KR20050083682A - 내인성 에리트로포이에틴의 조직 보호 활성을 유지하는 장기 작용성 에리트로포이에틴 - Google Patents

내인성 에리트로포이에틴의 조직 보호 활성을 유지하는 장기 작용성 에리트로포이에틴 Download PDF

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안토니 케라미
존 스마트
마이클 브라인즈
칼라 케라미
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워렌 파마슈티칼즈 인코포레이티드
더 케네쓰 에스. 워렌 인스티튜트 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 화학적으로 개질된 장기 작용성 에리트로포이에틴을 함유하는 약학 조성물을 투여함으로써 내인성 에리트로포이에틴의 조직 보호 활성을 유지하면서 개체의 적혈구 용적율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 신규의 화학적으로 개질된 장기 작용성 에리트로포이에틴, 화학적으로 개질된 장기 작용성 에리트로포이에틴의 제조방법 및 화학적으로 개질된 장기 작용성 에리트로포이에틴을 포함하는 조성물도 개시되어 있다.

Description

내인성 에리트로포이에틴의 조직 보호 활성을 유지하는 장기 작용성 에리트로포이에틴{LONG ACTING ERYTHROPOIETINS THAT MAINTAIN TISSUE PROTECTIVE ACTIVITY OF ENDOGENOUS ERYTHROPOIETIN}
본 발명은 개질 후 조직 보호능을 유리하게 유지하는 장기 작용성 에리트로포이에틴에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 혈청 반감기가 증가될 뿐만 아니라 생체 내에서 천연 단백질의 조직 보호 기능을 유지하는 방식으로 화학적으로 개질된 장기 작용성 에리트로포이에틴에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 장기 작용성 에리트로포이에틴으로 빈혈 및 빈혈 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 에리트로포이에틴이 조직 보호능을 나타내는지의 여부를 결정하는데 유용한 분석법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 참조
본원은 2002년 9월 9일자로 출원된 미국 특허 가출원 제 60/409,020 호(이는 본원에 참고로 인용되어 있음)에 대해 우선권을 주장한다.
천연 발생 또는 내인성 에리트로포이에틴(EPO)은 주로 간에서 생성되는 당단백 호르몬이다. 내인성 EPO는 165개의 아미노산을 포함하고, 약 30,000 내지 약 34,000달톤의 분자량(인간에서)을 갖는다. 3개의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 및 1개의 O-결합 올리고사카라이드 쇄로 이루어진 EPO에서의 글라이코실 잔기는 이 단백질의 총 중량의 약 40%를 차지한다. N-결합 올리고사카라이드 쇄는 위치 24, 38 및 83에서 아스파라긴의 아마이드 질소에 결합하는 반면, O-결합 올리고사카라이드 쇄는 위치 126에 위치하는 세린 잔기의 산소에 결합한다. EPO 단백질은 α, β 및 무시알산의 3가지 형태로 발생될 수 있다. α 및 β 형태는 동일한 역가, 생물학적 활성 및 분자량을 갖지만 탄수화물 성분에서 약간 상이한 반면, 무시알산 형태는 말단 시알산(탄수화물)이 제거된 α 또는 β 형태이다.
최근까지, 내인성 EPO의 주요 기능은 다른 성장 인자와 함께 작용하여 반응성 골수 적혈구 전구체 세포의 증식 및 성숙을 촉진시키고 개체의 적혈구 용적율(적혈구 세포를 함유하는 전혈의 백분율)을 유지시키는 것이다. 적혈구 세포를 생성시키는 과정은 적혈구 생성(erythropoiesis)으로 불리며, 이는 순환을 방해하지 않으면서 적절한 조직 산소화를 위해 적혈구 세포의 수를 최적화시키는 정밀하게 제어되는 생리학적 메카니즘이다. 예를 들어, 적혈구에 의한 산소 수송이 감소되면, EPO는 골수에서 전구체 세포를 성숙한 적혈구 세포(이는 이어 순환계 내로 방출됨)로 전환시키는 과정을 촉진시킴으로써 적혈구 세포 생성을 증가시킨다. 순환계 내의 적혈구 세포의 수가 정상적인 조직 순환에 필요한 것보다 초과될 때에는, 순환계 내의 EPO가 감소된다. 따라서, 신체가 건강한 상태인 경우, EPO는 매우 낮은 농도로 혈장에 존재하며, 이것만으로도 노화를 통해 정상적으로 손실되는 적혈구 세포의 대체를 촉진시키기에 충분하다. 혈장 EPO 수준은 통상 0.01단위/ml 내지 0.03단위/ml이다.
신장이 개체의 EPO의 대부분을 생성시킨다는 점에서, 만성 신부전증(CRF)에서와 같은 신장 기능의 상실은 EPO 생성에 장애를 일으키고 종종 빈혈을 유발시킨다. 유사하게, 빈혈은 암 같은 다른 만성 질환, 또는 이러한 질환에 수반되는 치료(예: 화학요법)에 의해 발병될 수도 있다. 따라서, 내인성 EPO와 실질적으로 동일한 생물학적 효과를 갖는 재조합 EPO(아래에 더욱 상세하게 논의됨)를 투여하면 적혈구 세포가 감소된 개체의 적혈구 용적율 수준을 회복하는데 유용한 것으로 입증되었다.
만성 질환의 경우 적혈구 용적율 수준을 유지시킴에 있어서의 재조합 EPO의 역할에 덧붙여, 재조합 EPO는 선택적이거나 예정된 수술 전에 적혈구 세포 수준을 높임으로써 수혈의 필요성을 감소시키거나 수혈이 필요하지 않게 만드는데 사용되어 왔다. 예를 들어, 환자가 혈액 공급자로부터 바이러스 또는 병원균을 수용하는데 대한 우려를 불식시키거나 수혈에 대한 종교적인 제한 문제를 해결하기 위해 재조합 EPO를 투여할 수 있다.
뿐만 아니라, 최근의 몇 가지 증거는 사이토카인 상과(superfamily)의 일원으로서의 EPO가 다른 중요한 치료 특성(이는 EPO 수용체(EPO-R)와의 상호작용을 통해 매개됨)을 가짐을 암시하고 있다. 예를 들어, EPO와 그의 수용체는, EPO와 수용체 사이의 상호작용이 저산소성 세포 환경을 개선시킴은 물론 대사 스트레스에 의해 야기되는 예정된 세포 사멸을 조정하는 역할을 하는 보상 반응을 제공하기 때문에, 조직 손상을 약화시키는데 중요한 역할을 할 수 있다. 실제로, 만성 신부전증 및/또는 암 환자는 일반적으로 EPO로 치료받은 후 더욱 편안한 느낌과 정신이 더욱 맑아짐(이는 환자의 증가된 적혈구 용적율에 기인한 효과임)을 경험하게 된다. 그러나, 최근, 국제 특허 공개 제 WO/02053580 호 및 미국 특허원 제 2002/0086816 호 및 제 2003/0072737 호에 논의되어 있는 바와 같이, 이러한 개선은 EPO의 조직 보호 및 향상 효과에 기인한 것이다.
최근의 연구에 따르면, 또한 혈액 뇌 장벽을 형성하는 모세혈관도 EPO 수용체를 나타내기 때문에 전신 투여된 EPO가 완전한 혈액 뇌 장벽을 가로지를 수 있음이 암시되고 있다. 이로써, 말초 순환계로부터 뇌 내로의 수용체-매개되는 세포간 수송의 해부학적 기초가 제공된다.
말기 신장 질환으로부터 발병된 빈혈을 치료하고, AZT(지도부딘) 요법과 함께 사용될 때 HIV-감염된 환자를 치료하며, 화학요법 효과의 균형을 맞추는데, 상표명 PROCRIT(등록상표)(뉴저지주 래리턴 소재의 오르토 바이오테크 인코포레이티드(Ortho Biotech Inc.)) 및 EPOGEN(등록상표)(캘리포니아주 싸우전드 오크스 소재의 암젠, 인코포레이티드(Amgen, Inc.))으로 시판중인 재조합 EPO(에포에틴 알파)를 사용해왔다. 재조합 EPO의 치료 효과는 무수히 많지만, 현재까지는 재조합 EPO를 주로 만성 빈혈을 치료하는데 사용하고 있다. 이와 관련하여, 재조합 EPO는 전형적으로 환자의 제안된 적혈구 용적율 범위를 회복시키기 위하여 정맥내 또는 피하 주사에 의해 약 6주 내지 8주동안 50 내지 150단위/kg의 초기 투여량으로 주당 3회 투여된다. 환자가 약 30% 내지 약 36% 내에 속하는 양 같은 목적하는 적혈구 용적율 수준을 달성한 후에는, EPO 요법을 유지함으로써 철 결핍증 및 동시 발생 질환 없이 그 수준을 유지할 수 있다. 환자 개인의 필요에 따라 투여 요구량은 달라질 수 있지만, 전형적으로 유지 투여량은 1주일에 약 3회 투여될 수 있다(투여량이 더 많으면 3회 미만 투여될 수 있음).
재조합 EPO의 투여량 및 투여 빈도는 부분적으로는 분자가 생체 내에 있을 때 제한될 수 있는 분자의 반감기에 의해 결정된다. 예를 들어, 정맥내 투여되는 EPOGEN(등록상표)은 보고된 바에 따르면 CRF를 갖는 성인 및 소아과 환자에서 약 4 내지 13시간에 이르는 순환계 반감기와의 1차 동역학에 일치되는 속도로 제거된다. 따라서, 치료 효과를 나타내기 위해서는, 재조합 EPO의 비교적 짧은 반감기를 고려하도록 투여량 및 투여 빈도를 맞추어야 한다.
또한, 재조합 EPO가 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여되기 때문에, 간호사 또는 의사는 종종 환자에게 재조합 EPO를 투여해야 한다. 이는 환자에게 불편함을 가중시키며, 분자의 반감기를 연장시키는 것이 바람직할 수 있는 또 다른 이유이다. 이로써, 연장된 반감기가 동일하거나 개선된 치료 이점을 제공하면서 투여 요구량을 감소시킨다는 전제하에 지난 10년동안 재조합 EPO의 반감기를 증가시키려는 노력은 연구자의 주의를 집중시켰다.
실제로, 인간 EPO에 대한 최근의 실험은 EPO의 시알산-함유 탄수화물 함량과 그의 순환 반감기 및 생체내 생물 활성 사이에 직접적인 관련이 있음을 입증하고 있다. PCT 공개 제 WO 95/05465 호에서 논의된 바와 같이, 시알산 잔기는 당 쇄의 말단을 캡핑하여 간에 의한 갈락토즈의 검출을 방지한다. N-결합 올리고사카라이드 쇄는 전형적으로 쇄당 4개 이하의 시알산을 갖고, O-결합 올리고사카라이드 쇄는 쇄당 2개 이하의 시알산을 갖는다. 그러므로, 개질되지 않은 EPO 폴리펩타이드는 총 14개 이하의 시알산을 수용할 수 있다.
시간이 지남에 따라, 이들 시알산 잔기가 단백질로부터 절단됨으로써 갈락토즈 쇄가 노출되어 간에 의해 검출된다. 간이 갈락토즈 쇄를 검출하면, 단백질은 혈액으로부터 여과된다. 이로써, EPO 분자당 시알산 함량의 단계적 증가는 갈락토즈 쇄를 더욱 차폐하여 생물학적 활성(정상 마우스의 적혈구 용적율을 상승시키는, 등몰 농도의 단리된 에리트로포이에틴 이소폼(isoform)의 능력에 의해 측정됨)의 상응하는 단계적 증가를 제공하는 것으로 생각된다. 개질되지 않은 EPO가 시알산 부위를 14개만 함유하기 때문에, 이러한 접근법은 EPO의 반감기를 연장시키는 능력이 제한될 수 있다. 이는 추가의 올리고사카라이드 쇄를 갖도록 처리된 EPO 유사체가 향상된 생물학적 활성을 갖게 된다는 가설로 이어진다. 이러한 추가적인 당화 부위를 제공함으로써, 말단을 갖는 추가의 올리고사카라이드 쇄가 시알산 잔기로 개질될 수 있다. PCT 공개 제 WO 91/05867 호, 제 WO 94/09257 호 및 제 WO 01/81405 호 참조.
예를 들어, 개질된 EPO 유사체는 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 가질 수 있다. 구체적으로, 제 WO 01/81405 호는 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 및/또는 138번의 아미노산에서 분자에 N-결합 탄수화물 쇄를 부가함을 개시한다. 개질된 EPO 분자는 1 내지 4개의 추가적인 당화 부위를 어느 곳에나 가질 수 있으며, 이로써 분자에 2 내지 16개의 시알산 잔기가 부가될 수 있다.
그러나, EPO의 혈청 반감기를 증가시키고자 하는 노력이 성공적인 것으로 입증되고 적혈구 용적율 수준을 유지하는데 유용하기는 하지만, 이들 추가적인 당화 부위가 EPO의 다른 기능에 대해 가질 수 있는 효과에 대해서는 주의를 기울이지 않았다.
따라서, 내인성 EPO의 기능을 유지하면서 연장된 혈청 반감기(장기 작용성)를 갖는 개질된 EPO를 제공하는 것이 유리하다. 구체적으로, 당해 분야에서는, 빈혈 및/또는 관련 질환을 앓는 개체를 치료하는 약학 조성물에 사용하기 위한, 적혈구 조혈 기능 및 조직 보호 기능을 갖는 장기 작용성 EPO 화합물이 요구되고 있다. 또한, 특정 EPO가 내인성 EPO의 조직 보호능에 대해 길항성인지의 여부를 결정하는 분석법도 요구되고 있다.
발명의 개요
본 발명은 재조합 인간 에리트로포이에틴(rhuEPO)보다 더 긴 혈청 반감기를 갖고 조직 보호 기능을 갖는 에리트로포이에틴 생성물을 제공하는 단계 및 치료 효과량의 에리트로포이에틴 생성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 적혈구 용적율 수준을 조절하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 에리트로포이에틴 생성물을 제공하는 단계는 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 O-결합 올리고사카라이드 쇄중 하나 이상에 대한 하나 이상의 화학적 개질 방법으로 재조합 에리트로포이에틴을 개질시키는 단계를 추가로 포함하며, 이 때 화학적 개질 방법은 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합을 포함한다.
또한, 치료 효과량의 에리트로포이에틴 생성물을 투여하는 단계는 상응하는 표적 적혈구 용적율을 수득하기 위한 rhuEPO보다 더 적은 몰량으로 에리트로포이에틴 생성물을 투여함을 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 혈청 반감기는 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 20% 이상 더 길다. 다른 실시태양에서, 혈청 반감기는 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 40% 이상 더 길다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 에리트로포이에틴 유도체를 포함하는 인공(man-made) 에리트로포이에틴 생성물에 관한 것으로, 이 때 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄는 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화, 또는 이들의 조합의 결과로서 하나 이상의 화학적 개질을 갖고, 에리트로포이에틴 생성물은 rhuEPO보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 에리트로포이에틴 생성물은 바람직하게는 조직 보호 기능을 갖는다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 화학적 개질은 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 산화시켜 하나 이상의 추가적인 산 잔기를 제공함을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 화학적 개질은, 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 황화시켜 EPO 생성물에 증가된 음전하를 제공함을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 화학적 개질은 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 포스포릴화시켜 EPO 생성물에 증가된 음전하를 제공함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 화학적 개질은, 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄에 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 첨가함을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 제공하는 단계; 및 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합에 의해 하나 이상의 내인성 또는 재조합 에리트로포이에틴상의 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 개질시키는 단계를 포함하는, 연장된 혈청 반감기 및 조직 보호 활성을 갖는 에리트로포이에틴 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
개질시키는 단계는 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄상의 하나 이상의 인접 하이드록실을 하나 이상의 산 잔기로 대체하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄상의 하나 이상의 인접 하이드록실을 하나 이상의 산 잔기로 대체하는 단계는 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄상의 다수의 인접 하이드록실을 다수의 산 잔기로 대체함을 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 개질시키는 단계는 유기 용매를 제공하는 단계; 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 유기 용매에 용해시켜 용액을 형성시키는 단계; 하나 이상의 축합제를 제공하는 단계; 하나 이상의 설페이트 공여체를 제공하는 단계; 및 하나 이상의 축합제와 하나 이상의 설페이트 공여체를 용액 내로 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 개질시키는 단계는 또한 유기 용매를 제공하는 단계; 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 유기 용매에 용해시켜 용액을 형성하는 단계; 하나 이상의 축합제를 제공하는 단계; 인산을 제공하는 단계; 및 하나 이상의 축합제 및 하나 이상의 인산을 용액 내로 혼합하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 개질시키는 단계는 유기 용매를 제공하는 단계; 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 유기 용매에 용해시켜 제 1 용액을 형성시키는 단계; 하나 이상의 산화제를 제공하는 단계; 하나 이상의 산화제를 제 1 용액에 첨가하여 제 2 용액을 형성시키는 단계; 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제공하는 단계; 및 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제 2 용액 내로 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제공하는 단계는 쇄의 말단에 하나 이상의 1급 아미노 잔기를 갖는 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제공함을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 O-결합 올리고사카라이드 쇄중 하나 이상에 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 화학적 개질을 갖는 에리트로포이에틴 생성물을 제공하는 단계; 치료 효과량의 에리트로포이에틴 생성물을 투여하는 단계를 포함하는, 조직 손상의 위험이 있는 환자에서 빈혈을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 에리트로포이에틴 생성물은 상당하는 표적 적혈구 용적율을 수득하기 위한 rhuEPO보다 더 적은 몰량으로 투여되고, 에리트로포이에틴 생성물은 조직 보호 기능을 갖는다.
본 발명의 이 요지에서, 에리트로포이에틴 생성물은 바람직하게는 rhuEPO보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 한 실시태양에서, 혈청 반감기는 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 20% 이상 더 길다. 다른 실시태양에서, 혈청 반감기는 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 40% 이상 더 길다.
