JPH0231952B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は静脈血栓症（venous thrombosis）の
治療に使用される酵素誘導体に関するものであ
る。 静脈血栓症は血液成分から塊状の固体すなわち
栓（plug）を静脈中に形成する。このような栓は
全部または一部分が転移して他の血管部位に移動
することがあり、この移転が起るとき、血栓
（thrombus）またはその断片を塞栓（embolus）
という。血栓または塞栓に関連する状態を一緒に
して血栓塞栓疾患または異常といい、総合的に見
ると、これらはヨーロツパ諸国で重疾患および死
亡の主な原因となつている。 現在静脈血栓症の治療のために提案されている
２種類の治療剤、すなわち凝固抑制剤および血栓
崩壊剤がある。現在最も一般的に使用されている
治療剤は凝固抑制剤であつて、その中でも最も広
く使用されているのは、一般的に最も効果的であ
ることが認められているヘパリン（heparin）お
よびジヒドロキシクマリン〔ワルフアリン、
（warfarin）〕である。凝固抑制剤の主な欠点は、
これらの凝固抑制剤には凝塊（clot）に対する直
接の溶解作用をもたないので、急性血栓症状の治
療に対してほとんど有用性をもたないことであ
る。第二に、これらの凝固抑制剤は凝塊系の機能
を低下させるので、この種の医薬を使用するとき
に特有な合併症として、相当に危険と思われてい
る出血が抑制できない。 静脈血栓症の治療に使用することを現在までに
提案されている血栓溶解剤は２種類に分類され
る。その中のひとつはフイブリンを直接溶解する
ことができるタンパク質分解酵素であり、他は凝
塊を溶解するブラスミンを体内で放出する溶解素
生成通路（lytic Pathway）を活性化させる酵素
性活性化剤である。血栓崩壊剤として使用するこ
とが提案されているタンパク質分解酵素の例に
は、たとえばブリナーゼ（brinase）、パパイン
（papain）、オクラーゼ（ochrase）、トリプシン
およびプラスミンがある。しかしながら、これら
の酵素は、静脈注射によつて投与されると、生体
内で抑制できないタンパク質分解変化を誘発する
ことができるので、きわめて毒性が強い。たとえ
ば、プラスミンは出血症候群を起すフイブリノー
ゲンその他の凝塊要素に変質する。またこれらの
酵素はプラスミノーゲン欠乏を起すことによつて
血栓症状を生じることがある。これらの理由のた
めに、このタイプの酵素を治療薬として使用する
ことはほとんどない。 血栓崩壊治療に最も有用であることが一般に認
められている医薬はストレプトキナーゼ
（streptokinase）とウロキナーゼ（urokinase）
の２種類である。これらは活性化因子であり、プ
ラスミノーゲンをプラスミンに転換させることに
よつて作用する。ストレプトキナーゼは溶血性連
鎖状球菌（haemolytic streptococci）の分泌物
であり、多量に安価に製造することができる。ウ
ロキナーゼは非常に少量しか得られず、きわめて
高価である。これらの医薬はともに大きい凝塊を
静脈の深部においてさえも溶解することができる
が、これらによつて生じる強力なフイブリン溶解
状態は同様にかなり危険である出血を誘発する傾
向をもつ。従つてこれらの医薬の使用は主静脈中
に重症の血栓性閉塞を持つ患者または肺動脈塞栓
症患者だけに厳重に制限される。さらに活性化因
子は天然の溶解素分泌系を刺戟するので、その全
身系の投与はプラスミノーゲン欠乏を生じ、その
ためにもし治療が長びくと、患者を血栓症にかさ
れやすい体質にすることがある。この作用はスト
レプトキナーゼおよびプラスミノーゲンの併用に
よつてある程度克服できるが、この折哀案は、こ
のような併用によるプラスミンの全身的な形成が
凝塊／溶解素生成通路制御機構を無力にする傾向
があるので、治療としてのフイブリン分解の問題
の適切な解決とならない。 本発明者らは、可逆的に失活できるある種の酵
素の使用によつて、今までに知られている血栓溶
解剤のほとんどすべての欠点を克服することが可
能であることを見出した。ストレプトキナーゼ／
プラスミノーゲン活性化因子複合体
（activatorcomplex）のある種の酵素が特に生体
内でフイプリンに対してある程度の選択性を示す
ことが認められた。 本発明者らは、触媒活性をおおうと同時にフイ
ブリンに対する親和性に影響を与えないでもとの
ままこれを保持するが、水性媒中で加水分解して
