作用性EPO類とともに使用し得る分子の1つの例が、一般に、発癌性シグナルを抑制するか、またはin vivoでの脳の遺伝子発現を画像化するために用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに、本発明の長期作用性EPO類を、多くは、大きすぎて、助けなしではBTBを通過することができない種々の遺伝子療法（ウイルスまたは非ウイルス製剤）に含めてもよい。
さらに、本発明の長期作用性EPO類を、種々の化学療法薬についての担体を介する輸送体として使用してもよい。BBBおよびBTBで発現される薬物-活性な流出輸送体が化学療法薬を脳から血液へと活発に流出するため、これらの薬剤が脳内で行き渡るのが抑制されるか、または妨げられる。中枢神経系(CNS)外の癌を治療するのに用いられてきた古典的化学療法分子の多くが脳腫瘍の治療に効果がないのは1つにはこれらの理由による。よって、本発明の長期作用性EPOのこのような化学療法薬の担体としての使用が、薬剤の脳への運搬だけでなく、治療のための脳内での薬剤の保持においても有用であり得る。もう１つの実施形態では、長期作用性EPOを、通常、脳から血液へと流出する化学療法薬をさらに確実に取り込むために、活性な流出輸送体を阻害する薬物と合わせてもよい。
さらに、本発明はまた、修飾型EPOのEPO受容体を有する身体の他の部位へと侵入しにくい分子の担体としての使用も意図する。このような細胞の限定されない例としては、網膜細胞、筋細胞、心臓細胞、肺細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、小腸細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、毛細血管内皮細胞、精巣細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、骨細胞、皮膚細胞および子宮内膜細胞が挙げられる。特に、応答性細胞としては、限定されるものではないが、神経細胞；網膜細胞：光受容体（桿状体および錐体）細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、無軸索細胞およびミュラー細胞；筋細胞；心臓細胞：心筋細胞、ペースメーカー細胞、洞房結節(sinoatrial node)細胞、洞房結節(sinoatrial node)細胞、洞房結節(sinus node)細胞および接合部組織細胞（房室結節およびヒス束）；肺細胞；肝臓細胞：肝細胞、星細胞およびクッパー細胞；腎臓細胞：メサンギウム細胞、腎上皮細胞および尿細管間質細胞；小腸細胞：杯細胞、腸腺（腸陰窩）細胞および腸内内分泌細胞細胞；副腎皮質細胞：球状帯細胞、索状層細胞および網状帯細胞；副腎髄質細胞：クロム親和細胞；毛細血管細胞：周皮細胞細胞；精巣細胞：ライディヒ細胞、セルトリ細胞および精子細胞ならびにそれらの前駆体；卵巣細胞:グラーフ卵胞細胞および原始卵胞細胞；膵臓細胞：ランゲルハンス島細胞、α-細胞、β-細胞、γ-細胞およびF-細胞；骨細胞：骨前駆体、破骨細胞および骨芽細胞；皮膚細胞；子宮内膜細胞：子宮内膜間質細胞および子宮内膜細胞；ならびに上述の器官に存在する幹細胞および内皮細胞が挙げられる。
EPO類似体および組織保護サイトカインの組成物ブレンド
上で簡潔に記述したように、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有するEPO類似体（血清半減期は長いが、組織保護活性がない）を、少なくとも1種の組織保護サイトカインとブレンドして含んでよい。例えば、少なくとも2つの追加N結合炭水化物鎖（ここで、追加炭水化物鎖の1つがO’Brienペプチド内に位置する）を有するEPO類似体を組織保護サイトカインと組み合わせて、本発明の組成物としてもよい。もう１つの実施形態では、本発明の医薬組成物が、少なくとも1種の組織保護サイトカインと、三次元空間での再検討により、O’Brienペプチドをブロックすることが分かっている、追加炭水化物鎖を含む少なくとも１種のEPO類似体を含んでよい。なおもう1つの実施形態では、本発明の医薬組成物が、少なくとも1種の組織保護サイトカインと、タンパク質への追加炭水化物鎖の付加方法の結果として組織保護機能がない、少なくとも1種のEPO類似体を含む。
配置転換されたグリコシル化部位を有するEPO類似体が、本発明の医薬組成物での使用のために意図される。特定の理論にとらわれずに、天然に存在するアミノ酸38のグリコシル化部位が、EPO類似体の、30〜47アミノ酸セグメントを除いた、他の場所に配置転換される場合には、EPO類似体の組織保護能力がアミノ酸38にグリコシル化部位を有するEPO類似体と比べて増強されると思われる。よって、本発明の医薬組成物が、グリコシル化部位が38アミノ酸からその分子の他の場所に配置転換されたEPO類似体を含んでよい。PCT公開番号WO 01/81405に示されているように、配置転換されたグリコシル化部位は、アミノ酸51、57、69、88、89、136または138に起こり得る。1つの実施形態では、O’Brienペプチドが1以下の炭水化物鎖を含有する。別の実施形態では、O’Brienペプチドが2以上の炭水化物鎖を含有する。
本発明のこの態様での使用に好適な組織保護サイトカインは、好ましくは、骨髄への影響がなく、内因性の組織保護作用を維持するサイトカインであるが、組織保護能力を示す全てのサイトカインが本発明での使用に意図される。例えば、好適な組織保護サイトカインとしては、グアニジン化、アミジン化、カルバミル化（カルバモイル化）、トリニトロフェニル化、アシル化（アセチル化またはスクシニル化）、硝化、またはその混合によって得られる化学修飾型EPOが挙げられる。さらに、少なくとも１つのアルギニン、リジン、チロシン、トリプトファンもしくはシステイン残基またはカルボキシル基が修飾されたEPO分子もまた、本発明のこの態様による組織保護サイトカインとしての使用に意図される。
さらに、本発明で使用するさらなる組織保護サイトカインは、その全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Satake ら, 1990, Biochim. Biophys. Acta 1038: 125-9で開示されているような分子生物学的技術による限定タンパク質分解、アミノ基の除去および／またはアルギニン、リジン、チロシン、トリプトファンもしくはシステイン残基の突然変異置換によって得てもよい。例えば、好適な組織保護サイトカインとしては、C7S、R1OI、V11S、L12A、E13A、R14A、R14B、R14E、R14Q、Y15A、Y15F、Y15I、K20A、K20E、E21A、C29S、C29Y、C33S、C33Y、P42N、T44I、K45A、K45D、V46A、N47A、F48A、F48I、Y49A、Y49S、W51F、W51N、Q59N、E62T、L67S、L70A、D96R、S100R、S100E、S100A、S100T、G101A、G101I、L102A、R103A、S104A、S104I、L105A、T106A、T106I、T107A、T107L、L108K、L108A、S126A、F142I、R143A、S146A、N147K、N147A、F148Y、L149A、R150A、G151A、K152A、L153A、L155A、C160S、I6A、C7A、B13A、N24K、A30N、H32T、N38K、N83K、P42A、D43A、K52A、K97A、K116A、T132A、I133A、T134A、K140A、P148A、R150B、G151A、K152W、K154A、G158A、C161Aおよび／またはR162Aに部位突然変異を有する少なくとも１種以上の突然変異型EPOが挙げられる。上述の修飾の例は、それらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる同時係属の米国特許公開番号2003/0104988、2002/0086816および2003/0072737に記述されている。本明細書において記載する突然変異タンパク質の命名法では、変化したアミノ酸が、最初に、天然アミノ酸の一文字コード、その後、EPO分子におけるその位置を付け、続いて、置換アミノ酸の一文字コードを付けて表される。例えば、「S100E」とは、アミノ酸100においてセリンがグルタミン酸に変化しているヒトEPO分子を指す。
もう１つの実施形態では、部位突然変異がI6A、C7A、K20A、P42A、D43A、K45D、K45A、F48A、Y49A、K52A、K49A、S100B、R103A、K116A、T132A、I133A、K140A、N147K、N147A、R150A、R150E、G151A、K152A、K154A、G158A、C161AまたはR162Aを含んでいないならば、組織保護サイトカインが上述の部位突然変異の１以上を含んでよい。
さらにもう1つの実施形態では、組織保護サイトカインが、K45D/S1OOE、A30N/H32T、K45D/R150E、R103E/L108S、K140A/K52A、K140A/K52A/K45A、K97A/K152A、K97A/K152A/K45A、K97A/K152A/K45A/K52A、K97A/K152A/K45A/K52A/K140A、K97A/K152A/K45A/K52A/K140A/K154A、N24K/N38K/N83KおよびN24K/Y15Aなどの部位突然変異の組合せを含んでよい。なおもう1つの実施形態では、組織保護サイトカインが上述の組合せを含んでいない。もう１つの実施形態では、部位突然変異が以下の置換組合せ：N24K/N38K/N83Kおよび／またはA30N/H32Tを含んでいないならば、組織保護サイトカインが上述の部位突然変異のいずれかを含んでよい。
特定の修飾または修飾の組合せが、突然変異タンパク質（ムテイン）の、その受容体、例えば、EPO受容体または二次受容体への結合能力の柔軟性に影響を及ぼす可能性がある。このような修飾または修飾の組合せの例としては、限定されるものではないが、K152W、R14A/Y15A、I6A、C7A、D43A、P42A、F48A、Y49A、T132A、I133A、T134A、N147A、P148A、R150A、G151A、G158A、C161AおよびR162Aが挙げられる。対応する突然変異がヒト成長ホルモンにおいて悪影響をもたらすことは当業者には公知である。よって、1つの実施形態では、組織保護サイトカインが、突然変異タンパク質の、その受容体への結合能力の柔軟性に影響を及ぼし得る１以上の修飾または修飾の組合せを含んでいない。このような組織保護サイトカインのさらなる議論は、その全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、2003年7月1日提出の「応答性細胞、組織および器官の保護、回復および強化に向けた組換え組織保護サイトカインおよびそれをコードする核酸(Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic Acids Thereof for Protection, Restoration, and Enhancement of Responsive Cells, Tissues, and Organs,)」と題する、同時係属の米国特許出願番号_、代理人整理番号10165-022-999に示されている。