본 발명은 또한 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄가 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화, 또는 이들의 조합의 결과로서 하나 이상의 화학적 개질을 갖는 하나 이상의 에리트로포이에틴 유도체(이는 재조합 에리트로포이에틴보다 더 긴 혈청 반감기를 갖고 조직 보호 기능을 가짐) 치료 효과량을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체는 하나 이상의 희석제, 보조제, 부형제, 비히클 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 하나 이상의 습윤제, 유화제, pH 완충제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 하나 이상의 조직 보호 사이토카인을 추가로 포함한다.
하기 도면과 관련하여 제공되는 하기 상세한 설명으로부터 본 발명의 추가적인 특징 및 이점을 확인할 수 있다.
도 1A는 트라이메틸 틴에 노출됨으로써 야기되는 세포 사멸에 대해 보호함에 있어서 EPO의 다양한 형태의 효율을 비교한 도면이다.
도 1B는 트라이메틸 틴에 노출됨으로써 야기되는 세포 사멸에 대해 보호함에 있어서 EPO의 다양한 형태의 효율을 비교한 도면이다.
본 발명은 내인성 EPO의 기능이 유지되도록 탄수화물 쇄로 화학적으로 개질된 연장된 혈청 반감기(장기 작용성)를 갖는 EPO 분자의 용도에 관한 것이다. 배경기술에 논의된 바와 같이, EPO의 반감기를 연장시키려는 노력은 통상적으로 갈락토즈 쇄가 노출되지 않도록 보호하기 위하여 EPO 분자에 추가의 탄수화물 쇄를 첨가하는데 집중되었다. 그러나, 첨가된 탄수화물 쇄는, 예를 들어 보다 긴 반김기를 달성하기 위하여 기능이 희생되도록, EPO 유사체의 기능에 영향을 끼치는 것으로 생각된다. 적혈구 조혈 활성을 갖는 재조합 EPO보다 더 긴 반감기를 갖는 공지의 EPO 유사체가 존재하지만, 이들 유사체는 EPO의 최근에 발견된 다른 치료 효과, 예컨대 조직 보호 활성을 보유하지 않는다.
예를 들어, 오브라이언(O'Brien) 펩타이드로도 불리는 30 내지 47번 아미노산에 상응하는 EPO의 17개 아미노산 분절은 시험관 내에서 조직 보호 활성을 갖지만 시험관 내에서 적혈구 조혈 활성은 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 캠파나(Campana, W.M.), 미사시(Misasi, R.) 및 오브라이언(O'Brien, J.S.)의 문헌[Int. J. Mol. Med., 1, 235-41 (1998)] 참조. 따라서, 오브라이언 펩타이드 내에 추가적인 당화부위를 갖는 개질된 EPO 분자는 다른 시험관내 분석법에서 조직 보호 활성을 갖지 않을 수 있는 것으로 생각된다. 또한, EPO 분자의 3차원 배향이 기능에 중요하기 때문에, 분자에 당화 부위를 첨가하는면 전체적인 기능이 방해받을 수 있다.
따라서, 본 발명은 적혈구 조혈 활성, 조직 보호 활성, 세포간 수송능, 또는 이들의 조합중 하나 이상을 갖는 장기 작용성 EPO에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 적혈구 조혈 활성, 및 조직 보호 활성 또는 세포간 수송능중 하나 이상을 갖는다.
한 실시태양에서, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 재조합 EPO의 혈청 반감기보다 약 20% 이상 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 장기 작용성 EPO의 혈청 반감기는 재조합 EPO의 반감기보다 약 30% 이상 더 길다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 재조합 EPO의 혈청 반감기보다 약 40% 이상 더 길다.
간단히, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 천연(내인성) EPO와 비교하여, 바람직하게는 천연 인간 EPO와 비교하여, 하나 이상의 개질 방법으로 변화된 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 분자를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 탄수화물 쇄에 대해 다수의 개질이 진행된다.
한 실시태양에서는, 천연 EPO의 탄수화물 쇄상의 인접 하이드록실을 산 잔기로 산화시켜, 본 발명의 장기 작용성 EPO 분자를 생성시킨다. 또 다른 실시태양에서는, EPO상의 시알산 잔기를 덜 불안정한 산 잔기로 대체한다. 또 다른 실시태양에서는, EPO의 탄수화물 쇄를 황화 및/또는 포스포릴화시켜 본 발명에 따른 장기 작용성 EPO를 생성시킨다. 다른 실시태양에서는, 폴리에틸렌 글라이콜을 EPO의 탄수화물 쇄에 첨가함으로써 본 발명의 장기 작용성 EPO를 생성시킨다. 전술한 개질의 임의의 조합도 본 발명에서 고려된다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 하나 이상의 상기 장기 작용성 EPO 분자를 포함하는 약학 조성물을 비롯한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 장기 작용성 EPO 분자는 빈혈 및 관련 질환, 특히 급성 신부전증, 패혈증, HIV, 화학요법 등과 같은(이들로 한정되지는 않음) 질환으로부터 야기되는 합병증을 갖는 질환을 치료하는 약학 조성물에 혼입시키기 위해 고려된다.
본 발명은 또한 빈혈 및 관련 질환을 치료하는 방법뿐만 아니라 치료 절차에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본원에 사용되는 용어 "치료"는 치료 및 예방 또는 방지용 처치(이의 목적은 표적 병리학적 상태 또는 질병을 방지하거나 둔화(경감)시키는 것임)를 일컫는다. 치료가 필요한 대상은 이미 질병을 앓고 있는 대상뿐만 아니라 질병을 앓기 쉽거나 질병을 예방해야 하는 대상을 포함한다. 본 발명은 장기 투여, 단기 치료 및/또는 간헐적 투여에 장기 작용성 EPO를 사용할 것을 고려한다. 본원에서, "장기 투여"는 보다 긴 기간동안 초기 치료 효과(활성)를 유지하기 위하여 급속 방식과 반대되는 지속 방식으로 약제(들)를 투여함을 일컬으며, "간헐적 투여"는 중단 없이 연속적으로 수행되지 않고 본질상 주기적인 치료이다.
본 발명의 장기 작용성 EPO 및 그의 용도는 임의의 포유동물에 적용가능하다. 본원에 사용되는 용어 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 경주용 또는 애완동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 본 발명의 장기 작용성 EPO의 투여는 경구, 정맥내, 비강내, 국부, 관강내, 흡입 또는 비경구 투여를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않으며, 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 복강내, 점막하, 피내 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 EPO 수용체를 갖는 신체 구역 내로 다른 분자를 수송하는 캐리어로서의 본 발명에 따른 장기 작용성 EPO 분자의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 분자는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 침투력이 불량하기 때문에, 이들 분자를 본 발명의 장기 작용성 EPO에 연결하여 이들 분자를 뇌 내로 안전하고 효과적으로 수송하는 시스템을 제공한다. 또한, 이후 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 신체의 다른 구역(예: 망막, 심장 및 폐)이 EPO 수용체를 나타내기 때문에, 본 발명의 장기 작용성 EPO 분자는 이러한 구역을 통한 침투력이 불량한 분자에 대해 수송 시스템으로서 작용할 수 있다.
더욱이, 본 발명은 특정 EPO가 내인성 EPO의 기능을 유지하는지의 여부를 결정하기 위한 분석법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 분석법은 개질된 EPO가 조직 보호성인지, 즉 내인성 EPO와 관련하여 작용제인지의 여부를 결정할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "작용제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 천연 EPO의 생물학적 활성을 모방하는 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "길항제"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 천연 EPO의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 한 실시태양에서, 특정 EPO의 시험은 시험관내 분석법, 예컨대 P19 세포 및/또는 래트 운동 신경 세포 분석법에서 이루어진다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 분석법은 래트 국소 허혈, 척수 외상 및 비쿠쿨린(bicuculline) 발작 모델 같은 다양한 분석법을 이용하여 생체 내에서 특정 EPO를 평가함을 포함한다.
기능
배경기술에서 논의된 바와 같이, EPO의 반감기를 증가시키고자 하는 다양한 시도는 EPO 유사체가 더욱 긴 반감기를 갖고 적혈구 조혈 활성을 유지한다는 점에서 성공적이었다. 또한, 논의된 바와 같이, 보다 긴 반감기를 갖는 EPO 유사체는 아미노산 서열에 첨가된 추가의 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 분자를 주로 포함하였다. 그러나, 이들 추가적인 탄수화물 쇄는 EPO의 다른 치료 이점(예: 조직 보호 기능 및 분자의 세포간 수송능)을 방해할 수 있는 것으로 예상된다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 오브라이언 펩타이드에 탄수화물 쇄가 첨가되면, 조직 보호 기능에 대한 이 펩타이드의 중요성에 기초한 기능에 영향을 끼칠 수 있다. 또한, 첨가된 탄수화물 쇄는 오브라이언 펩타이드 내이거나 오브라이언 펩타이드 외부이거나에 관계없이 분자의 3차원 배향에 영향을 끼치는 것으로 생각된다. 예를 들어, 분자의 3차원 형상에서, 추가적인 탄수화물 쇄는 기능에 필수적인 분자의 구역을 차단할 수 있다. 뿐만 아니라, 당화(또는 탄수화물 쇄의 첨가) 방법은 또한 당단백의 기능에도 영향을 끼칠 수 있는 것으로 생각된다.
조직 보호능
여분의 탄수화물 쇄가 당단백의 기능에 영향을 끼칠 수 있는 가능성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 5개의 N-결합 탄수화물 쇄(재조합 EPO의 3개의 N-결합 탄수화물 쇄와 비교하여)를 갖는 EPO 유사체의 형태를 연구하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 32번 아미노산에 여분의 당화 부위를 가짐으로써 재조합 EPO(에포에틴 알파)보다 약 3배 더 긴 반감기를 갖게 된 EPO 유사체를 사용하였다.
이 EPO 유사체는 전신 주사 후 뇌척수액 내에 출현하였지만(도 1A), 이는 놀랍게도 후속 P19 시험관내 분석법에서 평가하였을 때 조직 보호성이 아니었다. 조직 보호 활성의 이러한 결여는 예기치 못한 것이었다. 또한, 조직 보호 활성이 없으면, 빈혈 환자가 조직 보호능을 필요로 하는 다른 질환을 앓고 있는 경우 빈혈 환자의 치료에 사용될 때 합병증을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 비-조직 보호성 EPO 유사체가 조직 보호 반응을 촉발시키는 수용체를 놓고 조직 보호성 내인성 EPO와 경쟁하는 경우에는, 이러한 EPO 유사체의 사용으로 인해 외상에 기인한 손상 범위를 실제로 악화시킬 수 있다. 실제로, 이러한 EPO 유사체를 투여받은 환자가 발작을 일으키면, 발작으로 인한 경색 부피가 EPO 유사체로 치료받지 않은 개체보다 실제로 더 클 수 있다.
임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 발견은 하나 이상의 추가적인 EPO 수용체 형태가 적혈구 전구체의 신호와 상이한 신호를 나타내는 신경 세포 조직에 기능적으로 존재하고 특정 EPO 유사체가 이러한 수용체 형태에 결합하는 내인성 EPO의 능력을 중화시킬 수 있음을 암시한다. 내인성 EPO와 이들 EPO 유사체 사이의 뚜렷이 상이한 생물학적 활성은 EPO 분자의 상이한 영역에 반응하는 기능 면에서 상이한 EPO 수용체를 통해 수용체 신호가 발생됨을 암시한다. 실제로, EPO 수용체 유전자 단백질 서열이 적혈구 전구체에 의해 발현되는 것과 동일한 것으로 보고되어 있기는 하지만, 시험관내에서 EPO에 대한 신경 세포-유형 수용체의 결합 친화력은 적혈구 전구체의 EPO 수용체보다 훨씬 더 낮다. 예컨대, 마스다(Masuda, S.) 등의 문헌[J Biol Chem, 268, 11208-16 (1993)] 참조. 아마도, 이러한 차이들은 보조 단백질로부터 야기되고, 적혈구 성숙 프로그램에서 활성화된 것과는 상이한 신호 경로를 이용함을 의미할 수 있다. 흥미롭게도, 친화력의 이러한 차이는 EPO의 완전한 탈당에 의해 변화되지 않으며, 이는 천연-활성 결합이 통상 EPO의 비-당화된 AB 루프 영역에서 이루어질 경우 예상되지 못한 결과이다. 상기 서적 참조. 또한, 별아교세포에 의해 생성된 EPO(이는 아마도 신경 세포 같은 다른 세포에 의해 생성된 것과 동일한 생성물임)는 또한 신장에 의해 생성된 것보다 더 작다. 마스다의 문헌[J Bio Chem, 269, 19488-93 (1994)] 참조. 이러한 차이는 상이한 당화 정도의 결과인 것으로 보인다. 상기 문헌 참조. 시알산이 제거된 천연 리간드가 이들 공지의 수용체 단백질과 친화력에서 차이를 나타내는지의 여부는 아직 결정되지 않았으나, 명확한 관계가 있다.
EPO 수용체 개질 보조 단백질의 존재에 덧붙여, EPO 수용체는 다수의 손질된 수용체(절단된 가용성 수용체 포함)가 존재하는 복잡한 유전자이다. 야마지(Yamaji, R.) 등의 문헌[Eur J Biochem, 239, 494-500]; 야마지 등의 문헌[Bichim Biophys Acta, 1403, 169-78 (1998)]; 배런(Barron, C.) 등의 문헌[Gene, 147, 263-8 (1994)]; 킨(Chin, K.) 등의 문헌[Brain Res Mol Brain Res, 81, 29-42 (2000)]; 후지타(Fujita, M.) 등의 문헌[Lukemia, 11 Suppl 3, 444-5 (1997)]; 웨스텐펠더(Westenfelder, C.), 비들(Biddle, D. L.) 및 바라노우스키(Baranowski, R. L.) 등의 문헌[Kid. Internat., 55, 808-820 (1999)] 참조. 이들 임의의 수용체가 EPO의 신경 효과를 보조하는지의 여부도 결정되어야 할 것으로 남아 있다.
또한, 배경기술에서 논의된 바와 같이, 오브라이언 펩타이드는 시험관 내에서 조직 보호 활성은 갖지만 적혈구 조혈 활성은 갖지 않는 것으로 알려져 왔다. 실제로, 오브라이언 펩타이드 내에 첨가된 탄수화물 쇄를 함유하는 EPO 유사체 상에서 수행된 분석에서는 EPO 유사체가 조직 보호능을 갖지 않는 것으로 입증되었다. 이 결과는, 탄수화물 쇄의 첨가와 같은 오브라이언 펩타이드에 대한 특정 개질이 단백질의 기능을 방해함을 암시한다. 오브라이언 펩타이드에 대한 개질을 갖는 EPO 유사체는 EPO 수용체에 결합하는 내인성 EPO의 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단하므로 신체 내에 위치하는 내인성 EPO에 대한 길항제로서 작용할 수 있다. 이로써, 이러한 EPO 유사체 사용시 외상에 기인한 손상 한도가 증가될 위험이 있다. 그러므로, 오브라이언 펩타이드가 개질된 EPO 유사체는 또한 래트 운동 신경 세포 분석법 같은 다른 시험관내 분석법, 및 래트 국소 허혈, 비쿠쿨린 발작, 래트 망막 허혈 및 척수 외상 분석법 같은 생체내 분석법에서 조직 보호능을 갖지 않을 것으로 생각된다.
수용체 매개되는 세포간 수송
상기와 동일한 EPO 유사체, 즉 5개의 N-결합 탄수화물 쇄(재조합 EPO의 3개의 N-결합 탄수화물 쇄와 비교하여)를 갖는 EPO 유사체를 사용하여, 본 발명자들은 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 유사체의 능력을 연구하였다. EPO 유사체는 전신 주사 후에 뇌척수액 내에 출현하였다(도 1A 및 도 1B). 임의의 특정 이론에 얽매임 없이, 혈액 뇌 장벽을 구성하는 모세혈관도 EPO 수용체를 나타내고 말초 순환계로부터 뇌 내로의 수용체-매개되는 세포간 수송의 해부학적 기초를 제공하기 때문에, EPO 유사체가 완전한 혈액 뇌 장벽을 가로지를 수 있는 것으로 생각된다. 이로써, 다른 전신 투여된 EPO 유사체도 혈액 뇌 장벽뿐만 아니라 EPO 수용체를 나타내는 모세혈관을 갖는 다른 장벽을 횡단할 수 있는 것으로 생각된다.
요컨대, 종래 기술의 EPO 유사체가 내인성 EPO의 기능중 적어도 일부를 희생시키면서 적혈구 조혈 활성을 유지하는 것으로 밝혀진 바, 당해 분야에서는 내인성 EPO의 공지 기능을 모두 유지하는 장기 작용성 EPO에 대한 요구가 있다. 유리하게도, 본 발명은 재조합 EPO에 비해 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 내인성 EPO의 기능(즉, 조직 보호 기능 및 세포간 수송능)을 유지하는 본 발명의 장기 작용성 EPO에 관한 것이다. 이러한 유익한 단백질을 제공하기 위해 EPO를 개질시키는 다양한 방법이 다음 부분에 기재된다.
천연 EPO의 개질
본 발명의 장기 작용성 EPO는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 일반적으로는, EPO에 부착된 탄수화물(당) 쇄를 화학적으로 개질시킴으로써, 장기 작용성 EPO를 생성시킬 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "탄수화물 쇄"는 내인성 EPO에서 발견되는 N-결합 올리고사카라이드 쇄 및 O-결합 올리고사카라이드 쇄, EPO 유사체에서 발견되는 추가적인 N-결합 올리고사카라이드 쇄 및 O-결합 올리고사카라이드 쇄, 및 EPO에 부착된 임의의 다른 탄수화물 쇄, 구체적으로는 당 쇄를 일컫는다.
한 실시태양에서는, 내인성 EPO의 조직 보호능이 방해되지 않도록 하기 위해 내인성 또는 재조합 EPO를 개질에 사용한다. 또한, 오브라이언 펩타이드(즉, 30 내지 47번 아미노산 서열) 부근에 추가의 당화 부위가 존재하지 않는다면 본 발명에 따라 개질시키는 데에 EPO 유사체가 고려된다. 본원에 사용되는 용어 "EPO 유사체"는 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 갖는 개질된 EPO 분자를 일컫는다. 한 실시태양에서, 개질에 사용되는 EPO 유사체는 오브라이언 펩타이드의 약 5개 아미노산 내에 임의의 추가적인 당화 부위를 갖지 않는다. 다른 실시태양에서는, EPO 유사체가 오브라이언 펩타이드의 약 3개의 아미노산 내에 임의의 추가적인 당화 부위를 갖지 않는다. 또 다른 실시태양에서, EPO 유사체는 오브라이언 펩타이드 내에 임의의 추가적인 당화 부위를 포함하지 않는다.
