JPS5921626A - ウロキナ−ゼ・コンドロイチン硫酸結合物、その製造法及び血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発り］け新規なウロキナーゼ誘導体、その製ガ１Ｔ法
及び血栓溶解剤に関する。更に詳しくは、本発明は水可
溶性ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物及びその
製造法当該結合物を有効ｈ′Ｘ、分とする血栓溶解剤に
関する。

フィブリンおよび血栓の溶解酵素であるウロキナーゼは
各種血栓症や塞栓性疾患の治療および制癌剤との併用療
法等に広く用いられており、優れた臨床効果をもたらし
ている。しかし生体に投与さｈたウロキナーゼは、蛋白
体としても又酵素活性としてもいずれも速やかに血中よ
り消失し、このものの廂中牛頗期はわずか１〜２号であ
る。さらに投与されたウロキナーゼの酵素活性は血中ノ
ウロキナーゼ阻害因子による作用を受け、ある閾値以上
の以を投与しないと、血栓浴＃能か兄現しないことが判
っている。

ウロキナーゼのこのような皿中動態に、十分な効果を得
るためには必然的に入電投与へと進展ぜざるを得ｖ１今
ｌ−１の大量投与療法になっていると理解される。発す
）者らはかねてＪ：り血中におけるウロキナーゼの効力
を持続させ、かつ皿中の阻害因子による影響を堂けにく
くすることを研究し、実験及び検討を重ねΔ−結果、水
ｔｉ、［解性のつｏ−％リーダ・コンドロイチン＃を酸
結合物音創製すると共に当該結合物がウロキナーゼの単
独投与１１．′ｌにみらＪする種々の欠点全改善し得る
こと、人びウロキナーゼの酵素活性を十分に〃・つ持続
的に発揮しうることを見用し、その医薬としての自用性
に宿目して本発明を完成し）ｔｏ １ｉｌＪち、本発明は■ウロキナーゼ・つノドロイ−１
−ン硫酸結合物、（２）ウロキナーゼとコンドｆＪ　４
４ン硫威の反応性誘導体、！：をＩ×応さゼ−でなるウ
ロー髪ノーー七・コンドロイチン硫酸結合物及び、■ウ
ロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物よりなる血栓浴
解剤に関する。

木兄ＥＪ、ｌに月１いるつｏ−ｉナーゼＶｉ医桑とＬ２
で右ν袈されたものであＪ］ば、人尿、腎組織培養のい
ずれの由来のものでもよく、更に遺伝子下学の手法によ
りヒト由来のつｒＪＡナーゼ遺伝子分大腸菌に投入し、
培養後その人腸繭が生殖−ｆるウロキナーゼてもよい。

４７仁分子組２５０００〜６００００　の組１７１１の
もの全便用′ｊ−ることか好ましい。

不発Ｅ月１こ使用さハるコンド「１イチン飢゛「仮ｅＪ
力了量４０００〜４（１００ｆＪの範囲Ｊ）ものから煎
択′Ｊ−ることが好ましい。

木兄１１のウロー・ノーーセ・フン）−「ノイチン硫酸
結合物は、活性化二ｒ　、：／　ト’　ｏイチン鮭酸（
たとえＶ５１′、コンド「］・ｆチレチン酸の水酸基を
ア１１／デヒドにｔ占べ牛化しん−ものる二と）とウロ
キナーゼと全ｌ１１−接結合さ、＋！″たものて゛もよ
く、また活セ１−化ｆノグンとつ「」キプーセとを１１
！！の基を介し−ｒｊｒｇ接的に結合１−、、　ｆｃも
のｃ′もよい。ｒｔ−にｔ占・ＩＱ化＝〕シトロイチン
１波酸と−Ｊ、ものでめ０、／（償゛（、化Ｊ／ト〔ｊ
イチン睨Ｍとし−ＣＬ１、／ｌとえ？−ｆ式 ％式％ （） で１．−わさｆｒる化合物などがあげられる。化合物（
１）は、たとえばコンドロイチン硫酸を過ヨウ素酸など
°て゛酸化−することＫよって製造、！ねる。化合物（
ＩＩ）１・］］↓−コンドロイチン鈍故゛ヲンアンゾロ
ーマイとｊｋ応さ１ξることによって得られる。これら
の６４１性化法は、Ｊ、　１ｓｉｏ１．　Ｃｈｅｒｎ、
　　２５１　、１０８１（１９７６’ｆ′）　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７
８　。