最後に、組織保護能力を示すスーパーファミリーサイトカインが長期作用性EPOの赤血球産生作用または血清半減期の障害とならない限り、それらも同様に使用し得る。例としては、限定されるものではないが、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-5(IL-5)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、色素上皮由来因子(PEDF)および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)が挙げられる。
本発明のもう1つの態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有するEPO類似体（血清半減期は長いが、組織保護活性がない）を、組織保護機能を示す少なくとも1種の小分子とブレンドして含んでよい。好適な小分子としては、限定されるものではないが、ステロイド（例えば、ラザロイドおよびグルココルチコイド）、抗酸化剤（例えば、コエンザイムQ10、アルファリポ酸およびNADH）、抗異化酵素（例えば、グルタチオンペルオキシダーゼスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、合成触媒スカベンジャー、ならびに類似作用物質）、インドール誘導体（例えば、インドールアミン、カルバゾールおよびカルボリン）、硝酸中和剤、アデノシン／アデノシンアゴニスト、植物化学物質（フラバノイド）、ハーブエキス（イチョウおよびウコン）、ビタミン類（ビタミンA、E、およびC）、オキシダーゼ電子受容阻害剤（例えば、キサンテンオキシダーゼ電子阻害剤）、鉱物（例えば、銅、亜鉛およびマグネシウム）、NSAIDS（例えば、アスピリン、ナプロキセンおよびイブプロフェン）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。さらに、本発明の医薬組成物は、EPO類似体、組織保護サイトカイン、および組織保護活性を有する小分子を含んでよい。
組織保護サイトカインおよび／または小分子は、好ましくは、本発明の医薬組成物中に、内因性EPOによって引き出されるものと同じ活性を神経細胞または他の応答性細胞系において維持するかまたはその活性を超えるのに十分な量で存在する。1つの実施形態では、組織保護サイトカインおよび／または小分子が、個体内の赤血球産生応答性細胞の生存力および機能を保護、維持または増強することによって個体の組織保護を強化するのに十分な量で存在する。例えば、本発明のこの態様の医薬組成物が、好ましくは、有効で、毒性のない量の組織保護サイトカイン、例えば、約1ng以上を含む。1つの実施形態では、組織保護サイトカインが、医薬組成物中に約5mg以下の量で存在する。もう１つの実施形態では、組織保護サイトカインが、医薬組成物中に約500ng〜5mgの量で存在する。さらにもう1つの実施形態では、医薬組成物が約1μg〜5mgの組織保護サイトカイン、好ましくは、約500μg〜5mgを含む。別の実施形態では、本発明の医薬組成物中に多量の組織保護サイトカイン、例えば、約1mg〜5mgが存在する。当業者ならば公知のことではあるが、患者に投与される医薬組成物の量は、限定されるものではないが、患者の状態および投与頻度をはじめとする数多くの因子に応じたものとなる。
治療および投与方法
上述の長期作用性EPO類および長期作用性EPO類を含む医薬組成物は、貧血、貧血または貧血状態もしくは疾患を伴うヒト疾患、あるいは結果として貧血を引き起こす治療方法の治療的または予防的処置に向けられるものである。一般に、本発明の長期作用性EPO類は、他の組織障害から回復する患者の能力を危うくすることなく、上述の疾患を治療するための投与回数を少なくし、または使用するエリスロポエチンの量を減少させることができる。
本発明は、全身もしくは長期投与、急性期治療および／または間欠投与に向けた長期作用性EPO類の使用を意図する。1つの実施形態では、本発明の医薬組成物が、標的細胞、組織または器官を保護または強化するために長期投与される。もう１つの実施形態では、本発明の医薬組成物が、急性期投与、すなわち、損傷時の単回治療で投与され得る。なおもう1つの実施形態では、本発明の医薬組成物が周期的に投与される。
組成物の投与は、非経口投与、例えば、静脈注射、腹膜内注射、動脈内、筋肉、皮内または皮下投与による；吸入による；経粘膜、例えば、経口、経鼻、直腸、膣内、舌下、粘膜および経皮投与；またはそれらの組合せであってよい。好ましくは、本発明の医薬組成物の投与が非経口投与である。このような投与は、約0.01pg〜約5mg、好ましくは、約1pg〜約5mgの投与量で行われる。1つの実施形態では、投与量が約500pg〜約5mgである。もう１つの実施形態では、投与量が約1ng〜約5mgである。なおもう1つの実施形態では、投与量が約500ng〜約5mgである。さらにもう1つの実施形態では、投与量が約1μg〜約5mgである。例えば、投与量が約500μg〜約5mgであってもよい。もう１つの実施形態では、投与量が約1mg〜約5mgであってもよい。
非経口投与に適した本発明の医薬組成物としては、水性および非水性滅菌注射可能溶液または懸濁液が挙げられ、これらが抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および対象とするレシピエントの血液と組成物とが実質的に等張となるようにする溶質を含有していてもよい。本発明のこの態様において、医薬組成物は、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、およびそれらの混合物も含んでいてよい。非経口投与に適した医薬組成物は、単回投与型または多容量型容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルに入れて与えてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば、注射用滅菌生理食塩溶液を添加するだけでよい、凍結乾燥（フリーズドライ）した状態で保存してもよい。即時注射溶液および懸濁液は、滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製し得る。1つの実施形態では、救急車、救急処置室および戦場といった状況下での緊急用に、本発明の長期作用性EPOの注射可能溶液を含んでなる自己注射器を提供してもよい。
1つの実施形態では、本発明の医薬組成物が、常法に従って、人間への静脈内投与に適した医薬組成物として製剤される。例えば、医薬組成物が滅菌等張水性バッファー中の溶液剤であってよい。必要に応じて、医薬組成物が可溶化剤および／または注射部位の痛みを軽減するリドカインなどの局部麻酔薬も含んでいてもよい。それらの成分は、別個に提供してもよいし、または混ぜて単位投与形として、例えば、活性物質の量を示したアンプルまたはサシェ(sachette)などの密封容器に入れた凍結乾燥粉末または無水濃縮物として提供してもよい。本発明の医薬組成物を輸注により投与する場合には、組成物の分散に医薬品グレードの滅菌水または生理食塩水の入った輸液ボトルを使用してもよい。さらに、医薬組成物を注射により投与する場合には、成分を混合するために滅菌生理食塩水のアンプルを提供してもよく、それらの成分が投与の前に混合される。
経口投与に適した医薬組成物は、カプセル剤もしくは錠剤；散剤もしくは顆粒剤；溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁液剤（水性または非水性液中）；食用泡沫剤もしくはホイップ剤；エマルション剤；またはそれらの組合せとして与えてよい。経口製剤は、約10重量パーセント〜約95重量パーセントの有効成分を含んでいてよい。1つの実施形態では、有効成分が経口製剤に約20重量パーセント〜約80重量パーセントの量で含まれる。さらにもう1つの実施形態では、経口製剤が約25重量パーセント〜約75重量パーセントの有効成分を含む。
錠剤またはハードゼラチンカプセルは、ラクトース、デンプンまたはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸またはその塩を含んでいてよい。ソフトゼラチンカプセルは、植物油、ワックス、脂質、半固体、液体ポリオールまたはその混合物を含んでいてよい。溶液剤およびシロップ剤は、水、ポリオール、糖またはその混合物を含んでいてよい。
さらに、経口投与を目的とする活性物質は、胃腸管での活性物質の崩壊および／または吸収を遅らせる物質でコーティングしてもよいし、またはその物質と混合してもよい。例えば、活性物質を、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリルまたはそれらの組合せと混合してもよいし、またはそれらでコーティングしてもよい。このように、活性物質の持続性放出は長時間にわたって得られるが、必要に応じて、活性物質を胃内での分解から保護することもできる。経口投与に向けた医薬組成物は、特定のpHまたは酵素条件を理由に、特定の胃腸部位での活性物質の放出を促進するように製剤化してもよい。
経皮投与に適した医薬組成物を、レシピエントの表皮と長時間密着させたままにしておくことが意図された個別パッチ剤として与えてよい。さらに、局所投与に適した医薬組成物を、軟膏剤、クリーム剤、懸濁液剤、ローション剤、散剤、溶液剤、パスタ剤、ゲル剤、スプレー剤、エアロゾル剤、オイル剤、点眼剤、トローチ剤、香錠および口内洗浄剤、ならびにそれらの組合せとして与えてよい。皮膚、口、眼または他の外部組織への局所投与用には、局所軟膏またはクリームを使用することが好ましい。さらに、軟膏剤として製剤する場合には、有効成分、すなわち、長期作用性EPOは、パラフィン系もしくは水混和性の軟膏基剤と一緒に使用し得る。あるいは、有効成分は、水中油基剤または油中水基剤を用いてクリームとして製剤し得る。局所投与が点眼剤による場合には、本発明の医薬組成物は、好ましくは、好適な担体中、例えば、水性溶媒中に溶かされたか、または懸濁された有効成分を含む。
経鼻および経肺投与に適した医薬組成物は、粉末（好ましくは約20ミクロン〜約500ミクロンの粒径を有するもの）などの固体担体を含んでいてよい。粉末は、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻でさっと吸入することにより投与される。別の実施形態では、本発明の経鼻投与を目的とする医薬組成物は、液体担体、例えば、経鼻スプレーまたは点鼻剤を含んでいてよい。好ましくは、本発明の医薬組成物が鼻腔内へ直接投与される。
マウスピースを介した中咽頭への深吸入により、また、所定用量の有効成分を提供するように設計され得る、他の特別仕様の装置、限定されるものではないが、加圧エアロゾル、ネブライザーまたは注入器を含む、により肺への直接吸入を行ってもよい。経肺吸入を目的とする医薬組成物は、有効成分の水性または油性溶液を含んでいてよい。好ましくは、本発明の医薬組成物が、中咽頭への直接深吸入により投与される。
直腸投与に適した医薬組成物は、坐剤または浣腸剤として与えてよい。1つの実施形態では、本発明の坐剤が、約0.5重量パーセント〜10重量パーセントの有効成分を含む。もう１つの実施形態では、坐剤が約1重量パーセント〜約8重量パーセントの有効成分を含む。さらにもう1つの実施形態では、有効成分が坐剤中に約2重量パーセント〜約6重量パーセントの量で存在する。本発明のこの態様において、本発明の医薬組成物は、伝統的な結合剤とトリグリセリドなどの担体を含んでいてよい。