活性酵素を放出するようにこれらの酵素誘導体を
作り得ることを見出した。 従つて本発明によれば、、フイブリン溶解活性
に必須な触媒部位（site）が、PH7.4の等脹性水性
媒（isotonic aqueous media）中37℃での擬一
次加水分解速度恒数（pseudo−first order rate
constant for hydrolysis）が10-6〜10-3／秒であ
るような速度で加水分解によつて除去できるアシ
ル基によつてブロツクされているストレプトキナ
ーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体
（ただしｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキ
ナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体
は除く）の酵素誘導体が得られる。 生体内フイブリン溶解活性を測定するのに使用
される試薬は被験ウサギの下大静脈（inferior
vena cava）中に放射能によつてラベルされる凝
塊を形成することによつて実施される。試験薬
は、確実に静脈血と完全に混合するように、必ら
ず心臓を通らなければならない点で血流中に導入
される。特異性がない溶解素酵素（lytic
enzyme）は血中のタンパク質におかし、凝塊の
溶解が観察される前に死に到らしめる。フイブリ
ンに対してある程度の特異性をもつ酵素は致死量
より低い投与量で凝塊を溶解する。溶解が起つた
ことは、血流中に放射性の断片が遊離されること
によつて示される。 この試薬を実施するひとつの特定方法を次に示
す。 体重2.5〜3.5Kgのニユージーランド白ウサギに
麻酔をかけ、３本のカニユーレをそれぞれ前顔面
静脈（本明細書でカニユーレ１と呼ぶ）、左頚動
脈（カニユーレ２と呼ぶ）および左外腸骨静脈
（カニユーレ３と呼ぶ）に挿入する。次にウサギ
の開腹手術を実施し、左腎臓静脈との接合部付近
で下大静脈を露出させる。下大静脈の一部をその
接合部付近で結紮し、左脹骨静脈との接合部寄り
に近づいた点で下大静脈上に鉗子を置くことによ
つて隔離する。100μの放射性ヨウ素化したヒ
トフイブリノーゲン（human fibrinogen）およ
び150μのウキギのトロンボプラスチン
（thromboplastin）よりなる混合物の50μの静
脈の隔離された部分に注射することによつて放射
性凝塊を誘発させる。50μという量は任意にき
められた量であつて、正確に測定できる最低量
と、隔離された静脈の部分内で生理学的条件に過
度の障害を与えることなしに注射できる最大量と
の間の量を表わす。血流中に放出される放射能を
測定するためには、静脈に注射される放射性活性
体の量が0.25μCiよりも少くならないようにすべ
きであつて、一般に0.25〜1.0μCiの量が便利であ
る。注射を注射部位から滲出液および凝塊しない
放射性活性体を吸収するようにおこなうために下
大静脈の外壁の入口点で注射針の上に凝塊綿棒
（clot swab）を置く。フイブリンノーゲン／ト
ロンボブラスチン混合物の第２の対照液50μを
計数用ビアルに移し、そのγ−放射線のレベルを
液体シンレーシヨンカウンターで計数するか、あ
るいはヨウ化ナトリウム結晶法を使用して直接γ
−計数することによつて測定する。対照液は動物
に注射された放射能の目安を与える。第１の凝塊
綿棒は全ての最初の滲出液を採取するのに十分な
時間、一般に５分間定置してから第２の綿球にと
りかえる。第１の凝塊綿棒を計数用ビアルに移
し、γ−放射レベルを計数する。カニユーレ３を
前述の鉗子からできるだけ離し、フイブリノーゲ
ン／トロンボプラスミン混合物の注射後10分後に
ヘパリンの溶液0.5ml（500μ／ml）をカニユーレ
３を通して投与する。ヘパリン注射の目的は試験
凝塊中に有意量のラベルされていない自己発生的
ウサギフイブリンが入りこむことを防止するため
に、凝塊形成の程度を制限することである。この
理由は、もし有意量の非ラベル物質が凝塊の中に
這入り込むと、非ラベル溶解生成物が血流中に放
出されるので、溶解の検出ができなくなることに
ある。しかたとえば放射性凝塊が非放射性物質で
包被されると、この誤差は無視できなくなる。 結紮を部分的に開いて、下大静脈をその正常直
径の40〜60％に絞窄する絞窄は凝塊の移動を防止
するために必要である。鉗子を除去し、カニユー
レ２を通り、ヘパリン溶液1.0ml（500μ／ml）を
