JPH04501848A - 血小板依存性動脈血栓症の予防方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 川ｍ 本件は、その開示が参考文献として本文中に組み込まれている、１９８７年１１ 月２７日出願に係る第１２５，１７８号の一部係属出願である。

狭五分！ 本発明は動脈血栓症の危険のある患者における血小板凝集を予防するためのハロ ゲン−メチルケトン含有ペプチドの使用に関する。

発ｉｌｌ最 血栓は血栓形成性刺激への反応として生きた心臓若しくは血管中に血液構成要素 から形成される成分の集合体である。

血栓症、すなわち血栓形成過程は独特であるが通常相互作用的なメカニズムを通 じて発生しうる。第一段階、すなわち血小板凝集は血小板が血管壁損傷等の血栓 形成性刺激により活性化された結果として起きる。第二段階、すなわちフィブリ ン形成は凝血連鎖系の活性化の結果であり、その最終段階が通常トロンビンによ るフィブリノーゲンのフィブリンへの転化、すなわちフィブリン形成と考えられ ている。フィブリン形成の目的は凝集血小板を安定化させることにより止血プラ グ（Ｐｌｕｇ）を安定化させることであると思われる。

血小板凝集及びフィブリン形成の関与の強度若しくは程度は、血行力学（血流） 因子の結果として変化することが今では知られている。たとえば、静脈血栓症は 低流速条件下で発生し、血小板及び凝血連鎖系成分の合同かつ等量の消費を伴な うことが示されている（バーカーら、ニューイングランド　ジャーナル　オブメ ディスン、２８７巻、第９９９−１００５頁、１９７２年）。

結果として、静脈血栓は通常比較的少数の凝集血小板、多量の散在フィブリン及 び幾つかの赤血球細胞から成る非＆ｌｌ織化塊であり、このため′赤色血栓”と 呼ばれる。フライマン１止血と血栓症”；基本原理と臨床的実践′、コールマン ら編、第２版、フィラデルフィア、Ｊ、Ｂ、　リソビンコント社、第１１２３− ３５頁（１９８７年）を参照のこと、これらの観察はフィブリン形成が静脈血栓 の発生において主役を演じることを示唆している。

対照的に、動脈血栓症は高流速条件下で発生し、少なくともその初期の段階で、 血小板の選択的消費を伴なうことが示されている（バーカーら、ニューイングラ ンドジャーナル　オプ　メディスン、２８７巻、第９９９−１００５頁、１９７ ２年）０例として、動物実験はプラスチック動静脈カニユーレの補綴表面は完全 に血小板だけから成る血栓を発生させ、その血栓形成過程は検出可能な凝血連鎖 系の関与なしに進行することを示している（エバンスら、ジャーナル　オブ　エ クスペリメンタルメディスン、１２８巻、第８７７−８９４頁、１９６８年、及 びバーカーら、ジャーナル　オプ　クリニカル　インベスティゲイシッン、第６ ４巻、第５５９−５６９頁、１９７９年）、おそらく、凝血作用が十分に活性化 される前にトロンビン等の凝血促進物質が急速な動脈血流によって血栓形成焦点 から洗い流されてしまうために、動脈血栓症においてはフィブリン形成は極少量 である。結果として、動脈血栓は通常、完全に血小板だけから成る（“白色血栓 ”）か、若しくは血小板による基底あるいは一次塊及び、−成環上を覆いそこか ら下流方向へ伸張する血小板及びフィブリンによる二次風から成る複合構造から 成る。前述のフライマンの引用文献を参照のこと、いずれの場合も、損傷部にお ける血小板凝集は動脈血栓発現の主要なメカニズムである。それゆえ、動脈血栓 症は少なくともその初期の段階では、血小板依存性と特徴付けることができる（ バーカーら、“脈管系疾患：最新の研究と臨床応用”ストランデスら編、オーラ ンド、グラン　アンド　ストラントン、第２７１−２８３頁、１９８７年）。

前述の視点から、血小板凝集若しくはフィブリン形成のいずれかに作用する薬剤 の治療上の有効性が処置される血栓症の型に依存することが知られている、のは 驚くべきことではない。

例えば、アスピリン若しくはジピリダモール等の血小板機能を阻害する、すなわ ち血小板の凝集能を阻害する薬剤は、動脈血栓症の予防において有効であるが、 うっ皿型静脈血栓症の治療においては有効でない、逆に、ヘパリン及びヒルジン 等のトロンビンのフィブリン形成能を阻害する薬剤は、うっ皿型静脈血栓症に対 しては治療上有効であるが、動脈血栓症に対しては有効でないことが示されてい る（バーカーら、トロンバス　アンド　ダイアセティツク　ヘモリジ（Ｔｈｒｏ ｗ、　０ｉａｔｈ、　Ｆｌａｅｍｏｒｒｈ、　＞　３１！！、第１８８−２０３ 頁、１９７４年）。

このように、本技術分野は動脈血栓症の効果的な管理においては、フィブリン形 成ではなく血小板凝集の調節に力点が置かれるべきであることを教えるものであ る。すなわち、血小板依存性動脈血栓症を治療上有効に予防するには、前述のフ ィブリン形成を阻害する薬剤（抗凝血剤）ではなく、血小板の凝集能を阻害する 薬剤（血小板機能阻害剤）の投与が必要である。理想的には、臨床上有用な血小 板機能阻害薬は毒性がなく、持続性作用を持ち、異常出血の過剰リスクなしに良 好な抗血栓症能をもつべきである。

現在使用できる臨床薬剤のいずれも、これらの要求のすべてを満足してはいない 、アスピリン、スルフィンピラゾン、ジピリダモール、スロクチジル及びチクロ ピジンが現在までに臨床試験による評価を受けている薬剤である。

血小板依存性動脈血栓症を予防する能力のある薬剤の開発における困難のひとつ は、アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）　、コラーゲン、トロンビン、トロンボキサ ンＡＩ、エピネフリン、セロトニン、パップレシン、抗原−抗体複合体、プラス ミン、ウィルス、バクテリア、エンドトキシン及び癌細胞を含む多様な刺激によ って血小板の凝集が誘導されうろことである０本技術分野によれば、インビボ（ 釦動）ではいかなる単独の刺激剤の局所濃度もおそらく凝集を発生させるのに十 分なほど高くはないらしい、結果として、インビボでは、いくつかの刺激が共同 作用的効果を伴なって同時に血小板に作用するため、その刺激の個々については 非常に低濃度で凝集の誘導に対して有効であるらしい、バソカム、トロンボシス 　アンド　へモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、）５０１１、 第６１０−６１９頁（１９８３年）を参照のこと。

このように、本技術分野では特定の血小板凝集誘導刺激を押さえることが、血小 板依存性動脈血栓症の予防に対する有効なアプローチにならないと思われること を示唆されている。いくつかの研究が、この視点を支持しており、そのうち最も 関連のあるものはトロンビンの酵素活性ではなく、トロンビンの体液活性、すな わちその血小板活性化刺激能を調べた研究である。たとえば、既知の抗凝血剤で あるヘパリン及びヒルジンはインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ　）でトロンビンの血 小板凝集刺激能を阻害することも示されている（マークワードら、ヘモスタシス 、１３巻、第２２７−２３３頁、１９８３年、及びホフマンら、ヘモスタシス、 １４巻、第１６４−１６９頁、１９８４年）、もっとも、ヘパリン若しくはヒル ジンのいずれもインビボでの動脈血栓症の予防においては有効でなく、このこと はトロンビン以外の１個以上の刺激が４７且奥の動脈内血小板凝集の誘導の原因 であることを示唆している。

本発明で特に重要性を持つものは、Ｄ−フェニルアラニル−し−プロリル−し− アルギニル−クロロメチルケトン（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−ＣｈｔＣＩ− 若しくはＰＰＡＣＫ）であるトリペプチド誘導体である（ケトオーら、トロンボ シス　リサーチ（Ｔｈｒｏ＋ｍｂ、　Ｒｅｓ、　）、１４巻、第９６９−９７３ 頁、１９７９年、及び米国特許第４．３１８，９０４号、１９８２年３月９日、 シラーら）、ＰＰＡＣＫはトロンビンの酵素活性を、その活性部位付近のヒスチ ジン残基をヘパリン−抗トロンビン■複合体及びトロンとン間のそれと同等の緩 速度定数（１，ｌＸ１０’Ｌ１モル／秒）でアルキル化することにより、非可逆 的に阻害する。

ヘパリン及びヒルジンと同様に、ＰＰＡＣＫはインビボでトロンビンの、血漿フ ィブリノーゲンをフィブリンに転化し、それにより、赤色血栓の形成を誘導する 能力を阻害することが示されている。ケトオーら、トロンボシス　リサーチ、１ ４ｔ１、第９６９−９７３頁、１９７９年、参照のこと、しかしながら、引用し た各実験に記されているような注射によりもたらされる局所的に非常に高い濃度 のトロンビンは、いかなる自然の血栓症過程においてもおそらく発生しないこと は銘記しておくべきである。さらに、それらの実験の方法論は、報告されている 実験条件下での血栓症の発生におけるトロンビンの酵素活性及び体液活性の相対 的寄与を描写させない、このように、それらの実験は、ＰＰＡＣＫの動脈血栓症 に及ぼす影響についての結論を引き出すのに適当なモデルを用いていなかった。

ＰＰＡＣＫのフィブリン形成を予防する能力は、ヒトの血漿中及び実験動物の血 液中で急速に減退することが示されている。たとえば、コレンら、ジャーナル　 オプ　ラボラトリ−アンドクリニカルメディスン、９９巻、第７６−８３頁、１ ９８２年、はウサギにおけるＰＰＡＣＫのフィブリン形成阻害能の半減期は約２ ．９分であると報告した。ハウブトマンら、トロンボシスリサーチ、２０巻、第 ３４７−３５１頁、１９８０年、も同様に参照のこと。

ウサギの血漿におけるＰＰＡＣＫのフィブリン形成阻害能の半減期が相対的に短 かいため、前述のコレンらはＰＰＡＣＫの抗凝血効果をより長い期間持続させる には連続的注入が必要であろうと結論した。さらに、コレンらはＰＰＡＣＫの短 かい血漿半減期から、ＰＰＡＣＫは散在性血管内凝血が疑われるある種の緊急条 件において特に有効と思われると示唆するに至った。彼らの推論は、ＰＰＡＣＫ の単回注射はただちにトロンビンの酵素活性を阻害するらしいが、そのフィブリ ン形成阻害能は急速に減退するらしいため長期間の抗凝血効果はもたらされない であろう、というものであった。

マークワード、アニエアル　ニューヨーク　アカデミツク　サイエンス、４８５ 巻、第２０４−２１４頁、１９８６年、はＰＰＡＣＫの相対的に短かい半減期は それがトロンビンだけでなく、アミノ基若しくはチオール基を含有する他の血液 及び組織成分とも安定な共有結合を形成することができるためであると報告して いる。マークワードによれば、その性質がＰＰＡＣＫを抗凝血剤としてのインビ ボでの使用に不適当たらしめている。ハウブトマンら、トロンボシスリサーチ、 ２０巻、第３４７−３５１頁、１９８０年、も参照のこと。

インビトロでのヘパリン様抗凝血剤としてのＰＰＡＣＫの使用の記述については 、モーラ−ら、トロンボシス　アンド　へモスシラス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅ ＋５ｏｓｔａｓ、）　、５６’ｍｓ第１６０−１６４頁、１９８６年；ボウドら 、パックスサングイモーター（Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、）、５１巻、第１９２−１９ ６頁、１９８６年；ティーフェンブルンら、サーキュレイシ四ン、７３巻、第１ ２９１−１２９９頁、（１９８６年；り（Ｋｕ）　、ジャーナル　オブ　カルデ ィアックファーマコロジ４　（Ｊ、　Ｃａｒ、　Ｐｈａｒｍ、）　、８巻、第２ ９−３６頁、１９８６年；オフオスら、アニエアル　ニューヨーク　アカデミツ クサイエンス、４８５ｓ、第４１−５５頁、１９８６年；及びスカーファ−ら、 ジャーナル　オブ　ラボラトリイ　アンドクリニカル　メディスン、１０７ｓ、 第４８８−４９７頁、１９８６年、を参照のこと。