２１２８（１９７６４ユ）博に記載、さバーＣいる１、
本発明のつ［１キナーゼ・コンド【１イチシ硫酸結合物
の製造法ｌ：１１、たとλ−げ次のＵｌｌ　＜　−Ｃあ
る。

（第１法） ド「」イゴン偵シがυ（ウロー＼−ノーセ）（ウロキナ
ーゼ・コンドロイチン懺敵）本反応においてＣ・ハ１ｆ
コンド１イシ脈酸全酸化Ｍｌｌ　（Ａとえは過ヨウ素酸
すトリウム）Ｖこて酸化する。この際コンドロイチンｍ
ｕｆｆ　１００知１１ａ都に対して酸化剤をｌＯ〜４０
’ｊｌｊ、置部使用−［る。また反応時開は１０〜６０
分てあ０、室温、暗所で播燥する。かくｌ−〇得られた
活性化占：／、Ｒ巖ｉｉ４１０〜５０％である。ウロキ
ナーゼと４１ｉ性化コンドロイチン硫酸との反応は通常
、ウロキナーゼ１００屯Ｍ都に対して活性化コンドロイ
チ硫酸２０〜２０００中、槍１部をＩ反応させることに
よって行われる。この１転ウロキ−）−七は水浴液とし
て、捷た活性化コンドロイチン硫酸はリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６〜８）浴液として反応に供される。かくして得らり
、ｉ化合物を還元することによって目的物が得られるが
、この（怜還″に、剤としで汀、水素化属塩にて還元す
る。水素化ホウ素金属塩及び水素化／アンホウ素金八塩
と１７では清々アルカリ企Ｍ地（たとえばナトリウム塩
）か好筐しいものとして例示される。当該還元は、通常
０〜３０゛Ｃ好筐しくは４°Ｃにて６〜１２時間攪拌す
ることによって行われる。

（第２法） 硫酸）　　　　　　イチン硫酸） １ ０　　　　　　０ １１１ （ウロギナーセコンドロイチン硫酸結合物）（式中、ｘ
、ｘ’はそれぞれハロゲンハル子（ｆｃとえば、クロル
など）を、ｎＶｉ１〜６の整数を示す）コンドロイチン
硫酸と臭化シアンとの反応にｔゴ、ｓｉＪ者１００重ｉ
１１．都に対して後者を１０〜１００重ｌｉｔ部を使用
する。

活性化デンプンに二′自能性化合物（例えばジアミノエ
タン、ジアミノヘキサン）次いでノ晶ケンアセチルハロ
ゲニドたとえば、グロムアセチｌレプロミドを作用させ
て結合さ−じる。次にこの粘性化コンドロイチン硫酸と
ウロキナーゼとを接触させウロキナーゼ・コンドロイチ
ン硫酸を得る。この結合反応［、ｐＨ７，２〜１１に調
整し、温Ｊｙ　３〜２５°Ｃで１２〜４８時同接触させ
ことにより行なう。

かくして得らｔしたウロキナーゼ・フンドロイチン硫酸
結合物１１公知のゲル′０３過法、分子篩別法、イオン
文換法等にて回収できるか、ケル濾過法て′分画した場
合ｔまウロキナーゼ・コンドロ４チン４ｉ酸結合物と未
結ギｊのコンドロ、イチン便を服及びウロキナーゼかき
わめてす］瞭な差異を持って挙！Ｉ）Ｊ−ｆるから、目
的と−ｒる結合物の回収を容易に行いつる。

回収したウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸ＭＡ物は、
徐菌ｐ過及び加熱処理等を行なったのち分注し、凍結乾
燥してウロキナーゼ・コンドロイ’ｆ−ン硫酸結合物を
含有する血栓浴Ｗｆ剤か得られる。