膣内投与に適した医薬組成物は、ペッサリー剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡沫剤またはスプレー製剤として与えてよい。
本発明の医薬組成物は、潅流、器官への注入を用いて投与してもよいし、または局所投与してもよい。このような実施形態では、医薬組成物が、好ましくは、約0.01pM〜約30pM、好ましくは、約15pM〜約30nMの本発明の長期作用性EPOを含む。1つの実施形態では、潅流溶液が、約1U/ml〜約25U/ml EPO；5パーセントヒドロキシエチルデンプン（好ましくは、分子量が約200,000〜約300,000であり、エチレングリコール、エチレンクロロヒドリン、塩化ナトリウムおよびアセトンを実質的に含まない）、25mM KH2PO4、3mMグルタチオン；5mMアデノシン；10mMグルコース；10mM HEPESバッファー；5mMグルコン酸マグネシウム；1.5mM CaCl2；105mMグルコン酸ナトリウム；200,000単位ペニシリン；40単位インスリン；16mgデキサメタゾン；および12mgフェノールレッドを含む、ウィスコンシン大学(the University of Wisconsin)(UW)溶液（pH約7.4〜約7.5および浸透圧約320mOSm/lを有する)である。UW溶液は、その全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,798,824号で詳細に論述されている。もう１つの実施形態では、UW溶液が、約0.01pg/ml〜約400ng/ml、好ましくは、約40ng/ml〜約300ng/mlの組換え組織保護サイトカインを含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物を治療を必要とする領域に局所投与することが望ましいことがある。このような投与は、外科手術中の局所注入により；局所投与、例えば、外科手術後の創傷包帯と組み合わせた投与；注射により；カテーテルにより；坐剤により；または多孔性、非多孔性またはゼラチン様材料、シラスティック膜などの膜または繊維を含む、からできたインプラントを用いて行うことができる。
さらに、経皮投与に関して上で簡潔に記述したように、本発明の長期作用性EPOを制御放出系で送達してもよい。例えば、静脈内注入、植込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与方法を用いてポリペプチドを投与してもよい。1つの実施形態では、例えば、Saudek ら, 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574で論述されているように、ポンプを使用してもよい。もう１つの実施形態では、例えば、それらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開番号WO 91/04014および米国特許第4,704,355号に記載されているように、化合物は、小胞、特にリポソーム内に入れて送達することができる。もう１つの実施形態では、高分子材料、例えば、Howard ら, 1989, J. Neurosurg. 71: 105で論述されている材料を用いて制御放出系を作製してもよい。
このような制御放出系は、治療標的、すなわち、標的細胞、組織または器官の近傍に配置することができ、そのため、全身投与量の一部だけで済む。例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 第2巻, 115-138頁, 1984を参照のこと。本発明での使用に意図される他の制御放出系は、Langerによる総説、Science 249 : 1527-1533, 1990で論述されている。
投与
上述の投与方法に関する、有効かつ毒性のない好ましい用量の選択は、当業者には公知である要因に基づいて専門家により決定される。これらの要因の例としては、長期作用性EPOの特定の形態；EPOの薬物動態パラメーター、例えば、バイオアベイラビリティー、代謝、半減期など（専門家に提供される）；治療しようとする状態または疾患；正常な個体で達成されるであろう利益；患者の体重；投与の方法；投与の頻度、すなわち、長期投与、急性期投与、間欠投与；併用薬；および投与される医薬品の効果に影響を及ぼすことでよく知られている他の要因が挙げられる。このように、正確な投与量は、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
例えば、Physicians Desk Reference(PDR)は、EPOで治療している患者集団に応じて、毒性を予防するために目標とされるヘマトクリットレベルが異なることを示している。Physicans Desk Reference, 第54版, 519-525および2125-2131 (2000).実際には、PDRでは、CRFを有する患者において、毒性のない30パーセント〜36パーセントの目標ヘマトクリットを達成するEPOの投与を推奨している。これに対して、化学療法中の癌患者については、PDRでは、ヘマトクリットレベルが異なる、すなわち、ヘマトクリットレベルが40パーセントを超える場合には、投与量を調整するように教示している。PDRでは、EPOによる治療中、医師が患者のヘマトクリットをモニタリングし、患者のヘマトクリットが目的の範囲の上限に近づくか、またはそれを超える場合には、毒性を予防し、投与量を調整し、および／または治療を控えることを示している。従って、熟練した医師は、本発明の教示をもって、毒性問題を回避しながら、治療効果をもたらすのに十分なEPOの用量を投与することができるはずである。
1つの実施形態では、本発明の長期作用性EPOが1回投与当たり約0.1μg/kg体重〜約100μg/kg体重の用量で長期または全身投与される。例えば、化学療法を受けている癌患者の治療における週1回の投与には、約1μg/kg体重〜約5μg/kg体重と考えられる。もう1つの実施形態では、長期作用性EPOの用量が1回投与当たり約5μg/kg体重〜約50μg/kg体重である。さらにもう1つの実施形態では、長期作用性EPOが1回投与当たり約10μg/kg体重〜約30μg/kg体重の量で投与される。なおもう1つの実施形態では、長期作用性EPOが約1μg/kg体重以下の量で投与される。例えば、CRF患者の貧血の治療で週1回投与する場合には、約0.45μg/kg体重〜約0.75μg/kg体重の長期作用性EPOが有効であろう。
有効量は、好ましくは、長期作用性EPOの血清レベルが約10,000mU/ml(80ng/ml)を超えるのに十分な量である。1つの実施形態では、有効量が長期作用性EPOの血清レベル約15,000mU/ml(120ng/ml)以上を達成させる量である。もう１つの実施形態では、有効量が長期作用性EPOの血清レベル約20,000mU/ml(160ng/ml)を達成させる量である。血清レベルは、好ましくは、投与後、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10時間、またはそれらを組み合わして測定および達成される。当業者が必要であると考えた場合には投薬を繰り返してもよい。例えば、臨床上必要であれば、毎日、または好適な間隔を置いた後に、例えば、1〜12週間おき、好ましくは、1〜3週間おきに投与を繰り返してもよい。
本発明の長期作用性EPO類は血清半減期が長くなったため、体内でのそれらの有効性も高められている。例えば、哺乳類患者が放射線療法をはじめとする癌治療での全身化学療法を受けている場合には、治療中の本発明の長期作用性EPO医薬組成物の投与によると、現在の組換えEPO組成物の頻度および量と比べて、頻度が少なくなり、かつ、量が減少するため、貧血の不安が減少する可能性がある。
さらに、以上で論述したが、本発明の医薬組成物が本発明の長期作用性EPOまたはEPO類似体を、組織保護サイトカインとブレンドして含んでいる場合には、組成物を、組織障害の危険性もある患者において貧血および関連疾患を治療するために使用してもよい。例えば、心臓疾患の危険性も高い貧血を有する患者を、治療により障害が高まる危険性を回避するために、現在利用可能なEPO類似体の代わりに本発明の医薬組成物により治療してもよい。
治療キット
また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ以上を充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。1つの実施形態では、有効な量の長期作用性EPOと製薬上許容される担体を単回投与用バイアルまたは他の容器にパッケージングしてもよい。
本発明の医薬組成物を非経口投与に適合させる場合には、例えば、組成物を凍結乾燥した状態で保存してもよい。よって、キットが凍結乾燥組成物、滅菌液体担体および注射用シリンジを含んでよい。1つの実施形態では、キットが、各回治療実施時に担当者が所定量の材料を計り分け、所定量の担体を加えるといったように、数回の治療に十分な凍結乾燥材料の入ったアンプルを含む。もう１つの実施形態では、キットが、各回治療実施時に担当者が計量または秤量することなく1つのアンプルと1つの担体容器の内容物を混合するだけで済むように、各アンプルに所定量の凍結乾燥材料の入った複数のアンプルと各容器に所定量の担体が入った複数の容器を含んでいてもよい。なおもう1つの実施形態では、キットが本発明の長期作用性EPOの注射可能溶液を含む自己注射器を含む。さらにもう1つの実施形態では、キットが凍結乾燥した組成物の入った少なくとも１つのアンプル、少なくとも１つの担体溶液の容器、局部麻酔薬の入った少なくとも１つの容器、および少なくとも１本のシリンジ（など）を含む。アンプルおよび容器が、好ましくは、密封されている。
本発明の医薬組成物を輸注により投与する場合には、キットが、好ましくは、医薬組成物の入った少なくとも１つのアンプルと医薬品グレードの滅菌水または生理食塩水の入った少なくとも１つの輸液ボトルを含む。
また、本発明のキットは、直接肺吸入するための少なくとも１つのマウスピースまたは加圧エアロゾル、ネブライザーまたは注入器などの他の特別仕様の装置も含んでいてもよい。本発明のこの態様において、キットが、直接肺吸入するための医薬組成物を含む装置、またはその装置と少なくとも１つの本発明の長期作用性EPOの水性または油性溶液のアンプルを含んでいてよい。
本発明の長期作用性EPO医薬組成物を経口、経皮、直腸、膣または経鼻に適合させる場合には、キットが、好ましくは、有効成分の入った少なくとも１つのアンプルと少なくとも１つの投与補助器具を含む。投与補助器具の例としては、限定されるものではないが、計量スプーン（経口投与用）、滅菌クリーニングパッド（経皮投与用および鼻用吸入器（経鼻投与用）が挙げられる。このようなキットは、単回投与量の長期作用性EPO（急性期治療）または複数回投与量（長期治療）を含んでいてよい。
さらに、キットは、１種類以上の溶液を備えたものであってよい。例えば、本発明の長期作用性EPO医薬組成物が、アルブミン溶液とポリソルベート溶液を入れて作製したものであってよい。キットがポリソルベート溶液を含んでいる場合、「アルブミンを含まない」という言葉を、好ましくは、容器ラベルに表示し、さらに、キットにもメインパネルを表示する。