またヘパリン及びヒルジンと同様に、ＰＰＡＣＫはインビトロでトロンビンの血 小板活性化刺激能を阻害することが示されている。ハーモンら、ジャーナル　オ プ　バイオロジカル　ケミストグイ、２６１＠、第１５９２８−３３頁、１９８ ６年；ハーモンら、アニエアル　ニューヨーク　アカデミツク　サイエンス、４ ８５１第３８７−３９５頁、１９８６年；及びマークワードら、ヘモスタシス、 １３１！！、第２２８−２３３頁、１９８３年、を参照のこと、もっとも、それ らの各実験はクエン酸処理した血小板を人工培地中で使用して行なわれた。パフ カム、トロンボシス　アンド　へモスシラス（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ ａｓ、）　、５０巻、第６１０−６１９頁、１９８３年、によればそのような培 地中におけるヒト血小板の反応は生理的濃度のイオン化カルシウムが存在する培 地中におけるそれとは異なる。このように、パフカムによれば、血小板機能阻害 剤についての多くの実験は実はイオン化カルシウムが低濃度の培地中における間 隔の詰まった血小板の接触により起きる。アラキドン酸経路の人工的刺激に対す る阻害についての実験であった。ＰＰＡＣＫのインビトロでの血小板凝集阻害能 についての実験から結論を引き出すことは、それゆえ困難である。

現在までインビボでの血小板凝集に対するＰＰＡＣＫの作用若、シ＜はそれの動 脈血栓症予防能についての研究はなされていない。

このことは、トロンビンの酵素活性だけでなく、それの血小板凝集刺激能も阻害 するヘパリン等の薬剤が動脈血栓症の予防においては有効でないという上記考察 の教訓の見地からすれば驚くに価本発明は患者における血小板依存性動脈血栓症 を予防する方法において、該患者に治療上有効な量の式（１）のペプチドを投与 すること含む方法に関する。

他の態様においては、本発明は患者における治療後動豚胃狭窄症を予防する方法 で、該患者に治療上有効な量の式（１）のペプチドを投与すること、該患者に狭 窄した動脈中の血流管直径を増大させ処置動脈を作成するための治療過程を施す こと、及び該患者の動脈血を該処置動脈中に循環させることを含む方法に関する 。

本発明はまた患者の補綴表面における血小板沈着を予防する方法で、該患者に治 療上有効な量の式（１）のペプチドを投与すること、及び該患者の動脈血を補綴 表面上に循環させることを含む方法に関する。

皿血亘呈見バ脱貝 本開示の一部をなす図面において； 第１図は式（１）、すなわちハロゲン−メチルケトン含有ペプチドを表わす式に おいて、式中Ｘがハロゲン原子、好ましくは塩素若しくは臭素を示し、Ｚが水素 若しくはＣ＋−Ｃｂアシル基、好ましくは水素を示す式を具体的に表わしている 。記号（Ｄ−）は該フェニルアラニン残基が右旋性であることを示しており、− 労咳プロリン及びアルギニン残基は両方とも左旋性の配置を持つ。

第２図は式（２）、すなわち式（１）において式中Ｘが塩素を示しＺが水素を示 す、好ましいハロゲン−メチルケトン含有ペプチドであるＰＰＡＣＫの式を具体 的に表わしている。

第３図は、ヒヒにおける動脈移殖片上への血小板沈着を阻害する能力についてＰ ＰＡＣＫとヘパリンを比較した実験を具体的に表わした２パネルを含んでいる。

これらの実験では自己由来の血小板を＋＋＋　Ｉｎ−オキシドでラベルした。そ の後長さ５１の内径４．０ｆｉのニットのダクロン血管移殖片（Ｖ、Ｓ、カテー テル社からの寄贈品）を長期体外転位の大腿部動脈シラスティックシャント（吻 合）中に伸張片として挿入した。該シャント内の血流量をカフス（ｃｕｆｆ）　 ドツプラー変換器針を用いて測定し、１７５±１６１／分の平均値を得た。血管 移殖片上のＩＩＩ　Ｉｎ−血小板沈着を映像分析システム（医療データシステム Ａ８、メトトロニック）と連結したガンマカメラ映像装置（グイナカメラ、ピッ カー社）によって測定した。結果は、沈着した血小板の放射能を１ｍｌあたりの 循環血液の放射能で割り、１ｍｌあたりの循環血小板数を掛けることにより得ら れる総沈着血小板で表わした。該測定回数は括弧内に示してあり、垂直棒線は平 均値±１標準偏差（ｏｎｅ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を表示し ている。

パネルＡは非薬剤処置の対照動物において、１１１Ｉｎ−血小板が急速にタリロ ン血管移殖片に沈着し、５０分後までに約１０ＩＯ血小板のプラトー（安定期） 値に達したことを具体的に示している。該移殖片は１．２±０．２時間で閉塞し た。水平方向の斜線棒で示される６０分間の１００　ｎ＊ｏｌ／　ｌｕｒ／分の 速度でのＰＰＡＣＫの連続的静脈内注入は血小板沈着を十分に阻害し、移殖片の 閉塞を予防した。血小板依存性動脈血栓形成の回復は、該横座標上の約９０分の 位置より後の血小板沈着の増加によって明らかなように、ＰＰＡＣＫ投与停止の ３０分後に発現する。

パネルＢは、該ヒヒに体重１キログラム（−）あたり１００ユニツ）　（Ｖ）の ヘパリン投与（総血液凝固時間を３倍遅延させる用量）が、６０分間の沈着実験 時間にわたって該移殖片上への血小板沈着を有意には減少させなかったことを具 体的に表わしている。パネルＢはまた該ヒヒへの１０００ユニツト／ｋｇの投与 が該移殖片上の血小板沈着を極一部しか阻害しなかったことを具体的に表わして いる。

第４図は頚動脈内膜切除部位におけるＰＰＡＣＫの動豚胃狭窄（Ｉｌｌ　ｌ　ｎ −血小板沈着）阻害能を具体的に表わしている。垂直棒線は平均値±１標準偏差 を表示している。非薬剤処置の対照実験（・）における、該処置動脈内の動脈循 環の開始後９０分間の急性血小板沈着をパネルＡに示す、パネルＡに示された値 は移殖標準値を用いて組織希釈について補正されるため、該結果は沈着血小板数 で表わされている。

ＰＰＡＣＫ（０）を該処置動脈内の動脈血循環を開始する直前から１００ｒｖｏ ｌ／ｋｇ／分の速度で静脈内投与した際に得られた結果もパネルＡに示す。

パネルＢでは、該動脈内膜切除部位のＩＩＩ　ｌ　ｎ−血小板沈着を実施例１に 記述した方法で得た動脈内膜切除／血液比で表わしている。パネルＢより、対照 （・）及びＰＰＡＣＫ処置（０）条件下の両方でＩＩＩ　ｌ　ｎ−血小板の漸進 的な蓄積は極少なかったことがわかる。

第５図は、ヘパリン（・）と比較してＰＰＡＣＫ　（○）の、血小板沈着の結果 としての血液透析器内の容量損失若しくは該透析器の補綴表面における容量損失 を防ぐ能力を具体的に表わしている。垂直棒線は平均偵±！標準偏差を表示して いる。

第６図は頚動脈内膜切除処置を具体的に表わしている。該総頚動脈をクランプで 締めた後、遠位を横に切開する。該近位断片を曲ビンセットで逆に引っばって裏 返す、固定縫合を付け、マイクロサージヤリ−法を用いて１Ｇの区間に内膜切除 術を施す、Ｆｋ血管をその通常の配置に戻し、末端−末端吻合術を施す、正常内 膜の断片が該内膜切除部位と該吻合部位の間に介在する。

第７図はＰＰＡＣＫの頚動脈内膜切除部位での血小板沈着阻害能を具体的に表わ す２パネルを含む、非薬剤処置動物では頚動脈内膜切除部位への血小板沈着は急 速に増加し、６０−９０分でプラトーに達する。　１００ｒｖｏｌ／ｋｇＰ　Ｐ ＡＣＫの６０分間静脈内注入の処置をうけた動物では、血小板沈着は著しく減少 する０本作用は先の術後即時（左）及び、血小板内膜切除対血液比から明らかな ように３日間を通じて（右）ｗ！！察される。垂直棒線は平均値付近の分散を± １標準偏差で表示している。該対照と処置群の間の比較は両側スチューデントを 一検定で行なった。

第８図は第５図と同様にヘパリンと比較した際の、該透析器内の血栓形成に対す る各使用後の別個の測定値により、線推束（血液透析器）中の容量損失及びＩＩ Ｉ　ｉ　ｎ−血小板沈着を阻害するＰＰＡＣＫの能力を具体的に表わしている。

ヘパリン処置動物は全試験時間において、有意かつ漸進的なりＦＶの損失及び該 線推束内の血小板蓄積の相反的増加を示した。対照するに、該ＰＰＡＣＫ処置は ＤＦＶを保ち、透析器中の血小板蓄積を著しく減少させた。

Ｕの−細な一′ Ｕ−負 “血管形成術“は狭められた（狭窄した）動脈血管の外科的再構築を言う、“経 皮的管腔外車管形成術”は風船カテーテルによる動脈血管の拡張であり、該風船 カテーテルは皮膚を通して選択された血管中に挿入され、その後血管の管腔を通 って狭窄病変部位に達し、そこで該風船を動脈壁に対する平らなプラグになるま で脹らまし、それにより患部動脈内に流路を再設置する。

“抗凝血剖”は凝血を妨害し、それによりフィブリン形成を阻害する薬剤を言う 。

“動脈内損傷”は循環中に動脈血が触れる血栓形成表面を言う。

通常の動脈内損傷は動脈壁の内皮！ｌ　Ｍ　８Ｎ域、非内皮処理補綴装置などで ある。

“動脈内補綴装置”は、動脈血を受けて輸送するように脈管構造内に挿入される 生物由来若しくは合成血管補綴を言う。

“凝血”は血液の多数の凝血因子が相互作用し、その結果フィブリンを形成する 連続過程を言う。

“動脈内膜切除術”は動脈の厚化被アテローム内膜の切除を言う、“ガス動脈内 膜切除術′は、７テローム性動脈硬化症の治療において心臓血管からプラグ状沈 着物を除去するために高圧二酸化炭素を利用して行なう動脈内膜切除術を言う、 “レーザー動脈内膜切除術”はアテローム性動脈硬化血栓を除去するために、カ テーテル指向性レーザーを利用して行なう動脈内膜切除術を言う。

種々の文法上の形態における“式（１）のペプチド”は第１図に示す式（１）に より表わされるペプチド及びそのハロゲン酸付加生成物を言う。

旦−血胤立広 本発明は第１図で示される式（１）（式中、Ｚは水素若しくはＣ＋　Ｃｂアシル 基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す）で表わされるハロゲン−メチルケトン含有 ペプチド及びそのハロゲン酸付加生成物についての新規使用法に関する。

好ましいハロゲン−メチルケトン含有ペプチドは図２で示される式（２）（式中 、Ｚは水素を示し、Ｘは塩素を示す）で表わされ、ここではＰＰＡＣＫと呼ぶ。

ハロゲン原子には好ましくは塩素、臭素若しくはヨウ素を含む。

式（１）で表わされるハロゲン−メチルケトン含有ペプチドの合成及びトロンビ ンの酵素活性を押さえるためのその使用は米国特許第４，３１８，９０４号、１ ９８２年３月９日、シ９−ら、に記述されており、その開示は参考文献としてこ こに組み込まれている。