EPO 유사체를 3차원 공간 면에서 검토하고, 추가적인 탄수화물 쇄가 오브라이언 펩타이드를 차단하지 않거나 조직 보호 기능의 상실을 야기하지 않는 것으로 확인되면, EPO 유사체를 본 발명에 따라 개질하는데 사용할 수 있다. 다른 요지에서는, 당화 방법이 펩타이드의 조직 보호 기능을 억제하지 않는다면, EPO 유사체를 본 발명에 따라 개질하는데 사용함이 고려된다. 또 다른 요지에서는, 오브라이언 펩타이드에 하나의 탄수화물 쇄(또는 그 이하)가 존재하는 경우, EPO 유사체를 본 발명에 따른 개질에 사용할 수 있다. 예를 들어, 내인성 EPO는 38번 아미노산에 탄수화물 쇄를 함유하고, 오브라이언 펩타이드 내의 추가적인 탄수화물 쇄는 단백질의 조직 보호 활성을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 오브라이언 펩타이드에 하나의 탄수화물 쇄를 갖거나 탄수화물 쇄를 갖지 않는 EPO 유사체가 개질에 사용되는 것으로 고려된다. 한 실시태양에서, 38번 아미노산에 부착된 탄수화물 쇄는 단백질의 다른 임의의 위치로 이전될 수 있다.
본 발명에 따른 개질의 비한정적인 예는 (1) 인접 하이드록실의 산화를 통해 탄수화물 쇄에 추가적인 산 잔기를 제공함; (2) 시알산 잔기를 덜 불안정한 잔기로 대체함; (3) 황화 및/또는 포스포릴화에 의해 에리트로포이에틴상의 음전하를 증가시킴; 및/또는 (4) 탄수화물 쇄를 더욱 복잡한 분자로 종결시킴을 포함한다. 따라서, EPO의 탄수화물 쇄에 대한 개질은 다른 절차중에서도 산화, 황화, 포스포릴화 및/또는 PEG일화를 포함할 수 있으며, 이들은 아래에 더욱 상세하게 기재되고 예시적인 실시예 1에 추가로 예시된다.
당 쇄를 산화시키고 시알산 잔기를 대체함
본 발명의 화학적으로 개질된 장기 작용성 EPO는 탄수화물(당)이 산화되어 추가적인 산 잔기를 제공하는 EPO를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 시알산 잔기가 덜 불안정한 산 잔기로 대체된다. 이러한 유형의 개질에 의해 분자의 반감기가 내인성 EPO에 비해 증가되는데, 이는 간이 선별하여 순환계로부터 관련 단백질을 제거하는 갈락토즈 쇄가 검출되지 않도록 보호되기 때문이다. EPO상의 탄수화물 쇄에 대한 더욱 실질적인 화학적 개질에 의해, 본 발명의 장기 작용성 EPO의 혈청 반감기가 크게 증가된다. 예를 들어, 더욱 많은 인접 하이드록실이 산에 의해 대체될 때, 혈청 반감기가 더욱 크게 증가한다.
당해 분야의 숙련자가 에리트로포이에틴의 갈락토즈 단위를 전환시키는 몇 가지 적합한 방법을 인지하고 있기는 하지만, 한가지 적합한 방법은 (1) 인접 하이드록실을 갖는 당 분자를 퍼아이오데이트로 개질시켜 알데하이드를 형성하고; (2) 이 알데하이드를 산화시켜 산을 생성시킴을 포함한다. 당 쇄를 산화시켜 알데하이드를 생성시키는데 적합한 시약은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 퍼아이오데이트(예: 과요오드산나트륨) 및 당 옥시다제(예: 갈락토즈 옥시다제)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 숙련자는 알데하이드를 변형시키는데 적합한 시약, 예를 들어 정량용 베네딕트 용액(Quantitative Benedict Solution)(피셔(Fisher)에서 구입가능함)을 알고 있다. 한 실시태양에서는, 당 분자를 과요오드산나트륨으로 산화시키고, 정량용 베네딕트 용액(피셔)으로 추가로 처리하여, 알데하이드를 산으로 전환시킨다.
다른 실시태양에서는, 약 0 내지 13개의 시알산 잔기를 갖는 EPO 이성질체, 또는 시알산 잔기를 갖지 않는 하나 이상의 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 유사체를 갈락토즈 옥시다제에 의해 산화시킨다. EPO의 무시알산 형태, 즉 말단 탄수화물(시알산)이 제거된 EPO의 α 또는 β 형태를 본 발명의 이 요지에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게는, 무시알산 에리트로포이에틴(asialoerythropoietin)을 사용한다. 산화시킨 후, EPO를 다른 산화제(예: 정량용 베네딕트 용액)와 반응시켜, 알데하이드를 산으로 변형시킨다.
또 다른 실시태양에서는, 사산화루테늄 시스템을 사용하여 당쇄상에 산을 생성시킬 수 있다. 이러한 변형에 관련된 산이 EPO 분자로부터 스트립핑된다고 해도 이들 개질이 갈락토즈 쇄를 포함함을 고려하면, 간이 선별하는 성분인 갈락토즈 쇄가 노출되지 않을 것이기 때문에 분자는 간에 의한 제거를 피할 수 있어야 한다.
음전하를 증가시킴
본 발명의 다른 요지에서는, EPO 분자에 설페이트 및/또는 포스페이트를 첨가하여 분자의 음전하를 증가시킴으로써 분자의 반감기를 증가시킴에 의해, 본 발명의 장기 작용 EPO를 생성시킨다. 달리 말해, 단백질, 당지질, 글라이코사미노글라이칸 및 스테로이드를 비롯한 설페이트 공여체로부터의 설퓨릴기의 전달을 포함하는 황화에 의해, EPO 분자의 음전하를 증가시킬 수 있다. 또한, 탄수화물 내로 인산기를 도입함으로써도 음전하를 증가시킬 수 있다.
인슐린의 황화에 적합한 한 가지 방법이 폰거(S. Pongor) 등의 문헌[Preparation of High-Potency, Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diabetes, Vol. 32, No. 12, 1983년 12월]에 논의되어 있다. 예를 들면, N,N'-다이사이클로헥실 카보다이이미드(DCC) 같은 축합제 및 설페이트 공여체의 존재하에 다이메틸폼아마이드(DMF) 같은 유기 용매 중에서 인슐린 황화를 수행하였다. 축합제의 양을 변화시킴으로써, 황화의 정도를 8배 범위에 걸쳐 조절할 수 있다. 통상적으로 제조된 황화된 인슐린은 인슐린 생체 활성이 크게 손실되지만, 폰거 방법에 의해 제조된 황화된 인슐린의 생체 활성은 개질되지 않은 인슐린의 78% 내지 87%로 가변적이다.
EPO에 대해 유사한 절차를 이용함으로써, 당해 분야의 숙련자는 황화의 양, 따라서 화학적으로 개질된 EPO의 혈청 반감기를 조절할 수 있다. 예를 들어, 약 4℃에서 EPO 또는 EPO 유사체를 하나 이상의 수용성 카보다이이미드, 바람직하게는 DCC에 용해시켜 단백질에 설페이트를 첨가함으로써 EPO의 음전하를 증가시킬 수 있다. DCC가 설페이트 공여체로서 바람직하긴 하지만, 당해 분야의 숙련자는 본 발명에 사용하기 적합한 다른 설페이트 공여체를 용이하게 알아낼 수 있다.
유사한 절차를 이용하여, 포스페이트 공여체로서 인산(H3PO4)을 사용하는 EPO의 포스포릴화를 제어할 수 있다. 마찬가지로, 인산이 바람직하지만, 숙련자는 EPO의 포스포릴화를 수행하기에 적합한 다른 포스페이트 공여체를 용이하게 선택할 수 있다.
탄수화물 쇄를 PEG로 종결시킴
하기 화학식을 갖는 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)(길고 안전한 임상적 역사를 갖는 화합물)을 첨가함으로써, EPO의 탄수화물 쇄를 또한 개질할 수 있다:
PEG는 또한 하기 화학식의 메톡시 PEG(mPEG)일 수도 있다:
한 실시태양에서, PEG는 아미노 PEG, 바람직하게는 말단에 1급 아미노기를 갖는 메톡시 PEG(mPEG-NH2)이다. 말단에 1급 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글라이콜 쇄는 매우 유용한 작용화된 중합체이다. mPEG-NH2상의 아미노 말단기는 통상적인 PEG상에 존재하는 하이드록실기보다 아실화제에 대해 더욱 반응성이며, 이들은 또한 용이하게 환원성 아민화 반응을 수행한다. 다른 실시태양에서, PEG는 친전자적으로 활성화된 PEG, 예컨대 mPEG-석신이미딜 프로피온에이트(mPEG-SPA) 또는 mPEG-석신이미딜 뷰타노에이트(mPEG-SBA)이며, 이들 둘은 모두 알라바마주 버밍햄 소재의 넥타 쎄라퓨틱스(Nektar Therapeutics)에서 시판중이다. 또 다른 실시태양에서, PEG는 메톡시 PEG-하이드라자이드이다.
한 실시태양에서는, 퍼아이오데이트(상기 논의된 바와 같음)로 산화시킨 후 사이아노보로하이드라이드 및 아미노 PEG를 사용함으로써, 하나 이상의 PEG를 첨가한다. 예를 들어, 용액중의 EPO를 먼저 실온에서 소정 시간동안 퍼아이오데이트(예: 과요오드산나트륨)로 산화시키면, 탄수화물 쇄에 알데하이드를 생성시킨다. 적합한 퍼아이오데이트는 시그마(Sigma)에서 시판중인 소듐 메타-퍼아이오데이트이다. 이어, 완충액 교환에 의해 퍼아이오데이트를 제거할 수 있으며, 이 때 EPO의 N-결합 올리고사카라이드 기상의 산화된 시알산기를 사이아노보로하이드라이드의 존재하에 하나 이상의 아미노 PEG에 노출시킬 수 있다. 사용하기에 적합한 PEG는 넥타 쎄라퓨틱스에서 시판중인 메톡시-PEG-하이드라자이드를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 실시태양에서는, 갈락토즈 옥시다제로 산화시킨 후 말단 갈락토즈 잔기에 PEG 기를 부착함으로써, 하나 이상의 PEG를 첨가한다. 예를 들면, 완충액중 EPO의 무시알산 형태(노출된 말단 갈락토즈 잔기를 가짐)를 먼저 갈락토즈 옥시다제(시그마에서 시판중임)에 노출시켜, 탄수화물 쇄에 알데하이드를 생성시킨다. 이어, 완충액 교환에 의해 완충액을 제거할 수 있으며, 이 때 산화된 갈락토즈 잔기를 사이아노보로하이드라이드의 존재하에 하나 이상의 아미노 PEG에 노출시킬 수 있다.
상기 제공된 방법은 이들로만 국한시키고자 하는 의도는 아니거나, 또는 다른 방법을 이용하여 본 발명의 화합물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 당해 분야의 숙련자는 다른 장기 작용성 EPO 유도체, 예를 들어 본원에 참고로 인용되어 있는 국제 특허 공개 제 WO/02053580 호 및 미국 특허원 제 2002/0086816 호 및 제 2003/0072737 호에 개시되어 있는 조직 보호 사이토카인을 생성시키는데 이들 화학적 개질을 적용할 수 있음을 인식할 것이다.
EPO 분자의 제조
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여, 본 발명의 장기 작용성 EPO 및 EPO-관련 분자를 제조할 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 장기 작용성 EPO를 생성시킨 후 정제시킬 수 있는 비히클을 의미할 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염될 때 원위치에서 개질된 에리트로포이에틴 유전자 생성물을 나타낼 수 있는 세포를 의미한다. 이들은 세균, 곤충, 식물, 인간을 비롯한 포유동물 숙주 시스템, 예를 들어 장기 작용성 EPO 생성물 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 에리트로포이에틴-관련 분자 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프모모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터(예: 아데노바이러스 레이트 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 수획하는 인간 세포 시스템, 예컨대 HT1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3을 비롯한 포유동물 세포 시스템을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
또한, 목적하는 특정 방식으로 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 목적하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 개질 및 처리하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 개질 및 처리는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같이, 상이한 숙주 세포는 번역후 처리, 및 단백질 및 유전자 생성물의 개질에 특이적인 메카니즘을 갖는다. 발현되는 외래 단백질의 올바른 개질 및 처리를 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이 목적을 위하여, 일차 전사체의 적절한 처리, 유전자 생성물의 당화 및 포스포릴화를 위한 세포 기작을 갖는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 인간 숙주 세포를 비롯한 이러한 포유동물 숙주 세포는 HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38을 포함하지만 이들로 국한되는 것은 아니다.
재조합 단백질의 장기간에 걸친 고수율 생성을 위하여, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 재조합 조직 보호 사이토카인-관련 분자 유전자 생성물을 안정하게 발현하는 세포주를 처리할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적절한 발현 조절 요소, 예컨대 프로모터, 증강자, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등 및 선택가능한 마커에 의해 조절된 DNA로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 처리된 세포를 풍부한 배지에서 1 내지 2일간 생육시킨 다음 선택적인 배지로 교환할 수 있다. 재조합 플라스미드내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그의 염색체내로 안정적으로 혼입하여 생육시킴으로써 다시 클로닝되어 세포주내로 확장될 수 있는 중심을 형성할 수 있도록 한다. 이 방법을 유리하게 이용하여, EPO 뮤테인-관련 분자 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 처리할 수 있다. 이러한 처리된 세포주는 EPO-관련 분자 유전자 생성물의 내인성 활성에 영향을 끼치는 화합물의 선별 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
다르게는, 삽입된 조절 요소가 내인성 에리트로포이에틴 뮤테인 유전자와 작동가능하게 연결되도록 이종 DNA 조절 요소를 안정한 세포주 또는 클로닝된 미생물의 게놈 내로 삽입함으로써, 세포주 또는 미생물 내의 내인성 EPO 뮤테인 유전자의 발현 특징을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 발현되는 유전자 생성물의 발현을 촉진시킬 수 있는 조절 요소를 세포주 또는 미생물에 삽입함으로써, 통상 "전사 침묵성"인 내인성 EPO 뮤테인 유전자, 즉 통상 발현되지 않거나 또는 세포주에서 매우 낮은 수준으로만 발현되는 EPO 유전자를 활성화시킬 수 있다. 다르게는, 세포 유형을 가리지 않고 작용하는 무차별적인 조절 요소를 삽입함으로써, 전사 침묵성인 내인성 EPO 유전자를 활성화시킬 수 있다.
당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있을 뿐만 아니라 본원에 참고로 인용된 프랑스 특허 제 2646438 호, 미국 특허 제 4,215,051 호 및 제 5,578,461 호, 및 국제 특허 공개 제 WO 93/09222 호 및 제 WO 91/06667 호에 기재되어 있는 표적화된 동종 재조합 같은 기법을 이용하여, 내인성 에리트로포이에틴 유전자와 작동가능하게 연결되도록 이종 조절 요소를 안정한 세포주 또는 클로닝된 미생물 내로 삽입할 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 장기 작용성 EPO 분자를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 장기 작용성 EPO가 유리하게 적혈구 조혈 활성뿐만 아니라 조직 보호능 및 세포간 수송능을 갖기 때문에, 이들은 다양한 조직 손상(예: 발작 및 심근 경색)의 위험도 있는 개체에서 빈혈 및 관련 질환을 치료하기 위해 고려된다. 또한, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 정신적 기능의 열화(예: 알쯔하이머병, 파킨슨병 등)도 앓고 있는 개체에서 빈혈 및 관련 질환을 치료하는 데에도 고려된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 정상적인 노화 과정에 기인한 질환, 예컨대 넘어짐, 쉬운 타박상 등을 야기하는 평형 문제를 갖는 개체에서 빈혈을 치료하기 위해 고려된다. 또한, 본 발명은 EPO 수용체가 있는 모세혈관을 갖는 장벽을 가로지르는 침투력이 불량한 다른 분자에 대한 담체로서의 본 발명에 따른 장기 작용성 EPO의 용도에 관한 것이다.
예를 들어, 상기 논의된 임의의 장기 작용성 EPO를 본 발명의 약학 조성물에 포함시킬 수 있다. 또한, 다양한 EPO 유사체를 하나 이상의 조직 보호 사이토카인과 블렌딩시켜 본 발명의 약학 조성물에 포함시킬 수 있는데, 이는 아래에서 더욱 상세하게 논의된다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의 개질된 EPO를 바람직하게는 정제된 형태로 함유한다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 달리 말해, 본 발명의 약학 조성물은 적절한 투여량 및 투여법이 이용되는 경우 표적 질환이 치료될 수 있도록 하는 양의 본 발명의 개질된 EPO를 포함한다. 또한, 아래에 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 약학 조성물은 비독성 투여량으로 전달되어야 한다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의 장기 작용성 EPO 화합물 및 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기에 적합한 양의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 구체적인 실시태양에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에서 동물, 더욱 특히는 인간에 대한 사용이 승인되거나 또는 미국 약전 또는 다른 통상적으로 인정되는 외국 약전에 동물, 더욱 특히는 인간에 대한 사용이 기재되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 일컫는다. 이러한 약학 담체는 물 및 오일(석유, 동물, 식물 또는 합성 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등 포함)중 염수 용액 같은 멸균 액체일 수 있다. 약학 조성물을 정맥내 투여할 경우에는 염수 용액이 바람직한 담체이다. 특히 주사가능한 용액의 경우에는 염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글라이세롤 용액도 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글라이세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글라이세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로 배합될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 아미노기, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 카복실기를 갖도록 형성된 염을 포함한다.