投与して被験動物の凝固を防止し、実験の目的に
要求される凝塊以外の凝塊の形成を防止する。次
に出血をチエツクし、もし持続していたらトロン
ビン含侵綿棒を使用することによつて止血する。
放射性活性物質の注射後15分後にカニユーレ２か
ら血液試料1.8mlを抜取り、クエン酸三ナトリウ
ム緩衝液0.2ｇ（3.8％ｗ／ｖ）を加えることによ
つて凝固を防止する。希釈血液試料（P0）のγ
−放射能を液体シンチレーシヨンカウンターで計
数するか、あるいはヨウ化ナトリウム結晶法を使
用して直接γ−計数することによつて測定する。
この値は血液中の放射性活性の目安となる。次に
凝塊を4.0mlの食塩水を0.2ml／分の流量でカニユ
ーレ３を通して注入することによつて洗浄し、外
因性の放射性活性物質を循環液中に洗い流し、血
栓形成剤を洗い流すことによつて凝塊の生長の防
止を助成する。第２の血液試料（P10）を前述の
如く、クエン酸塩緩衝液中に取出し、P0から10
分後に前述の如くγ−放射能を計数する。この計
数は余計な放射性活性物質が血液中に洗い込まれ
ているかどうかをチエツクし、凝塊の安定性の目
安を得るためにおこなわれる。 試料P0の20分後に、食塩水の注入をやめ、さ
らに血液試料を採取（時間ｔ＝０）し、試験酵素
の注入を開始する。ｔ＝０に採取された血液試料
の放射能の量はバツクグランド放射能量の目安と
なる。 酵素の一投与量の全身注入によつて投与し、注
入開始後30分毎に６時間２mlずつの血液試料を採
取し、各試料の放射能をヨウ化ナトリウム結晶法
を使用する直接γ−計数または液体シンチレーシ
ヨンカウンターで計数することによつて測定し、
遊離プラスミン活性を生体外で測定する。 陽性の結果を得るために、被験動物に投与すべ
き投与量は致死をともなわず活性が観測されるま
で試行錯誤法によつて決定する。使用すべき投与
量の引手きとして、被験動物の体重Kgあたり活性
触媒部位の１×10-7〜５×10-6モルのヒトプラス
ミンの投与量が試験で陽性の結果を与え、同様に
ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化因
子複合体の投与量は１×10-10〜１×10-8モル／
Kgで陽性になる。従つてタンパク質分解活性部位
の濃度が不明の場合には、色素生成滴定または螢
光生成滴定によるか、あるいは酵素の分析的な純
な試料の分子量および比活性度を測定することに
よつて求めることができる。 投与量は前述の範囲の選択と同様に人為的に選
択される。選ばれた投与量の20％を実験の開始に
投与し、残りの量を２時間にわたつて投与する。
もし活性が観察されなければ、活性が観察される
まで、あるいは毒性が実験を制限するまで、投与
量を増加して実験を反復する。注入の期間を５時
間まで増すことができる。 本願明細書に記載されているような生体内フイ
ブリン溶解活性を有する酵素はたとえばウロキナ
ーゼ、ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活
性化因子複合体、血管活性化因子、特にヒト血管
活性化因子およびプラスミン、特に哺乳動物プラ
スミンたとえばブタ、ウシ、ウマ、サルおよびヒ
トのプラスミンである。 本発明で使用する酵素はストレプトキナーゼ／
ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体である。
本発明によつて、ストレプトキナーゼ／ヒトプラ
スミノーゲン活性化因子複合体のブロツクされた
誘導体、特にアシル誘導体を形成すると特に有利
なことが判明した。 本発明において、本発明の誘導体に使用される
ブロツクされた酵素は対応する誘離酵素を使用す
るよりも次の有利点をもつことがわかつた。 (a) ブロツクされている方がブロツクされていな
い酵素よりも効果がある。 (b) ブロツクされている酵素の生理学的活性に永
続性がある。 (c) ブロツクされている酵素はその毒性が比較的
に低毒性であるために１回の、場合によつては
多量の投与量を静脈注射によつて投与すること
ができる。これに対して現在おこなわれている
治療法では、酵素、活性化因子又は活性化因子
複合体を数時間または数日間の期間にわたつて
連続的に静脈注入しなければならない。 ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化
因子複合体はマツククリントツクおよびベル
（D.K.McclintockおよびP.H.Bell（Biochem.