式（１）のペプチドにより表わされるペプチドについての該新規使用法は、該ペ プチドが動脈内損傷上への血小板沈着を有意に阻害し、それにより血小板依存性 動脈血栓症の危険性を減少させるという発見から生まれた。

このように、本発明は患者における血小板依存性動脈血栓症を予防する方法で、 該患者に治療上有効な量の式（１）のペプチド、好ましくはＰＰＡＣＫを投与す ることを含む方法に関する。

式（１）のペプチドに関して使用される“治療上有効な量”という句は、該被験 者のトロンビン時間を最低約２倍、好ましくは最低約５倍、より好ましくは最低 約１０倍延長させるに十分なペプチド量を言う。本発明の好ましい態様において は、式（１）のペプチドは血漿中のペプチド濃度が最低約０．２マイクログラム ／ミリリツター（μｇ／ｍｌ）、好ましくは最低約１μｇ／ｍｌ、より好ましく は最低約１０μｇ／ｍｌに達するに十分な量を投与される。

治療上有効な量の式（１）のペプチドの通常投与は血漿中のペプチド濃度が、約 ０．２μｇ　／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５μｇ／ｍｌから 約５μｇ／■ｌ、より好ましくは約１μｇ／−１から約２μｇ／−１の範囲であ る。すなわち、上記の血漿濃度の式（１）のペプチドを含有する循環血液が血小 板依存性動脈血栓症を予防する方法を提供する。

該血漿中の式（１）のペプチドの濃度測定法は本技術分野において周知であり、 好ましい方法が、コレンら、ジャーナル　オプラボラトグイ　アンド　クリニカ ル　メディスン、９９＠、第７６−８３頁、１９８２年、に記述されており、そ の開示は参考文献としてここに組み込まれている。

患者（ヒト被験者）における血小板依存性動脈血栓症の存在を診断する方法は、 本技術分野において周知である。それらの方法には、コントラスト血管造影法、 動脈造影法、コンピューターＸ線体軸断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、放射性核種 ラベル化血小板を用いたインビボ映像法、二次元ドツプラー装置を用いたロケー ション（ｌｏｃａｔｉｏｎ）法等が含まれる。血小板依存性動脈血栓症が役割を 演じる特殊な疾患も本技術分野では周知であり、脳卒中若しくは一過性大脳虚血 により明らかになる脳血管アテロース性動脈硬化症；心臓虚血、非安定性アンギ ナ若しくは急性心筋梗塞により明らかになる心臓アテロース性動脈硬化症；及び 末端虚血により明らかになる末梢動脈閉塞症等が含まれる。

血小板依存性動脈血栓症の治療を必要とする患者には、狭窄動脈内の血流を改善 するために医療（治療）処置を受ける者も含まれる。たとえば、動脈潰瘍、アテ ローム性動脈硬化症プラグ状動脈血栓等の閉塞性存在を除去するために行なわれ た治療処置の間に被膜化されなかったか若しくは作られた動脈内損傷によって誘 導された血小板依存性血栓症による治療後再狭窄症を多くの患者が経験する。

このように、本発明は患者における治療後動豚胃狭窄症を予防する方法で、以下 の（ａｌ、（ｂｌ及び（Ｃ１を含む方法に間する：ｔａｒ　該患者に対する治療 上有効な量の式（１）のペプチド、好ましくはＰＰＡＣＫの投与。

（ｂｌ　該患者に対する狭窄動脈内の血流管直径を増大させ、それにより処置動 脈を作成するための医療処置の実施、狭窄動脈の血流管直径を増大させるための 医療処置は本技術分野において周知であり、外科的処置（手技若しくは、器具あ るいは装置の介在によってなされる、手による若しくは操作運転による治療方法 ）及び薬物療法を含む、たとえば、狭窄動脈の血流能力を改善するために行なわ れる外科的処置には、動脈内膜切除術、特に、ガス若しくはレーザー動脈内膜切 除術、血管形成術、動脈血管補綴挿入等が含まれる。

狭窄動脈の血流能力を増大させるための医療処置には、患者への治療上有効な量 の血栓崩壊剤の投与も含まれる。血栓崩壊剤及びそれらの使用は同様に本技術分 野において周知である。

市販の血栓崩壊剤にはストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ及び組織プラスミノー ゲン活性化剤（ｔＰＡ）が含まれる。

（Ｃ１該患者の動脈血を該処置動脈中に循環させる。

治療後再狭窄症の処置に対する好ましい方法において、ｌａｌによる式（１）の ペプチドの投与は（Ｃ１により該処置動脈を循環動脈血にさらすより前に行なわ れる。好ましくは、（Ｃ）はｆａ）にひき続いて行なわれるが、（δ）により投 与した式（１）のペプチドの血漿中濃度が最低約０．２μｇ／ｍｌ、好ましくは 最低約１μｇ／ｍｌ、より好ましくは最低約１０μｇ／ｍｌの間に行なわれる。

他のａ様においては、（Ｃ１はｌａｌが行なわれた後約９０分以内、好ましかし ながら、本発明は（ａ）及び（ｅｌが実質上同時に（同一時間に）行なわれ、か つ（Ｃ１が（ａｌより先に行なわれる方法にも関する。

動脈血栓症に対する治療を必要とする患者にはさらに、その循環動脈血が血栓形 成表面を遣ることになる患者が含まれる。血栓形成表面が動脈循環にさらされる 状態は動脈補綴装置を外科的に挿入しである患者において通常発生する。このよ うに、本発明は動脈補綴表面の血小板沈着を予防する方法で、以下のｌａｌ及び 山）を含む方法に関する： （川　該患者に対する治療上有効な量の式（１）のペプチド、好ましくはＰＰＡ ＣＫの投与。

（ｂｌ　該患者の動脈血を補綴表面上に循環させること。

患者の循環中に外科的に挿入されその表面が動脈血にさらされる動脈内補綴装置 は本技術分野において周知である。“生物由来及び合成血管補綴、”Ｊ、スタン レイ編、グルーネ及びストラットン、ニューヨーク、１９８２年、を参照のこと 、生物的動脈補綴の例としては、自家動脈移植片、特に自家伏在静脈動脈移植片 、ジアルデヒドでんぷん一褐色化（ｔａｎｎｅｄ）ウシ異種移植片、ヒト誘帯静 脈移植片等が含まれる０合成動脈補綴も本技術分野では周知であり、ダクトン移 植片、米国特許第３，９６２．１５３号に記述されたもののような拡張ポリ四フ ッ化エチレン移植片、米国特許第４．６８７，４８２号に記述されたもののよう な疎水性重合体連結移植片等が含まれる。

動脈補綴表面の例としては動脈ステン（ｓｔｅｎｓ　）　、Ａ　−Ｖ吻合等があ る。Ａ−Ｖ吻合は通常非内皮処理化管断片で、一般に重合物質で構成されており 、動脈血を直接静脈に輸送するか若しくは、最初に静脈を通してエクスビボ（生 体外）の治療装置に輸送するために使用される。エクスビボの治療装置の例とし ては心肺補助装置等が含まれる。エクスビボの治療装置の使用は本技術分野にお いては周知である。

補綴表面上への血小板沈着を予防する好ましい方法において、ｌａｌによる式（ １）のペプチドの投与は、（ｂｌにより該患者の動脈血を補綴表面上に循環させ るより前に行なわれる。好ましくは、山）は（ａ）にひき続いて行なわれるが、 ｔａｌにより投与したペプチドの血漿中濃度が最低約０．２μｇ／ｍｌ、好まし くは最低約１μｇ／ｍｌ、より好ましくは最低約１０．！Ｉｇ／＋ｓｌＯ間に行 なわれる。他の態様においては、（ｂｌはｌａｌが行なわれた後約９０分以内、 好ましくは約１５分以内、より好ましくは約５分以内に行なわれる。しかしなが ら、本発明は（ａｌ及び（ｂｌが実質上同時に行なわれ、かつ（ｂ）が（ａｌよ り先に行なわれる方法にも関する。

式（１）のペプチド若しくはそのハロゲン酸付加生成物は通常溶液若しくは懸濁 液の形態の医薬用組成物として投与されるが、もっとも、周知のようにペプチド 類は錠剤、丸剤、カプセル剤、徐崩剤若しくは粉末剤としても治療投与用に処方 することができる。いずれの場合も、該投与組成物は約０．１０％から約９９％ 、好ましくは１０％−９０％、より好ましくは２５％−７５％の式（１）のペプ チドを含有する。

活性成分としてペプチド類を含有する治療用組成物類の製造は本技術において周 知である０通常、このような組成物類は液体溶液若しくは液体懸濁液のいずれか の注射可能薬物として製造されるが、もっとも注射前に液体、若しくは懸濁液に するのに適当な固体形態類も製造することができる。該製造物も乳化することが できる。該活性治療用成分は、医薬上許容しうるかつ該活性成分（ペプチド）と 適合する無機及び／又は有機賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤として は、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等 、及びそれらの混合物がある。さらに、必要ならば、該組成物は該活性成分の有 効性を高める少量の湿潤あるいは乳化剤、ｐｅｌｔ衝剤等の補助剤を含有するこ とができる。

本発明の実施において有用な治療用組成物は、中性の医薬上許容しうる塩の形態 で該治療用組成物中に処方された式（１１のペプチドを含有することができる。

医薬上許容しうる塩類には核酸付加塩１！（該ポリペプチド若しくは抗体分子の 遊離アミノ基と形成される）及び、たとえば塩酸あるいはリン酸等の無機酸、若 しくは酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と形成されるものが含まれる 。該遊離カルボキシル基と形成される塩類はまた、たとえば水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、若しくは水酸化鉄（ Ｉ［［）等の無機塩基類、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エ チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基類より誘導するこ ともできる。

該治療用ペプチド含有性組成物は通常静脈内に、たとえば単位投与量を注射する ことにより、投与される０本発明で用いられる治療用組成物に関して使用される “単位投与量”という用語は、ヒトに対する単位投与として適当な物理的に不連 続の単位を言い、各単位は必要な賦形剤とともにめられる治療効果をもたらすよ うに計算されたあらかじめ決められた量の活性物質を含有する。

該組成物は該投与処方に適合した形式で、かつ治療上有効な量を投与される。投 与されるべき量は治療をうける患者、すなわち該患者の止血系の該活性成分を利 用する能力、及びめられる血小板凝集阻害の程度に依存する。活性成分の投与を 必要とされる正確な量は該医師の判断に依存し、各個人に特有である。もっとも 、適当な投与量範囲は１ないし数百ナノモル／キログラム体重／分のオーダーの 式＋１）のペプチドであり、投与経路に依存する。

他の態様においては、本発明は両端の開いた実質的に非弾力性の中空本体部分を 持つ延長管断片を含む血栓抵抗性血管補綴に関する。該中空本体部分は制限され た流管であることの定義となる管腔（循環面接触性）表面を持つ０式＋１１のペ プチドは該管腔表面に除去可能に付着している。

“除去可能な付着”は、式＋１）のペプチドが制限された該血流管を通って循環 する血液と接触する間に該血漿中に溶解できるように該補綴の管腔表面に付着し ていることを意味する。除去可能な付着は、固体若しくは液体の形態の式（１１ のペプチドの該管腔表面上への吸着による沈着を含む周知の方法により完成され る。実質的に純粋な形！　（１１低約９９％の純度）のペプチドを該表面に結合 させた場合、それは該循環面と接触する間に非常に迅速に溶解して、該管腔表面 上に該ペプチドの血漿中溶解度にほぼ等しい局所ペプチド濃度を提供するであろ う。