さらに、キットに、ヒト投与を目的とする製造、使用または販売機関による認可を反映する、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を管理する政府機関により規定された形式の注意書きを添えてもよい。
EPOアッセイ
本発明はまた、数種類の本発明の医薬組成物に使用される本発明の長期作用性EPO類、ならびにEPO類似体の赤血球産生能力および組織保護能力を判定するアッセイにも関する。例えば、長期作用性EPOの赤血球産生作用は、実施例2でより詳細に論述するTF-1アッセイを利用することにより検証することができる。EPO化合物の組織保護特性は、以下でより詳細に論述するin vitroアッセイおよびin vivoアッセイを利用して調べることができる。さらに、本発明はまた、特定のEPO化合物が組織保護活性を有するかどうかだけでなく、EPO化合物が内因性EPOに関してアンタゴニストとして作用するかどうかも判定するための試験もまた包含する。
本発明のアッセイは、好ましくは、最少量のEPO化合物を用いて短時間に完了するよう設計されている。さらに、本明細書に記載のアッセイは限定されるものではなく、当業者ならば、EPO化合物の赤血球産生能力および組織保護能力の判定に有用な他のアッセイも認識するであろう。
赤血球産生活性アッセイ
赤血球産生特性、すなわち、特定のEPO化合物のヘマトクリットレベルを制御する能力は、種々のアッセイを利用して判定される。1つの実施形態では、TF1細胞系を用いて、特定のEPO化合物が赤血球産生活性を有するかどうかが判定される。これらの細胞をペレット化し、洗浄し、1ml培地中105細胞の濃度に再懸濁して、さらに、組換えEPOおよび目的のEPO化合物を特定の濃度で添加する。各培養物を24時間維持し、24時間の時点で細胞数をホルマザン反応産物(CellTiter; Promega, Madison, WI)を用いて判定する。
目的のEPO化合物の有効性を、まず、雌BALB/cマウスを用いてヘモグロビン濃度へのその影響を観察することによりin vivo評価する。動物に500U/kg-bw EPO、目的のEPO化合物、または等量のビヒクルを週に3回、合計3週間（赤血球産生応答を観察するのに十分な時間間隔）皮下投与する。マウスの血清ヘモグロビン濃度が高まった場合に、EPO化合物に赤血球産生性があると判定する。
有効性のさらなる評価は、TF1赤白血病細胞を用いてin vitroにて得ることができる。関連のTF1細胞数が対照のものよりも多くなれば、目的のEPO化合物に赤血球産生性がある。さらに、当業者ならば、赤血球産生活性の判定のための他のアッセイも利用可能であることを理解するであろう。例えば、欧州薬局方では、エクスハイポキシック(exhypoxic)マウスアッセイおよび網状赤血球アッセイを含む、EPO化合物の赤血球産生活性の判定に有用な少なくとも2つのアッセイを論述している。
EPO受容体に基づく組織保護能力アッセイ
1つの実施形態では、本発明の組織保護能力アッセイはEPOの組織保護受容体に基づいたものである。ひとたび、組織保護受容体の配列が単離されたら、種々のアッセイを用いて特定のEPO化合物の組織保護能力を判定することができる。当業者には公知であるように、使用されるアッセイの種類は、EPO化合物の重量によって大きく異なる。
例えば、アッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイまたは立体的阻害アッセイであってよい。競合アッセイは、共通の結合パートナーにある限られた数の結合部位に対して試験サンプル分析物と競合するトレーサー類似体の能力を利用するものである。本明細書において、「分析物」とは、組織保護活性を調べるべき目的のEPO化合物を指す。「結合パートナー」とは、分析物（一般に、EPO受容体）と結合するタンパク質を指す。本明細書において、「トレーサー」とは、標識化分析物類似体、固定化分析物類似体、標識化結合パートナー、固定化結合パートナーおよび立体コンジュゲートなどの標識試薬を指す。本明細書において使用するトレーサーが、分析物とその結合パートナーとの結合の妨げとならない検出可能な機能であってもよい。限定されない例としては、蛍光色素標識、化学発光標識および放射性標識などの直接検出し得る部分、ならびに酵素などの検出するために反応させるか、または誘導体化しなけらばならない部分が挙げられる。好適なトレーサーは、放射性同位元素P32、C14、I125、H3、I131およびそれらの混合物；蛍光体、例えば、希土類キレート、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号））、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、糖類オキシダーゼ（グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、過酸化水素を使用してHRPなどの色素前駆体を酸化する酵素と結合された複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼおよびそれらの混合物；ビオチン／アビジン；スピン標識；バクテリオファージ標識；安定したフリーラジカル；ならびにそれらの組合せであってよい。1つの実施形態では、トレーサーがセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼの少なくとも1つである。
当業者ならば、トレーサーとタンパク質またはポリペプチドとを共有結合させる方法を知っている。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミダート、ビス-ジアゾ化ベンジジンなどの結合剤を用いて、上述の蛍光標識、化学発光標識および酵素標識によりタグ付けすることができ、それらのいくつかの事例が、それらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第3,940,475号および第3,645,090号で記述されている。
サンドイッチアッセイでは、試薬の固定、すなわち、溶液中に遊離している分析物からの結合パートナーの分離が必要であり、それはアッセイを行う前に、水に不溶の支持体または表面への吸着による（米国特許第3,720,760号）など、結合パートナーもしくは分析物類似体のいずれかを不溶化することによって、共有結合、例えば、グルタルアルデヒド架橋によって、またはその後にパートナーもしくは類似体を不溶化することによって、例えば、免疫沈降によって、果たし得る。
よって、結合パートナーが競合前または競合後に不溶化されるため、結合パートナーと結合したトレーサーおよび分析物が結合していないトレーサーおよび分析物から分離され得る。この分離はデカントすることによって（結合パートナーを前に不溶化した場合）または遠心分離することによって（結合パートナーを競合反応後に沈殿させた場合）果たし得る。マーカー物質の量によって判断する場合には、試験サンプル分析物の量が結合したトレーサーの量に反比例する。既知量の分析物に関する用量−応答曲線を作成し、それを試験サンプル中に存在している分析物の量を定量的に測定した試験結果と比較する。トレーサーとして酵素を用いて使用する場合、このアッセイを、一般に、ELISA系と呼んでいる。
連続サンドイッチアッセイでは、例えば、固定化された結合パートナーを使用して試験サンプル分析物を吸着させ、試験サンプルを洗浄により除去し、結合した分析物を使用して標識した結合パートナーを吸着させ、次いで、結合した材料を残留トレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は試験サンプル分析物に正比例する。「同時」サンドイッチアッセイでは、標識した結合パートナーを添加した前の試験サンプルの分離は行わない。
競合的およびサンドイッチ方法では、その方法の不可欠な部分として相分離工程を採用するが、単一反応混合物中で立体的阻害アッセイが行われる。しかしながら、「均一」アッセイと呼ばれるもう1つの種類の競合アッセイでは、相分離を必要としない。このようなアッセイでは、酵素と分析物とのコンジュゲートを調製し、それを、アンチ分析物が分析物と結合すると、アンチ分析物の存在によって酵素活性が改変されるように使用する。組織保護受容体を二官能性有機的ブリッジによりペルオキシダーゼなどの酵素とコンジュゲートさせる。
EPOとともに使用するために、コンジュゲートは、EPOの結合によって標識の酵素活性が阻害または増強されるように選択する。この種のアッセイを、一般に、EMITと呼んでいる。
均一アッセイでの立体障害方法においては、立体コンジュゲートが使用される。これらのコンジュゲートは、ハプテンに対する抗体が、抗分析物と同時に、コンジュゲートを実質的に結合することができないように、共有結合により低分子量ハプテンを小分析物と結合することによって合成される。試験サンプル中に存在している分析物は抗分析物と結合し、その結果、抗ハプテンとコンジュゲートとの結合を可能にし、コンジュゲートハプテンの特徴に変化、例えば、ハプテンが蛍光体であるときには蛍光性の変化をもたらす。
組織保護能力アッセイに関するより多くの情報は、その両方がそれらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、2002年7月3日提出の同時係属の米国特許出願番号10/188,905および2003年4月25日提出の出願番号60/456,891で論述されている。
機能アッセイ
組織保護受容体の配列が同定がなされていない場合には、EPOの組織保護能力を機能アッセイを用いて、in vivoおよびin vitroの両方で判定し得る。好ましくは、当業者がEPO化合物の組織保護能力を判定するためにいずれか一方のin vitroまたはin vivoアッセイを実施するが、場合によっては、化合物がin vitroおよびin vivoで同じ組織保護能力を示すことを保証するために両方を実施することが必要であろう。
実際のところ、当業者ならば、EPO類似体が少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有するかどうかに関係なく、本発明により開示するアッセイの組合せを用いて判定することができる。まず、P19細胞およびラット運動ニューロンアッセイなどのin vitro試験を利用して目的のEPO化合物が組織保護能力を示すかどうかを判定することができる。次いで、ラット限局性虚血モデル、ビククリン発作モデル、または脊髄損傷モデルなどのin vivo研究を利用してin vitro試験の結果を検証することができる。
本発明により意図されるin vitroモデルとしては、限定されるものではないが、上述の高グリコシル化エリスロポエチンの組織保護能力の欠如を判定するために用いられるもの、すなわちP19細胞アッセイ、ラット運動ニューロン細胞アッセイ、およびcDNAマイクロアレイが挙げられ、これらのモデルについては、以下でより詳細に論述し、また、実施例2でさらに例示する。これらの例は限定されるものではなく、当業者ならば、EPO化合物の組織保護能力を判定するための他の好適なin vitroアッセイが存在することも理解するであろう。一般に、EPO化合物が、対照と比べて、細胞の生存力を維持したか、または増強した場合に、それに組織保護性があるといえる。エリスロポエチンが、対照と比べて、アッセイ中に細胞の生存力に悪影響を及ぼした場合に、それにアンタゴニスト性があるといえる。