장기 작용성 EPO를 포함하는 조성물
상기 간단히 언급된 바와 같이, 본 발명의 임의의 장기 작용성 EPO가 약학 조성물에 사용할 것으로 고려된다. 한 실시태양에서는, 인접 하이드록실의 산화로부터 생성된 장기 작용성 EPO를 본 발명의 약학 조성물에 포함시킨다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 시알산 잔기를 덜 불안정한 잔기로 대체한 결과 생성된 생성물인 하나 이상의 장기 작용성 EPO를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물에 포함된 장기 작용성 EPO는 황화 및/또는 포스포릴화에 의해 EPO의 음전하를 증가시킨 결과로서 생성된 것이다. 다른 실시태양에서는, 탄수화물 쇄를 더욱 복잡한 분자, 예컨대 PEG 쇄로 종결시킴으로써 생성된 장기 작용성 EPO를 본 발명의 약학 조성물에 포함시킨다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물에 본 발명의 임의의 방법에 의해 생성된 장기 작용성 EPO의 혼합물을 사용할 것을 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 시알산 잔기를 덜 불안정한 잔기로 대체시켜 생성된 하나 이상의 장기 작용성 EPO 및 황화 및/또는 포스포릴화에 의해 EPO의 음전화를 증가시켜 생성된 하나 이상의 장기 작용성 EPO를 포함할 수 있다.
수송 시스템
앞서 논의된 바와 같이, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 EPO 수용체가 있는 모세관을 갖는 장벽을 횡단할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 다른 요지는 EPO 수용체가 있는 신체의 표적 구역 내로의 장벽 침투력이 불량한 분자에 대한 담체로서 본 발명의 장기 작용성 EPO를 사용하는 수송 시스템이다. 이러한 수송 시스템은 유리하게는 완전한 장벽을 가로지르는 신규하고 안전한 운반 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 수송 시스템은 본 발명의 장기 작용성 EPO 및 뇌 침투력이 불량한 하나 이상의 분자를 포함하여, 완전한 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 안전한 신규 운반 방법을 제공한다. 달리 말해, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 뇌 침투력이 불량한 분자가 분자의 "트로이 목마"로서 작용하여 작거나 큰 분자 진단 또는 치료 분자의 뇌 흡수를 향상시키도록 할 수 있다.
실제로, 인간 뇌종양 치료시의 중요한 문제점은 뇌의 특정 영역에 치료제를 전달하여 이들 치료제를 뇌종양 내에 분포시키고 이들 치료제를 뇌종양에 표적 투여할 필요가 있다는 것이다. 진단 및 치료에 효과적인 분자는 종양에 인접한 뇌의 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지르지 못하거나 또는 적절한 양으로 혈액-종양 장벽(BTB)을 가로지르지 못한다. 따라서, 뇌에만 특징적이고 혈관을 우회하는 신규 전달 방법이 필요하다. 예를 들면, 진단 또는 치료 분자로서 사용될 수 있는 항체는 그들의 크기 때문에 효과적이기에 충분한 양으로 BTB를 횡단하지 못한다. 이로써, 본 발명의 장기 작용성 EPO를 이러한 분자에 대한 담체로서 사용하여 BBB 또는 BTB를 횡단할 수 있도록 한다. 본 발명의 장기 작용성 EPO와 함께 사용될 수 있는 분자의 일례는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드이며, 이는 생체 내에서 종양발생 신호를 억제하거나 뇌의 유전자 발현을 영상화하는데 통상적으로 사용된다. 또한, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 다양한 유전자 요법(바이러스성 또는 비-바이러스성 제제)(이들 제제는 너무 커서 종종 보조제 없이는 BTB를 횡단할 수 없음)에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 다양한 화학요법 제제에 대한 담체-매개되는 전달체로서 사용될 수 있다. BBB 및 BTB에서 발현되는 약물-활성 유출 전달체는 뇌로부터 혈액으로 화학요법 제제를 활발히 역유출시키기 때문에, 뇌에 이러한 제제가 분포되지 않도록 억제하거나 방지할 수 있다. 중추신경계(CNS) 외부의 암을 치료하는데 사용되어 온 전통적인 화학요법 분자중 대부분이 뇌종양의 치료에 효과적이지 못한 것은 부분적으로는 이러한 이유 때문이다. 따라서, 이러한 화학요법 제제용 담체로서 본 발명의 장기 작용성 EPO를 사용하는 것은, 상기 약제를 뇌 내로 운반할 뿐만 아니라 치료를 위해 상기 약제를 뇌 내에 유지시키는 데에도 유용할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 활성 유출 전달체를 억제하는 약물과 장기 작용성 EPO를 혼합하여, 통상 뇌로부터 혈액으로 유출되는 화학요법 제제의 흡수를 더욱 확실하게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 EPO 수용체를 갖는 다른 신체 구역에서 불량한 침투력을 갖는 분자에 대한 담체로서 개질된 EPO를 사용함을 고려한다. 이러한 세포의 비제한적인 예는 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부 및 자궁내막 세포를 포함한다. 특히, 반응성 세포는 신경 세포; 망막 세포: 광수용체(막대 및 원뿔) 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 및 뮐러(Mueller) 세포; 근육 세포; 심장 세포: 심근 세포, 박동 조율 세포, 굴심방 결절 세포, 굴 결절 세포 및 결합 조직 세포(방실결절 세포 및 방실 다발 세포); 폐 세포; 간 세포: 간세포, 별세포 및 쿠퍼(Kupffer) 세포; 신장 세포: 혈관사이 세포, 신장 상피 세포 및 요세관 사이질 세포; 소장 세포: 술잔 세포, 창자샘(움) 세포 및 소화관 내분비 세포; 부신피질 세포: 사구체 세포, 다발 세포 및 그물 세포; 부신수질 세포: 크롬 친화 세포; 모세관 세포: 혈관주위세포; 고환 세포: 레이디히(Leydig) 세포, 서톨리(Sertoli) 세포 및 정자 세포, 및 이들의 전구체; 난소 세포: 그라피안(Graffian) 난포 세포 및 원시 난포 세포; 췌장 세포: 랑게르한스섬 세포, α-세포, β-세포, γ-세포 및 F-세포; 골 세포: 골원세포(osteoprogenitor), 파골세포 및 조골세포; 피부 세포; 자궁내막 세포: 자궁내막 버팀질 세포 및 자궁내막 세포; 및 상기 나열된 기관에 존재하는 줄기 세포 및 내피 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
EPO 유사체와 조직 보호 사이토카인의 조성물 블렌드
상기 간략히 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 유사체(이는 연장된 혈청 반감기를 나타내지만 조직 보호 활성은 갖지 않음)를 하나 이상의 조직 보호 사이토카인과 블렌딩시켜 포함할 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 유사체(추가적인 탄수화물 쇄중 하나는 오브라이언 펩타이드에 위치함)와 함께 조직 보호 사이토카인이 본 발명의 조성물을 구성할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 조직 보호 사이토카인, 및 3차원 공간 면에서 유사체를 검토할 때 오브라이언 펩타이드를 차단하는 것으로 공지된 추가적인 탄수화물 쇄를 함유하는 하나 이상의 EPO 유사체를 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 조직 보호 사이토카인, 및 단백질에 여분의 탄수화물 쇄를 첨가하는 방법의 결과로서 조직 보호 기능을 갖지 않게 된 하나 이상의 EPO 유사체를 포함한다.
이전된 당화 부위를 갖는 EPO 유사체가 본 발명의 약학 조성물에 사용될 것으로 고려된다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 38번 아미노산의 천연 발생 당화 부위가 EPO 유사체의 다른 곳(30 내지 47번 아미노산 분절 외)에 이전되는 경우, EPO 유사체의 조직 보호능은 38번 아미노산에 당화 부위를 갖는 EPO 유사체에 비해 향상되는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 38번 아미노산으로부터 분자의 다른 곳으로 당화 부위가 이전된 EPO 유사체를 포함할 수 있다. 이전된 당화 부위는 PCT 공개 제 WO 01/81405 호에서 제안된 바와 같이 51, 57, 69, 88, 89, 136 또는 138번 아미노산에서 발생될 수 있다. 한 실시태양에서, 오브라이언 펩타이드는 1개 이하의 탄수화물 쇄를 함유한다. 다른 실시태양에서, 오브라이언 펩타이드는 2개 이상의 탄수화물 쇄를 포함한다.
본 발명의 이 요지에 사용하기 적합한 조직 보호 사이토카인은 바람직하게는 골수에 대한 효과는 갖지 않지만 내인성 사이토카인의 조직 보호 효과는 유지하는 사이토카인이지만, 조직 보호능을 나타내는 임의의 사이토카인이 본 발명에 사용될 것으로 고려된다. 예를 들어, 적합한 조직 보호 사이토카인은 구아니딘화, 아마이드화, 카밤일화(카밤오일화), 트라이나이트로페닐화, 아실화(아세틸화 또는 석신일화), 질화 또는 이들의 조합에 의해 생성되는 화학적으로 개질된 EPO를 포함한다. 또한, 하나 이상의 아르기닌, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기 또는 카복실기의 개질을 갖는 EPO 분자도 본 발명의 이 요지에 따라 조직 보호 사이토카인으로서 사용될 것이 고려된다.
뿐만 아니라, 본 발명에 사용하기 위한 추가적인 조직 보호 사이토카인은 제한된 단백질 분해, 아미노기의 제거 및/또는 본원에 참고로 인용된 사타케(Satake) 등의 문헌[1990, Biochim. Biophys. Acta 1038:125-9]에 개시되어 있는 분자 생물학적 기법에 의한 아르기닌, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기의 돌연변이 치환에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 적합한 조직 보호 사이토카인은 C7S, R10I, V11S, L12A, E13A, R14A, R14B, R14E, R14Q, Y15A, Y15F, Y15I, K20A, K20E, E21A, C29S, C29Y, C33S, C33Y, P42N, T44I, K45A, K45D, V46A, N47A, F48A, F48I, Y49A, Y49S, W51F, W51N, Q59N, E62T, L67S, L70A, D96R, S100R, S100E, S100A, S100T, G101A, G101I, L102A, R103A, S104A, S104I, L105A, T106A, T106I, T107A, T107L, L108K, L108A, S126A, F142I, R143A, S146A, N147K, N147A, F148Y, L149A, R150A, G151A, K152A, L153A, L155A, C160S, I6A, C7A, B13A, N24K, A30N, H32T, N38K, N83K, P42A, D43A, K52A, K97A, K116A, T132A, I133A, T134A, K140A, P148A, R150B, G151A, K152W, K154A, G158A, C161A 및/또는 R162A에서의 부위 변이를 갖는 하나 이상의 변이된 EPO를 포함한다. 상기 개질의 예는 본원에 참고로 인용되어 있는 동시 계류중인 미국 특허원 제 2003/0104988 호, 제 2002/0086816 호 및 제 2003/0072737 호에 기재되어 있다. 본원에 사용된 뮤테인 명명법에서는, 천연 아미노산의 한 글자 코드를 먼저 쓴 다음 EPO 분자에서의 그의 위치에 이어 대체 아미노산의 한 글자 코드를 써서, 변화된 아미노산을 기재한다. 예를 들어, S100E는 100번 아미노산에서 세린이 글루탐산으로 변경된 인간의 EPO 분자를 일컫는다.
다른 실시태양에서, 부위 변이가 I6A, C7A, K20A, P42A, D43A, K45D, K45A, F48A, Y49A, K52A, K49A, S100B, R103A, K116A, T132A, I133A, K140A, N147K, N147A, R150A, R150E, G151A, K152A, K154A, G158A, C161A 또는 R162A를 포함하지 않는다면, 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 상기 부위 변이를 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 K45D/S100E, A30N/H32T, K45D/R150E, R103E/L108S, K140A/K52A, K140A/K52A/K45A, K97A/K152A, K97A/K152A/K45A, K97A/K152A/K45A/K52A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A, K97A/K152A/K45A/K52A/K140A/K154A, N24K/N38K/N83K 및 N24K/Y15A 같은 부위 변이의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 상기 임의의 조합을 포함하지 않는다. 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 부위 변이가 N24K/N38K/N83K 및/또는 A30N/H32T 같은 치환의 조합을 포함하지 않는다면 상기 부위 변이중 임의의 것을 포함할 수 있다.
특정 개질 또는 개질의 조합은 그의 수용체(예: EPO 수용체 또는 보조 수용체)와 결합하는 뮤테인의 능력의 융통성에 영향을 끼칠 수 있다. 이러한 개질 또는 개질의 조합의 예는 K152W, R14A/Y15A, I6A, C7A, D43A, P42A, F48A, Y49A, T132A, I133A, T134A, N147A, P148A, R150A, G151A, G158A, C161A 및 R162A를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 상응하는 변이는 인간 성장 호르몬에 유해한 것으로 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 뮤테인이 그의 수용체와 결합하는 능력의 융통성에 영향을 끼칠 수 있는 하나 이상의 개질 또는 개질의 조합을 포함하지 않는다. 이러한 조직 보호 사이토카인에 대한 추가적인 논의는 2003년 7월 1일자로 출원된 동시 계류중인 미국 특허원 제 호(사건 명부 번호 10165-022-999)(발명의 명칭: "반응성 세포, 조직 및 기관의 보호, 회복 및 향상을 위한 재조합 조직 보호 사이토카인 및 이를 코딩하는 핵산")에 기재되어 있다.
마지막으로, 장기 작용성 EPO의 적혈구 조혈 효과 또는 혈청 반감기를 방해하지 않는다면, 조직 보호능을 나타내는 임의의 상과 사이토카인을 사용할 수 있다. 예로는 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-5(IL-5), 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GMCSF), 안료-상피 유도된 인자(PEDF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 있지만, 이들로 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 요지에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 유사체(연장된 혈청 반감기를 나타내지만 조직 보호 활성은 갖지 않음)를 조직 보호 기능을 나타내는 하나 이상의 작은 분자와 블렌딩시켜 포함할 수 있다. 적합한 작은 분자는 스테로이드(예: 라자로이드 및 글루코코르티코이드), 산화방지제(예: 조효소 Q10, 알파 리포산 및 NADH), 항-이화 요소(예: 글루타티온 퍼옥시다제 수퍼옥사이드 다이뮤타제, 카탈라제, 합성 촉매 소거제 및 유사 화합물), 인돌 유도체(예: 인돌아민, 카바졸 및 카볼린), 질산 중화제, 아데노신/아데노신 작용제, 식물성 약품(플라바노이드), 초본 추출물(징코 빌로바 및 투르메닉), 비타민(비타민 A, E 및 C), 옥시다제 전자 수용체 억제제(예: 잔텐 옥시다제 전자 억제제), 무기질(예: 구리, 아연 및 마그네슘), NSAIDS(예: 아스피린, 나프록센 및 이부프로펜) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 EPO 유사체, 조직 보호 사이토카인 및 조직 보호 활성을 갖는 작은 분자를 포함할 수 있다.
조직 보호 사이토카인 및/또는 작은 분자는 바람직하게는 내인성 EPO에서 유도되는 것과 동일한 중성 및 다른 반응성 세포 시스템에서의 활성을 유지하거나 이 활성을 초과하기에 충분한 양으로 본 발명의 약학 조성물에 존재한다. 한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인 및/또는 작은 분자는 개체의 적혈구 조혈 반응성 세포의 생존능 및 기능을 보호, 유지 또는 향상시킴으로써 개체의 조직 보호를 향상시키기에 충분한 양으로 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 이 요지에 따른 약학 조성물은 바람직하게는 효과적이지만 비독성인 양, 예를 들어 약 1ng 이상의 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 약 5mg 이하의 양으로 약학 조성물에 존재한다. 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 약 500ng 내지 5mg의 양으로 약학 조성물에 존재한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 약 1㎍ 내지 5mg, 바람직하게는 약 500㎍ 내지 5mg의 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 다른 실시태양에서는, 예컨대 약 1mg 내지 5mg의 보다 다량의 조직 보호 사이토카인이 본 발명의 약학 조성물에 존재한다. 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같이, 환자에게 투여되는 약학 조성물의 양은 환자의 상태 및 투여 빈도를 비롯한(이들로 한정되는 것은 아님) 다수의 인자에 따라 달라진다. 이는 투여와 관련하여 아래에서 더욱 상세하게 논의된다.
치료 및 투여 방법
전술한 장기 작용성 EPO 및 장기 작용성 EPO를 포함하는 약학 조성물은 빈혈, 빈혈 또는 빈혈 상태와 관련된 인간의 질환, 또는 빈혈을 일으키는 질환 또는 치료 방법을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 다른 조직 손상으로부터 회복되는 환자의 능력을 위태롭게 하지 않으면서 상기 질환을 치료하는데 있어서 투여 빈도가 더욱 적거나 또는 더욱 소량의 에리트로포이에틴을 투여할 수 있도록 한다.
본 발명은 전신 또는 장기 투여, 단기 치료 및/또는 간헐적인 투여에 장기 작용성 EPO를 사용할 것을 고려한다. 한 실시태양에서는, 표적 세포, 조직 또는 기관을 보호 또는 향상시키는데 본 발명의 약학 조성물을 장기 투여한다. 다른 실시태양에서는, 본 발명의 약학 조성물을 단기간, 즉 손상시 1회 치료시에만 투여할 수 있다. 또 다른 실시태양에서는, 본 발명의 약학 조성물을 주기적으로 투여한다.
조성물의 투여는 비경구 투여, 예컨대 정맥내 주사, 복강내 주사, 동맥내, 근육내, 피내 또는 피하 투여; 흡입; 경점막 투여, 예컨대 구강, 비강, 직장, 질내, 설하, 점막하 및 경피; 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물의 투여는 비경구 투여이다. 약 0.01pg 내지 약 5mg, 바람직하게는 약 1pg 내지 약 5mg의 투여량으로 투여할 수 있다. 한 실시태양에서, 투여량은 약 500pg 내지 약 5mg이다. 다른 실시태양에서, 투여량은 약 1ng 내지 약 5mg이다. 또 다른 실시태양에서, 투여량은 약 500ng 내지 약 5mg이다. 또 다른 실시태양에서, 투여량은 약 1㎍ 내지 약 5mg이다. 예를 들어, 투여량은 약 500㎍ 내지 약 5mg일 수 있다. 다른 실시태양에서, 투여량은 약 1mg 내지 약 5mg일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약학 조성물은 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액 또는 현탁액을 포함하며, 이들은 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 조성물을 의도된 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있다. 본 발명의 이 요지에서, 약학 조성물은 또한 물, 알콜, 폴리올, 글라이세린, 식물유 및 이들의 혼합물도 포함할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 단위-투여량 또는 다회-투여량 용기, 예컨대 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예컨대 주사용 멸균 염수 용액만 첨가하면 되는 동결건조 상태로 저장될 수 있다. 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 임시 주사 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다. 한 실시태양에서는, 앰뷸런스, 응급실 및 전쟁터 상황에 의한 응급 사용을 위해 본 발명의 장기 작용성 EPO의 주사 용액을 포함하는 자기 주사기(autoinjector)를 제공할 수 있다.