Biophys.Res.Comm.43、694〜702、1972）によ
つて述べられている。 触媒部位のブロツク基の本質的な特徴はブロツ
ク基が擬似一次加水分解速度恒数が10-6／秒以上
であり、10-3／秒以下であるような速度で加水分
解によつ除去されなければならないことである。
好ましくは速度恒数10-5〜10-3／秒である。 10-3／秒以上の擬似一次速度恒数を有する誘導
体はフイブリンと結合する前に、許容できないほ
どの高レベルの遊離酵素を放出する。10-6／秒以
下の擬似一次速度恒数を有する誘導体は著しく緩
慢に酵素を放出するので、臨床用に合わない。 本発明による誘導体は予防剤としても、また治
療剤としても使用することができる。予防剤の目
的には、加水分解速度が少さく、従つて長い半減
期を有する誘導体が好ましい。この目的に合う誘
導体は擬似一次加水分解速度恒数５×10-4〜
10-5／秒および半減期3.5〜16時間を有する。治
療用にはもつて急速に加水分解する誘導体、すな
ちち半減期約30分〜２時間に相当する擬似一次加
水分解速度恒数５×10-4〜７×10-5／秒を有する
ものが好ましい。 擬似一次反応速度恒数は酵素誘導体を生理学的
条件、すなわちPH7.4および37℃の等脹性水性媒
中で加水分解することによつて測定される。定期
的に液を少量ずつ抜取り、Ｓ−2251（Ｈ−Ｄ−
Val−Leu−Lys−Ｐ−ニトロアニリツド2HCl）
のような色素産生または螢光産生プロテアーゼ基
質で培養し、基質の転換率を測定する。 加水分解は基質の転換率が最大に達する時間ま
で続ける。速度恒数Ｋは時間ｔに対する。 Ioge（１−At／Amax） （式中Amaxは試料が基質を転換させる最大速度
であり、Atは試料が時間ｔで基質を転換する速
度である）をプロツトすることによつて計算され
る。 本発明は誘導体に使用されるブロツク基の詳細
な同定は、選択された酵素の性質および誘導体の
使用目的によつてある程度変動する。 ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化
因子では、タンパク質分解活性に必須な触媒部位
は遊離ビドロキシル部分（mojety）を有するセ
リン残基を含む。好ましくはこの部位はベンゾイ
ル、置換ベンゾイル、アクリロイルまたは置換ア
クリロイルのようなアシル基でブロツクされる。
特定の置換ベンゾイルでブロツクされた酵素誘導
体の擬似一次加水分解速度恒数は、特定の置換基
と酵素との間に特別の交互作用がない限り、２種
類以上の置換ベンゾイル誘導体の擬似一次反応速
度が測定されていれば任意の置換基のハメツトの
σ値を基準にして評価することができる。 ｍ−およびｐ−置換基に対するハメツト値σm
およびσpは加水分解速度を許容できる程度に予
言することが一般的に認められている。さらに
σm値およびσp値の合計は１基以上の置換基を有
する他の置換ベンゾイル基の動力学的性質をかな
りの精度で計算することができる。ｏ−置換基に
対するハメツト値σoは合計しても立体効果のた
めにσm値およびσp値と同一信頼度をもたない。
しかしながらｏ−置換基が小さく、立体効果が無
視できる場合、すなわちフツ素、メチルおよびメ
トキシの場合にはσo値は単独またはσm値および
（または）σp値と合計して一般に認められている
誤差の範囲内で反応速度の計数に使用することが
できる。 好適なベンゾイル基および置換ベンゾイル基に
はベンゾイル基およびハロゲン、C1〜C6アルキ
ル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルカノイルオ
キシ、C1〜C6アルカノイルアミノ（RCONH−）
で置換されたベンゾイル基、たとえばベンゾイ
ル、ｐ−フルオロベンゾイル、ｏ−トルオイル、
ｍ−トルオイル、ｐ−トルオイル、ｏ−メトキシ
ベンゾイル、ｍ−メトキシベンゾイル、ｐ−メト
キシベンゾイル（即ち、アニソイル）、ｏ−エト
キシベンゾイル、ｍ−エトキシベンゾイル、ｐ−
エトキシベンゾイル、２，４−ジメトキシベンゾ
イル、３，４−ジメチルベンゾイル、４−ブチル
ベンゾイル、３−メチル−４−メトキシベンゾイ
ル、ｏ−アセトキシベンゾイル（すなわちアセチ
ルサリシロイル）およびｐ−アセタミドベンゾイ
ルがある。別の芳香族基にナフトイルがある。 この一般則に対する例外はベンゾイル基が塩基
性部分、たとえばアミノ、ジメチルアミノおよび
グアニジノを有する場合ある。この種の誘導体の
加水分解速度は計算値より10倍程度までおそくな
る。 好適な置換アクリロイル基には、C1〜C6アル