A. P19細胞系に基づくIn Vitroアッセイ
1つの実施形態では、in vitro組織保護能力アッセイがP19細胞系に基づいたものである。例えば、P19細胞を2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリンG、100μg/ml硫酸ストレプトマイシン(Gibco)および10パーセントウシ胎児血清(Hyclone Laboratories)を補充した、1.2g/l NaHCO3 10mM hepesバッファーを含有するDMEMで未分化で維持する。無血清培地は、5μg/mlのインスリン、100μg/mlのトランスフェリン(transferring)、20nMプロゲステロン、100μMプトレッシンおよびウシ胎児血清の代わりの30nM Na2SeO3(Sigma)の他は上記と同じ成分を含んでいてよい。
50パーセント密集度で反応する細胞を、組換えEPOおよび／または目的のEPO化合物で一晩処理し、トリプシンを用いて解離し、無血清培地で洗浄し、25cm2組織培養フラスコで、無血清培地単独で、または前処置用添加物を加えて最終密度104細胞/cm2に培養する。細胞生存力はトリパンブルー排除により判定し得る。
当業者には公知であるように、未分化ニューロン様P19細胞においては、組換えEPOを添加することで血清中止後の細胞消失を防ぐことができる。例えば、組換えEPOを0.1U/ml〜100U/mlの濃度にて使用した場合には、最大50パーセントのニューロン様細胞が死から救済される。よって、組織保護性があるというには、目的のEPO化合物が対照より多くのP19細胞を死から救済しなければならず、好ましくは、その化合物が約25パーセント〜約50パーセントの細胞、最も好ましくは、約40パーセント〜約50パーセントの細胞を救済しなければならない。
B. In Vitroラット運動ニューロンアッセイ
もう１つの実施形態では、ラット運動ニューロンアッセイが目的のEPO化合物のin vitroでの組織保護能力の判定に利用される。例えば、一次運動ニューロンを、15日齢のSprauge Dawleyラット胎児の脊髄を用いて得、それを免疫パニングにより精製する。細胞を、好ましくは、ポリ-DL-オルニチンおよびラミニンでプレコーティングした、完全培養培地（Neurobasal、B27（2パーセント）、0.5mM L-グルタミン、2パーセントウマ血清、25μM 2-メルカプトエタノール、25μM グルタミン酸塩、1パーセントペニシリンおよびストレプトマイシン、1ng/ml BDNF）を含有する24mmウェルプレート中のガラスカバースリップ上に低密度（20000細胞/cm2）で播種する。しばらくして、好ましくは、約6日後、EPO(10U/ml)および目的のEPO化合物(10U/ml)またはビヒクルを培養物に添加する（好ましくは、生存ニューロン密度の測定の約5日前）。この培地は、その後、廃棄し、細胞をPBS中4パーセントパラホルムアルデヒドで40分間固定し、0.2パーセントTriton X-100で透過処理し、PBS中10パーセントウシ胎児血清でブロックし、非リン酸化ニューロフィラメントに対する抗体(SMI-32; 1:9000)とともに一晩インキュベートし、ジアミノベンジジンを用いるアビジン−ビオチン方法を用いて視覚化する。運動ニューロンの生存力は、SMI-32陽性細胞を計数することによって形態学的に評価し得る。
運動ニューロンの混合初代培養物は、維持培養状態において、特徴的にアポトーシスを受ける。細胞数評価5日前の組換えEPO(10U/ml)の培養培地への添加によって、5日において観察される一次運動ニューロン数がかなり増加することは知られている。よって、組織保護性があるというには、目的のEPO化合物が、好ましくは、対照と少なくとも同数の運動ニューロンを救済する。1つの実施形態では、維持培養状態において、対照と比べて、多くの運動ニューロンが死から救われる場合に、目的のEPO化合物に組織保護性があるといえる。
C. cDNAマイクロアレイに基づくIn Vitroアッセイ
目的のEPO化合物の組織保護能力を判定するもう1つのin vitroアッセイがcDNAマイクロアレイである。このアッセイは、組換えEPOおよび目的のEPO化合物による、P19細胞における遺伝子発現に対する修飾に違いがあるかどうかを判定するのに利用される。未分化P19細胞から単離されたmRNAは、EPOへの曝露に応じて異なるパターンの遺伝子モジュレーションを示すことができ、この遺伝子モジュレーションはマウス1200cDNAマイクロアレイにより評価される。例えば、P19細胞の1,200遺伝子の発現を、Clontech製のナイロンメンブランアレイ（Atlasマウス1.2）を使用して測定してもよい。細胞（107/サンプル）を生理食塩水、組換えEPO、目的のEPO化合物(1mU/ml)またはその混合物で一晩処理する。次いで、細胞をRNA抽出用に溶解するか、または3時間血清飢餓に付す（常に、前処理中に添加した同じサイトカインの存在下で）。カラムクロマトグラフィーによる標準的な全RNA抽出の後、オンカラムDNアーゼ処理によりポリA+RNAを精製する。次いで、[P32]-ATPの存在下でプローブを構築する。好ましくは、2000万カウント以上の標識化プローブを、cDNAナイロンメンブランと68℃にてハイブリダイズさせる。これらのメンブランを洗浄し、X線フィルムに露光する。放射性シグナルの強度をホスホルイメージャー(Phosphor Imager)により測定し、Atlas Image 2.0 コンピュータプログラム(Clontech)を用いて解析する。
本発明により意図されるin vivoアッセイとしては、限定されるものではないが、EPO化合物の評価に用いられる組織保護アッセイ、例えば、限局性虚血モデルおよび海馬内ビククリンモデルが挙げられる。さらに、組織保護を評価するためのin vivoモデルとしては、脊髄損傷アッセイが挙げられる。さらに、国際公開番号WO/02053580および米国特許公報番号2002/0086816および2003/0072737内で開示されている種々のアッセイも本発明での使用に意図される。
D. 限局性虚血モデルに基づくIn Vivoアッセイ
1つの実施形態では、特定のEPO化合物の組織保護能力の判定に利用されるin vivoアッセイが限局性虚血モデルに基づいたものである。例えば、3血管限局性虚血モデルに雄Sprague-Dawleyラット(〜250gm)を使用してもよい。要するに、ペントバルビタール(60mg/kg-bw)でラットに麻酔をかけ、ウォーターブランケットを使用して核芯温度37℃に維持する。右頚動脈を2本の縫合糸で閉塞し、横に切開する。右眼窩の近傍および吻側のバーホールによって中大脳動脈が見えるようにし、それを鼻動脈の遠位で焼灼する。この固定されたMCA損傷を取り囲む周縁部を作るため、対側頚動脈を細い鉗子によりもたらされる牽引により1時間閉塞する。可逆性頚動脈閉塞開始時に、生理食塩水、組換えEPO(5000U/kg-bw)または目的のEPO化合物(5000U/kg-bw)を投与する。
24時間後、脳を取り出し、ブレインマトリックス装置(Harvard Apparatus)を使用して全脳から1mm厚の連続切片を切断する。次いで、各切片をその後、154mM NaCl中2パーセント塩化トリフェニルテトラゾリウム(w/v)の溶液中で37℃にて30分間インキュベートする。障害体積をコンピュータ画像解析システム(MCID, Imaging Research, St. Catharines, Ontario, Canada)を使用して測定する。このアッセイでは、目的のEPO化合物がラットMCA限局性虚血による梗塞体積を組換えEPOと同程度以上に改善する場合に、それに神経保護性があると認められる。
E. 海馬内ビククリン発作モデルに基づくIn Vivoアッセイ
もう１つの実施形態では、EPO化合物の組織保護能力を海馬内ビククリン試験によりin vivoにて判定する。例えば、雄Sprague-Dawleyラット(250〜280g)を、一定温度(23℃)および相対湿度（60パーセント）にて、食物および水が自由に得られる状態で、かつ、一定の12時間明暗サイクルで飼育する。Vezzani, A., ら, J. Neurosci, 19, 5054-65 (1999)で記載されているような定位固定に関する指針の下で、手術によりラットにカニューレおよび電極を埋め込む。要するに、エキテシン(Equithesin)（1パーセントフェノバルビタール／4パーセント抱水クロラール；3ml/kg i. p.）によりラットに麻酔をかける。2つのスクリュー電極を鼻腔上に置かれたアース線とともに頭頂葉皮質上に左右相称に置く。次いで、双極性ニクロム線絶縁電極(60μm)を背側海馬（中隔極(septal pole)）の歯状回に左右相称に埋め込み、薬物の海馬内または脳室内注入のためにカニューレ（22ゲージ）を硬膜の上、片側に置く。電極を埋め込むためのブレグマからの座標は、(mmで)-2.5に設定されたノーズバー(nose bar)を有する硬膜の下方、前後方向-3.5；側方2.4および3であるべきである。Paxinos, G., & Watson, C., The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academis Press, New York (1986).電極を複数ピンソケット(March Electronics, NY)に接続し、注入用カニューレと一緒に、アクリル系歯科用セメントによって頭蓋に固定する。
動物が十分に回復している場合には、試験を、好ましくは、術後3〜7日に実施する。次いで、ビククリン発作誘発の24時間前、さらに30分前に、組換えEPOもしくは目的のEPO化合物（いずれも5000U/kg-bw）またはビヒクルを動物に腹腔内投与する。EEGおよび薬物の脳内注入を記録する手法は、これまでに記載されている。Vezzani, A., ら, J. Pharmacol Exp Ther, 239, 256-63 (1986).要するに、EEG記録（4-チャンネルEFGポリグラフ、型BP8、Battaglia Rangoni, Bologna, Italy）開始前の少なくとも10分間、動物をプレクシグラスケージ(25×25×60cm)内で順応させる。約15分〜約30分後、0.8nmol/0.5μlビククリンメチオジド注入の後120分間続けてEEGを記録する。カニューレの下方に3mm突出した針（28ゲージ）を使用して、麻酔をかけていないラットにも全ての注入を行った。
発作を、薬物の抗痙攣作用の感度の良い指標を与えることがこれまでにわかっているEEGの解析により測定する。Vezzani, A., ら, J. Pharmacol Exp Ther, 239, 256-63 (1986).このアッセイの目的では、発作は、記録する四肢情報における以下の変化：高頻度および／またはマルチスパイクの複合群(multispike complexes)および／または高圧同期スパイクまたは波活動、のうちの少なくとも2つが同時に発生する事態である。発作と同期スパイキングとが混ざって観察される。発作の定量に選択されるパラメーターは、好ましくは、最初の発作（発作の発症）の潜伏期、癲癇性活動に費やされた総時間（発作性症状の期間も含めて決定される；発作期間）、およびEEG記録期間のスパイキング活動（発作活動)である。