한 실시태양에서는, 본 발명의 약학 조성물을 통상적인 절차에 따라 인간에게 정맥내 투여하기 적합한 약학 조성물로서 배합한다. 예를 들면, 약학 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액중의 용액의 형태일 수 있다. 필요한 경우, 약학 조성물은 또한 가용화제 및/또는 주사 부위에서의 통증을 경감시키기 위한 국부 마취제(예: 리도카인)도 포함할 수 있다. 성분을 별도로 공급하거나 또는 예컨대 활성 약제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사쉐 같은 기밀-밀봉된 용기에 담겨진 동결건조된 분말 또는 무수 농축액으로서의 단위 투여형으로 함께 혼합할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 주입에 의해 투여하고자 하는 경우에는, 조성물을 분배하기 위하여 멸균 약제 등급의 물 또는 염수가 담겨진 주입 병을 사용할 수 있다. 또한, 약학 조성물을 주사에 의해 투여하고자 할 때에는, 멸균 염수의 앰풀을 제공하여 투여 전에 성분을 혼합할 수 있다.
경구 투여에 적합한 약학 조성물은 캡슐 또는 정제; 분말 또는 과립; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비-수성 액체); 식용 포움 또는 휩(whip); 유화액; 또는 이들의 혼합물로서 제공될 수 있다. 경구 제제는 약 10중량% 내지 약 95중량%의 활성 성분을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서는, 활성 성분이 약 20중량% 내지 약 80중량%의 양으로 경구 제제에 포함된다. 다른 실시태양에서는, 경구 제제가 약 25중량% 내지 약 75중량%의 활성 성분을 포함한다.
정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토즈, 전분 또는 그의 유도체, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물유, 왁스, 지방, 반고체, 액체 폴리올, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올, 당 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, 위장관에서 활성 약제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질로 경구 투여하고자 하는 활성 약제를 코팅하거나 상기 물질과 활성 약제를 혼합할 수 있다. 예를 들어, 활성 약제를 글라이세릴 모노스테아레이트, 글라이세릴 다이스테아레이트 또는 이들의 혼합물과 혼합하거나, 이들로 코팅시킬 수 있다. 따라서, 수시간에 걸쳐 활성 약제가 서서히 방출될 수 있으며, 필요한 경우, 활성 약제를 위장 내에서 붕해되지 않도록 보호할 수 있다. 또한, 특정 pH 또는 효소 조건에 의해 특정 위장관 위치에서 활성 약제의 방출을 촉진시키도록 경구 투여용 약학 조성물을 제형화시킬 수도 있다.
경피 투여에 적합한 약학 조성물은 장시간동안 수용자의 표피와 긴밀하게 접촉된 상태로 유지시키고자 하는 별개의 패치로서 제공될 수 있다. 또한, 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어노졸, 오일, 점안액, 로젠지, 향내나는 알약(pastille) 및 구강세정제, 및 이들의 조합으로서 제공될 수 있다. 피부, 구강, 눈 또는 다른 외부 조직에 국부 투여하고자 할 때에는, 국부용 연고 또는 크림을 바람직하게 사용한다. 또한, 연고에 배합될 때, 활성 성분, 즉 장기 작용성 EPO은 파라핀계 또는 수혼화성 연고 기제와 함께 사용될 수 있다. 다르게는, 수중유적형 기제 또는 유중수적형 기제를 사용하여 활성 성분을 크림에 배합할 수 있다. 국부 투여가 점안액의 형태인 경우, 본 발명의 약학 조성물은 적합한 담체, 예컨대 수성 용매에 용해 또는 현탁된 활성 성분을 바람직하게 포함한다.
비강 투여 및 폐 투여에 적합한 약학 조성물은 분말(바람직하게는 약 20마이크론 내지 약 500마이크론의 입자 크기를 가짐) 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 코 가까이에 놓인 분말 용기로부터 코를 통해 신속하게 흡입함으로써, 분말을 투여할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 따라 비강 투여하고자 하는 약학 조성물은 액체 담체, 예를 들어 비강 스프레이 또는 비강 점적액을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물을 비강 내로 직접 투여한다.
입인두 내로 들어가는 입에 무는 부분, 및 소정 투여량의 활성 성분을 제공하도록 제조될 수 있는 가압된 에어로졸, 분무기 또는 취입기를 비롯한(이들로 한정되는 것은 아님) 다른 특별하게 적합화시킨 장치를 통해 깊게 흡입함으로써, 직접적으로 폐 투여할 수 있다. 폐 흡입시키고자 하는 약학 조성물은 활성 성분의 수성 또는 오일 용액을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 입인두 내로 직접 깊이 흡입함으로써 본 발명의 약학 조성물을 투여한다.
직장 투여에 적합한 약학 조성물은 좌약 또는 관장제로서 제공될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 좌약은 약 0.5중량% 내지 10중량%의 활성 성분을 포함한다. 다른 실시태양에서, 좌약은 활성 성분을 약 1중량% 내지 8중량%로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 활성 성분은 약 2중량% 내지 약 6중량%의 양으로 좌약에 존재한다. 본 발명의 이 요지에서, 본 발명의 약학 조성물은 전통적인 결합제 및 담체(예: 트라이글라이세라이드)를 포함할 수 있다.
질 투여에 적합한 약학 조성물은 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이 제제로서 제공될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 관류액, 기관 내로의 주사에 의해서도 투여될 수 있거나 또는 국부 투여될 수 있다. 이러한 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명의 장기 작용성 EPO를 약 0.01pM 내지 약 30pM, 바람직하게는 약 15pM 내지 약 30nM로 포함한다. 한 실시태양에서, 관류 용액은 유니버시티 오브 위스콘신(University of Wisconsin; UW) 용액(약 7.4 내지 약 7.5의 pH 및 약 320mOSm/l의 삼투압을 가짐)이며, 이는 약 1U/ml 내지 약 25U/ml EPO; 5% 하이드록시에틸 전분(바람직하게는 약 200,000 내지 약 300,000의 분자량을 갖고, 에틸렌 글라이콜, 에틸렌 클로로하이드린, 염화나트륨 및 아세톤을 실질적으로 함유하지 않음), 25mM KH2PO4, 3mM 글루타티온; 5mM 아데노신; 10mM 글루코즈; 10mM HEPES 완충액; 5mM 글루콘산마그네슘; 1.5mM CaCl2; 105mM 글루콘산나트륨; 200,000단위 페니실린; 40단위 인슐린; 16mg 덱사메타손; 및 12mg 페놀 레드를 함유한다. UW 용액은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 4,798,824 호에 상세하게 논의되어 있다. 다른 실시태양에서, UW 용액은 약 0.01pg/ml 내지 약 400ng/ml, 바람직하게는 약 40ng/ml 내지 약 300ng/ml의 재조합 조직 보호 사이토카인을 함유할 수 있다.
치료가 필요한 구역에 국부적으로 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 수술시 국부 주입에 의해; 예컨대 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부 투여함으로써; 주사에 의해; 카테터에 의해; 좌약에 의해; 또는 이식물에 의해 이렇게 투여할 수 있으며, 상기 이식물은 실라스틱(silastic) 막 같은 막 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
또한, 경피 투여와 관련하여 상기 간략히 논의된 바와 같이, 본 발명의 장기 작용성 EPO는 조절된-방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 패치, 리포좀을 이용하여 또는 다른 투여 방식을 이용하여 폴리펩타이드를 투여할 수 있다. 한 실시태양에서는, 소덱(Saudek) 등의 문헌[1989, N. Engl. J. Med. 321:574]에 논의되어 있는 바와 같은 펌프를 사용할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 본원에 참고로 인용된 국제 특허 공개 제 WO 91/04014 호 및 미국 특허 제 4,704,355 호에 기재되어 있는 것과 같은 소포(특히, 리포좀)에 화합물을 전달할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 하워드(Howard) 등의 문헌[1989, J. Neurosurg. 71:105]에 논의되어 있는 물질 같은 중합체 물질을 사용하여 조절-방출 시스템을 생성시킬 수 있다.
이러한 조절 방출 시스템을 치료 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관에 인접하게 위치시키면, 전신 투여량의 일부만 필요해질 수 있다. 예컨대, 굿선(Goodson)의 문헌[Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138, 1984] 참조. 본 발명에 사용하기 위해 고려되는 다른 조절 방출 시스템은 랑거(Langer)의 문헌[Science 249:1527-1533, 1990]에 논의되어 있다.
투여
상기 투여 방법에 바람직한 효과적인 비독성 투여량의 선택은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 인자에 기초하여 상기 숙련자가 결정한다. 이러한 인자의 예는 장기 작용성 EPO의 특정 형태; EPO의 약동학적 변수, 예컨대 생체내 이용효율, 대사, 반감기 등(숙련자에게 제공됨); 치료되어야 하는 상태 또는 질환; 정상적인 개체에서 달성되어야 하는 이점; 환자의 체질량; 투여 방법; 투여 빈도, 즉 장기, 단기, 간헐적 투여; 병행되는 투약; 및 투여된 약학 제제의 효능에 영향을 끼치는 것으로 널리 알려져 있는 다른 인자를 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 담당 의사의 판단 및 특정 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
예를 들어, 내과의 참조 문헌(Physicians Desk Reference; PDR)에는, EPO로 치료되는 환자 개체군에 따라 독성을 피하기 위하여 상이한 적혈구 용적율 수준을 표적으로 한다고 기재되어 있다. 내과의 참조 문헌(54판, 519-525 및 2125-2131 (2000)) 참조. 실제로, CRF 환자에 있어서, PDR은 30% 내지 36%의 비독성 표적 적혈구 용적율을 달성하도록 EPO를 투여할 것을 권고하고 있다. 대조적으로, 화학요법중인 암 환자의 경우, PDR은 상이한 적혈구 용적율 수준에서(즉, 적혈구 용적율 수준이 40%를 초과하는 경우) 투여량을 조정하라고 교시하고 있다. PDR은 EPO로 치료하는 동안 의사가 환자의 적혈구 용적율을 모니터링하고, 독성을 피하기 위하여, 환자의 적혈구 용적율이 표적 범위의 상한에 근접하거나 그를 초과할 때 투여량을 조정하고/하거나 치료를 보류할 것을 기재하고 있다. 따라서, 본 발명의 교시내용을 익힌 숙련된 의사는 임의의 독성 합병증을 피하면서 치료 효과를 달성하기에 충분한 투여량의 EPO를 투여할 수 있어야 한다.
한 실시태양에서는, 1회 투여시 체중 1kg당 약 0.1㎍ 내지 약 100㎍의 투여량으로 본 발명의 장기 작용성 EPO를 장기 또는 전신 투여한다. 예를 들면, 화학요법을 받고 있는 암 환자를 치료함에 있어서는 매주 1회 투여시 체중 1kg당 약 1㎍ 내지 약 5㎍이 고려된다. 다른 실시태양에서, 장기 작용성 EPO의 투여량은 1회 투여시 체중 1kg당 약 5㎍ 내지 약 50㎍이다. 또 다른 실시태양에서는, 1회 투여시 체중 1kg당 약 10㎍ 내지 약 30㎍의 양으로 장기 작용성 EPO를 투여한다. 다른 실시태양에서는, 장기 작용성 EPO를 체중 1kg당 약 1㎍ 이하의 양으로 투여한다. 예를 들어, CRF 환자에서 빈혈을 치료하기 위해서 1주 1회 투여될 때에는 체중 1kg당 약 0.45㎍ 내지 약 0.75㎍의 장기 작용성 EPO가 효과적일 수 있다.
유효 투여량은 바람직하게는 약 10,000mU/ml(80ng/ml)보다 높은 장기 작용성 EPO의 혈청 수준을 달성하기에 충분하다. 한 실시태양에서는, 유효 투여량이 약 15,000mU/ml(120ng/ml) 이상의 장기 작용성 EPO의 혈청 수준을 달성한다. 다른 실시태양에서는, 유효 투여량이 약 20,000mU/ml(160ng/ml)의 장기 작용성 EPO의 혈청 수준을 달성한다. 투여한지 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10시간 후에, 또는 이들이 임의로 조합된 시간 후에 혈청 수준을 바람직하게 측정하고 혈청 수준이 달성된다. 당해 분야의 숙련자가 필요하다고 판단되면 투여를 반복할 수 있다. 예를 들어, 임상적으로 필요하다면 매일 반복해서 투여할 수 있거나, 또는 적절한 간격을 두고, 예컨대 매 1 내지 12주마다, 바람직하게는 매 1 내지 3주마다 투여를 반복할 수 있다.
본 발명의 장기 작용성 EPO가 증가된 혈청 반감기를 갖기 때문에, 신체에서의 이들의 효율 또한 증가된다. 예를 들어, 포유동물 환자가 암 치료를 위해 전신 화학요법(방사선요법 포함)을 받고 있는 경우, 이 요법동안 본 발명의 장기 작용성 EPO 약학 조성물을 투여하면 현재의 재조합 EPO 조성물의 빈도 및 양에 비해 감소된 빈도 및 투여량으로 빈혈 문제를 감소시킬 수 있다.
또한, 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물이 조직 보호 사이토카인과 블렌딩된 본 발명의 장기 작용성 EPO 또는 EPO 유사체를 포함하는 경우에는, 이 조성물을 사용하여 조직 손상의 위험 또한 있는 환자에서 빈혈 및 관련 질환을 치료할 수 있다. 예를 들어, 치료로 인한 손상 위험성의 증가를 방지하기 위하여, 현재 시판중인 EPO 유사체 대신 본 발명의 약학 조성물을 사용하여, 심장 질환의 위험이 높은 빈혈 환자를 치료할 수 있다.
치료 키트
본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 한 실시태양에서는, 효과량의 장기 작용성 EPO 및 약학적으로 허용가능한 담체를 단일 투여 바이알 또는 다른 용기에 포장할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 비경구 투여에 적합한 경우에는, 예를 들어 이 조성물을 동결 건조된 상태로 저장할 수 있다. 그러므로, 키트는 동결 건조된 조성물, 멸균 액체 담체 및 주사용 주사기를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 키트는 투여자가 매 치료 기간마다 특정량의 물질을 칭량해내고 특정량의 담체를 첨가할 수 있도록, 수회 치료에 충분한 동결건조 물질을 함유하는 앰풀을 포함한다. 다른 실시태양에서, 키트는 각각 특정량의 동결건조된 물질을 함유하는 다수의 앰풀 및 각각 특정량의 담체를 함유하는 다수의 용기를 함유하여, 투여자가 측정 또는 칭량하지 않고도 각각의 치료 기간동안 하나의 앰풀과 하나의 담체 용기의 내용물을 혼합하기만 하면 되도록 할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 키트는 본 발명의 장기 작용성 EPO의 주사 용액을 포함하는 자기 주사기를 함유한다. 또 다른 실시태양에서, 키트는 동결건조된 조성물을 갖는 하나 이상의 앰풀, 담체 용액의 하나 이상의 용기, 국부 마취제를 갖는 하나 이상의 용기 및 하나 이상의 주사기(등)를 함유한다. 앰풀 및 용기는 바람직하게는 기밀-밀봉된다.
본 발명의 약학 조성물을 주입에 의해 투여하는 경우에, 키트는 바람직하게는 약학 조성물을 갖는 하나 이상의 앰풀 및 약제 등급 물 또는 염수를 갖는 하나 이상의 주입 병을 포함한다.
본 발명에 따른 키트는 또한 가압된 에어로졸, 분무기 또는 취입기 같은 직접적인 폐 흡입에 특수하게 적합화된 장치 또는 하나 이상의 입에 무는 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 이 요지에서, 키트는 약학 조성물을 함유하는 직접 폐 흡입용 장치, 또는 본 발명의 장기 작용성 EPO의 수성 또는 오일 용액의 하나 이상의 앰풀을 포함할 수 있다.
본 발명의 장기 작용성 EPO 약학 조성물이 경구, 경피, 직장, 질 또는 비강 투여에 적합한 경우에는, 키트가 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 앰풀 및 하나 이상의 투여 보조기구를 바람직하게 포함한다. 투여 보조기구의 예는 측정 스푼(경구 투여용), 멸균 세정 패드(경피 투여용) 및 비강 흡기기(비강 투여용)를 포함하지만, 이들로 국한되지는 않는다. 이러한 키트는 단일 투여량의 장기 작용성 EPO(단기 치료) 또는 다수회의 투여량(장기 치료)을 포함할 수 있다.
또한, 키트에는 하나 이상의 유형의 용액이 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장기 작용성 EPO 약학 조성물은 알부민 용액 및 폴리솔베이트 용액 중에서 제조될 수 있다. 키트가 폴리솔베이트 용액을 포함하는 경우에는, "무-알부민"이란 말을 바람직하게는 용기 라벨 및 키트의 주패널에 보이게 한다.
더욱이, 키트는 또한 약학 제품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 고지문을 포함할 수 있으며, 이 고지문은 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매함에 대한 정부 기관의 승인을 반영한다.
EPO 분석법
본 발명은 또한 본 발명의 장기 작용성 EPO 및 본 발명의 몇몇 약학 조성물에 사용되는 EPO 유사체의 적혈구 조혈 활성 및 조직 보호능을 결정하는 분석법에 관한 것이다. 예를 들어, 실시예 2에서 더욱 상세하게 논의되는 TF-1 분석법을 이용함으로써 장기 작용성 EPO의 적혈구 조혈 효과를 입증할 수 있다. 아래에 더욱 상세하게 논의되는 시험관내 분석법 및 생체내 분석법을 이용하여 EPO 화합물의 조직 보호 특성을 시험할 수 있다. 또한, 본 발명은 특정 EPO 화합물이 조직 보호 활성을 갖는지의 여부뿐만 아니라 EPO 화합물이 내인성 EPO와 관련하여 길항제로서 작용하는지의 여부도 결정하는 시험도 고려한다.