キルアクリロイル、フリルアクリロイル、シンナ
モイル、C1〜C6アルキルシンナモイル、特に３，
３−ジメチルアクリロイル、３−（２−フリル）
アクリロイル、シンナモイルおよびｐ−メチルシ
ンナモイルがある。 本発明の酵素誘導体はヒトに静脈注射によつて
投与するのに適する医薬組成物を調剤する常法に
従つて調剤される。 静脈注射投与用の代表的な酵素誘導体組成物は
滅菌等腸性水性緩衝液中の滅菌誘導体の溶液であ
る。必要に応じて、組成物に誘導体を溶液にして
おくための可溶化剤および注射部位の苦痛を緩和
するためのリグノカイン（Iignocaine）のような
局部麻酔剤を入れることができる。一般に酵素誘
導体はたとえば乾燥粉末または水を含まない原液
の形にしてアンプルのような密封容器または薬袋
に入れた単位投与量の形で供給され、活性単位数
で表わされた酵素の量ならびに遊離酵素が放出さ
れる時間を指示する。誘導体を注入によつて投与
しようとする場合には、誘導体は滅菌製薬剤「注
射用水」を入れた注入ビンとともに配給される。
誘導体を放射投与しようとするときには、誘導体
は注射用の滅菌水のアンプルとともに配給され
る。注射用または注入用組成物は投与前に各成分
を混合することによつて調製される。 物質の投与量は、フイブリン溶解所要量、溶解
に要求される速度、血栓塞栓症の病状および凝塊
の場所および大きさによつて変化する。たとえば
肺動脈塞栓症または生死に関係するような大型の
上昇回腸−股動脈血栓症の患者には急速に作用す
る物質の１服を投与しなければならない。一方手
術後の血栓形成を防止しようとする場合には、緩
効物質の少量を必要とする。投与しようとする定
量的な投与量および投与の方式は状況に応じて処
置を監督する医師によつて患者の性質を考慮に入
れて必然的に決定されなければならない。しかし
ながら、一般に、中程度の大きさの血栓を治療し
ようとしている患者には、体重１Kgに対して１日
１〜20mgの投与量が８回までの回数に分割して、
あるいは注入によつて一般に投与される。 本発明に使用できる酵素誘導体が知られてい
る。この誘導体およびその製造を記載している文
献とともに次に示す。 ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナー
ゼ／プラスミノーゲン活性因子複合体（D.K.
McClintock＆P.H.BeII、Biochem.Biophys.Res.
Comm.、43、694〜702、1972） 過去においてこの誘導体は前述の酵素の活性部
位滴定中に生成された。しかしながらこれらの誘
導体の単離および特性はまだ報告されたことはな
い。さらにこれらの酵素誘導体がフイブリン溶解
剤として有用なことは今までに認められていなか
つた。 本発明によれば、フイブリン溶解活性に必須な
触媒部位が、PH7.4の等張性水性媒中37℃での擬
似一次加水分解速度恒数が10-6／秒〜10-3／秒で
あるような速度で加水分解によつて除去できるア
シル基によつてブロツクされているストレプトキ
ナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子（ただ
しｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナー
ゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体は除
く）の酵素誘導体が得られる。 本発明の誘導体は逆ブロツキングによつて製造
することができる。 逆ブロツキング法はストレプトキナーゼ／ヒト
プラスミノーゲン活性化因子複合体を式 EF で示される化合物（式中Ｅはｐ−アミジノフエノ
キシまたはｐ−アセトアミジノフエノキシである
かまたはメタ−もしくはパラ−位で正に帯電した
部分を含有する構造的に類似する置換フエノキシ
基であり、Ｆはアシル基である）と反応させるこ
とよりなる。 基Ｅの例にはｐ−アミジノフエノキシまたはｐ
−アセトアミジノフエノキシであるかまたはメタ
−もしくはパラ−位で正に帯電した部分を含有す
る構造的に類似する置換フエノキシ基であり、基
Ｆはアシル基である。 逆ブロツキング試薬はたとえばp′−フルオロ安
息香酸ｐ−アミジノフエニル、p′−トルイル酸ｐ
−アミジノフエニル、p′−アニス酸ｐ−アミジノ
フエニル、安息香酸ｐ−アミジノフエニル、桂皮
酸ｐ−アミジノフエニル、p′−メチル桂皮酸ｐ−
アミジノフエニル、３−（２−フリル）−アクリル
酸ｐ−アミジノフエニル、２−ナフトエ酸ｐ−ア
ミジノフエニル、３，３−ジメチルアクリル酸ｐ