このようにして得たウロキナーゼ・コンドロ４チン６ｆ
ｔ酸結合物の性状は水及び生理的塩類溶液に容易に射角
’Ｔ！−ｉる。又、ウロキ・ノーゼ・コンドロイチン硫
酸結合物のｐＨ安定性、加熱安定性及び血漿中プロテア
ーゼ阻害因子に対する安定性をｎＮべろと、ｐＨについ
てし１ウロキナ一セ自体はｐＨ３〜■０の範囲にわたっ
て比較的安定であるが、ウロキナーゼ・コンドロイチン
硫酸結合物＆：Ｌ、！らｉ／ご安定であり、ｌ）　８２
〜１１の広い範囲にわたって力価の低下（−、」全く詔
められなかりた。加熱安定性についてＶ、Ｊウロキナー
ゼが最も安定なｐＨ８，０において６０　”Ｃの加温を
行ったところ傘噂、ウロキナーゼ単独のものｉｊ　２時
間の加熱で安全に失活しｋのに対シ、ウロキナーゼ・コ
ンドロイチン硫酸結合物は加熱１０時間後においてもな
お１００％の活性残存率をボし、熱に対して非常に安定
であることが認められた。

本発明に係るウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物
は、血栓溶解作用を有するので血栓溶解剤として有用で
あり、たとえば汗射剤として非経口的に投与される。具
体的には、九とえば５０〜３０．０ＯＯＩＵの本品を日
本薬局方注射用蒸留水０５〜５ｍ１ＪＣ浴解し、年令、
症状および経過にに〉じて適宜加減して静脈内注射１点
滴〃ｊｔ注、）、ハ簡注射。

結膜下又は球後注射して月１いる。

本分［！１１に係るウロキナーゼ・コンドロイチン個仁
酸結合物は血中で極めて安定であって容易に＃離やゲｙ
解をせず、熱に対しても著るしく安定であり、血中のウ
ロキナーゼ阻害因子σ）作用を受けｉ’＋＝＜＜、ウロ
キナーゼ単独マ゛は血栓俗解作Ｉｌｌをン丁りさない低
活性の投与でも血栓浴解作［１をもたらし７、生体内に
投与したとき血中滞留時間が著るしく姑長し、。

毒性もほとんど検出されない宿の優Ｊしたも”を性をｌ
’！し、従来にない極めて有用性の商い医薬を彷供でき
る多力果がある。。

以下、天施例）χび失験例により不発１夕ｊヶより共体
重に説明−「る。

実施例 次にヒト血Ｖを用いてウロキナーゼ及びウロキナーゼ・
コンドロイチン硫酸結合物の血即中ブロアーアーゼ阻害
因子に対する抵抗性を調べた。試験力ｉノ＊　ｉ、ｆ　
ｓ　Ａ’、］性が１００ＩＵ（国際Ｗ１位）／ｍｌ（国
際中位（ｌこついて（−：１１　、医薬品研究（３）、
２９５−３０８゜１９７４年診照）になる様に稲沢した
ウロキナーゼ単独またＶまウロキナーゼ・ロンドロイチ
ン硫酸結合物２２５ｐｔＫ１８％ヒト血漿アルフミン１
５ｔｌｔを混合し、次いでこの混合液２０　ｐｔにヒト
血漿８０μノ　を混ぜ、８７゛Ｃにて１時間インキュベ
ー）Ｌｉのちヒトフィブリン標準平板法（１３，ｉＬＡ
、　、　２４　、２７８−２８２　、１９７５年）にて
つ「１キノ゛−ゼ活性を測定し、ヒト血漿とのインキュ
ベ−１・［４ｉｊのウロキナーゼＭ、性を１００％とし
、そのウロキナーゼ残存活性を像ｔ１４（〜た。試験れ
ジｉ果はりＳ１図に示ｊ゛通りであり、ウロキナーゼｆ
１！独の残存活性が１５％であるのに対し、ウロキナー
ゼ・コンドロイチン（ｐｉＣ酸結酸物合物ま２３％であ
った。

このことから本結合物は血漿中プロテアーゼ阻害因子の
影響に対して抵抗件全有することが認められた。

実施例 ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物について高速
成体り自マトグラノイ−（Ｌ　Ｃ−８Ａ、　：島津製作
所製）を１４１いてＳｏｍｅｎｏらＣＪ　、　Ｃｈｒｃ
ｎｎｔ、　。