본 발명의 분석법은 최소량의 EPO 화합물을 사용하여 단기간 내에 종결되도록 바람직하게 디자인된다. 또한, 본원에 제공된 분석법은 비한정적인 것이며, 이는 당해 분야의 숙련자가 EPO 화합물의 적혈구 조혈능 및 조직 보호능을 결정하는데 유용한 다른 분석법을 알 수 있기 때문이다.
적혈구 조혈 활성 분석법
다양한 분석법을 이용하여 특정 EPO 화합물의 적혈구 조혈 특징, 즉 적혈구 용적율 수준을 조절하는 능력을 결정할 수 있다. 한 실시태양에서는, TF1 세포주를 사용하여 특정 EPO 화합물이 적혈구 조혈 활성을 갖는지의 여부를 결정할 수 있다. 세포를 펠렛화시키고 세척한 다음, 재조합 EPO 및 흥미있는 EPO 화합물이 특정 농도로 첨가된 배지 1ml중 105개 세포의 농도로 재현탁시킬 수 있다. 개별 배양액을 24시간동안 유지시키고, 포마잔 반응 생성물(셀타이터(CellTiter); 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega))을 사용하여 세포수를 결정한다.
먼저 암컷 BALB/c 마우스를 이용하여 헤모글로빈 농도에 대한 흥미있는 EPO 화합물의 효과를 관찰함으로써, 생체내에서 상기 화합물의 효능을 평가할 수 있다. 동물에 500U/kg-bw EPO, 관심있는 EPO 화합물, 또는 동일한 부피의 비히클을 총 3주일동안(적혈구 조혈 반응을 관찰하기에 충분한 시간 간격) 1주일에 3회씩 피하 투여한다. EPO 화합물이 마우스의 혈청 헤모글로빈 농도를 상승시키면, 이 화합물을 적혈구 조혈성인 것으로 결정한다.
TF1 적백혈병 세포를 이용하여 시험관내에서 효능을 추가로 평가할 수 있다. 상대적인 TF1 세포수가 대조용의 세포수보다 많아질 정도로 증가하면, 관심있는 EPO 화합물이 적혈구 조혈성이다. 또한, 당해 분야의 숙련자는 적혈구 조혈 활성을 결정하기 위한 다른 분석법을 이용할 수 있음을 알게 될 것이다. 예를 들어, 유럽 약전은 EPO 화합물의 적혈구 조혈 활성을 결정하는데 유용한 분석법(극저산소성(exhypoxic) 마우스 분석법 및 망상적혈구 분석법 포함)을 둘 이상 논의하고 있다.
EPO 수용체에 기초한 조직 보호능 분석법
한 실시태양에서, 본 발명의 조직 보호능 분석법은 EPO의 조직 보호 수용체에 기초한다. 조직 보호 수용체의 서열이 단리되면, 특정 EPO 화합물의 조직 보호능을 결정하기 위하여 다수의 분석법을 이용할 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같이, 이용되는 분석법의 유형은 EPO 화합물의 중량에 따라 크게 달라진다.
예를 들어, 분석법은 경쟁식 분석법 또는 샌드위치 분석법 또는 입체 저해 분석법일 수 있다. 경쟁식 분석법은 공통된 결합 대상의 한정된 수의 결합 부위에 대해 시험 샘플 분석체와 경쟁하는 트레이서 유사체의 능력에 의존한다. 본원에 사용되는 용어 "분석체"는 조직 보호 활성에 대해 시험되는 흥미있는 EPO 화합물을 일컫는다. 용어 "결합 대상"은 분석체에 결합하는 임의의 단백질(전형적으로는 EPO 수용체)을 의미한다. 본원에 사용되는 "트레이서"는 라벨링된 분석체 유사체, 부동화된 분석체 유사체, 라벨링된 결합 대상, 부동화된 결합 대상 및 입체 공액체 같은 라벨링된 시약을 나타낸다. 본원에 사용되는 트레이서는 분석체와 그의 결합 대상의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 작용기일 수 있다. 비한정적인 예는 직접 검출될 수 있는 잔기(예: 플루오로크롬, 화학발광제 및 방사성 라벨), 및 검출되기 위해서 반응 또는 유도화되어야 하는 잔기(예: 효소)를 포함한다. 적합한 트레이서는 방사성 동위원소 P32, C14, I125, H3, I131 및 이들의 혼합물; 희토류 킬레이트, 플루오레사인(fluorescein), 플루오레사인 유도체, 로다민, 로다민 유도체, 단실, 움벨리페론 루시퍼라제(개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제 4,737,456 호)), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(글루코즈 옥시아제, 갈락토즈 옥시다제 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제), HRP 같은 염료 전구체를 산화시키는데 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로환상 옥시다제(우리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 및 이들의 혼합물 같은 형광 발색단(fluorophore); 바이오틴/아비딘; 스핀 라벨; 박테리오파지 라벨; 안정한 유리 라디칼; 및 이들의 조합일 수 있다. 한 실시태양에서는, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제중 하나 이상의 트레이서이다.
숙련자는 단백질 또는 폴리펩타이드에 트레이서를 공유 결합시키는 방법을 알고 있다. 예를 들어, 다이알데하이드, 카보다이이미드, 다이말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-다이아조화된 벤지딘 등과 같은 커플링제를 사용하여 상기 형광성, 화학 발광성 및 효소 라벨을 붙일 수 있으며, 이들 라벨중 몇몇은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 3,940,475 호 및 제 3,645,090 호에 기재되어 있다.
샌드위치 분석법에서는 시약의 부동화, 즉 용액중에서 유리 상태로 유지되는 임의의 분석체로부터 결합 대상을 분리시킬 필요가 있으며, 이는 비수용성 매트릭스 또는 표면에의 흡착(미국 특허 제 3,720,760 호)에 의해, 글루타르알데하이드 가교결합 같은 공유 커플링에 의해 분석 절차 전에 결합 대상 또는 분석체 유사체를 불용화시킴으로써, 또는 상기 결합 대상 또는 유사체를 후에 예컨대 면역 침전에 의해 불용화시킴으로써 달성될 수 있다.
따라서, 경쟁시키기 전 또는 후에 결합 대상을 불용화시킬 수 있고, 결합 대상에 결합된 트레이서 및 분석체를 미결합 트레이서 및 분석체로부터 분리시킨다. 따라냄으로써(결합 대상이 불용화되기 전인 경우) 또는 원심분리에 의해(결합 대상이 경쟁 반응 후에 침전된 경우) 이러한 분리를 달성할 수 있다. 시험 샘플 분석체의 양은 마커 성분의 양에 의해 측정된 결합 트레이서의 양에 반비례한다. 공지된 양의 분석체를 사용하여 투여량-반응 곡선을 만들 수 있으며, 이를 시험 결과와 비교하여 시험 샘플에 존재하는 분석체의 양을 정량적으로 결정할 수 있다. 트레이서로서 효소를 사용하는 경우, 분석법은 전형적으로 ELISA 시스템으로 일컬어진다.
연속적인 샌드위치 분석법에서는, 예컨대 부동화된 결합 대상을 사용하여 시험 샘플 분석체를 흡착하고, 세척에 의해 시험 샘플을 제거한 다음, 결합된 분석체를 이용하여 라벨링된 결합 대상을 흡착시킨 후, 결합된 물질을 나머지 트레이서로부터 분리시킨다. 결합된 트레이서의 양은 시험 샘플 분석체에 정비례한다. "동시" 샌드위치 분석법에서는, 라벨링된 결합 대상을 첨가하기 전에 시험 샘플을 분리시키지 않는다.
경쟁식 방법 및 샌드위치 방법은 방법의 필수적인 일부로서 상-분리 단계를 이용하는 반면, 입체 저해 분석법은 단일 반응 혼합물에서 수행된다. 그러나, "균질" 분석법으로 불리는 다른 경쟁식 분석법 부류에서는 상 분리를 필요로 하지 않는다. 이러한 분석법에서는, 효소와 분석체의 공액체를 제조하고, 항-분석체가 분석체에 결합할 때 항-분석체의 존재가 효소 활성을 변화시키도록 이를 사용한다. 이작용성 유기 가교를 사용하여 조직 보호 수용체를 퍼옥시다제 같은 효소에 공액 결합시킨다. EPO의 결합이 라벨의 효소 활성을 저해하거나 또는 강화하도록 EPO와 함께 사용하기 위한 공액체를 선택한다. 이러한 유형의 분석법은 전형적으로 EMIT라고 불린다.
입체 공액체는 균질 분석법을 위한 입체 장애 방법에 사용된다. 부착소(hapten)에 대한 항체가 실질적으로 항-분석체와 동시에 공액체를 결합시킬 수 없도록 저분자량의 부착소를 작은 분석체에 공유 결합시킴으로서 공액체를 합성한다. 시험 샘플에 존재하는 분석체는 항-분석체와 결합하게 되고, 이로써 항-부착소가 공액체를 결합시켜, 공액체 부착소의 특징에 변화(예컨대 부착소가 형광 발색단인 경우에는 형광의 변화)를 일으킨다.
조직 보호능 분석법에 대한 더 이상의 정보는 2002년 7월 3일자로 출원된 동시 계류중인 미국 특허원 제 10/188,905 호 및 2003년 4월 25일자로 출원된 미국 특허원 제 60/456,891 호에 논의되어 있으며, 상기 두 문헌은 본원에 참고로 인용된다.
기능 분석법
조직 보호 수용체의 서열이 확인되지 않은 상태에서는, 생체내 및 시험관내 기능 분석법을 이용하여 EPO의 조직 보호능을 결정할 수 있다. 바람직하게는, 당해 분야의 숙련자는 EPO 화합물의 조직 보호능을 결정하기 위해 단일 시험관내 또는 생체내 분석을 수행하지만, 몇몇 경우에는 화합물이 동일한 시험관내 및 생체내 조직 보호능을 나타내도록 두 분석을 모두 수행할 필요가 있을 수 있다.
실제로, 당해 분야의 숙련자는 본 발명에 개시된 분석법의 조합을 이용하여, 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 유사체가 조직 보호능을 갖는지의 여부를 결정할 수 있다. 먼저, P19 세포 및 래트 운동 신경 세포 분석법 같은 시험관내 시험을 이용하여 흥미있는 EPO 화합물이 조직 보호능을 나타내는지의 여부를 결정할 수 있다. 이어, 래트 국소 허혈, 비쿠쿨린 발작 또는 척수 외상 모델 같은 생체내 연구를 이용하여 시험관내 시험의 결과를 입증할 수 있다.
본 발명에서 고려되는 시험관내 모델은 상기 과당화된-에리트로포이에틴의 조직 보호능의 결여를 결정하는데 사용되는 모델, 즉 아래에서 더욱 상세하게 논의되고 실시예 2에 추가로 예시되어 있는 P19 세포 분석법, 래트 운동 신경 세포 분석법 및 cDNA 마이크로어레이를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 당해 분야의 숙련자가 EPO 화합물의 조직 보호능을 결정하기 위한 다른 적합한 시험관내 분석법이 있음을 알 것이기 때문에, 이들 예는 비한정적이다. 일반적으로, 대조용과 비교하여 EPO 화합물이 세포의 생존능을 유지 또는 향상시킨다면, EPO 화합물은 조직 보호성인 것으로 생각된다. 대조용과 비교하여 에리트로포이에틴이 분석시 세포의 생존능에 유해한 영향을 끼친다면, 에리트로포이에틴은 길항성인 것으로 생각된다.
A. P19 세포주에 기초한 시험관내 분석
한 실시태양에서, 시험관내 조직 보호능 분석법은 P19 세포주에 기초한다. 예를 들어, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린 G, 100㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트(깁코(Gibco)), 및 1.2g/l NaHCO3 10mM 헤페스 완충액을 함유하는 10% 태아 송아지 혈청(하이클론 래보러토리즈(Hyclone Laboratories))이 보충된 DMEM중에 P19 세포를 분화되지 않게 유지시킬 수 있다. 무혈청 배지는 태아 송아지 혈청 대신 인슐린 5㎍/ml, 트랜스페린 100㎍/ml, 프로게스테론 20nM, 푸트레신 100μM 및 Na2SeO3(시그마(Sigma)) 30nM을 가짐을 제외하고는 상기와 동일한 성분을 함유할 수 있다.
50% 컨플루언시(confluency)로 반응하는 세포를 재조합 EPO 및/또는 관심있는 EPO 화합물로 하룻밤동안 처리하고, 트립신으로 분리시킨 다음, 무혈청 배지에서 세척하고, 무혈청 배지에 104개 세포/cm2의 최종 밀도로 25cm2 조직 배양 플라스크에 접종시키거나 전처리를 추가하여 접종시킨다. 트립판 블루 배제에 의해 세포 생존능을 결정할 수 있다.
당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같이, 재조합 EPO를 첨가하면 미분화된 신경세포-유사 P19 세포에서의 혈청 회수 후 세포 손실을 방지할 수 있다. 예컨대, 재조합 EPO는 0.1U/ml 내지 100U/ml의 농도로 사용될 때 신경세포-유사 세포의 50% 이하를 사멸로부터 구한다. 따라서, 조직 보호성인 것으로 간주되려면, 관심있는 EPO 화합물은 대조용보다 더 많은 P19 세포를 사멸로부터 구해야 하며, 바람직하게는 세포의 약 25% 내지 약 50%, 더욱 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%를 구해야 한다.
B. 시험관내 래트 운동 신경 세포 분석법
다른 실시태양에서는, 흥미있는 EPO 화합물의 조직 보호능을 시험관 내에서 결정하기 위하여 래트 운동 신경 세포 분석법을 이용한다. 예를 들어, 15일된 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트 태아로부터의 척수를 이용하여 일차 운동 신경 세포를 수득한 다음 면역 선별(immunopanning)에 의해 정제할 수 있다. 폴리-DL-오르니틴 및 라미닌으로 미리 코팅되고 완전 배지(뉴로베이설, B27(2%), 0.5mM L-글루타민, 2% 말 혈청, 25μM 2-머캅토에탄올, 25μM 글루타메이트, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 1ng/ml BDNF)를 함유하는 24mm 웰 플레이트의 유리 커버슬립에 세포를 바람직하게는 낮은 농도(20000개 세포/cm2)로 접종한다. 소정 시간, 바람직하게는 약 6일 후, EPO(10U/ml) 및 관심있는 EPO 화합물(10U/ml) 또는 비히클을 배양액에 첨가할 수 있다(바람직하게는 생존하는 신경 세포 밀도를 결정하기 약 5일 전). 이어 배지를 버리고, 세포를 PBS중 4% 파라폼알데하이드로 40분간 고착시킨 후, 0.2% 트리톤 X(Triton X)-100으로 투과성으로 만들고, PBS중 10% 태아 송아지 혈청으로 차단한 다음, 비-포스포릴화 신경 필라멘트에 대한 항체(SMI-32; 1:9000)를 사용하여 하룻밤동안 배양하고, 다이아미노벤지딘을 사용하는 아비딘-바이오틴 방법에 의해 가시화시킬 수 있다. SMI-32 양성 세포의 수를 셈으로써, 운동 신경 세포의 생존능을 형태학적으로 평가할 수 있다.
운동 신경 세포의 혼합된 일차 배양액은 배양 조건을 유지하는 동안 특징적으로 세포자멸사를 겪게 된다. 세포 수를 평가하기 5일 전에 배지에 재조합 EPO(10U/ml)를 첨가하면 5일째에 관찰된 일차 운동 신경 세포의 수가 상당히 증가되는 것으로 나타났다. 따라서, 조직 보호성인 것으로 간주되기 위해서는, 관심있는 EPO 화합물이 대조용과 적어도 동일한 운동 신경 세포 수를 구하는 것이 바람직하다. 한 실시태양에서는, 배양 조건을 유지하는 동안 대조용에 비해 더 많은 수의 운동 신경 세포가 사멸로부터 보호되는 경우에, 관심있는 EPO 화합물이 조직 보호성인 것으로 간주된다.
C. cDNA 마이크로어레이에 기초한 시험관내 분석법
흥미있는 EPO 화합물의 조직 보호능을 결정하는 다른 시험관내 분석법은 cDNA 마이크로어레이이다. 이 분석법을 이용하여, 재조합 EPO 및 관심있는 EPO 화합물이 P19 세포에서 유전자 발현을 상이하게 변화시키는지의 여부를 결정할 수 있다. 미분화된 P19 세포로부터 단리된 mRNA는 EPO에의 노출에 따라 마우스 1200 cDNA 마이크로어레이로부터 평가된 유전자 조정의 상이한 패턴을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 클론테크(Clontech)(아틀라스 마우스 1.2)로부터의 나일론 막 어레이를 사용함으로써, P19 세포에서의 1,200개 유전자의 발현을 측정할 수 있다. 세포(107개/샘플)를 염수, 재조합 EPO, 관심있는 EPO 화합물(1mU/ml) 또는 이들의 혼합물로 하룻밤동안 처리할 수 있다. 이어, 세포를 RNA 추출을 위해 용해시키거나 또는 3시간동안 혈청을 박탈한다(항상 전처리동안 첨가된 동일한 사이토카인의 존재하에). 온-칼럼 DN아제 처리와 함께 칼럼 크로마토그래피에 의해 표준 총 RNA를 추출한 다음, 폴리A+RNA를 정제할 수 있다. 이어, [P32]-ATP의 존재하에 프로브를 제작할 수 있다. 바람직하게는 2000만개 이상인 라벨링된 프로브를 68℃에서 cDNA 나일론 막과 하이브리드 형성시킬 수 있다. 막을 세척하고 x-선 필름에 노출시킨다. 포스포어 이미져(Phosphor Imager)를 이용하여 방사성 신호의 강도를 측정하고, 아틀라스 이미지 2.0 컴퓨터 프로그램(클론테크)을 이용하여 분석할 수 있다.