好ましい態様においては、該補綴装置の該管腔表面に除去可能に付着した式（１ １のペプチドは徐放性処方の一部として存在する。

通常の徐放性処方は医薬上許容しうる生物分解可能な賦形剤と混合された式（１ １のペプチドを含む。徐放性処方中の使用に適した医薬上許容しうる生物分解可 能な賦形荊順は周知であり、重合体類（たとえば、ポリエチレングリコール）、 ポリアミノ酸類（たとえば、ポリグリコール酸）等を含む。弐（１）のペプチド を含む徐放性処方が該管腔表面に除去可能に付着された場合、該血液中のペプチ ドの局所濃度（すなわち、該血液−管腔表面界面における該ペプチド濃度）は該 賦形剤の熔解速度に比例すると思われる。ペプチド対賦形剖の割合は、本技術分 野において周知なように、賦形剤の選択及び該補綴血流管内の血流条件に依存す るため、治療上有効な量の式（１１のペプチドは徐放性処方が用いれらる場合、 数時間から数日の間、該管腔表面に接触する血液に供給されうる。

本発明の血管補綴は、その好ましい態様においては、実質的に非弾力性である。

ここで使用する場合、”非弾力性”という表現は、正常な動脈圧（２５０ｗＨｇ 以下）下の収縮期及び拡張期の間に内径の伸張が１０パーセント以下を示すこと を意味する。該血管補綴の外部表面は、現在市販されている補綴について一般的 である様に、ヒト若しくは他の哺乳動物における移植時に組織固定してもよい。

該血管補綴の該管状分節は必要な強度、耐久性及び縫合性を示す物質で構成され てもよい、我々が該補綴若しくは移植片を製作するのに適当な市販の物質には、 ダクロン（Ｃ，Ｒ，バード社、ビレリカ、マサチューセッツ州）等のポリエステ ル及びテフロン（ゴアテソクス）（Ｗ、Ｌ、ボア、フラグスタッフ、アリシナ州 ）等のポリフッ化炭素が含まれる。

好ましい態様においては、該管腔表面は比較的なめらかで、非極性の疎水性表面 を形成する重合体類を含む、このような物質類及び管腔表面の一部を形成する際 のおのおのの使用はハンソンの米国特許第４，６８７，４８２号に記述されてお り、その開示は参考文献としてここに組み込まれている。

本発明の血栓抵抗性血管補綴は、式（１１のペプチドを該補綴の該管腔表面上に 除去可能に付着させることを含む方法により製造される。このように、血管補綴 装置の管腔表面への式（１１のペプチドの除去可能な付着は、該装置の血栓抵抗 性を改善する方法である。

大振■ 以下の実施例は本発明を具体的に表わすことを意図しているが、制限することを 意図しない。

１、　人　゛　上の血ハ　゛　のインビボ制御されない変数のない形式でのイン ビボの急性動脈血栓形成の速度を定性するために、血管移植片血栓症の一部モデ ルを使用した。ヒトはヒトと同様の血栓症経過を持つらしいので、これらの実験 に対してヒトを選択した。急性血栓形成の程度は、ハンソンら、アルテリオ、５ 巻、第５９５−６０３頁、１９８５年、に記述されているように、自己由来の１ １インジウムラベル化血小板の小内径ダクロン血管移植片の断片上への吸着をシ ンチレーションカメラで映像化することにより、実時間に測定した。

要約すれば、長期動静脈シャントは正常な１０−１２キログラムのオスとヒト（ パビオアヌビス）の大腿部動静脈間に外科的に移植された（Ａ−Ｖシャント）、 該永久的シャント系は１３−及び１５−ゲージのテフロン管先端（ライフメト、 ベニトロン社、コンプトン、カリフォルニア州）に接続した内径（ｉ、ｄ、）　 ３ミリメートル（１）、長さ２５センチメートル（＋？ｌｌ）のシラスティック 管（ダウコーニング社、ミドランド、ミシガン州）２本から成る。さらに、２本 の該シラスティック管を皮膚出口部位でダクロン縫合カフス（デュポン、Ｅ、１ ．　ドヌモア社、ウィルミングトン、プラウニア州）で固定した。２個の該シラ ステインク吻合断片を長さＩｃｍの鈍角末端のテフロン管（内径２．８纏）で連 結することにより、血流を確立した。全実験において、その後ダクロン血管移植 片を該永久シラスティックＡ−Ｖ吻合断片間に挿入することにより、該動物の外 科的に連結した。

モデルの合成血管補綴は以下の方法で、長さ１０１の非タリンビングニットダク ロン移植片材料（サビッジエクスターナルベロア、１２０■Ｈｇにおける平均有 孔性：　２０００ないし２２００−１／ＨｔＯ１分、内径４．０　ｗ＋　）を血 液漏出不浸透性にすることにより、該Ａ−Ｖ吻合系での使用にむけて製造された 。

最初に、４．０閤径のテフロンロッド（あらかじめ、穏やかな石けん液、それに 次いでエタノールを使用し、最後に滅菌蒸留水ですすぐことにより完全に洗浄し であるもの）を該移植片中に挿入した。その後、該移植片を外側から５Ｘ１０Ｃ １ｍのパラフィルムシートで包み、長さ１０ｃｍ、内径６．３−の“熱収縮性” テフロン管（スモールパーツ社、マイアミ、フロリダ州）内に入しタ。

該移植片断片を含むテフロン管を低ブンセン炎上で約５．３閣まで収縮が起きる まで穏やかに加熱し、その結果初めの該移植片表面を変化させずに該外部織地間 隙上に該パラフィルムを圧縮させた。シリコンゴム管、長さ１０１×内径４．０ 閣、を該テフロンロッド上に移動し、シラスティック医療用接着剤、シリコンタ イプＡを用いて該移植片断片の両端に接続した。該重合体を２４時間硬化させた 後、該テフロンロッドを該管腔内から注意深くひき出した０本処置により、直線 形状に厳密に圧迫され４．０閣の内径を持つ不透過性移植片が製造された。でき 上がった等直径の血流管は、連結処置による欠陥もなしに該シラスティックから 移植片表面への境目がなめらかであった。該移植片は鈍端テフロン接続子を用い て該ヒトの吻合系内に接続された。

自己由来のヒト血小板を以下の処置により　＋１１１１−オキシンでラベルした 。全血（１００＋／りを２０−２の酸−クエン酸−デキストロース抗凝血剤（Ｎ ＩＨ処方Ａ）を含むプラスチックバック中に直接採取した。該血液を該バック中 で３００ｘｇで１０分間遠心した。上清の濃−血小板血漿（ＰＰＰ）を第２のバ ッグにその後移し、０．１５　Ｍのクエン酸（０，１ｍ１７１０　ｍｆＰＲＰ） を加えてｐＨ６，５に調整した。赤血球分画は供血動物に返却した。該ＰＲＰを １３００ｘｇで１５分間遠心して血小板をペレット状にした。上滑の血小板不足 血漿（Ｐ　Ｐ　Ｐ）は完全に別の容器に移し、廃棄した。

残りの血漿蛋白類を除去するために、該血小板ベレットを含むバッグを３０ｍｇ のリンガ−のクエン酸デキストロース（ＲＣＤ。

ｐＨ６，５）を上層した後他に移し廃棄することにより、注意深く一回洗浄した 。該ペレットをその後ゆっくりと５．０ｍ＃ＲＣＤに再懸濁し、５００−７００ マイクロＣｉ　”’Ｉｎ−オキシン（アマジャム社、チーリントン、ハイツ、イ リノイ州）とともに３０分間インキュベートした。混入している赤血球は最後に ２００ｘｇで５分間低速遠心して除去した。

２００マイクロリツターのラベル化血小板濃縮液を５．０ｍ／のＲＣＤで希釈し 、０．５ｓｊの該希釈血小板懸濁液の放射能を、３０００ｘｇ、３０分間の遠心 後得られる無細胞上清０．５　■ｉの活性と比較することによりラベル効率を測 定した。約１３パーセントの非血小板結合性アイソトープを含むラベル化血小板 懸濁液の測定した量を、１００マイクロリツター標準液を調製した後に直接受車 哺乳動物に注射した。非血小板結合性アイソトープを除去するためにさらに洗浄 する処置は、インビトロの細胞損傷をもたらすと思われたため望まくないと考え た。

循環血小板＋　１１１０−放射能は移植片配置前及び後に採取し、２１１Ｉｒ／ ＩＩｌの（エチレンジニトリロ）−四酢酸（ＥＤＴＡ）中に加えた４−１の血液 サンプルから測定した。各サンプルのうち１１１１の血小板数測定に使用し、１ ．Ｏｍｊ！！は全血＋　１１　Ｉｎ−放射能を測定した。残りの２Ｉ１１を３０ ００ｘｇ、３０分間遠心し、上清（ＰＰＰ）のうちｌ　ｌ１ｌｌについて血５１ １１１１ｎ−放射能を測定した。

血液及び血漿の全サンプルはガンマスペクトロメーター（ヌクレアシカゴ、シカ ゴ、イリノイ州）を用いて測定した。血小板数測定は電子血小板カウンター（ク レイアダムスＵＦ−１００，パーシパニイ、ニューシャーシー州）を用いて全血 について行なった。

＋１１１ｎの両ガンマ光子ピーク（１７２ｋｅＶ及び２４７ｋｅＶ）のシンチレ ーションカメラ映像化には、一般に高エネルギーコリメーシ！ンが、感度及び空 間的分解能の両方を低下させるにもがかわらず、映像の不鮮明化を防ぐために必 要とされてきた。血小板放射能活性が本実験では制限因子ではなかったため、高 感度９９７　ｃコリメーターを１１１１０の低い方のエネルギーピークのみを映 像化することにより（１７２ｋｅＶビーク及び５％エネルギーウィンドウにおい て）良好な分解能で使用することができた。近位及び遠位シラスティック断片を 含む該ダクロン移植片の映像はビンカ−ＤＣ４／１１ダイナシンチレーシツンカ メラ（ピッカー社、ノースフォード、コネティカット州）で取り、該カメラに連 結した医療用データシステムＳＩＭＵＬコンピューター（メドトロニ７り、７７ ７−バー、ミシガン州）により保存及び分析した０本システムは６４Ｘ６４語モ ードでデータの同時取得及び分析ができ、図３に示したデータを作るために使用 した。該移植片をエクスビボで映像化する直前に、２分間の映像を、血小板濃縮 液の２００マイクロリツターサンプル（注射液標準）及び自己由来血液で満たさ れた該移植片と同管腔容量を持つ内径４ｍのシラスティック管（血液標準）につ いて取った。

全ての標準液及び管は直線形状を維持するように、該コリメーターの表面から約 １ｃｍの所にあるブレクシグラス中に正確に規格化された溝の中に置いた。該標 準液及びｌＱｃ＊の移植片の放射能ｊｃ１Ｍ要す同ｕ　＜　３．１　ｃｍＸ　１ ２．５　ｃｍＧＭ域＜１０ｃｍＸ４０画素）ニラいてカウントし、画像分析ソフ トウェアルーチンにより定義した。

移植片設置時間から、映像をデータを保存しながら２分間隔で連続的に取った。

沈着した＋　＋　＋　１１−血小板の放射能は該血液標準放射能を全動的実験映 像から減じることにより計算した。

置し、映像化した。循環する１＋１１ｎ−血小板放射能は、正常な生理的機構を 通じて連続的に、また一連の移植片設置により急性に失なわれたため、血小板蓄 積の測定値は、沈着した移植片放射能を各評価の開始時に測定した該移植片内の 全血（循環）血小板放射能で割った比率を定義した、移植片／血液比として表現 した。

本測定値は該哺乳動物のサイズ、注射したアイソトープの量、若しくは該アイソ トープが減衰したと考えられる範囲に依存しないため選択された（リソチーら、 アメリカンジャーナルオプカルディオロジイ、４７巻、第８８２頁、１９８１年 ；カロウら、アニュアルサージェグイ、１９１Ｓ、第３６２頁、１９８０年）、 該移植片／血液比は、しかしながら、該循環中の加齢若しくはトロンボゲン表面 上の反復通過の結果として起こる血小板機能の変性における観察のタイミング若 しくは順序に依存する。