−アミジノフエニル、４−ブチル安息香酸ｐ−ア
ミジノフエニル、２，４−ジメトキシ安息香酸ｐ
−アミジノフエニル、アセチルサリチル酸ｐ−ア
ミジノフエニル、４−エトキシ安息香酸ｐ−アミ
ジノフエニル、p′−アニス酸ｐ−アセタミジノフ
エニル、ｏ−トルイル酸ｐ−アミジノフエニル、
３，４−ジメチル安息香酸ｐ−アミジノフエニル
３−メチル−４−メトキシ安息香酸ｐ−アミジノ
フエニルおよび４−アセタミド安息香酸ｐ−アミ
ジノフエニルである。 逆ブロツキング反応は、酵素、ブロツキング試
薬および製品に有害でないPH範囲、たとえばPH４
〜８、好ましくは5.0〜7.5で水性媒中で実施され
る。 反応は一般に等モルの酵素およびブロツキング
試薬を使用して実施されるが、過剰のブロツキン
グ試薬を使用することもできる。また希釈溶液、
すなわち酵素に対しては10-3モル以下およびブロ
ツキング試薬に対して10-2モル以下の濃度の溶液
中で反応をおこなうことが好ましい。一般に酵素
またはブロツキング試薬の濃度が10-7モル以下の
溶液では実施されない。 ブロツキング反応は中温、すなわち室温または
湿温以下、好ましくは10℃以下であり、また反応
媒の凍結温度以上で実施しなければならない。 反応を進行させる時間は使用されるブロツキン
グ試薬、反応を実施する温度およびブロツキング
反応に選ばれる酵素によつて変化する。ある特定
の状況に対する最適反応時間は反応液の一部を色
素または螢光産生基質で培養することによる酵素
活性の低下によつて選ぶことがきる。 反応が完結しながら、誘導体は、透析、アフイ
ニテイクロマトグラフイー（affinity
cnromatography）および限外ろ過のような標準
的な方法によつて精製され、次に水性媒から凍結
乾燥のような標準的方法によつて回収される。ま
た必要に応じて、ヒトの静脈注射投与に適合させ
るために、たとえば滅菌する。 式EFで示される逆ブロツキング試薬（式中Ｅ
はｐ−アミジノフエノキシであり、Ｆはアシル基
である）はｐ−ヒドロキシベンザミジンまたはそ
の塩を式 FX で示されるアシル化誘導体（式中Ｆは前述の基で
あり、Ｘはヒドロキシルまたはその活性化アシル
化誘導体である）で、場合によつては触媒の存在
下にアシル化することによつて製造することがで
きる。 活性化アシル化誘導体にはたとえば塩化または
臭化アシルがある。これらの誘導体は標準的方法
によつて製造することができる。 アシル化反応に好ましい触媒にはピリンジのよ
うな第三有機塩基およびジシクロヘキシルカルボ
ジイミドのようなカツプリング剤がある。 一般にアシル化反応は反応剤および製品に対し
て不活性な極性有機溶媒中で実施される。好適な
溶媒にはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびジ
メチルスルホキシドがある。別法として触媒がピ
リジンのような液体である場合には溶媒を使用し
ないで反応を実施することができる。 一般に反応は中温すなわち70℃以下、好ましく
は40℃以下、最適には室温で実施される。 反応を完結するまで進行させる時間は、使用す
る反応剤、溶媒および反応をおこなう温度によつ
て変化する。反応時間はたとえば薄層クロマトグ
ラフイーで反応を追跡することによつて決定する
ことができる。 反応が完結したら、製品を回収し、標準的な方
法によつて精製する。 Ｆが置換ベンゾイル基である逆ブロツキング試
薬は新規化合物であり、本発明の要件の一部を構
成する。 次に参考例及び実施例は本発明を説明するもの
である。参考例１〜18は逆ブロツキング試薬の製
造を例示する。 参考例 １ 安息香酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩酸
塩 ｐ−ヒドロキシベンズアミジン塩酸塩0.12ｇを
乾燥ピリジン1.0mlにとかし、これにピリジン1.0
ml中の塩化ベンゾイル0.141ｇを溶液を滴下した。
混合物を室温で１時間かきまぜてから、室温で４
日間放置した。混合物を乾固近くまで蒸発し、残
留物を乾燥ジエチルエーテルとすりつぶし、得ら
れる固体を約３mlの２−プロパノールとジエチル
エーテルの２：1v／ｖの混液から再結晶させ、
融点160℃の目的化合物0.223ｇを得た。 核磁気共鳴スペクトル分析（n.m.r.）δ（ジメ
チルスルホキシドd6）：9.65 二重線、４Ｈ、
D2Oで交換可能、アミジンのＨ：約8.0 多重線、
９Ｈ、フエニルおよびアミジノフエニル。 参考例２〜10は参考例１に記載の方法と同様に
して製造された。 参考例 ２ トランス桂皮酸のｐ−アミジノフエニルエステ