본 발명에서 고려되는 생체내 분석법은 EPO 화합물을 평가하는데 사용되는 조직 보호 분석법, 예컨대 국소 허혈 모델 및 해마내 비쿨린 모델을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 조직 보호성을 평가하기 위한 생체내 모델은 척수 손상 분석법을 포함한다. 뿐만 아니라, 국제 특허 공개 제 WO/02053580 호 및 미국 특허원 제 2002/0086816 호 및 제 2003/0072737 호에 개시되어 있는 다양한 분석법이 본 발명에 사용될 것으로 고려된다.
D. 국소 허혈 모델에 기초한 생체내 분석법
한 실시태양에서, 특정 EPO 화합물의 조직 보호능을 결정하는데 사용되는 생체 분석법은 국소 허혈 모델에 기초한다. 예를 들어, 수컷 스프라그-돌리 래트(∼250gm)를 3개 용기 국소 허혈 모델에 이용할 수 있다. 간단히, 래트를 펜토바비탈(60mg/kg-bw)로 마취시키고, 수 블랭킷을 사용하여 37℃의 중심 온도에 유지시킬 수 있다. 2회 봉합 및 절단에 의해 우측 목동맥을 폐색시킬 수 있다. 우측 안와에 인접하고 입쪽에 있는 천공 구멍에 의해 중간 대뇌 동맥을 볼 수 있으며, 이를 코동맥으로부터 멀리 소작(cauterization)시킬 수 있다. 이 고정된 MCA 환부를 둘러싸는 반음영을 만들기 위해, 미세한 겸자에 의해 끌어당김으로써 1시간동안 반대쪽 목동맥을 폐색시킬 수 있다. 가역적인 목동맥 폐색 개시시에 염수, 재조합 EPO(5000U/kg-bw) 또는 관심있는 EPO 화합물(5000U/kg-bw)을 투여할 수 있다.
24시간 후, 뇌를 제거하고, 뇌 매트릭스 장치(하버드 어패러투스(Harvard Apparatus))를 이용하여 전체 뇌에 걸쳐 1mm 두께로 연속적으로 절개한다. 각 절개부를 154mM NaCl중 2% 트라이페닐테트라졸륨 클로라이드(w/v)의 용액에서 37℃에서 30분간 후속 배양시킬 수 있다. 전산화된 이미지 분석 시스템(MCID, 캐나다 온타리오주 세인트 캐써린즈 소재의 이미징 리써치(Imaging Research))을 이용하여 손상 부피를 결정할 수 있다. 이 분석법에서는, 관심있는 EPO 화합물이 래트 MCA 국소 허혈에 기인한 경색 부피를 재조합 EPO와 동일한 정도로 또는 그보다 큰 정도로 개선시키는 경우, 이 화합물이 신경 보호성인 것으로 간주된다.
E. 해마내 비쿨린 발작 모델에 기초한 생체내 분석법
다른 실시태양에서는, 해마내 비쿨린 실험을 이용하여 생체 내에서 EPO 화합물의 조직 보호능을 결정한다. 예를 들어, 수컷 스프라그-돌리 래트(250 내지 280g)를, 음식과 물에 자유로이 접근할 수 있도록 하고 12시간의 고정된 광/암소 싸이클로 일정한 온도(23℃) 및 상대습도(60%)에서 수용한다. 베자니(Vezzani, A.) 등의 문헌[J. Neurosci, 19, 5054-65 (1999)]에 기재되어 있는 정위 뇌수술 지침에 따라 캐뉼라 및 전극을 래트에 이식시킨다. 간단히, 에퀴테신(1% 페노바비탈/4% 클로랄 하이드레이트; 3ml/kg 복강내)을 사용하여 래트를 마취시킬 수 있다. 부비동에 걸쳐 위치하는 그라운드 리드(ground lead)를 따라 두정골 피질에 2개의 스크류 전극을 좌우대칭으로 위치시킨다. 양극성 니크롬 와이어 절연된 전극(60μm)을 등쪽 해마(사이막 끝)의 치아 이랑 내로 좌우대칭으로 삽입할 수 있고, 캐뉼러(22-게이지)를 경질막 위에 좌우대칭으로 위치시켜 약물을 해마내 또는 대뇌혈관내로 주입할 수 있다. 전극을 삽입하기 위한 정수리점으로부터의 좌표는 다음과 같아야 한다: (mm) -2.5에 코뼈가 설정된 상태에서 정면-3.5; 외측 경질막 아래 2.4 및 3. 팩시노스(Paxinos, G.) 및 왓슨(Watson, C.)의 문헌[The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, New York (1986)] 참조. 전극을 멀티핀 소켓(마치 일렉트로닉스(March Electronics), 뉴욕)에 연결하고, 아크릴 치과용 시멘트에 의해 주사 캐뉼러와 함께 두개골에 고정시킬 수 있다.
동물이 충분히 회복되면 수술한지 3 내지 7일 후에 실험을 수행하는 것이 바람직하다. 이어, 비쿠쿨린 발작을 유도하기 24시간 전에 또한 30분 전에 다시 재조합 EPO 또는 관심있는 EPO 화합물(둘 다 5000U/kg-bw) 또는 비히클을 동물에게 복강내 투여한다. EEG를 기록하는 절차 및 약물의 뇌내 주사 절차는 베자니 등의 문헌[J. Pharmacol Exp Ther, 239, 256-63 (1986)]에 이미 기재되어 있다. 간단히, 동물을 최소 10분간 프렉시글라스 우리(25×25×60cm)에 넣어 익숙해지도록 한 다음 EEG 기록(4-채널 EEG 복사기, 모델 BP8, 배타글리아 랭고니(Battaglia Rangoni), 이탈리아 볼로냐 소재)을 개시한다. 약 15분 내지 약 30분 후, 0.8나노몰/0.5㎕ 비쿠쿨린 메티오다이드를 주입한 다음 120분 동안 계속 EEG 기록을 수행한다. 모든 주사는 캐뉼러 아래 3mm 돌출된 바늘(28-게이지)을 이용하여 마취되지 않은 래트에게 수행되었다.
약물의 항경련 활성을 민감하게 측정할 수 있는 것으로 이미 밝혀진 EEG 분석에 의해 발작을 측정할 수 있다. 베자니 등의 문헌[J. Pharmacol Exp Ther, 239, 256-63 (1986)] 참조. 이 분석법에서, 발작은 4개의 기록 리드 모두에서 다음과 같은 변화중 적어도 2개가 동시에 발생되는 것으로 이루어진다: 높은 빈도 및/또는 멀티스파이크 합병증 및/또는 높은 전압의 동시 발생 스파이크 또는 파동 활동. 동시 발생 스파이킹은 발작과 혼합되어 관찰될 수 있다. 발작을 정량하기 위해 선택된 변수는 바람직하게는 최초 발작까지의 잠복기(발작 개시), 간질 활동에 소비된 총 시간(발작 에피소드의 지속시간을 함께 더함으로써 결정됨; 발작 지속), 및 EEG 기록 기간 동안의 스파이킹 활성(발작 활성).
판독치로서의 EEG 활성을 이용한 해마내 비쿠쿨린 발작 모델은 약물의 발작-억제 효능의 민감하고 특수한 예측 모델인 것으로 밝혀졌다. 베자니 등의 문헌[J. Pharmacol Exp Ther, 239, 256-63 (1986)] 참조. 따라서, 관심있는 EPO 화합물이 조직 보호성인 것으로 간주되려면, 이 화합물이 발작 빈도 및 정도를 재조합 EPO와 동일하거나 그보다 높은 정도로 감소시켜야 한다.
F. 급성 가역성 녹내장 래드 모델에 기초한 생체내 분석법
본 발명에 따른 다른 생체내 분석법에서는, 급성 가역성 녹내장 래트 모델을 이용하여 관심있는 특정 EPO 화합물의 조직 보호능을 결정할 수 있다. 예를 들어, 망막 세포는 허혈에 매우 민감하기 때문에, 이들 세포중 다수는 허혈 스트레스가 개시된지 30분 후에 사멸하게 된다. 이로써, 말초-투여된 관심있는 EPO 화합물이 허혈에 민감한 세포를 보호하기에 충분한 조직 보호 활성을 나타내는지의 여부를 시험하기 위해서, 로젠바움(Rosenbaum) 등의 문헌[Vis. Res. 37:3443-51, 1997]에 기재되어 있는 바와 같은 급성 가역성 녹내장 래트 모델을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 전신 동맥 혈압보다 높은 압력이 될 때까지 염수를 성체 수컷 래트의 눈의 전실 내로 주사하고, 60분간 유지시킬 수 있다. 이어, 허혈을 유도하기 24시간 전에 염수 또는 5000U EPO/kg 체중을 복강내 투여한 다음, 추가 3일동안 매일 1회 계속 투여한다.
처치한지 1주일 후에 암흑에 익숙해진 래트에서 망막전위도 검사를 수행하여, 흥미있는 EPO 화합물이 조직 보호 활성을 갖는지의 여부를 결정할 수 있다. EPO가 조직 보호성인 경우에는, 염수만으로 처리된 동물과는 달리 망막전위도 상에서 활성이 우수하게 유지되어야 한다.
G. 심근 경색 분석법
EPO 화합물이 전신에 걸쳐 또는 특수하게 심장 내에서 조직 보호 활성을 나타내는지의 여부를 결정하기 위하여, 심근 경색 분석법을 본 발명에 이용할 것이 고려된다. 예를 들어, 마취시키고 관상 동맥 폐색을 준비하기 24시간 전에 성체 수컷 래트에게 EPO(5000U/kg 체중)를 투여할 수 있다. 절차를 시작할 때 EPO를 추가로 투여할 수 있으며, 이 때 좌측 주 관상 동맥을 30분간 폐색시켰다가 풀어준다. 처치한 후 1주일동안 매일 동일한 투여량의 EPO를 투여하고, 그 동안 동물의 심장 기능에 대해 연구한다. 샴 주사(염수)를 받은 동물은 좌측 말단 확장기 혈압이 크게 증가하는(이는 심근 경색에 부수적인 팽창되고 경직된 심장의 지표임) 반면, 흥미있는 EPO 화합물을 투여받은 동물은 EPO가 조직 보호성이라면 샴 처리된 대조용에 비해(p<0.01 수준에서 상당한 차이) 심장 기능의 감소를 나타내지 않아야 한다.
H. 척수 손상 분석법
또한 척수 손상 분석법을 본 발명에 이용하여 관심있는 특정 EPO 화합물의 조직 보호능을 평가할 수 있다. 구체적으로는, 래트 척수 압착이 본 발명에 사용될 것으로 고려된다. 체중 약 180g 내지 약 300g의 위스타(Wistar) 래트(암컷)을 이 연구에 바람직하게 이용한다. 바람직하게는 수술하기 전 12시간 동안 동물을 절식시키고, 인도적으로 감금한 후 티오펜탈 소듐을 복강내 주사(40mg/kg-bw)하여 마취시킨다. 피부 침투(부피바케인 0.25%) 후, 절개 현미경을 사용하여 2cm 절개함으로써, 완벽한 1회 수준(T-3)의 척추후궁절제술을 수행한다. 척수에 0.6뉴튼(65g)의 폐쇄력을 가하는 일시적인 동맥류 클립을 1분동안 경막 외에서 가함으로써, 외상성 척수 손상을 유도한다. 클립을 제거한 후, 피부 절개부를 닫고 동물을 마취에서 완전히 회복시킨 다음 우리로 돌려보낸다. 저절로 배뇨가 다시 시작될 때까지 매일 2회 이상 방광 촉진을 병행하면서 래트를 계속 모니터링한다.
대조용 군의 동물에게는 절개부를 닫은 직후 통상적인 염수를 투여한다(정맥내 주사를 통해). 나머지 동물에게는 관심있는 EPO 화합물을 16㎍/kg-bw의 양으로 정맥내 투여한다. 운동 등급을 사용하여 래트의 운동 신경 기능을 평가한다. 이 등급에서는, 동물에게 0(뒷발 움직임이 관찰되지 않음) 내지 21(정상적인 보행)의 점수를 부여한다. 각 동물이 받은 처치에 대해 모르는 동일한 시험관에 의해, 손상된지 1, 12, 24, 48 및 72시간 후 및 1주일 후에 래트를 기능 결손에 대해 시험한다. 관심있는 EPO 화합물이 조직 보호성인 경우, EPO를 투여받은 래트는 염수 주사를 받은 래트보다 손상으로부터 보다 빨리 더욱 우수하게 전반적으로 회복됨을 보여주어야 한다.
I. 래빗 척수 허혈 시험
다른 실시태양에서는, 래빗 척수 허혈 시험에 의해 조직 보호능을 시험할 수 있다. 예를 들어, 체중 1.5kg 내지 2.5kg의 뉴질랜드 화이트 래빗(36마리, 8 내지 12월령, 수컷)을 이 연구에 이용한다. 동물을 12시간동안 절식시킨 후 인도적으로 감금한다. 100% 산소중 3% 할로테인을 통해 마취를 유도하고, 50% 산소 및 50% 공기의 혼합물중 0.5 내지 1.5% 할로테인으로 마취를 유지시킨다. 정맥내 카테터(22게이지)를 왼쪽 귀 정맥에 넣는다. 수술 절차 동안 링거 락테이트를 시간당 4ml/kg 체중(bw)의 속도로 주입시킨다. 감염을 예방하기 위하여, 수술 전에 세파졸린 10mg/kg-bw를 정맥내 투여한다. 동물을 오른쪽 측면으로 누운 자세로 위치시키고, 피부를 포비돈 요오드로 준비한 다음, 부피바케인(0.25%)을 침투시키고, 12번째 갈비뼈 높이에서 척추에 평행하게 옆구리 피부를 절개한다. 피부 및 피하 등허리 근막을 절개한 후, 가장 긴 허리근 및 엉덩갈비 허리근을 수축시킨다. 좌측 복막 뒤로 접근하여 복부 대동맥을 노출시키고, 좌측 신장 동맥보다 덜 움직이도록 한다. PE-60 관으로 좌측 신장 동맥으로부터 멀리 대동맥 주위에서 고리를 매고 양 말단을 보다 큰 고무관을 통해 통과시킨다. PE 관을 잡아당김으로써, 대동맥을 20분간 비-외상 방식으로 폐색시킨다.
대동맥 폐색 전에 헤파린(400IU)을 정맥내 알약으로서 투여한다. 폐색시킨지 20분 후, 관 및 카테터를 제거하고, 절개부를 닫은 다음, 완전히 회복될 때까지 동물을 모니터링하고 신경 기능에 대해 연속적으로 평가한다. 대조용 군의 동물은 대동맥 폐색을 푼 직후에 통상적인 염수를 정맥내 투여받는다. 다른 군의 동물은 재관류 직후 관심있는 EPO 화합물을 6.5㎍/kg-bw로 정맥내 투여받는다(각 군에 대해 n=6).
재관류한지 1, 24 및 48시간 후에 처치에 대해 알지 못하는 연구자가 드러몬드(Drummond) 및 무어(Moore)의 기준에 따라 운동 기능을 평가한다. 다음과 같이 각 동물에게 0 내지 4의 점수를 부여한다: 0=뚜렷한 다리 운동 기능 없이 하반신 마비; 1=불량한 다리 운동 기능, 약한 반중력 움직임만; 2=적당한 다리 운동 기능, 우수한 반중력 강도, 몸체 아래로 다리를 펼 수 없음; 3=탁월한 운동 기능, 몸체 아래로 다리를 펼 수 있고 정상적이지는 않지만 깡총 뛸 수 있음; 4=정상적인 운동 기능. 하반신 마비 동물의 경우 하루에 2회 수작업으로 방광을 비워준다.
흥미있는 EPO 화합물이 조직 보호성이라면, EPO를 투여받은 동물이 염수 주사를 받은 동물보다 손상으로부터 더욱 빨리 더욱 양호하게 전반적으로 회복됨을 보여주어야 한다.
앞서 간략히 논의한 바와 같이, 몇 가지 유형의 조직이 EPO 수용체를 가지며, 따라서 EPO의 조직 보호 효과에 반응성일 수 있다. 따라서, 관심있는 EPO 화합물의 제안된 임상적 용도에 따라, 당해 분야의 숙련자는 이러한 추가적인 반응성 세포를 포함하는 유사한 시험관내 분석법 또는 관련 기관을 포함하는 유사한 생체내 분석법을 또한 수행할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 심근, 망막 및 레이디히 세포 및 P19 분석법에 대해 상기 개괄된 것과 유사한 방법을 이용하여, 혈청 박탈에 기초한 시험관내 분석법을 수행할 수 있다.
생체내 분석법은 개별 기관에 관련될 수 있다. 예를 들어, 망막 세포에 대한 EPO의 효과를 평가하기 위하여, 당해 분야의 숙련자는 상기 기재된 망막 허혈 분석법을 수행할 수 있다. 또한, 심근 세포에 대한 EPO 유사체의 효과를 평가하기 위하여, 숙련자는 상기 논의된 심근 경색 모델을 용이하게 변화시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 적혈구 조혈 반응 세포, 조직 또는 기관과 관련하여 특정 EPO가 조직 보호 활성을 갖는지의 여부를 평가하기 위해 적절한 분석법 또는 모델을 선택하도록 충분히 숙련될 것이다.
하기 예시적인 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양의 단순한 예시일 뿐이며, 첨부된 청구의 범위에 의해 그 영역이 정의되는 본 발명을 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: 화학적으로 개질된 EPO
A. 당 쇄의 산화
하기 절차에 의해 EPO의 당 단위를 산으로 전환시킬 수 있다. EPO 및 목적하는 산화 정도를 제공하기에 충분한 양의 과요오드산나트륨(과요오드산나트륨의 양이 많을수록 산화 정도가 커짐)을 100mM 아세트산나트륨 완충액 내에 넣을 수 있다. 이어, 이 용액을 약 20분동안 얼음에서 항온처리하고, 증류수를 사용하여 완전히 투석시킬 수 있다. 투석 관으로부터 생성물을 제거하고 새 관에 모을 수 있다(생성물 I).
정량용 베네딕트 용액(18g 황산구리, 100g 탄산타트륨(무수), 200g 시트르산칼륨, 125g 티오시안산칼륨, 25g 포타슘 페로사이아나이드)을 증류수에 1리터의 최종 부피까지 용해시킬 수 있다. 메틸렌 블루 몇 방울을 정량용 베네딕트 용액에 첨가할 수 있다.