読み出しとしてEEG活動を利用した海馬内ビククリン発作モデルは、薬物の発作抑制効力の感度の良い特異的な予測指標であることが分かっている。Vezzani, A., ら, J. Pharmacol Exp Ther, 239, 256-63 (1986).よって、組織保護性があるというためには、目的のEPO化合物が組換えEPOと同程度以上に発作の頻度および重症度を低減する必要がある。
F. 急性可逆性緑内障ラットモデルに基づくIn Vivoアッセイ
本発明のなおもう1つのin vivoアッセイでは、急性可逆性緑内障ラットモデルが目的の特定のEPO化合物の組織保護能力の判定に利用される。例えば、網膜細胞は虚血に対してひどく敏感であるため、これらの多くは虚血性ストレスの30分後に死滅する。そうであるから、末梢血管から投与された目的のEPO化合物が、虚血に対して敏感な細胞を保護するのに十分な組織保護活性を示すかどうかを調べるため、Rosenbaum ら, Vis. Res. 37: 3443-51, 1997で記載されているように、急性、可逆性緑内障ラットモデルを使用する。特に、生理食塩水を成人雄ラットの前眼房に全身動脈圧を上回る圧力で注入し、60分間維持する。次いで、虚血誘発の24時間前に、生理食塩水または5000U EPO/kg体重を動物に腹腔内投与し、1日1回の投与としてさらに3日間続ける。
処置の1週間後に、目的のEPO化合物が組織保護活性を有するかどうかを判定するため、暗順応ラットで網膜電図記録を行う。EPOに組織保護性があれば、生理食塩水単独で処置した動物とは対照的に、網膜電図での活動の保存状態が良いはずである。
G. 心筋梗塞アッセイ
心筋梗塞アッセイもまた、EPO化合物が組織保護活性を、一般的に、または、具体的に言えば、心臓内で示すかどうかを判定するために、本発明での使用に意図される。例えば、麻酔をかけ、冠状動脈の閉塞を準備する24時間前に、成人雄ラットにEPO(5000U/kg体重)を与える。手順開始時にさらなる量のEPOを与え、その時点で、左冠状動脈を30分間閉塞し、その後、開放する。処置後、毎日1週間、同量のEPOを与え、その時点で、それらの動物を心臓機能について調査する。偽注入（生理食塩水）を受けた動物は、心筋梗塞に続発する拡張した硬い心臓を示す左拡張終期圧の大幅な上昇を示すが、一方、目的のEPO化合物を受けた動物は、もしEPOに組織保護性があれば、擬似操作した対照と比べて、心臓機能の低下を示さないはずである（p<0.01値で有意な差）。
H. 脊髄損傷アッセイ
脊髄損傷アッセイもまた、目的の特定のEPO化合物の組織保護能力を評価するために、本発明で利用される。特に、ラット脊髄圧迫が本発明での使用に意図される。この調査では、体重約180g〜約300gのWistarラット（雌）を、好ましくは使用する。好ましくは、動物を手術前12時間絶食させ、人道的に拘束し、チオペンタールナトリウム(40mg/kg-bw)の腹膜内注射により麻酔をかける。皮膚の浸潤後（ブピバカイン0.25パーセント）、完全単一レベル (T-3)椎弓切除術を解剖顕微鏡下で2cm切開して実施する。一時的に動脈瘤クリップを硬膜外に適用し、脊髄に0.6ニュートン（65グラム）の閉鎖力を1分間及ぼすことにより外傷性脊髄損傷を誘発させる。クリップを外した後、皮膚切開部を縫合し、動物を麻酔状態から十分に回復させ、それらのケージに戻す。自発排尿が回復するまで、膀胱の触診により、1日に少なくとも2回、ラットを継続的にモニタリングする。
対照群の動物は、切開部を縫合した直後に生理食塩水（静脈注射により）を受ける。残りの動物は、目的のEPO化合物を16マイクログラム/kg-bwの量でivにより受ける。その後、ラットの運動神経機能を運動機能評定尺度により評価する。この尺度では、0（後肢運動が観察できない）〜21（正常歩行）に及ぶ評点を動物に与える。障害の1時間、12時間、24時間、48時間、72時間、および1週間後、ラットを、各動物が受ける処置がブラインドされた同じ検査員によって機能欠損について調べる。EPOが与えられたラットは、もし目的のEPO化合物に組織保護性があれば、生理食塩水注射が与えられたラットよりも障害からの全体的な回復が早くかつ良好であるはずである。
I. ウサギ脊髄虚血試験
もう１つの実施形態では、ウサギ脊髄虚血試験により組織保護能力について調べることが可能となる。この調査では、例えば、体重1.5kg〜2.5kgのニュージーランド白色ウサギ（36、8〜12ヶ月齢、雄）を使用する。動物を12時間絶食させ、人道的に拘束する。麻酔導入は100パーセント酸素中3パーセントハロタンによって行い、50パーセント酸素および50パーセント空気の混合物中0.5パーセント〜1.5パーセントハロタンに維持する。静脈内カテーテル（22ゲージ）を左耳静脈に留置する。外科手術中、1時間当たり4ml/kg体重(bw)の速度で乳酸リンガー液を注入する。感染を予防するため、手術前にセファゾリン10mg/kg-bwを静脈内投与する。動物を右側臥位に置き、ポビドンヨードで皮膚を前処置し、ブピバカイン（0.25パーセント）を浸潤し、第12番肋骨レベルの脊椎に平行に側腹皮膚切開をする。皮膚および皮下胸腰筋膜の切開後、腰最長筋および腰腸肋筋を牽引する。腹大動脈を左後腹膜アプローチによって露出させ、左腎動脈のすぐ下方にを動かす。PE-60管材料の一部分で左腎動脈のすぐ遠位の大動脈の周りに輪を作り、両末端を大きいゴムチューブに通す。PE管材料を引っ張り、大動脈を非外傷的に20分間閉塞する。
大動脈閉塞の前にヘパリン(400IU)を静脈内ボーラスとして投与する。閉塞の20分後、チューブおよびカテーテルを外し、切開部を縫合し、十分に回復するまで動物をモニタリングする、回復した時点で、それらを神経機能について連続的に評価する。1つの対照群の動物は、大動脈閉塞の開放直後に生理食塩水を静脈内に受ける。もう1つの群の動物は、再潅流直後に6.5μg/kg-bwの目的のEPO化合物を静脈内に受ける（各群n=6）。
再潅流の1時間、24時間および48時間後、DrummondおよびMooreの基準に従い、処置がブラインドされた治験責任医師が運動機能を評価する。各動物に以下のような0〜4の評点を与える：0=はっきりとした下肢運動機能がない対麻痺状態；1=下肢運動機能状態不良、抗重力移動(antigravity movement)のみ弱い；2=抗重力強度(antigravity strength)は優れているが、体の下に足を引き寄せることができない中程度の下肢機能；3=体の下に足を引き寄せ、跳躍する能力がある優れた運動機能であるが、正常ではない；4=正常な運動機能。対麻痺状態の動物において、1日に2回、手を使って膀胱を空にする。
EPOが与えられた動物は、もし目的のEPO化合物に組織保護性があれば、生理食塩水注射を受けた動物よりも障害からの全体的な回復が早くかつ良好であるはずである。
以前に簡潔に検討したことであるが、何種類もの組織がEPO受容体を保有しているため、それらの組織はEPOの組織保護作用に応答する。そのため、当業者ならば、目的のEPO化合物に対して提案される臨床応用性に応じて、これらのさらなる応答性細胞に関する同様のin vitroアッセイを実施してよいし、または随伴器官に関するin vivoアッセイも実施してよいことを理解するであろう。例えば、血清飢餓に基づくin vitroアッセイを心筋細胞、網膜細胞およびライディヒ細胞ならびにP19アッセイに関する上記のものと同様のプロトコールを用いて実施することができる。
In vivoアッセイは、個々の器官にも向けられる。例えば、EPOの網膜細胞に及ぼす影響を評価するために、当業者ならば、上述の網膜虚血アッセイを実施し得る。さらに、EPO類似体の心筋細胞に及ぼす影響を評価するために、当業者ならば、上述の心筋梗塞モデルを容易に修飾することができる。当業者ならば、赤血球産生応答性細胞、組織または器官に関して、特定のEPOが組織保護活性を有するかどうかを評価するための好適なアッセイまたはモデルを選択するのに十分な技術を有しているであろう。
以下の予言的な実施例は、本発明の好ましい実施形態の例示に過ぎず、それらが本発明を限定するものと解釈されてはならず、その範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。
実施例1: 化学修飾型EPO
A. 糖鎖の酸化
EPOの糖単位は、以下の手順によって酸に変換される。EPOと所望の酸化量をもたらすのに十分な量の過ヨウ素酸ナトリウム（過ヨウ素酸ナトリウムの量が多いほど酸化の程度高まる）を100mM酢酸ナトリウムバッファーに入れる。次いで、その溶液を氷上で約20分間インキュベートし、蒸留水を用いて完全に透析する。その後、透析用チューブから生成物を取り出し、新しい試験管に回収する（生成物I）。
定量ベネジクト液（18g硫酸銅、100g炭酸ナトリウム（無水）、200gクエン酸カリウム、125gチオシアン酸カリウム、25gフェロシアン化カリウム）を蒸留水に溶かして最終量1リットルにする。その後、その定量ベネジクト液にメチレンブルーを数滴添加する。
次いで、生成物Iを定量ベネジクト液に、溶液の色が透明になり、その溶液が十分に酸化されたことが分かるまで添加する。その後、この溶液を脱塩し、ウルトラフリー遠心濾過ユニットを用いて濃縮する。その後、そのサンプル（生成物II）を蒸留水を用いてさらに完全に透析する。
B. ガラクトースオキシダーゼを用いたアシアロ型EPOの酸化
50〜500μgのアシアロ型EPO、10μl １U/μlガラクトースオキシダーゼおよび100μl 10mMリン酸ナトリウムバッファーを15ml円錐型遠心分離管で混合する（全量110μl）。次いで、この混合物を37℃にて2時間インキュベートし、その時点で、その溶液を蒸留水を用いて完全に透析する。透析用チューブから生成物を取り出し、新しい試験管に回収する（生成物III）。
定量ベネジクト液（上記のとおり）を蒸留水に溶かして最終量1リットルにする。その後、その定量ベネジクト液にメチレンブルーを数滴添加する。
生成物IIIを定量ベネジクト液に、溶液の色が透明になり、その溶液が十分に酸化されたことが分かるまで添加する。その後、この溶液を脱塩し、ウルトラフリー遠心濾過ユニットを用いて濃縮する。その後、そのサンプル（生成物IV）を蒸留水を用いてさらに完全に透析する。
C. EPOの硫酸化
EPOをN,N-ジメチルホルムアミド(DMF-SA)に4℃にて溶かす。次いで、DMFに溶かしたN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)を添加し、その溶液を4℃にて4時間振盪する。砕いた氷を加え、pHを10N NaOHを用いて7.5に調整する。溶液の量を調整し、サンプルをタイプHN-S2 遠心分離機(DAMONIEC, Needham Hts., Massachusettes)により1000×gにて15分間遠心分離する。その後、その上清を大規模に透析する。硫酸化に関するより多くの情報は、その全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、S. Pongor ら, Preparation of High-Potency, Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diabetes, 第32巻, No. 12, December1983年12月で論述されている。
D. PEG鎖のEPOへの結合