該移植片／血液比を測定するために、該移植片管腔（１，２６−１）内血液の放 射能を２個の別々の方法で測定した。最初に、該血液標準（１，５７＋７！血液 量）を映像化した後、それを直接計算した。第２の方法では、各実験開始時に存 在した血液１　ａｌｌあたりの放射能を、該注射液標準を各実験前に映像化し、 この値に該実験時点に採取した全血１　ｖｘｌあたりのＣＰＭ　（ある経過時点 ｔ、において、ガンマカウンターを用いて測定）を掛け、注射液標準の放射能（ 同様に、１．においてガンマ−カウンターで測定）で割ることにより計算した。

全ての血液サンプル及び標準を各評価シリーズの終わりに同時にカウントした。

全ての計算において、放射能値は血小板放射能のみに関するものであり、全ての 血液及び標準についての値は非血小板性アイソトープ分画について補正した。

総血小板沈着（ラベル化プラス非ラベル化細胞）は移植片／血液比に因子：移植 片血液容積（１，２６ｍＡ）ｘ全血１　ｅｂＡあたりの血小板濃度、を掛けて評 価した０本計算には、該ラベル化及び非ラベル化血小板母集団が移植片沈着に関 しては全時点において同等であったという仮定が含まれた。上記の方法により測 定した該血管移植片上への総血小板沈着に対する値は第３図に示す。

無処置の対照動物において、該血管移植片上への血小板沈着は、６０分で８．５ Ｘ１０’血小板のプラトー値に達しく第３図）、該移植片は１．２±０．２時間 で閉塞した。さらに、表１に示すように、これらの対照実験における血栓形成期 間中に、血小板特異性アルファ顆粒蛋白である血小板因子４　（ＰＦ４）及びベ ータトロンボグロブリン（βＴＧ）　、及びトロンビンによるフィブリノーゲン 開裂産物であるフィブリノペプチドＡ　（ＦＰＡ）の血漿レベルの上昇が観察さ れた。

表１ 血管移植片血栓形成に対するＰＰＡＣＫの効果蚤！菫　胆級し笈！ 移植前　移植後　移植前　移植後 血小板数　３４４±６８２９０±７５　２７５±５６２６９±５４（×ＩＯ雫／ Ｋ）１ １１１１、−血小板沈着（Ｘ　１０’）　−−−８，５±１．０　−−−０．４ ±０．２ 血漿ＰＦ４　（μｇ／Ｌ）”　９．２±２．４１８．５±１．７７．１±１．９ ４６４±０．２ 血＠ＢＴＧ　（μｇ／Ｌ）”　６．０±２．６２６．２±１．２８．０±２．０ １．４±０．２ 血ｆｉＦ　Ｐ　Ａ　（ｎｍｏｌ／　Ｌ）３２０．８±２．７２７．２±８．６１ ９．０±４．７２．０±０．５４ １゛　全血中で電子的（Ｊ、Ｔ、ペイカー、８１０型分析器、アレントン、ペン シルバニア州）にカウントした血小板数は、血管移植片血栓形成期間中の血小板 形成により該循環中において減少した。

露°　血漿ＰＦ４及びＢ−ＴＧはハンソンら、チーテリオスクレロシス、５巻、 第５９５−６０３頁、１９８５年、に記述されているように採取及び処置した血 液サンプルに対するラジオイムノアッセイにより測定した。血漿中のこれらの血 小板特異性蛋白の増加は、血栓形成に利用された血小板からの放出を反映した。

３゛　前記のハンセンらの方法によるラジオイムノアッセイにより測定したＦＰ Ａ値も同様に増加しており、移植片血栓における血栓形成期間中のトロンビンに よるフィブリノーゲン開裂産物を表１００単位／ｋｇ投与）は移植片血小板沈着 に効果を持たなかった（第３図Ｂ：ｐ＞０．５）が、ヘパリン用量を１０倍増加 すると部分的に有効であった（第３図Ｂ）、アスピリン（移植片設置の２時間前 に経口で３２．５■７ｋｇ１日投与）及びアスピリンとへパリの実験における血 管移植片＋１１１０−血小板沈着に影響を及ぼさなかった。バーカーら、“血管 疾患：最新の研究と臨床応用”、ストランドネスら編、オーランド、グルーネア ンドストラットン、第２７１−２８３頁、１９８７年、参照のこと、このように 対照動物においては、該血管移植片は血栓形成性が高く、フィブリン形成の阻害 （ヘパリン処ｉｆ）　、血小板機能の阻害（アスピリン処置）若しくはそれらの 両方（アスピリン及びヘパリン処置）を目的とした通常の抗血栓症治療に抵抗性 を持った。

対照的に、ＰＰＡＣＫの血漿中濃度を約１−２μｇ／ｍｌにする１００ｎ■ｏｌ ／ｋｇ／分の速度での静脈内注入は＋１１１．−血小板沈着を完全に押さえ、移 植片閉塞を予防した（第３図Ａ）０表２に示すように、ＰＰＡＣＫはまた止血性 血小板プラグ形成も押さえ（出血時間を３０分以上に延長し、対照値に比較して Ｐ＜１０−’）、トロンビン誘導性血液凝固も押さえたくトロンビン時間＞１０ 分、対照値に比較してＰ＜１０−’）。

表２ 止血　に・するＰＰＡＣＫのｔ果 −皇土仮巳一　Ｉ準ｉ　ＰＰＡＣに投与期間中　ＰＰＭＣＫ投与後（１００ｎｍ ｏｌ／　ｋｇ／　）　（１５）−血小板数（×１０啼ル）２９０±７５　２７５ ±５６　２６９±５４出血時間（分）５．４±０．３　＞３０　５．９±２．６ 凝集（Ｅ　Ｄ　ｓ。）： ＡＤＰ（８Ｍ）　７．１±０．８　２．３±０．３コラーゲシ（μｇ／　請ｊり 　４．２±０．４　２．６±０．３）１ピン（Ｕ／　ｓｊり　０．１　＞２０凝 血 フィブリノーゲン（ｇ腸／Ｌ）　３．６７±０．３３　３．８０±０．３３　３ ．７５±０．３５）ロンビン　時間　（秒）　２１±３　＞６００　１９±１ブ イプリン　溶解 プラスミノゲン（■／Ｌ）　１６３±１３　１６３±８　１７４±７Ｄ−ダイマ ー　（ｑ／　Ｌ）　０．４５±０．１０　０．４９±０．０８　０．５３±０． １３１・　血小板止血作用を、血小板数、血小板プラグ形成能（テンプレート出 血時間）、及び血小板凝集に関して評価した。血小板凝集はクエン酸添加の濃血 小板血漿の攪拌懸濁液を通る光透過度を記録することにより測定した。該結果は １／２最大凝集をもたらすのに必要な作用物質（ＡＤＰ、コラーゲン及びトロン ビン）の濃度で表わしである。結果は平均値±１標準偏差で表わしである。

加えて、ＰＰＡＣＫ投与期間中に血小板若しくはＦＰＡから血漿中へのＰＰ４若 しくはβＴＧの放出は検出されなかった（表１）。

表３に示したインビボの用量−作用実験の結果は、トロンビン誘導性血液凝固及 び出血時間の遅延化と、約１５分間の１００ｎ＋ｗｏｌ／ｋｇ／分の速度での注 入でもたらされた約１−２μｇ／ａｒｔのＰＰＡＣＫ血漿濃度において観察され た最大効果における予想外の一致を明らかにしている。

表３ ＰＰＡＣＫの用量−作用効果 ＰＰＡＣに用量１　出血時間　トロンビン時間」憇１／に／豆Ｙ　−」分Ｌ−一 　−−Ａ並１−０　５．４±０．３　１７±３ １５　７．６±１．６　１９±３ ３０　９、５±４．２　２２±２ ６０　２６、６±３．４　２７９±１３２１００　＞３０　＞６００ １°　５匹の別々の動物において、表示した用量漸増形成に従ってＰＰＡＣＫを 静脈内注入した。１５分間の所定用量の連続注入の後、該テンプレート出血時間 測定を開始し、トロンビン時間測定に血液を採取した０次の用量への漸増は出血 時間測定が完了した後即ちに行なった。該結果は平均値±１標準偏差で表わしで ある。

ＰＰＡＣＫをヒヒ血漿にインビトロで加えた場合、トロンビン時間は６μＭ／Ｉ １以上の濃度においてはっきりと長くなったが、これは該注入データ（表３）と 一致する。治療期間中、心拍数及び血圧に対して何ら効果ももたらさなかった。

ＰＰＡＣＫ注大停止後、　１日１ｎ−血小板の移植片沈着は第３図Ａに示すよう に３０分間で常態化し、出血時間及びトロンビン時間は表２に示すように１５分 以内に十分正常化した。

トロンビン誘導性血小板凝集はＰＰＡＣＫが３．２±０．１ｍｂ（＝ｇ／Ｌ）以 上の濃度で存在した間押さえられた（表２）が、一方コラーゲン若しくはＡＤＰ により誘導される血小板凝集はＰＰＡＣＫによって阻害されなかった（表２）、 このように、血小板の固有の反応性は影響を受けなかった。

２、血ハ　゛　び　のインビボにおけるＡ、ＰＰＡＣＫの動豚胃狭窄阻害能をイ ンビボの動脈移植片挿入及び動脈内膜切除のヒヒモデルにおいて試験した。移植 片挿入として、長さ３ｃｓのボアテックス移植片（内径４鶴）の形態の小血管補 綴を、オスのヒヒの頚動脈中に外科的に挿入した。該移植片を通して（該補綴表 面上を通って）動脈血液を循環させる直前、及びその後１時間の期間中、約１０ ０ｎｍｏｌ／ｋｇ／分の速度で該ヒヒにＰＰＡＣＫを静脈内投与した。対照動物 はＰＰＡＣＫ処置を受けなかった　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｌ　ｎ−血小板沈着は実施例１ に記述したように動脈血流を再構成したものについてモニターした。

動脈内膜切除術として、ヒヒの頚動脈に標準的外科処置により動脈内膜切除を行 なった。該内膜切除（処置）動脈を通しての血液循環の直前、及びその後約１時 間の期間中核ヒヒに約１００１００ｎ／ｂ／分の速度でＰＰＡＣＫを静脈内投与 した。対照動物はＰＰＡＣＫ投与を受けなかった。

再実験の結果は同等であった。該動脈内膜切除実験のデータは第４図に示されて おり、血小板沈着（再狭窄）がＰＰＡＣＫ投与を受けた動物においては対照動物 と比較すると９０−９５％阻害されたことを示している。

Ｂ、！！１動脈内膜切除の別の実験においては、体重が８ないし１１−の１４匹 のヒヒ（オス１０匹及びメス４匹）に、ここに記述した標準的外科処置により動 脈内膜切除を行なった。

動物達に前麻酔薬としてアトロピン（０，０４■／瞳筋注）を投与し、その後導 入用にケラミン（１０■／−筋注）及び維持用に気管内チューブによるハロタン （酸素中１％）を用いて麻酔した。