よｙ邑、１８５−９２（１９８０）］の方法に従い分析
［７た。担体、ｌ−１，−でＴＳＫ−６’ｅｌ　３００
０ＳＷ　（束１”ｆ−ソーダ製）全１４１い、Ｉ）　Ｈ
３の０２Ｍ　リン酸緩備液を１．２ｍｅ／ｍ＊の流速で
族１用したところ、第２図の高速液体クロマトグラムを
得た。その結果、つ「Ｊギヅーセ・コシド〔１イ−ｆン
硫酸結合物ｅ」、予に１．（さハたρ［」〈高分子側に
浴出された。

実施例 ウロキナーゼ・コシド「」イチ／侃酸結合物とつｏ４ナ
ーゼ単独のもののげ１［栓溶解能をすＡ′ンドフルーゾ
法をＩＩ＋いてＪＬ較した。この試験力２．！、１１　
ｌｒ鮮で正常なヒト・クエン画面？＆ｌ　＋）１１！会
で内径３　＋ＩＪ　１長さ２７０肱のノラスチック・ヂ
：Ｊ−グに入れ、この血液にさらに３８％塩化力ルンウ
ム・２水塩液０．１−添加したのち、チューブの両端に
内径５ａａＪくさ１５１ａのシリコンチューブを接合し
てループに−Ｔる。このチューブ全曲ちに水平面より８
０”Ｃの角度で毎分１２同転するように設計された回転
盤に載せ、３７゛Ｃの恒温室にて２０力間回転させる。

これにより血液カラムの先端に長さ約１８ＬｍＯ人」−
血栓が生成する３、この人工血栓ｄ病理組織４二的にみ
て人体にできる混合血栓に１・れめてλ１似した組織１
宋をイ１する古いわｔｚている。

ループをこの装置からｌＩＸりはｆしたのち、ループ状
にしたポリビニルチューブの一端を／リコンチューブか
らはｒし、試料数又は生理良塩欣０７１ｒｎｌ　’／、
１　’）ユープ内に入れ、再度チューブをルーフ状に（
７、回転装置に架け、回転ｆｒ：続けた。

第１査目のループに就いて血イ全浴Ｆｉ’？を開り１コ
しＣから４１１．ｉ１Ｍ後に、この第１を目のル−プを
回転装置１１から抜きＪｉ’Ｉす、チューブ内の血栓を
１０ｍ１の蒸栢水にｂ　ｏｍｏｇｅｎ　ｉ　ｚ　ｅ　Ｌ
、遠心１．（３６ｔ）ｔ）ｒｐｍ、５力間）、上清の５
４０　ｎｍ　Ｋ於ける吸光度を測定した。第２査目以１
昇のル−フ”も身４１査目のル−ゾに引きわｌ・いて抜
き収り、光と同様に処理した。

なお、試相准添加群の血栓俗解率（Ｙ）全次式に従って
水めた。

Ｙ＝（１−Ａ／Ａｃ）Ｘ１００＜’ｔ）１１１シ、Ａ：
を低利液を・添加したループに１．）いての５４０　ｎ
ｍにおける吸薯二度 Ａ（・；生坤食Ｊ−１８Ａ１代をＩＡ＼加したループに
ついての５４０　ｎｍにおＨ２，吸光 度の七均饋 ウロキナーゼ単独とつ１ズＡナーセ・ロコントロイチン
像醒結合４’／ｌのチャンドラループ２，１、Ｋよる血
瞳浴解試験の結果は、第３メ］にン１＜すｕｌ＋　＜−
ｒある。第３図のグラフこり横軸ｔ」、ル（Ｊ−＋液ｏ
、１ｆｎｌ　ケループ内に注入した時のμ終ソ月ｌｌｈ
金表小し−Ｃおり、Ｃ４つ力価はフイズリン乎ＩＪＩ法
て゛側’ｔＪ工′１７だ（１ｆｔ−Ｃある。