酸化された炭水化物、例えば、以上のAで得られたもの（生成物I）にPEG鎖を結合することによってEPOを修飾する。修飾の程度は、酸化中の過ヨウ素酸塩濃度を変えることにより制御してもよい。
PEG-EPOコンジュゲートを、まず、EPO（50mM酢酸ナトリウム中2〜4mg/ml）を1mM〜100mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム(Sigma)を用いて室温にて30分間酸化することにより作製する。次いで、100mM酢酸ナトリウム、ph 5.4へのバッファー交換によりリン酸バッファーを除去する。
次いで、種々の分子量のメトキシ-PEG-ヒドラジド(Nektar Therapeutics)を5倍〜100倍モル過剰にて添加する。（ポリマー：タンパク質）。次いで、中間体のヒドラジン結合を、15mMシアノホウ水素化ナトリウム(Sigma)の添加によりさらに還元し、4℃にて一晩反応させる。その後、得られたコンジュゲートを当技術分野で公知の技術により分画／精製する。
E. PEG鎖のアシアロEPOへの結合
ガラクトースオキシダーゼによる酸化後に新たにもたらされる末端ガラクトース残基、例えば、以上のBで得られたもの（生成物III）にPEG鎖を結合することによってアシアロ型EPOを修飾する。
製造業者プロトコールに従って、シアリダーゼA(Prozyme, Inc.)を用いて、組換えヒトEPO(rhuEPO)を脱シアル酸化（desialized）する。化学修飾は、好ましくは、反応生成物をSDSポリアクリルアミドゲルにて展開させることによって確認される。得られたバンドの染色によって、修飾型EPOの見かけの分子量が約31kDaであり、一方、非修飾型EPOの分子量が約34kDaであることが示されるであろう。EPOに残留しているシアル酸残基は、好ましくは、EPO1モル当たり0.1モル未満である。
アシアロ型EPOを得た後、EPO（10mMリン酸ナトリウムバッファー中2〜4mg/ml）の新たに露出されるガラクトース残基を、EPO溶液1ml当たりPBS(Sigma)中100単位のガラクトースオキシダーゼを用いて酸化する。次いで、その反応混合物を37℃にて2時間インキュベートする。
その後、100mM酢酸ナトリウム、ph 5.4へのバッファー交換によりリン酸バッファーを除去する。次いで、種々の分子量のメトキシ-PEG-ヒドラジド(Nektar Therapeutics)を5倍〜100倍モル過剰にて添加する。（ポリマー：タンパク質）。次いで、中間ヒドラジン結合を、好ましくは、15mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム(Sigma)の添加によりさらに還元し、4℃にて一晩反応させる。その後、得られたコンジュゲートを当技術分野で公知の技術により分画／精製する。
F. PEG鎖のアシアロEPOへの結合
ガラクトースオキシダーゼによる酸化後に新たにもたらされる末端ガラクトース残基、例えば、以上のBで得られたもの（生成物III）にPEG鎖を結合することによってアシアロ型EPOを修飾する。
ノイラミニダーゼ（Seikagaku Corporation of Japan、1Uの凍結乾燥粉末を100μLの75mM NaP04(pH 6.5)に溶かす）を0.05単位のノイラミニダーゼ(5μL)に対して1mgのEPOの割合で用いて、RhuEPO(1mg)を脱シアル酸化(desialized）する。次いで、その混合物に5単位(5μL)のガラクトースオキシダーゼ（75mM NaP04(pH 6.5)(Sigma)に溶かした450μL）を添加する。
その後、100mM酢酸ナトリウム、ph 5.4へのバッファー交換によりリン酸バッファーを除去する。次いで、その混合物にPEG-NH2（750分子量、Nektar Therapeutics）および15mMシアノホウ水素化ナトリウム(Sigma)を添加し、4℃にて一晩反応させる。PEG-NH2を、好ましくは、250倍モル過剰にて添加する（ポリマー：タンパク質）（80mgのPEG-NH2）。その後、得られたコンジュゲートを当技術分野で公知の技術により分画／精製する。
実施例2：機能アッセイ
A. 赤血球産生アッセイ
赤血球産生特性、すなわち、特定のEPO化合物のヘマトクリットレベルを制御する能力を以下のアッセイを利用して判定した。
TF1は、EPOをはじめとする増殖因子に全面的に依存するヒト赤白血病細胞系である。Kitamura, ら, Blood 73, 375-80. TF1細胞をATCCから入手し、以下のもの：2mM L-グルタミン、10mM Hepes、1mMピルビン酸ナトリウム、4.5g/Lグルコース、1.5g/L重炭酸ナトリウム、5ng/ml GM-CSFおよび10パーセントウシ胎児血清を含有するRPMI 1640で試験まで維持した。活発な増殖の間に得られたTF1細胞をペレット化し、培地単独で3回洗浄し、GM-CSFを含むまたは含まない1ml培地中105細胞の濃度に再懸濁し、さらに、少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有するEPOまたはEPO類似体を特定の濃度にて添加した。
個々の培養物を24時間維持し、製造業者プロトコールに従って、ホルマザン反応産物(CellTiter; Promega, Madison, WI)を用いて細胞数を決定した。
目的のEPO化合物の有効性を、まず、雌BALB/cマウスを用いてヘモグロビン濃度へのその影響を観察することによりin vivo評価した。動物に500U/kg-bw EPO、目的のEPO化合物、または等量のビヒクルを週に3回、合計3週間（赤血球産生応答を観察するのに十分な時間間隔）皮下投与した。マウスの血清ヘモグロビン濃度が高まった場合に、EPO化合物に赤血球産生性があると判定する。有効性のさらなる評価を、TF1赤白血病細胞を用いてin vitroにて得た。この調査では、関連のTF1細胞数が対照のものよりも多くなれば、EPOに赤血球産生性があることを確認した。
当業者ならば、エクスハイポキシックマウスアッセイおよび網状赤血球アッセイ（欧州薬局方）などの他のアッセイも赤血球産生活性を判定するために、本発明での使用に好適であることを認識するであろう。
B. 組織保護アッセイ
少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有するEPO類似体の組織保護特性を以下のアッセイを利用して判定した。
神経細胞の培養は18日齢ラット胎児の海馬により樹立された。脳を取り出し、髄膜を除いて、海馬を分離した。次いで、2.5パーセントトリプシン溶液中で37℃にて5分間インキュベートし、続いて、タイトレーションを行うことにより、細胞を分散した。その細胞懸濁物を、1パーセントB-27サプリメント(Gibco, Rockville, MD, USA)を含有する無血清Neurobasal培地で希釈し、ポリオルニチンでコーティングしたカバースリップ上にカバースリップ当たり80,000細胞の密度で播種する。次いで、細胞をEPOで一晩前処理し、その後、1)EPO、2)少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有するEPO類似体、あるいは3)アシアロ型EPOを加えてまたは加えないで、5μM TMTに24時間曝露した。培養物を10〜14日間、in vitroにて使用した。
細胞の生存力を臭化3-(4,5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイにより測定した。Denziot, F.,およびLang, R. 1986. Rapid Colormetric Assay for Cell Growth and Survival。テトラゾリウム染料手法を修飾することにより信頼性が向上する。J Immunol Methods 89: 271-277。要するに、MTTテトラゾリウム塩を無血清培地に溶かして最終濃度0.75mg/mlにし、それを37℃にて3時間の処置の終了時に細胞に添加した。その後、培地を除去し、1N HCl：イソプロパノール(1:24)で抽出した。560nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
図1Aに示すように、少なくとも１つの追加N結合炭水化物鎖および／または少なくとも１つの追加O結合炭水化物鎖を有するEPO類似体は組織保護機能を示さなかった。
これらの実施形態は本発明のいくつかの態様を例示するものであり、本明細書において記載し、また、主張する本発明は、本明細書において開示する特定の実施形態によって範囲が限定されることはない。いかなる等価な実施形態も本発明の範囲内であることが意図される。実際に、本明細書において示し、また、記載したものに加えて、本発明の種々の変形は、当業者ならば上述の説明から明らかになるであろう。このような変形もまた添付の特許請求の範囲に入ることが意図される。本明細書において引用した全ての参考文献は、全ての目的のためにそれらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる。
トリメチル錫への曝露により誘発される細胞死の防御における種々の形態のEPOの有効性の比較。 トリメチル錫への曝露により誘発される細胞死の防御における種々の形態のEPOの有効性の比較。

Claims (27)

  1. ヒトにおけるヘマトクリットレベルを調節する方法であって、
    rhuEPOよりも血清半減期が長く、かつ、組織保護機能を含んでなるエリスロポエチン製品を準備する工程、および
    治療上有効な量のエリスロポエチン製品を投与する工程
    を含む、方法。
  2. エリスロポエチン製品を準備する工程が、
    少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖またはO結合オリゴ糖鎖に対する少なくとも1つの化学修飾、すなわち酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその組合せを含む化学修飾、によりrhuEPOを修飾する工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 治療上有効な量のエリスロポエチン製品を投与する工程が、匹敵する目的のヘマトクリットを得るためにエリスロポエチン製品をrhuEPOより低いモル量にて投与することを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約20パーセント長い、請求項１に記載の方法。
  5. 血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約40パーセント長い、請求項４に記載の方法。
  6. 少なくとも1種のエリスロポエチン誘導体であって、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖が酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその混合の結果として少なくとも1つの化学修飾を有し、かつ、血清半減期がrhuEPOよりも長い前期エリスロポエチン誘導体を含んでなる、人造エリスロポエチン製品。
  7. 組織保護機能を有する、請求項６に記載のエリスロポエチン製品。