이어, 용액의 색상이 투명해져서 용액이 완전히 산화되었음을 나타낼 때까지 생성물 I을 정량용 베네딕트 용액에 첨가할 수 있다. 용액을 탈염시키고, 울트라프리 센트리퓨걸 필터 유닛(Ultrafree Centrifugal Filter Unit)을 사용하여 농축시킬 수 있다. 증류수를 사용하여 샘플(생성물 II)을 추가로 완전히 투석시킬 수 있다.
B. 갈락토즈 옥시다제를 사용한 무시알산 형태 EPO의 산화
EPO의 무시알산 형태 50 내지 500㎍, 1U/㎕ 갈락토즈 옥시다제 10㎕ 및 10mM 인산나트륨 완충액 100㎕를 15ml들이 원뿔형 원심분리 관에서 혼합할 수 있다(총 부피 110㎕). 이 혼합물을 37℃에서 2시간동안 항온처리하고, 증류수를 사용하여 용액을 완전히 투석시킬 수 있다. 생성물을 투석 관으로부터 제거하고, 새 관에 모을 수 있다(생성물 III).
정량용 베네딕트 용액(상기 기재된 바와 같음)을 1리터의 최종 부피가 될 때까지 증류수에 용해시킬 수 있다. 이어, 메틸렌 블루 몇 방울을 정량용 베네딕트 용액에 첨가할 수 있다.
용액의 색상이 투명해져서 용액이 완전히 산화되었음을 나타낼 때까지 생성물 III을 정량용 베네딕트 용액에 첨가할 수 있다. 용액을 탈염시키고, 울트라프리 센트리퓨걸 필터 유닛을 사용하여 농축시킬 수 있다. 증류수를 사용하여 샘플(생성물 IV)을 추가로 완전히 투석할 수 있다.
C. EPO의 황화
4℃에서 EPO를 N,N-다이메틸폼아마이드(DMF-SA)에 용해시킬 수 있다. DMF에 용해된 N,N'-다이사이클로헥실 카보다이이미드(DCC)를 첨가하고, 용액을 4℃에서 4시간동안 흔들 수 있다. 부숴진 얼음을 첨가하고, 10N NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 조정할 수 있다. 용액의 부피를 조정하고, 샘플을 HN-S2 유형의 원심분리기(다모니엑(DAMONIEC), 메사추세츠주 니드햄 하이츠 소재)에서 1000×g로 15분간 원심분리시킬 수 있다. 이어, 상청액을 광범위하게 투석시킬 수 있다. 황화에 대한 추가적인 정보는 폰거 등의 문헌[Preparation of High-Potency, Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diabetes, Vol. 32, No. 12, 1983년 12월]에 논의되어 있으며, 이 문헌은 본원에 참고로 인용된다.
D. EPO로의 PEG 쇄의 부착
산화된 탄수화물에 PEG 쇄를 부착시킴으로써, 상기 A에서 수득된 것(생성물 I)과 같은 EPO를 개질시킬 수 있다. 산화 동안 퍼아이오데이트의 농도를 변화시킴으로써, 개질 정도를 조절할 수 있다.
먼저 실온에서 1mM 내지 100mM의 소듐 메타-퍼아이오데이트(시그마)로 EPO(50mM 아세트산나트륨중 2 내지 4mg/ml)를 30분간 산화시킴으로써 PEG-EPO 공액체를 제조할 수 있다. 100mM 아세트산나트륨(pH 5.4)에서의 완충액 교환에 의해 포스페이트 완충액을 제거할 수 있다.
다양한 분자량의 메톡시-PEG-하이드라자이드(넥타 쎄라퓨틱스)를 5배 내지 100배 몰 과량(중합체:단백질)으로 첨가할 수 있다. 15mM 소듐 사이아노보로하이드라이드(시그마)를 첨가함으로써 중간 하이드라진 결합을 추가로 환원시키고, 4℃에서 하룻밤동안 반응시킬 수 있다. 생성된 공액체를 당해 분야에 공지되어 있는 기법에 의해 분별/정제시킬 수 있다.
E. 무시알산 EPO로의 PEG 쇄의 부착
PEG 쇄를 부착시켜, 상기 B에서 수득된 것(생성물 III)과 같이 갈락토즈 옥시다제와의 산화 후 말단 갈락토즈 잔기를 새롭게 생성시킴으로써, EPO의 무시알산 형태를 개질시킬 수 있다.
제조업체의 방법에 따라 시알리다제 A(프로자임, 인코포레이티드(Prozyme, Inc.)를 사용하여 재조합 인간 EPO(rhuEPO)에서 시알산을 제거할 수 있다. SDS 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 반응 생성물을 돌림으로써 화학적 개질을 바람직하게 확인한다. 생성된 밴드를 염색시키면, 개질되지 않은 EPO가 약 34kDa의 분자량을 갖는 반면 개질된 EPO가 약 31kDa의 겉보기 분자량을 가짐을 나타내어야 한다. EPO상에 잔류하는 시알산 잔기는 바람직하게는 0.1몰/몰 EPO 미만이다.
EPO의 무시알산 형태를 수득한 다음, EPO상의 새롭게 노출된 갈락토즈 잔기(10mM 인산나트륨 완충액중 2 내지 4mg/ml)를 EPO 용액 1ml당 100단위의 PBS(시그마)중 갈락토즈 옥시다제로 산화시킬 수 있다. 이어, 반응 혼합물을 37℃에서 2시간동안 항온처리할 수 있다.
100mM 아세트산나트륨(pH 5.4)에서의 완충액 교환에 의해 포스페이트 완충액을 제거할 수 있다. 다양한 분자량의 메톡시-PEG-하이드라자이드(넥타 쎄라퓨틱스)를 5배 내지 100배 몰 과량(중합체:단백질)으로 첨가할 수 있다. 15mM 소듐 사이아노보로하이드라이드(시그마)를 첨가함으로써 중간 하이드라진 결합을 추가로 환원시키고 4℃에서 하룻밤동안 반응시킬 수 있다. 생성된 공액체를 당해 분야에 공지되어 있는 기법에 의해 분별/정제시킬 수 있다.
F. 무시알산 EPO로의 PEG 쇄의 부착
갈락토즈 옥시다제로 산화시킨 후 새롭게 생성된 말단 갈락토즈 잔기에 PEG 쇄를 부착시켜, 상기 B에서 수득된 것(생성물 III)과 같은 EPO의 무시알산 형태를 개질시킬 수 있다.
1mg EPO 대 0.05단위 뉴라미니다제(5μL)의 비로 뉴라미니다제(일본의 세이카가쿠 코포레이션(Seikagaku Corporation), 냉동건조된 분말 1U를 75mM NaPO4(pH 6.5) 100μL에 용해시킴)를 사용하여 rhuEPO(1mg)에서 시알산을 제거할 수 있다. 갈락토즈 옥시다제(75mM NaPO4(pH 6.5)에 용해된 450μL, 시그마) 5단위(5μL)를 혼합물에 첨가할 수 있다.
100mM 아세트산나트륨(pH 5.4)에서의 완충액 교환에 의해 포스페이트 완충액을 제거할 수 있다. PEG-NH2(750 분자량, 넥타 쎄라퓨틱스) 및 15mM 소듐 사이아노보로하이드라이드(시그마)를 혼합물에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤동안 반응시킬 수 있다. PEG-NH2를 250배 몰 과량(중합체:단백질)으로 바람직하게 첨가한다(PEG-NH2 80mg). 생성된 공액체를 당해 분야에 공지되어 있는 기법에 의해 분별/정제할 수 있다.
실시예 2: 기능 분석법
A. 적혈구 조혈 활성 분석법
하기 분석법을 이용하여, 특정 EPO 화합물의 적혈구 조혈 특징, 즉 적혈구 용적율 수준을 조절하는 능력을 결정하였다.
TF1은 EPO를 비롯한 성장 인자에 완전히 의존하는 인간의 적백혈병 세포주이다. 기타무라(Kitamura) 등의 문헌[Blood 73, 375-80] 참조. TF1 세포를 ATCC로부터 수득하여, 실험할 때까지 2mM L-글루타민, 10mM 헤페스, 1mM 피루브산나트륨, 4.5g/L 글루코즈, 1.5g/L 중탄산나트륨, 5ng/ml GM-CSF 및 10% 태아 송아지 혈청을 갖는 RPMI1640에 유지시켰다. 왕성한 성장동안 수득된 TF1 세포를 펠렛화시키고, 배지만으로 3회 세척한 다음, 특정 농도로 첨가된 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 또는 EPO 유사체가 있고 GM-CSF가 있거나 또는 없는 배지 1ml중 105개 세포의 농도로 재현탁시켰다. 개별 배양액을 24시간동안 유지시키고, 제조업체의 방법에 따라 포마잔 반응 생성물을 이용하여 세포수를 결정하였다(셀타이터; 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가).
암컷 BALB/c 마우스를 이용하여 헤모글로빈 농도에 대한 EPO 화합물의 효과를 관찰함으로써, EPO 화합물의 효능을 생체내에서 먼저 평가하였다. 동물에게 500U/kg-bw EPO, 흥미있는 EPO 화합물 또는 동일한 부피의 비히클을 총 3주동안(적혈구 조혈 반응을 관찰하기에 충분한 시간 간격) 1주일에 3회 피하 투여하였다. EPO 화합물이 마우스의 혈청 헤모글로빈 농도를 상승시키면 이는 적혈구 조혈성인 것으로 결정된다. TF1 적백혈병 세포를 사용하여 시험관내에서 추가로 효능을 평가하였다. 이 연구에서는 상대적인 TF1 세포수가 대조용보다 더 많이 증가하면 EPO가 적혈구 조혈성임을 확인하였다.
당해 분야의 숙련자는 극저산소성 마우스 분석법 및 망상 적혈구 분석법(유럽 약전) 같은 다른 분석법도 본 발명에서 적혈구 조혈 활성을 확인하는데 사용하기 적합함을 알 것이다.
B. 조직 보호 활성 분석법
하기 분석법을 이용하여, 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 유사체의 조직 보호 특징을 결정하였다.
18일된 래트 태아의 해마로부터 신경 세포 배양액을 수득하였다. 뇌를 제거하고 수막을 제거한 다음, 해마를 단리하였다. 이어, 2.5% 트립신 용액에서 37℃에서 5분간 배양한 후 적정함으로써, 세포를 분산시켰다. 1% B-27 보충제(깁코, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)를 함유하는 무혈청 뉴로베이설(Neurobasal) 배지에 세포 현탁액을 희석시키고, 커버슬립당 80,000개 세포의 밀도로 폴리오르니틴-코팅된 커버슬립 상에 접종하였다. 이어, 세포를 EPO로 하룻밤동안 전처리한 다음, 1) EPO, 2) 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄, 또는 3) EPO의 무시알산 형태가 있거나 없는 상태에서 5μM TMT에 24시간동안 노출시켰다. 10 내지 14일 사이에 배양액을 시험관 내에서 사용하였다.
3-(4,5-다이메틸-티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석에 의해 세포의 생존능을 측정하였다. 덴지엇(Denziot, F.) 및 랑(Lang, R.)의 문헌[1986, Rapid Colormetric Assay for Cell Growth and Survival. Modification to the tetrazolium dye procedure giving improved reliability, J Immunol Methods 89:271-277] 참조. 간략하게, MTT 테트라졸륨 염을 무혈청 배지에 0.75mg/ml의 최종 농도로 용해시키고, 37℃에서 3시간 동안 처리한 다음 세포에 첨가하였다. 배지를 제거하고 1N HCl:아이소프로판올(1:24)로 포마잔을 추출하였다. 미소평판 판독기에서 560nm에서의 흡광도를 읽었다.
도 1A에서 입증되는 바와 같이, 하나 이상의 추가적인 N-결합 탄수화물 쇄 및/또는 하나 이상의 추가적인 O-결합 탄수화물 쇄를 갖는 EPO 유사체는 조직 보호 기능을 나타내지 않았다.
본원에 기재되고 청구된 본 발명은 본원에 개시된 특정 실시태양에 의해 그 범위가 한정되지는 않으며, 이는 이들 실시태양이 본 발명의 몇몇 요지의 예시일 뿐이기 때문이다. 임의의 동등한 실시태양이 본 발명의 영역 내에 포함된다. 실제로, 당해 분야의 숙련자는 상기 상세한 설명을 보고 본원에 예시 및 기재된 것에 덧붙여 본 발명의 다양한 변형을 용이하게 알아낼 수 있다. 이러한 변형도 첨부된 청구의 범위의 영역 내에 속하는 것으로 간주된다. 본원에 인용된 모든 참조문헌은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 인용되어 있다.

Claims (27)

  1. 재조합 인간 에리트로포이에틴(rhuEPO)보다 더 긴 혈청 반감기를 갖고 조직 보호 기능을 포함하는 에리트로포이에틴 생성물을 제공하는 단계; 및 치료 효과량의 에리트로포이에틴 생성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 적혈구 용적율 수준을 조절하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    에리트로포이에틴 생성물을 제공하는 단계가 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 O-결합 올리고사카라이드 쇄중 하나 이상에 대한 하나 이상의 화학적 개질 방법으로 rhuEPO를 개질시키는 단계를 추가로 포함하고, 이 때 상기 화학적 개질 방법이 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    치료 효과량의 에리트로포이에틴 생성물을 투여하는 단계가, 상응하는 표적 적혈구 용적율을 수득하기 위한 rhuEPO보다 더 낮은 몰량으로 에리트로포이에틴 생성물을 투여함을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    혈청 반감기가 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 20% 이상 더 긴 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    혈청 반감기가 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 40% 이상 더 긴 방법.
  6. 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄가 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합의 결과로서 하나 이상의 화학적 개질을 갖는 하나 이상의 에리트로포이에틴 유도체를 포함하며, rhuEPO보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는 인공(man-made) 에리트로포이에틴 생성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    조직 보호 기능을 갖는 에리트로포이에틴 생성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    하나 이상의 화학적 개질이 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 산화시켜 하나 이상의 추가적인 산 잔기를 제공함을 포함하는 에리트로포이에틴 생성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    하나 이상의 화학적 개질이 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 황화시켜 EPO 생성물의 음전하를 증가시킴을 포함하는 에리트로포이에틴 생성물.
  10. 제 6 항에 있어서,
    하나 이상의 화학적 개질이 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 포스포릴화시켜 EPO 생성물의 음전하를 증가시킴을 포함하는 에리트로포이에틴 생성물.
  11. 제 6 항에 있어서,
    하나 이상의 화학적 개질이 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄에 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 첨가함을 포함하는 에리트로포이에틴 생성물.
  12. 하나 이상의 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 제공하는 단계; 및
    산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합에 의해, 하나 이상의 내인성 에리트로포이에틴 또는 재조합 에리트로포이에틴의 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄를 개질시키는 단계를 포함하는,
    연장된 혈청 반감기 및 조직 보호 활성을 갖는 에리트로포이에틴 생성물을 제조하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    개질시키는 단계가 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄상의 하나 이상의 인접 하이드록실을 하나 이상의 산 잔기로 대체하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄상의 하나 이상의 인접 하이드록실을 하나 이상의 산 잔기로 대체하는 단계가, 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄상의 다수의 인접 하이드록실을 다수의 산 잔기로 대체함을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    개질시키는 단계가, 유기 용매를 제공하는 단계; 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 유기 용매에 용해시켜 용액을 제조하는 단계; 하나 이상의 축합제를 제공하는 단계; 하나 이상의 설페이트 공여체를 제공하는 단계; 및 하나 이상의 축합제 및 하나 이상의 설페이트 공여체를 용액 내로 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서,
    개질시키는 단계가, 유기 용매를 제공하는 단계; 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 유기 용매에 용해시켜 용액을 제조하는 단계; 하나 이상의 축합제를 제공하는 단계; 인산을 제공하는 단계; 및 하나 이상의 축합제 및 하나 이상의 인산을 용액 내로 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 12 항에 있어서,
    개질시키는 단계가, 유기 용매를 제공하는 단계; 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체를 유기 용매에 용해시켜 제 1 용액을 형성시키는 단계; 하나 이상의 산화제를 제공하는 단계; 하나 이상의 산화제를 제 1 용액에 첨가하여 제 2 용액을 형성시키는 단계; 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제공하는 단계; 및 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제 2 용액 내로 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제공하는 단계가 쇄의 말단에 하나 이상의 1급 아미노 잔기를 갖는 하나 이상의 폴리에틸렌 글라이콜 쇄를 제공함을 포함하는 방법.
  19. 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 O-결합 올리고사카라이드 쇄에, 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 화학적 개질을 갖는 에리트로포이에틴 생성물을 제공하는 단계;
    치료 효과량의 에리트로포이에틴 생성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    이 때 상응하는 표적 적혈구 용적율을 수득하는 rhuEPO보다 더 적은 몰량으로 에리트로포이에틴 생성물을 투여하고, 에리트로포이에틴 생성물이 조직 보호 기능을 갖는,
    조직 손상의 위험이 있는 환자에서 빈혈을 치료하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    에리트로포이에틴 생성물이 rhuEPO보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    혈청 반감기가 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 20% 이상 더 긴 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    혈청 반감기가 rhuEPO의 혈청 반감기보다 약 40% 이상 더 긴 방법.
  23. 하나 이상의 N-결합 올리고사카라이드 쇄 또는 하나 이상의 O-결합 올리고사카라이드 쇄가 산화, 황화, 포스포릴화, PEG일화 또는 이들의 조합의 결과로서 하나 이상의 화학적 개질을 갖고, 재조합 에리트로포이에틴보다 더 긴 혈청 반감기 및 조직 보호 기능을 갖는 하나 이상의 에리트로포이에틴 유도체를 치료 효과량으로 포함하는 약학 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 하나 이상의 희석제, 보조제, 부형제, 비히클 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학 조성물.
  26. 제 23 항에 있어서,
    하나 이상의 습윤제, 유화제, pH 완충제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  27. 제 23 항에 있어서,
    하나 이상의 조직 보호 사이토카인을 추가로 포함하는 약학 조성물.
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