このクラブより、ウロキナーゼ・コンドロイリン硫酸結
合物の１１．１目宅（ｉ解曲線がウロパノ−セ中３虫の
向曲枳よりｔ］ｒｉ　１１１１１　Ｙこ移納してｊ２・
す、本れ”１１１□１′η（・）血栓浴吟〆庵かウロキ
ナーゼ単独、［りも頒く１つ−Ｃいる事が分る。

実施例 次にピーグル大（雄１体重１２−ｔ５Ｋｙ）（ｒ−用い
てウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の血中維持
効果を実験し、ウロキナーゼの単独投与と比較した。ウ
ロキナーゼにクロラミン１゛汰（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、
　８９　、１１４　、１９６３年）により１２５１で標
識した。すなわちウロキナーゼ１０７Ｕ川キナーゼ水浴
Ｗ　０１ｎｒｔにｌ　ｍ　Ｃｉ　／ｍｌ　Ｎ　ａ”　Ｉ
　０．２ｔｘｔを加え、さらに００５％クロラミン−Ｔ
　Ｏ．　ｌ　ｌｎｉを加えて室温にて５分間反応さぜた
のち、０．ｌ〃重亜硫酸ナトリウム０．　１　ｍｌ．を
加えて反応を止め、このＩｙ．応混欣をセファデックス
Ｇ−２５カクムＣ（、通して＋２５Ｉ−ウロキナーゼと
遊離のＮａ１１２５　　に分υ１宜濾過１，た。

と４のよりにして得た　Ｉ−ウロキナーゼを２分［７、
１つＱ：１そのまず動物天験用試利とし、能は分子量４
万の活性化コンドロイチン硫酸と反応させ、＋１５１−
ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物をｄすて１牡
１天専賀月（拭旧とした。＋２５１　−ウロキナーゼ・
コンドロイチン硫酸結合物汐び　ｌ−ウロ・）ナーヒ゛
のぞれぞ；ｈ　２　Ｘ　ｌ　Ｏ　ｃｐｍ金ピーグ・し犬
ＶＣ静脈内投与し、そＪｌそれの皿甲襲ｔＷ全１０シナ
おさに水めた。実め悶鯖ｑ書゛１第１表に７「り丁抽り
１゛あり、本結合物を二１ウロキーノ”−セ車独に１１
ｚ軟してｆＩｌｌ中十減ＪＱ１は第１次減尺曲線からＬ
ｌ．　５．７　（ｒｉに、第２次坂ぺ曲線からＶｉ５　
イ．！’ｒにそれぞれ延長し、ウロキナーゼにコンドロ
イチン１１ＩＩｃ酸（ｉｌ−結合びぜると著るしい皿中
維持効果かｔｒｐｒ−）れることを認めた５、第　　１
　　表 実施例 急性毒性試験をウィスター系ラットの尾静脈内投与によ
り６１−１べるため、体重Ｉ　Ｋｙにつき本結合物のウ
ロキナーゼ５０万ＩＬＪを静注し投与後７日間にわたっ
て一般症状の観察と体重測定を行ったところ、１．ド１
Ｆは順調に増加して全く異″に所見は認められなかった
し、都検ｌらひに絹識学的検森の結果も全く異常を認め
なかった。

実施例１ フンドロイチン誠酸（分イ量４万）１５／を秤取し、こ
れにＡ（留水２（Ｊｍｅを加え溶解させ、Ｂ　５　（Ｄ
ｎｒの過ヨウ素酸ナトリウムを蒸１イｌ水５ｍ１．に溶
解させたもの’４１奈加し、室温で暗所にて３０分間梢
拌した。攪拌後、４Ｎ１の水酸化ナトリウム浴液で中和
し、水で充分透析した。透析後、凍結乾燥する。