  8. その少なくとも1つの化学修飾が、少なくとも１つのさらなる酸残基を与えるための少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖の酸化を含む、請求項６に記載のエリスロポエチン製品。
  9. その少なくとも1つの化学修飾が、EPO製品の負電荷を増強するための少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖の硫酸化を含む、請求項６に記載のエリスロポエチン製品。
  10. その少なくとも1つの化学修飾が、EPO製品の負電荷を増強するための少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖のリン酸化を含む、請求項６に記載のエリスロポエチン製品。
  11. その少なくとも1つの化学修飾が少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖への、少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖の付加を含む、請求項６に記載のエリスロポエチン製品。
  12. 延長された血清半減期と組織保護活性とを有するエリスロポエチン製品を製造する方法であって、
    少なくとも1種のエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体を準備する工程、および
    その少なくとも１種の内因性エリスロポエチンまたは組換えエリスロポエチン上の少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖を酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその組合せにより修飾する工程
    を含む、方法。
  13. 修飾する工程が、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖上の少なくとも1つの隣接するヒドロキシルを少なくとも1つの酸残基と置き換える工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖の少なくとも1つの隣接するヒドロキシルを少なくとも1つの酸残基と置き換える工程が、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖上の複数の隣接するヒドロキシルを複数の酸残基と置き換えることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 修飾する工程が、
    有機溶媒を準備する工程、
    そのエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体をその有機溶媒に溶かして溶液を作る工程、
    少なくとも１種の縮合剤を準備する工程、
    少なくとも１種の硫酸供与体を準備する工程、および
    その少なくとも１種の縮合剤とその少なくとも１種の硫酸供与体とをその溶液中で混合する工程
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  16. 修飾する工程が、
    有機溶媒を準備する工程、
    そのエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体をその有機溶媒に溶かして溶液を作る工程、
    少なくとも１種の縮合剤を準備する工程、
    リン酸を準備する工程、および
    その少なくとも１種の縮合剤とその少なくとも１種のリン酸とをその溶液中で混合する工程
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  17. 修飾する工程が、
    有機溶媒を準備する工程、
    そのエリスロポエチンまたはエリスロポエチン誘導体をその有機溶媒に溶かして第1溶液を作る工程、
    少なくとも１種の酸化剤を準備する工程、
    その少なくとも１種の酸化剤を第1溶液に添加して第2溶液を作る工程、
    少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖を準備する工程、および
    その少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖を第2溶液に混ぜる工程
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  18. 少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖を準備する工程が、少なくとも1つのポリエチレングリコール鎖に、その鎖の末端にて、少なくとも１つの第1級アミノ部分を与えることを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 組織損傷の危険性がある患者における貧血を治療する方法であって、
    エリスロポエチン製品に、少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖またはO結合オリゴ糖鎖に対する少なくとも1つの化学修飾、すなわち酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化、またはその組合せを含む化学修飾、を施す工程、
    治療上有効な量のエリスロポエチン製品を、匹敵する目的のヘマトクリットを得るためにrhuEPOより低いモル量にて投与する工程、
    を含み、
    ここで、そのエリスロポエチン製品が組織保護機能を有する、
    方法。
  20. エリスロポエチン製品の血清半減期がrhuEPOよりも長い、請求項１９に記載の方法。
  21. 血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約20パーセント長い、請求項２０に記載の方法。
  22. 血清半減期がrhuEPOの血清半減期よりも少なくとも約40パーセント長い、請求項２１に記載の方法。
  23. 治療上有効な量の少なくとも1種のエリスロポエチン誘導体、すなわち少なくとも1つのN結合オリゴ糖鎖または少なくとも1つのO結合オリゴ糖鎖が酸化、硫酸化、リン酸化、ペグ化またはその混合の結果として少なくとも1つの化学修飾を有するエリスロポエチン誘導体、を含んでなる医薬組成物であって、ここで、その少なくとも1種のエリスロポエチン誘導体の血清半減期が組換えエリスロポエチンよりも長く、かつ、その誘導体が組織保護機能を有する、医薬組成物。
  24. 少なくとも1種の製薬上許容される担体をさらに含んでなる、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. その少なくとも1種の製薬上許容される担体が少なくとも1種の希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビヒクル、またはその混合物を含んでなる、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 少なくとも1つの湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、またはその組合せをさらに含んでなる、請求項２３に記載の医薬組成物。
  27. 少なくとも1種の組織保護サイトカインをさらに含んでなる、請求項２３に記載の医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7718363B2 (en) 2003-04-25 2010-05-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds
WO2006061853A2 (en) * 2004-12-10 2006-06-15 Serum Institute Of India Limited Novel erythropoietic compounds and a process for producing erythropoietic compounds
TWI376234B (en) 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
CA3079319A1 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Araim Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective peptides and uses thereof
SG10202011946PA (en) 2008-01-22 2020-12-30 Araim Pharmaceuticals Inc Tissue protective peptides and peptide analogs for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage
CN101671388B (zh) * 2008-09-09 2013-01-02 曹国栋 血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用
RU2475273C1 (ru) * 2012-04-02 2013-02-20 Юлия Николаевна Козлова Способ получения полимерного цемента медицинского назначения
CN102746405B (zh) * 2012-07-24 2013-08-21 深圳赛保尔生物药业有限公司 重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法
RU2664588C2 (ru) * 2015-11-05 2018-08-21 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе
EP3448415A4 (en) 2016-04-29 2019-11-06 Araim Pharmaceuticals, Inc. TISSUE PROTECTIVE PEPTIDES FOR PREVENTING AND TREATING DISEASES AND DISORDERS ASSOCIATED WITH TISSUE INJURY
CN112741895A (zh) * 2021-01-19 2021-05-04 中国人民解放军陆军军医大学 Epo类似物在制备治疗脓毒症药物中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
WO2001081405A2 (en) * 2000-04-21 2001-11-01 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
DK1311285T4 (en) * 2000-05-15 2017-07-24 Hoffmann La Roche Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative

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