ル塩酸塩 融点、192℃ n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.55 二重
線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンのＨ：7.95
多重線、６Ｈ、アミジノフエニルおよびアクリ
ロイルのＨ：7.10 多重線、5H、フエニルの
Ｈ：6.96 二重線、Ｊ＝16Hz、１Ｈ、アクリロイ
ルのＨ。 参考例 ３ ｐ−アニス酸のp′−アミジノフエニルエステル
塩酸塩 ２−プロパノールから再結晶させた製品の融点
225℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシデd6）：9.50二重
線、4H：8.05 四重線、Ｊ＝６Hz、４Ｈ、アミ
ジノフエニルのＨ：7.38 四重線、Ｊ＝９Hz、
4H、ｐ−アニソールのＨ：3.90 シングレツト、
３Ｈ、メトシのＨ。 参考例 ４ ３，３−ジメチルアクリル酸のｐ−アミジノフ
エニルエステル塩酸塩 水から再結晶させた製品の融点、173℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.50 二重
線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンのＨ：7.95
および7.37 四重線、Ｊ＝９Hz、４Ｈ、アミジノ
フエニルのＨ：5.96 広い幅の二重線（Ｊ：１
Hz）、１Ｈ、アクリロイルＨ：2.09 シングレツ
ト３Ｈ、メチルＨ：1.90 シングレツト３Ｈ、メ
チルＨ。 参考例 ５ ４−ブチル安息香酸のｐ−アミジノフエニルエ
ステル塩酸塩 イソプロパノールと水との容積比１：４から再
結晶された製品の融点、190℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.55広い幅
の二重線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ：
7.6〜81 重復した四重線、８Ｈ、アミジノフエ
ニルおよびベンゾイルＨ：1.30 シングレツト９
Ｈ、ｔ−ブチルＨ。 参考例 ６ ２，６−ジメトキシ安息香酸のｐ−アミジノフ
エニルエステル塩酸塩 メタノールから再結晶させた製品の融点、213
〜214℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.48二重
線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ、8.01お
よび7.50AA′BB′四重線（Ｊ：８Hz）、４Ｈ、アミ
ジノフエニルＨ：8.03および6.75多重線、３Ｈ、
２，４−置換フエニルＨ：3.90シングレツト６
Ｈ、２×メトキシＨ。 参考例 ７ アセチルサリチル酸のｐ−アミジノフエニルエ
ステル塩酸塩 イソプロパノールから再結晶させた製品の融点
109〜111℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.62広い幅
の二重線 ４Ｈ、D2Oと交換可能アミジンＨ：
8.12および7.55 AA′BB′四重線（Ｊ：９Hz）４
Ｈ、アミジノフエニルＨ：2.26 シングレツト３
Ｈ、アセチルＨ。 参考例 ８ ４−エトキシ安息香酸のｐ−アミジノフエニル
エステル塩酸塩 イソプロパノールから再結晶させた製品の融点
211〜212℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.60広い二
重線、４Ｈ D2Oと交換可能 アミジンＨ：8.10
および7.56 AA′BB′四重線（Ｊ：９Hz）４Ｈ、ア
ミジノフエニルＨ：8.13および7.15AA′BB′四重
線、（Ｊ：９Hz）、４Ｈ、４−エトキシフエニル
Ｈ、4.19 四重線2H、−ＯCH2 CH3：9.38 三重
線3H、−OCH2 CH3 。 参考例 ９ ｏ−トルイル酸のｐ−アミジノフエニルエステ
ル塩酸塩 イソプロパノールとジエチルエーテルとの混液
から２回再結晶させた製品の融点、157〜９℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：広い二重
線４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ：8.20およ
び7.62 AA′BB′四重線４Ｈ、アミジノフエニル
Ｈ：7.3〜8.2 多重線４Ｈ、２−メチルフエニル