頚部中線切開を通じて、総頚動脈を近位は鎖骨から遠位は頚動脈分岐点までの周 辺組織から離すように切開した。該総頚動脈を、硫酸ヘパリン（１００単位／キ ログラム、（Ｕ）　／　（ｋＩｒ）　、静注）の塊状注射の３分後に該露出血管 の各末端に設置した非外傷性血管クランプを用いて横に締め、該遠位横断クラン プの１１近位を分割した（第６図）、該近位動脈断片をその後曲ピンセット上に 裏返した。該ピンセントを該血管の切断末端から挿入し、その後管腔内側から該 動脈壁の全厚みの引っ掛かりを得て、近位方向の該血管分割末端を逆に引っばっ て裏返した。最大露出が得られた後、該管腔露出断片上に一対のポリプロピレン 固定縫合（７−０）を近位の両側に、また第２の対を遠位に取り付けた。その後 動脈内膜切除術を、裏返した該血管断片の分割末端から１３の所から始めて施し 、ＩＣＩ＋の区間連続して行なった０本処置にはピンセット及び手術用顕微鏡（ 倍率×３２、ディス手術用顕微鏡、西ドイツ）を用いて該正常内膜、及び中膜の 厚みの一部を機械的に除去することが含まれた。動脈内膜切除術の後、該血管を その正常な配置に戻し、２％の倍率下で７−０ポリプロピレン糸で末端−末端吻 合術を施した。該処置動物において、静脈内ＰＰＡＣＫ注入は該被手術頚動脈中 の血流回復の５分前に開始した。５ＭＨｚペンシル型ドツプラー探針（バークス ミ子研究所、ビーバートン、オレゴン州）を用いて該動脈内膜切除部位の近位と 遠位、及び該吻合部位について開存を評価した。ｌｌｌＩｎ−源を内部標準とし て移植した（以下参照）、傷を断続的縫合で閉じ、シンチレーションカメラによ る映像化を即ちに行なった。該動物達は該処置に十分耐えた。血液損失量の評価 は約２５ｍ＋１であった。

自己由来のヒし血小板を、先に実施例１で述べたように８００−１０００．ｕｃ ｌ　（ＩＣ１＝３７ＧＢｇ）のｌｌｌＩｎ−オキシドでラベルし、該手術処置の 前に注射した。

中型エネルギーコリメーターを１′インジウムの低及び高エネルギービークの両 方を映像化することにより良好な分解能で使用した。該頚動脈の映像をピンカー 〇Ｃ４／１１ダイナシンチレーシツンカメラ（ピッカー社、ノースフォード、コ ネティカット州）で取り、該カメラに接続した医療用データシステムＡ２コンピ ューター（メトトロニック、アンチーバー、ミシガン州）により分類及び分析し た。全血５−１サンプルについても同様に映像を取った（血液標準）。

較正のために、小＋　１１１ｎ−ラジオアイソトープ源（約５μＣ４）を０．６ 鶴内径のポリエチレン管（ＰＲ−５０、タレイアダムス社、ニューヨーク、ニュ ーヨーク州）の末端に密封し、手術時に該動脈内膜切除部位と同じ組織面内の該 総頚動脈に隣接して設置した。

初期５分の映像を取った後（以下参照）、該１１１１１−源を回収し再カウント した。傷の中に移植された時点と除去後の該内部標準のｌ　ｌ　Ｉ　Ｉｎ放射能 の比率は、該動脈内膜切除部位に沈着した＋１１１ｎ放射能に対する介在組織の 減衰作用を直接測定するものとなる（ハンソンら、アルテリオスクレロシス、６ 巻、第５１１−５１８頁、１９８６年）、５ｍｊ全血標準、傷からの除去前後の 内部較正標準、動脈内膜切除部位及び対照対何性動脈の放射能を、画像分析ソフ トウェアルーチンにより定義しながら、重要な領域についてカウントした。沈着 した１１１１ｎ−血小板の放射能は、該対何対照動脈領域の放射能を実験映像か ら滅し、組織減衰について補正し、該全血標準を用いて該結果を沈着した血小板 で表わすことにより計算される。

実施例１の場合と同様に、循環する１１１１ｎ−血小板放射能は正常な生理的機 構を通じて連続的に失なわれ、また該急性映像の後の血小板蓄積の測定値は総数 の形では表わすことができない、データはより遅い時点で取り、動脈内膜切除領 域放射能から対側性非処置対照動脈管腔内の循環血小板放射能を減じ、該血液標 準放射能で割った比率を定義した該動脈内膜切除／血液比として表現する。本測 定値は該動物のサイズ、注射したアイソトープの量若しくは該アイソトープが減 衰したと考えられる範囲に依存しない。

全ての計算において、放射能値は血小板放射能のみに関するもので、全血及び標 準値は非血小板性＋１１■ｎ−放射能小分画について補正した（ハンソンら、ジ ャーナルオプクリニカルインベステイメーシジン、８１巻、第１４９−１５８頁 、１９８５年）。

各動物に同側頚動脈内膜切除術に続き、血流を回復させた６０及び９０分後、及 び２４．４８．７２時間後に５分間シンチレーションカメラ映像を取った。術後 第１日日に２４時間時の映像を取る前に、各ヒヒを塩酸ケタミン（１０■／ｋｇ ）で麻酔し、線傷を開き、該ペンシル探針ドツプラーを用いて動脈開存性を評価 した。線傷を閉じ、映像化を行なった。

血小板カウント及びヘマトクリット測定をパーカー８１０型全血分析器を用いて 、ＮａＪＤＴＡ　（２■／ｄ）中に採取した全血について手術前及び２日間毎日 行なった。平均血小板カウントは対照群が３１８±７０Ｘ１０３／μｌで、処置 群は２９６±５３×１０３μｌであった。

出血時間測定は、先にヒヒでの実験について述べられた標準テンプレート法（バ ーカーら、ブラッド、５８巻、第８２４−８３４頁。

１９８０年）を用いて、前腕の毛をそった手の平の表面において二回ずつ行なっ た。

ＰＰＡＣＫの抗トロンビン活性レベルを点滴前、点滴開始後３０分及び６０分、 及び治療終了後３０分に、酸−クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）に採取した血 液から調製した血漿について測定した。血漿抗トロンビン活性レベルは、該動物 自身の対照処置前血漿中に調製したＰＰＡＣＫについての標準曲線を用いて、即 ちにアッセイするか、若しくは後でアッセイするように一７０℃で瞬間凍結した 。

該ＰＰＡＣＫ溶液はＯ，ｌ　５　Ｍ　ＮａＣ１！に溶解し、濾過滅菌した。

該ＰＰＡＣＫｔ８液をシリンジポンプ（バーバート機器社、ケンブリッジ、マサ チューセッツ州）を用いて１００　ｎｍｏｌ　／ｋｇ／分の速度で約１時間連続 的に注入した。

血小板は、対照動物においては即座に頚動脈内膜切除部位に沈着し、血流再開後 ６０分以内にプラトーに達した（第７図）。その後動脈内膜切除対血液比（ＥＢ Ｒ）は、該対照動物においては上昇し続け、最初の３日間に３．０３±０．５１ から３．２５±０．４８に極くわずか増加した（ｐ＝０．７５９；第７図）、対 照的に、手術後９０分の該動脈内膜切除部位への急性血小板沈着はＰ　ＰＡＣＫ 処置を受けた動物では該対照動物に比較して著しく減少した（それぞれ、１．５ ９±０．３６ｘ１０’対１１．６７＋１．６１ｘｌＯ”血小板数／Ｃ１；　ｐ＜ ０．００２）　、また、その後３日間の血小板沈着も該動脈内膜切除領域の正味 の放射能対該対照の血液放射能のそれぞれの比率（ＥＢＲ）で評価すると減少し 続けた。手術当日の９０分後において、該比率はそれぞれＰＰＡＣＫ処置動物に ついては０．８２±０．２５、また対照動物については３．０３±０．５１であ った。３日後のＥＢＲ比率は該対照動物では３．２５±０．４８であったのに対 して、ＰＰＡＣＫ動物では０．８５±０．２３であった。ドツプラースキャニン グによると管理中２４時間について両群とも該血管は全て開存していた。

該手術後９０分に得られたシンチレーションカメラ映像は、対照動物の該動脈内 膜切除部位における血小板の焦点蓄積を明らかにした。ＰＰＡＣＫ処置は該動脈 内膜切除部位における＋１１■ｎ−血小板放射能の著しい減少を結果としてもた らした。動脈内膜切除術の３日後の、非処置動脈内膜切除血管表面のスキャニン グ電子顕微鏡検査は、急性の血小板血栓形成を明らかにした。ＰＰＡＣＫ処置を 受けた動物の動脈内膜切除部位における目に見える血小板沈着は著しく減少した 。

ＰＰＡＣＫの血漿レベルは点滴期間中一定に維持され、点滴停止後即ちに低下し た（表４）、ＰＰＡＣＫはテンプレート出血時間を処置前の５．６±０．８分か ら、点滴期間中は全動物において３０分以上に延長した。該出血時間はＰＰＡＣ Ｋ点滴停止後３０分では正常であった（６．２±１．３分）。

血小板数は該処置動物において実験期間を通して変化しなかった（第３日におい て、２９６±５３Ｘ１０’／μｉ、ｐ＝０．７２５）。

表４ ＰＰＡＣＫの血漿レベル 基準値　□ 点滴ｕｋ３０分３．７２＝Ｉ：０．６１　ｐｇ　／ｌｄ点滴後６０分　３．７１ ≦０．４７μｇ／ｄ点滴後９０分　１，１２±０．２７μｇ／威点滴後２４時間 　□ 本実験の結果は約１時間のＰＰＡＣＫの静脈内投与は、ヒヒの該頚動脈中に外科 的動脈内膜切除術によって作られた重症の損傷部位における血小板沈着を永続的 に阻害することを示している。

これらの知見はまた、バートＡにおける知見と同様に、１時間のＰＰＡＣＫ点滴 は最低３日間血小板沈着を有意に阻害することを示している。

本技術分野で示唆されるようなＰＰＡＣＫの連続的投与は、それゆえ手術後遅く まで有意の治療的効果をもたらすために必要ではない。

本発明はこのように、哺乳動物における血管形成術、動脈内膜切除術、血管内ス テント設置及び小径血管移植片移植等の血管処置の介在に伴なう血小板依存性動 脈血栓症を予防する手段を提供するものである。

３、　表　への血ハ　°　の Ａ、　長期動静脈大腿部吻合内に設置したエクスビボの治療装置の例として中空 線維（キャピラリー）血液透析器を用いてのＰＰＡＣＫの作用を、補綴表面にお ける抗血栓症作用を証明するために選んだ。

０、８　ｒｒｆキュプロファンキャピラリー血流透析器（１２，１１型；トラベ ノール、ディアフィールド、イリノイ州）を実施例１で述べたように７匹の別々 のオスのヒヒのＡ−Ｖ吻合系内に挿入した。

ＰＰＡＣＫを該ヒヒに１０　Ｏｎａｏｌ／ｋｇ１分の速度で、該ヒヒの動脈血が 該透析器の補綴表面上を（該透析器のキャピラリーを通して）循環する以前及び 循環中にわたり約１時間静脈内投与した。

比較する目的で、対照実験としてＰＰＡＣＫの代わりにヘパリンを投与した。ヘ パリン投与は１５０単位（Ｕ）／ｋｇ体重の初回塊投与、及びそれに続く該ヒヒ の動脈血が該透析器を通って循環する以前及び循環中の１時間にわたる１５０　 Ｕ／ｋｇ／時間の継続的点滴から成った。該補綴（キャピラリー）表面における 血小板沈着の阻害は、該透析器を通って動脈血を循環させた前後の該透析器によ り保持される生理食塩水の容量を測定することにより判定した。

第５図に示すように、ＰＰＡＣＫの投与はヘパリンよりも有意に良好に透析器の 容量損失を阻害した。

Ｂ、　体重が９ないし１３ｋｇの幼年オスヒヒでの別の実験において、各動物は 長期大腿部”スクリブナー型”動静脈シラスティック吻合を受けた。本永続性吻 合システムは検出可能な血小板若しくは凝血の活性化はもたらさない（バーカー ら、ジャーナルオブ　クリニカル　インベスティゲイション、６４巻、第５５９ −６９９．１９７９年；及びハンソンら、トロンボシスアンドへモスタシス、５ Ｂ　（３）巻、第８０１〜０５頁、　１９８７年）、へ？）クリア）（３３＋１ ．６％）、白血球数（１４＋２Ｘ１０２／μＬ）及びフィブリノーゲン濃度（４ ０３±２３Ｉ１ｇ／ｄＬ）は、使用した動物において全て正常であった。低ヘマ トクリット、ＷＢＣ増加、吻合血流不全若しくは局所的炎症を伴なう動物は該実 験から除外した。