？’ＫＶＣつｏキナーゼ１０ｙｌ（１００万ＩＵ）を含
有゛する水浴欣４　ｍｌに上記の活性化コンドロイチン
硫酸２　８　ｔｎＶ　　（　８．５モル当１１）を０，
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ’／）に溶解させ皮ものを加え
、史に水素化シアノホウ素ナトリウムｋ　１．２２ｍ？
　ＩＫ加し、４°Ｃにて１８時間攪拌する。攪拌後、水
素化ホウ素ナトリウムを３．３　ｙｌ　を０，１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させたものを加え、４°ＣＫ
て１８時間攪拌する。攪拌後、上記緩衝液にて透析する
。得られた反応混合物をセファデックスＧ−２０００カ
ラムにかけてゲル口過し、ウロキナーゼと上記のコンド
ロイチン硫酸の結合物と未反応のウロキナーゼとを分別
する。分別して得られた結合物を集め、ミリポアフィル
タ−による除菌濾過を行いウロキナーゼカ価を測定して
分注量を決めたのち、所定ｉｔを小分けして分注し、凍
結乾燥してウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の
製剤を得る。この結合物は前述したウロキナーゼ・コン
ドロイチン硫酸結合物の種々の特性，を何していた。

実施例２ コンドロイチン硫酸（分子量４万）１２に蒸Ｗｔ水４９
ｍ／！を加えて溶かし、これに臭化シアン１５０ｍｔｆ
シアン化メタン１．５−に溶かした液を滴加して十分に
攪拌する。この間１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ１０．
２〜１０．５に維持する。反応開始まり５分駐過Ｑ２　
ｋＣ濃ｕｒｎ　１７Ｃ−ｒ　Ｉ）　Ｈ２，２Ｋ　”Ｆｔ
ｊ’　、　、／　７　ｉ　ノエタニ’　２　ｔｎｌ　（
１７加えてｐ）１９．５に１−げ、ｐＨ９，５ン（＾巴
って４°Ｃで１佼ｆｆｐ直−Ｕる１、このイ桑蒸１臂水
にヌ寸して透セ１し＾σ）ｆ・沫ｈ□ｉ　’７１祿し−
てアミノエチル・γζノコンドロイーｆ−ン１νｆ　ｒ
＋’シτ赳イ、。仄にＣＪＬ存・０１Ｍリン醒駁Ｑｌｉ
Ｊ赦（ｐｌｉ　’ｉ’、ｏ　）　２５　ｍｅに俗解し、
７．７０ムアセナルノＩＪミドＩ　ｒｎｔ　’（（ｌｌ
：％ｊ　ｉ’　Ｌ、、約２　ｔＲｒ　ｔ（＋、ｌ　ｌ　
Ｍ水り’を化ナトリ・シム−ｔ゛ｐ　ｉ＋　７．０　＋
ｔｃ　１１４！□Ｑｉｔのち蒸ｈｔ水Ｔ′虐析Ｌ２、沫
ム゛ｉ４吃借ごし７−こＡ’＋　ＩｆＩＥ化−Ｊンド「
ｌイチシ佃仁醒（、ケｒ（する。

その５０７７１４７’　をｆｌ、　Ｉ　１１１戻駁稜何
欣（ｐ　ｋ（９，５）　０．４　ｍｔ’Ｖ（７ｔ４かし
１、つＤＡナーゼ５　ｔｒ＋９　（５０ツノＩ　Ｌｉ　
）　ｆ　ＩＩＩＩＡ、約５°Ｃにで５０　ｆｉｂ　ｌ＋
’ｌｌ　ｉｆ）　ｌ）７して結合１スｋｊ”＞？−〇■
す。

次いでｂｔ　！ｃ’９混ハｌ）力金−ヒフγデツタスに
　−２（＋　（ｌのカラムン（かけてり少ｆｐ山））シ
、ウロギノーーーヒ゛・二ｌンド［」イチン１匝醍１告
音９勿を爵るｖ　イ：ｔ６ｈｔｒ、つ１ギプーセ・コツ
トロイチン１１１１郭４１．イ゛Ｉ勿−Ｈ：ｈ小のＲＥ
ら〒４’Ｅ　　’ａ・　ＩＪ　ｔ〜−（い〕γ。