各動物は４回実験に使用された。同じ動物について２回の２時間のＰＰＡＣＫ潅 流（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を２回の２時間のヘパリン抗凝血作用の潅流と比較した 。各潅流の間、該吻合からの連続的血流をドツプラー超音波流量計（エルアンド エムエレクトロニクス１０１２型、ディグイシティ、カリフォルニア州）により 測定した。血流速度は１８０ないし２５０ｄ／分の範囲であった。

キュプロファン中空線維型の中空線維透析器（トラベノールＣＦ１２１１、ディ アフィールド、イリノイ州、米国）を使用した。

各透析器は同じ動物で同じ抗凝血剤について別々に２回ずつ使用した。該血液透 析器の各使用前及びオーバーナイトの存在中、各透析器ユニット（セル）は滅菌 標準生理食塩水で満たした。再使用に際して該透析器は４℃で約１２ないし約１ ８時間オーバーナイトで保存した。血液潅流中、透析物チャンバーは滅菌等偏性 生理食塩水で満たされており、排水口には栓をした。医療用シリコンゴム管、内 径３．０■、（ダウコーニング社、ミツドランド、ミシガン州）、及び薄壁テフ ロン管、長さ２ｃｍ、をその後該透析器を該吻合に接続するために使用した。

透析器線維容積を、線維血栓性閉塞の尺度として各使用の前後に測定した（ボッ チら、トランザクションズ　オブ　アメリカンソサイエティ　フォー　アーティ フィシャル　インターナル　オーガンズ、１９６９年、第８７−９６頁）、従っ て、各使用前に、該セルを等偏性生理食塩水で満たし、目に見える気泡は全て該 線維束から流い出した。バルブ付圧力計を該動脈圧力調整槽（ヘッダー）に取り 付け、４５トルで１分間空気を流すことにより、該セルの水容積はその後該静脈 圧力調整槽から容積測定容器中に量的に回復した。各時間について２回測定を行 ない、平均値を取った。

ＰＰＡＣＫ若しくは標準ヘパリン（豚腸粘膜由来、インベネクス研究所、チャグ リン　フォールズ、オハイオ州）を、該透析器にごく近接した該血管吻合の該動 脈腔中に注入した。該ヘパリン投与は透析器導入の５分前に１００　Ｕ／ｋｇの 初回投与を行ない、その後バーバードミクロ点滴ポンプ（９０１型、バーバード 機器株式会社）を用いて１５Ｕ／ｋｇ／時で２時間連続的に点滴した。

ＰＰＡＣＫは該透析器の該補綴表面上を血液が循環する以前の約１５分間、及び その後循環中の２時間１００　ｎｍｏｆｆｉ　７ｋｇ７分の速度で連続的に点滴 したが、安定状態レベルに達するまで約１５分間の前点滴を要した。

中空線維容積の損失の測定に加えて、該透析器線維束中の血小板血栓蓄積の程度 をシンチレーションカメラ（ピッカー社、ノースフォード、コネクティカット州 ）により、各使用直後に排水した該透析器中に残存する自己由来ＩＩＩ　ｉ　ｎ −ラベル花車小球を映像化して測定した。自己由来ヒヒ血小板はＩｌｌ　ｌ　ｎ −オキシド（アマジャム社、チーリントン　ハイツ、イリノイ州）でラベルし、 該透析器を挿入する前に注射した（コッツェら、トロンボシス　アンド　へモス タシス、　５３＠、第４０４−０７頁、　１９８５年）。

カウント７分（ｃｐ−）を与える“初回使用”の該透析器の映像を、該システム から血液を排出し、線維束容積の測定を完了した直後に取った。該残存ＩＩＩ　 ｌ　ｎ−血小板放射能を測定するために第２回使用の前に“再使用”透析器を映 像化した。総血小板沈着をその後、該透析器ｃｐ−を該循環血液ｃｐｓ／ａ１で 割り、この比率に血液ｌＨ１中の血小板数を掛けて算出した。

血球数測定（血小板、白血球、及び赤血球）はＪ、Ｔ、ベイカー全血分析器８１ ０型（アレンタウン、ペンシルバニア州）を用いてＥＤＴＡ２ナトリウム抗凝血 化全血について行なった（ハンソンら、ジャーナル　オブ　クリニカル　インベ スティゲイション、７５巻、第１５９１−９９頁、１９８５年；及びハンソンら 。

チーテリオスクレロシス、５巻、第５９５−６０３頁、１９８５年）。標準テン プレート出血時間は、バーカーら、ニューイングランド　ジャーナル　オブ　メ ディスン、２８７巻、第１５５−５９頁、１９７２年、及びマルパスら、ブラッ ド、５１＠、第７３６−４０頁、１９８１年、に記述されている方式で前腕の毛 をそった手の平の表面において測定した。出血時間は二回ずつ測定し、平均値を 出した。市販のラジオイムノアッセイを血小板第４因子（ＰＦ４）（アボット研 究所、ノースジカゴ、イリノイ州）、β−トロンボグロブリン（βＴＯ）（アマ ジャム社、チーリントンハイツ、イリノイ州）、フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ ）（マイクロＵＳＡ社、ニューヨーク、ニューヨーク州）及び活性化補体Ｃ３抗 原（Ｃ３ａ）（アマジャム社）の血漿レベルを測定するために行なった。これら の血漿アッセイ用の血液サンプルは、実施例１の処置及びマルバスら、上記、及 びハンソンら、チーテロスクレロシス、５巻、第５９５−６０３頁、１９８５年 、に記述されているように採取、処置及び測定した。活性化トロンボプラスチン 時間（ＡＰＴＴ）は標準法（活性化ＰＴＴ剤、オルト　ダイイグナスティクス、 ラリティン、ニューシャーシー州）を用いて行なった。線維計測計（フィブロシ ステム、ディビジョン　オブ　ヘクトン　アンド　ディキンソン多元社、コツケ イスビレ。

マサチューセンツ州）を、Ｒ，ピッゲス、人血の凝固、ヘモスタシス　アンド　 トロンボシス、オックスフォード、ブラックウェル科学、第６５７−７５０頁、 １９７６年に記述されているように凝血終点の検出に使用した。フィブリノーゲ ンは、Ｋ、ジェイコブソンら、スカンジナビアン　ジャーナル　オブ　クリニカ ルアンド　ラボラトリ−インベスティゲイション、７巻（増刊１４号）、第９− ５４頁、１９５５年、に述べられている総凝血蛋白法により測定した。

ヘパリン及びＰＰＡＣＫの血漿活性レベルはそれぞれ３．８％クエン酸ナトリウ ム及びＡＣＤ中に採取した血液サンプルにおいて測定した。サンプルは採取後即 ちに遠心しく２０００ｘｇ、５分）、回収血漿はアッセイまで凍結しておいた。

ヘパリン及びＰ　ＰＡＣＫの活性レベルは連続点滴の３０分及び６０分後に測定 した。いくつかの実験においてはＰＰＡＣＫレベルを３部位、すなわち、１）全 身性、１１）該透析器の隣接近位かつＰＰＡＣＫ点滴部位の遠位、及びｉｉｉ　 ）該透析器の隣接遠位、について測定した。ヘパリン活性レベルは合成発色基質 （スタクロムヘバリン、スタブ、フランス）を用いてヘパリンの血漿抗Ｘａ活性 増強作用を測定することにより決定した（ティーエンら、トロンボリサーチ、１ ０巻。

第３９９−４１０頁、１９７７年）、ＰＰＡＣＫレベルは標準トロンビン試薬（ ウシトロンビン、パーケーディビス、モリス　ブレインズ、ニューシャーシー州 ）を用いて抗トロンビン活性を測定することにより決定した。該結果は自己由来 のヒヒＡＣＤ血漿について得られたＰＰＡＣＫ換算曲線からμｇ／ｄで表わされ た。

血小板凝集はクエン酸添加の濃血小板血漿（ＰＰＰ）についてクロノログ血小板 放射能（ハーバ−タウン、ペンシルバニア州）を用いて３７°ＣにおけるＰＲＰ の撹拌懸濁液中の光透過度の増加を記録することにより行なった。クエン酸濃度 は０．１２Ｍに一定に保たれ、ＰＲＰの血小板数は２５０，０００血小板／μｌ に調整した。

該結果はマルパスら、ブラッド、５７巻、第７３６−４０頁。

１９８１年に報告されたようにコラーゲン（ホルモンーケミイ。

ミュンヘン）及びＡＤＰ　（シグマ　ケミカル社、セントルイス。

モンタナ州）によって誘導されるＥＣ，。（５０％最大凝集反応をもたらす作用 物質濃度）により表わした。

ヘパリン及びＰＰＡＣＫの凝血に対する効果を比較するにあたり、該ＡＰＴＴを 同等に延長させるような用量を選択した（表５）。

ヘパリンにおいては、１００　Ｕ／ｋｇの初回塊投与及びその後の１５　Ｕ／ｋ ｇ／時の速度の連続点滴（これは１，０６±０．０８Ｕ／ｄの血漿レベルに相当 する）による該透析器への血液循環期間中を通じて、全身血でのＡＰＴＴは１９ ９±１８秒に延長された。ＰＰＡＣＫにおいては、該透析器の近位に１ＯＯｎＩ ｌｏｌ／ｋｇ／分の速度で点滴（これは１．５２±０．０６Ｍｇ／ｄの全身血漿 レベルに相当する）した場合、静脈血でのＡＰＴＴは１３９±２３秒に延長され た。ＰＰＡＣＫは血漿中のＦＰＡ、フィブリノーゲンのトロンビン開裂産物、の レベルの上昇を妨げたが、ヘパリンは妨げなかった（表５）。

゛　１　ヘパ１ン　ＰＰＡＣＫ ＡＰＴＴ　（秒）３４±１１９９±１８　１３９±２３ヘパリン　（単位／ｄ） 　１．１±０．０８　−ＰＰＡＣＫ　（μｇ　／ｄ）　１．５±０．０６ｐｐ＾ 　（ｐｍｏｌ　／　ｌ　）　６．２±０．６８　９．２±３．１　１．８±０． ２０フイブリノーゲン　（ｌａｇ／ｄＬ）　４０３±２４　３８７±３２　３４ ４±１４．０ＰＰＡＣＫは該透析器内に直接注入され、該循環からの除去が迅速 であったため、本薬剤の該装置内レベルは全身濃度よりも実質的に高かった（表 ６）。

表６ 全身レベルと比較した中空線維透析器直前及び直後の血漿中ＰＰＡＣＫＩ度 ＰＰＡＣＫ（／献） サンプル部位　時　間（分） 全身　１．４±０．４０　１．６±０．５０透析器前　３．０５±０．５５　３ ．６５±０．６５透析器後　３．９±０．５０　４．１±１．２０血小板反応性 を全血血小板数、出血時間、血小板凝集、及び血小板特異性α顆粒蛋白βＴＣ， 及びＰＰ４を比較することにより評価した（表７）、血小板数はヘパリン若しく はＰＰＡＣＫの投与期間中の透析器通過中有意に変化しなかったが、血小板止血 作用に関しては有意の差が明らかになった。ＰＰＡＣＫは出血時間を著しく延長 し、ＰＰ４及びβＴＧの血小板から血漿中への放出を減少させた；ヘパリンはこ れらの測定値のいずれにも影響を及ぼさなかった（表７　）　、Ｉ　Ｑ　Ｏｎｍ ｏｆｆｉ　／ｋｇ／分のＰＰＡＣＫを投与された５匹の別々の動物について行な われたＡＤＰ若しくはコラーゲンによる血小板凝集は本質的に正常であった（表 ７）。

表７ 血小板におけるヘパリン及びＰＰＡＣＫの作用側　対　ヘパリン　ＰＰＡＣＫ 出血時間（分）４．５±０．４　６．７±１．２　２４．８±１．９　＞　０． ００１血漿 ＰＰ４　（ｎｇ／ｄ）　８．２±１．０　２０．７±６．８　４．５±０．７　 ＜　０．０１βＴＧ　（ｎｇ／ｄ）　１３．５±２．４　２３．７±６．６　１ １．５±５．７　＜　０．０１血小板凝集（ＥＣ５゜） ＡＤＰ　（μｉ＋ｏｊ！／Ｌ）　２．３５　２．８コラ〜ゲン　（μｇ／ｄ）　 １．９　−　３．１５透析器線維東容積（ＤＦＶ）及び該線維東向のＩＩＩ　ｉ 　ｎ＝血小板沈着を各使用後の該透析器中の血栓形成の独立の測定項目として使 用した（第８図）。ヘパリン処置動物は全試験時間についてＤＦＶの有意かつ漸 進的低下及び該線維東向の血小板蓄積の相反する増加を示した。対照的に、ＰＰ ＡＣＫ処置により該透析器内の血小板蓄積が著しく減少するとともにＤＦＶが保 たれた。

透析器使用中の補体活性化（Ｃ３ａ）若しくは白血球数減少に関してヘパリン及 びＰＰＡＣＫ治療の間に明白な差は見られなかった。Ｃ３ａレベルは７６９±２ ０２ｎｇ／ｄの対照値から、ヘパリン及びＰＰＡＣＫのそれぞれについて２００ ５±７２８ｎｇ／ｄ及び１９８９±３６０ｎｇ／ｄのピークレベルまで上昇した 。逆に、白血球数には対照値からの早期の低下が観察された（１４．１００±１ 　、０００細胞／μｌからヘパリンが６，２００±８６０細胞／μ２、ＰＰＡＣ Ｋが５，９００±８１０細胞／ｄ）。

本実験結果及びパートＡの結果はヘパリンによる抗凝血対照実験の知見とは対照 的に血液透析中の合成抗トロンビン剤ＰＰＡＣＫの点滴が血小板依存性血栓形成 及びその結果生じる該血液透析器中の中空線維透析器の損失を、著しく減少させ ることを明らかにしている。さらに、インビボの血栓形成の他の間接的血液指標 、すなわち血漿ＰＦ４、βＴＧ及びＦＰＡは、ヘパリン療法中に観察されたレベ ルの上昇とは対照的にＰＰＡＣＫ注人後も基準レベルを維持した。ＰＰＡＣＫは また、エクスビボのコラーゲン若しくはＡＤＰによって誘導される血小板凝集の 測定値を変化させずに、出血時間の延長によって示される血小板の止血プラグ形 成を阻害したが、ヘパリンは阻害しなかった。これらの結果は、透析器中空線維 の漸進的損失が血小板依存性で、トロンビンが介在する閉塞性血栓症過程である ことの証拠を提供するものである。

中空線維透析器による血液透析は米国では長期継続透析を受ける尿毒症患者に用 いられている。透析器再利用における機能の保存は、経済的理由からのみならず 、装置の再利用に伴ない死亡率及び罹病率が低下することを示している最近の疫 学的研究の視点からも重要とみなされるようになっている（ボクら、プロシーデ ィンゲス　オブ　カランセル　ダイアリティック　トランス　プラント、１０巻 、第９２−９頁、１９８０年）、シかしながら、ヘパリンによる凝血防止にもか かわらず、該透析器の人工表面への血液の接触は補体、血小板及び凝血を活性化 させ、その結果一過性の好中球減少−１血栓形成及び、ＤＦＶ及びそれに続く透 析器輸送機能の漸進的損失をもたらす（ケノウィズら、アーティフィシャル　オ ーガンズ、１１巻、第１５５−６２頁、１９８７年−Ｅ、ザルツマン、フェデラ ル　ブロシーデインダス、３０巻、第１５０３−０９頁、１９７１年；及びプロ ーマンら、フェデラルプロシーデインダス、３０巻、第１４９４−５０２頁、１ ９７１年）。さらに、血液−表面相互作用の結果として生じる活性化及び／又は 開裂産物は血圧降下及び呼吸障害等の不都合な全身作用をもたらしかねない（ヘ ンダーソンら、ブラッド　ピュリフィケイション、１巻、第３−８頁、１９８５ 年；及びダンジラダスら。

キドニーインターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎ、）　、１巻、第１９０−９ ６頁、１９７２年）、ヘパリン使用に伴なう他の副作用には骨修復時の異常出血 （特に胃腸部及び頭蓋内部）〔リンドセイら、ランセント、２巻、第１２８７− ９０頁、１９７２年；ダンジラダスら、キドニーインターナショナル（Ｋｉｄｎ ｅｙ　Ｉｎｔ、　）、１巻。

第１９０−９６頁、１９７２年〕、とヘパリン誘導性血小板減少症〔サイネスら 、ニューイングランド　ジャーナル　オブメディスン、３０３巻、第７８８−９ ５頁、１９８０年〕、及びともすれば重症の脱石灰質性骨疾患が含まれる（スク ワイアズら、　ＪＡＭＡ。

２４１巻、第２４１７−１８頁、１９７９年；及びＪ、プロワキ。

ライフサイエンス、３３巻、第１０１９−２４頁、　１９８３年）、さらに、透 析の終了時にヘパリン抗凝血作用を取り消すために投与されるプロタミンもまた 、血圧降下及び補体放出等の問題をもたらす（アンダーソンら、サージエリ４， ４６巻、第１０５０頁、　１９５９年、及びＰ、　Ｇ、ルーブザー。テキサス　 ハート　ジャーナル。

１４巻、第３６９−７３頁、１９８７年）０時折、市販のヘパリンには、おそら く何らかの混入血小板活性化分画（類）の作用による動脈血栓症が伴なうことが あった（ザルラマンら、ジャーナル　オブ　クリニカル　インベスティゲイショ ン、６５巻、第６４−７３頁、１９８０年）。

ＰＰＡＣＫはその分子サイズの小ささゆえに循環から（Ｔ　ｓ　ｏ除去速度：３ 分以内、コレンら、ジャーナル　オブ　ライフサイエンス　クリニカル　メディ スン、９９巻、第７６−８３頁。

１９８２年）及びおそらく透析膜を通しての両方により迅速に除去されるため、 全身性の抗止血作用はほとんどあるいは全くなしに、透析器内に局所的に抗血栓 症レベルを維持することが可能である。たとえば、本実験では１００　ｒ＋＋ｗ ｏｆ　／　ｋｇ／分を投与した際の、該透析器中の血漿抗凝血剤活性の測定値は 、全身レベルと比較すると著しく上昇した（表７）、実際の透析条件下では、Ｐ ＰＡＣＫも透析液体に除去されるため、この差はさらに顕著になると思われる。

このように、結果として生じる止血の困難はヘパリンと比較するとごく小さい、 ヘパリンは完全に安全若しくは有効というわけではないが、適当な代替品が得ら れなかったため、透析患者に使用され続けている０本発明は従って、血液透析を 実施する際の改善された方法を提供するものである。

前記の内容は本発明の実例を示すことを意図しているが、限定するものではない 。

本発明の真の意図及び範囲からはずれることなく多数の変化及び改良を行なって もよい。

ＦＩＧ、　２ 血小板沈着（ｘ　１ｏ−’） 総崩小板沈着（Ｘ　１０”／ｃｉ） 血小板動脈内膜切除／血液 時間（時） ＦＩＧ、　６ 総崩小板沈着（Ｘ　１０−８） 時間（時） ＦＩＧ、　８ 国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）患者における血小板依存性動脈血栓症を予防する方法において、該患者に 対する治療上有効な量の式１で表わされるペプチド又はそのハロゲン酸付加生成 物の投与を含む方法▲数式、化学式、表等があります▼（１）（式中、Ｚは水素 若しくはＣ１−Ｃ４アシル基を示し；Ｘはハロゲン原子を示す）。
2. （２）請求の範囲第１項記載の方法において、Ｘが塩素を示し、Ｚが水素を示す 方法。
3. （３）患者における動脈再狭窄症を予防する方法において、以下の（ａ），（ｂ ）及び（ｃ）； （ａ）該患者に対する治療上有効な量の式（１）で表わされるペプチド又はその ハロゲン酸付加生成物の投与▲数式、化学式、表等があります▼（１）（式中、 Ｚは水素若しくはＣ１−Ｃ６アシル基を示し；Ｘはハロゲン原子を示す）、 （ｂ）該患者に対する狭窄動脈内の血流管直径を増大させ、それにより処置動脈 を作成するための医療処置の実施、及び（ｃ）該患者の動脈血の該処置動脈中の 循環を含む方法。
4. （４）請求の範囲第３項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも０． ２μ８／ｍｌの該血中ペプチド濃度をもたらすのに十分である方法。
5. （５）請求の範囲第３項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも１μ ｇ／ｍｌの該血中ペプチド濃度をもたらすのに十分である方法。
6. （６）請求の範囲第５項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも５分 間該ペプチド濃度を維持するのに十分である方法。
7. （７）請求の範囲第５項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも５分 間以上で９０分間以下の間該血中濃度を維持するのに十分である方法。
8. （８）請求の範囲第３項記載の方法において、Ｘが塩素を示し、Ｚが水素を示す 方法。
9. （９）請求の範囲第３項記載の方法において、該医療処置が外科処置である方法 。
10. （１０）請求の範囲第９項記載の方法において、該外科処置が動脈内膜切除術若 しくは血管形成術である方法。
11. （１１）請求の範囲第３項記載の方法において、該医療処置が該患者に対する医 療上有効な量の血栓溶解剤の投与を含む方法。
12. （１２）請求の範囲第１１項記載の方法において、該血栓溶解剤がストレプトキ ナーゼ、ウロキナーゼ若しくは組織プラスミノーゲン活性化剤である方法。
13. （１３）請求の範囲第３項記載の方法において、（ａ）が（ｃ）より先に行なわ れる方法。
14. （１４）請求の範囲第１３項記載の方法において、該血中の該ペプチド濃度が少 なくとも１μｇ／ｍｌの間に（ｃ）が行なわれる方法。
15. （１５）請求の範囲第１３項記載の方法において、（ａ）が行なわれた後５分以 内に（ｃ）が行なわれる方法。
16. （１６）患者における動脈補綴表面の血小板沈着を予防する方法において、以下 の（ａ）及び（ｂ）； （ａ）該患者に対する治療上有効な量の式（１）で表わされるペプチド及びその ハロゲン酸付加生成物の投与▲数式、化学式、表等があります▼（１）（式中、 Ｚは水素若しくはＣ１−Ｃ６アシル基を示し；Ｘはハロゲン原子を示す）、 （ｂ）該患者の動脈血の補綴麦面上の循環を含む方法。
17. （１７）請求の範囲第１６項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも ０、２μｇ／ｍｌの該血中ペプチド濃度をもたらすのに十分である方法。
18. （１８）請求の範囲第１６項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも １μｇ／ｍｌの該血中ペプチド濃度をもたらすのに十分である方法。
19. （１９）請求の範囲第１８項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも ５分間該ペプチド濃度を維持するのに十分である方法。
20. （２０）請求の範囲第１８項記載の方法において、該ペプチドの量が少なくとも ５分間以上で９０分以下の間該血中濃度を維持するのに十分である方法。
21. （２１）請求の範囲第１６項記載の方法において、Ｘが塩素を示し、Ｚが水素を 示す方法。
22. （２２）請求の範囲第１６項記載の方法において、該血栓形成性表面が動脈補綴 若しくは動脈吻合である方法。
23. （２３）請求の範囲第１６項記載の方法において、（ａ）が（ｂ）より先に行な われる方法。
24. （２４）請求の範囲第２３項記載の方法において、該血中の該ペプチド濃度が少 なくとも０．２μｇ／ｍｌの間に（ｂ）が行なわれる方法。