天り色１り１１３ ′人施１ン１１２と回（＞１２に晃化）γンー（’　／
ｌ（ｉ　ｆｌＥ比１−〕ｔコンドロイナンｔＩｌ＋ｃ合
文ｙｃ、シγミノヘキ→Ｊン２１・にｉ、−＃ｌｌえて
ｐＨ９，５に１７、ｐ！−（９，５ンＣ保て４°Ｃで一
夜放置）−る６、この後蒸留水て′透析し、凍結乾燥し
てアミンへキシルアミノコンドロイチン硫酸を得る。こ
２Ｉ′ｌ全実施例２とｌｉｄ　ｍに、１０ムアーセチル
グロマ２イド−こグ（、＋１１’　ｌ、てＮ−ゾ「Ｊモ
アミノ−ヘキシルアミン−ロンドｒ−１イチン硫酸を得
た。この５　Ｑ　ｍｙ　をＯ，１Ｍ炭酸Ｍ　＃　’Ｄ　
（ｐ　Ｈ９，５）ｌ　ｍｅにど６かし、ウロキナーゼ５
ｍｙ（５０１Ｊ　ＩＵ”加７て、同様ｉｌｌ即す６０　
（Ｖ・”、＞Ｊ′したウロＡす・−セ・コンドロイチン
ｈｆ醇ｉｊ曲述の、堵才、冒ｔ１　　を　イ」（−−て
　いＡ−０なお、実施例１〜３における生１戊物の特性
は次の用Ｊリ−で゛ある５、 汀）組成比：活性化デンプン、／つ［１キナーゼ（Ｗ／
ｗ） 七ル比：活性化デンゾン／ウロキプーセ（ｍｏ々霜Ｏ６
） 蛋白含量：得らｌまたつ「Ｊキナーゼ結合物を凍結乾燥
後、８ｍｔ！の水に溶解き一＋！：にときの蛋白含４ｔ 、）Ｉ（：得られたつ「ｊキナーセ誘導体を生理食塩液
に溶解させたときのｐ　Ｈ

【図面の簡単な説明】

第ｌド１は血漿中ブロアアーゼ（Ｓ１１害因子に対する
抵抗性を示−ｆ図、第２図ｔゴウロキプーセ及びウロキ
ナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の高速成体クロマト
グクム、第３図Ｃ」つ「１キサーゼとウロキナーゼ・コ
ンドロイチン硫酸結合物の血栓俗解曲線をボしている。 第１図 １ 七 ｈ　　シロ−８Ｔ−ゼ　蓼４弘 Ｑ　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　５０角置
存飽性（〃） 算２図 １も′　　　　　　　　　　七 分子量 第３１ ＋０　　　　　　　５０　　１００　　　　　　５００
　　Ｌ１００Ｏ試料液１＋のウロ千欠−ピ活１庄（ＩＵ
／ｍｌ）手続補正書（方式う 特許庁長官　　　　　　殿 １、事件の表示 昭和５７　年　特許　願第１３２７８９号２　発明の名
称　ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物、その製
造法及び血栓俗解剤 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏ン、（？、ゼト） ４　代　　理　　人 〒５４１ ７、補正の対象 （１）明細書第２１頁第１２行〜第１４行に「第２；図
は・・・り・−トクラム、」とあるを「第２図（１）は
ウロキナーゼ、第２図（２）はウロキナーゼ・コンドロ
イチン硫酸結合物におけるそｎぞ汎の高速液体クロマト
グラムであり、実線は２８０ｎｍにおけ１吸光度であり
、破線は屈折率を示すものである。］に訂正する。 （２）第２図？別紙の通りに訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （υ　水可溶性ウロキナーゼ・コンドロイチン硫酸結合
   物。 （２ン　　ウロキナーゼとコンドロイチン硫酸の反応性
   誘導体とを反応させることを特徴とする水可溶性ウロキ
   ナーゼ・コンドロイチン硫酸結合物の製造法。 （３）　コンドロイチン硫酸の分子鼠が４千から４万で
   ある特許請求の範囲第（２）項記載の水可溶性ウロキナ
   ーゼ・デンプン結合物の製造法。 （４）　　ウロキナーゼ１モルに対してコンドロイチン
   硫酸１〜ｌＯモルの割合で反応ざぜることを特徴とする
   特許請求の＠間第（２）項記載の水可溶性ウロキナーゼ
   ・コンドロイチン硫酸結合物の製造法。 （靜九畿嗜ナーゼ・コンドロイチン４ｔＬ酸結合物を有
   効成分とする血栓溶解剤。