Ｈ：2.11 シングレツト3H、メチルＨ。 参考例 10 (a) ２−（４−ヒドロキシフエニル）アセトアミ
ジン塩酸塩 ｐ−ヒドロキシベンジルシアニド5.0ｇを無
水エタノール50mlにとかした溶液を室温で乾燥
HClガスで４時間にわたつて飽和させた。４℃
で72時間後乾燥ジエチルエーテル200mlおよび
軽質石油100mlを加え、２時間にわたつて白色
結晶を沈澱させた。固体をろ過によつて単離
し、直ちにアンモニア飽和エタノール300mlと
室温で３時間反応させ、反応混合物をスチーム
バス上で蒸発乾固し、残留物をエタノールで再
結晶させた。融点248℃ （分解） 収量、4.36ｇ n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.0〜9.8
エンペローブ５Ｈ D2Oと交換可能、アミジン
Ｈ、ヒドロキシルＨ：6.85＋7.38 AA′BB′四重
線４Ｈ、（Ｊ：９Hz）、フエニルＨ：3.70 シン
グレツト２Ｈ、ベンジルＨ。 (b) ４−メトキシ安息香酸のｐ−（ホルムアミジ
ノメチル）フエニルエステル イソプロパノールとジエチルエーテルとから
再結晶させた製品の融点、174〜176℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.42広い
幅の二重線４ＨD2Oと交換可能、アミジノＨ：
8.15および6.29 AA′BB′四重線（Ｊ：８Hz）４
Ｈ、４−メトキシフエニルＨ：7.69および7.13 AA′BB′四重線（Ｊ：８Hz）４Ｈ、アミジノ
フエニルＨ：3.90 シングレツト３Ｈ、メトキ
シＨ。 参考例 11 ｐ−トルイル酸のp′−アミジノフエニルエステ
ル塩酸塩 ｐ−ヒドロキシベンズアミジン塩酸塩1.72ｇお
よびｐ−トルイル酸1.36ｇを乾燥ピリジン5.0ml
とジメチルスルホキシド10.0mlとの混合物にとか
し、溶液Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド2.1ｇとともに室温で72時間かきまぜた。反応
混合物をろ過し、ろ液に乾燥ジエチルエーテル
200mlを加えて沈澱させ、生成する油状物を沈澱
後に結晶させ、等容積の２−プロパノールと1.4
−ジオキサンとから再結晶させて、融点164℃の
製品を得た。 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.6広い幅
の二重線D2Oと交換可能4H、アミジンＨ、8.15
四重線（Ｊ：約４Hz）アミジノフエニルＨ、：
7.60 四重線（Ｊ：約９Hz）4H、ベンゾイル
Ｈ：2.44 シングレツト３Ｈ、メチルＨ。 参考例12〜18の化合物は参考例11に記載の方法
によつて製造された。 参考例 12 ｐ−フルオロ安息香酸のp′−アミジノフエニル
エステル過塩酸塩 エーテルで沈除させた油状液を５％ｗ／ｖの過
塩素酸10mlから再結晶させた製品の融点、180℃ （分解） n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.3 二重線４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ：8.25 四重線（Ｊ：約５Hz）５Ｈ、ベンゾイルの３−
および５−Ｈ：7.8 重復四重線6H、アミジオフ
エニルＨおよびベンゾイルの２−および６−Ｈ。 参考例 13 ３−（２−フリル）アクリル酸のｐ−アミジノ
フエニルエステル過塩素酸塩 ピリジン中でカツプリング反応をおこない、ろ
液は乾固付近まで蒸発し、残留物を希過塩素酸か
ら再結晶させた灰色の板状結晶。 融点、157℃ n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.35二重線
D2Oと交換可能、４Ｈ、アミジンＨ：7.7 四重線（Ｊ：約８Hz）４Ｈ、アミジノフエニル
Ｈ：7.9二重線、（Ｊ：約３Hz）１Ｈ、フリル５−
Ｈ：7.85および7.40 二重線（Ｊ：20Hz）１Ｈ、
２−アクリロイルＨ：7.10 二重線（Ｊ：約３
Hz）１Ｈ、フリル３−Ｈ：6.70 多重線１Ｈ、フ
リル４−Ｈ：6.44 二重線（Ｊ：15Hz）１Ｈ、ア
クリロイル３−Ｈ。 参考例 14 ｐ−メチル−トランス桂皮酸のｐ−アミジノフ
エニルエステル過塩素酸塩 ３−（２−フリル）アクリル酸エステルとして
単離 融点、155℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.15 二重線D2Oと交換可能４Ｈ、アミジンＨ：7.2〜
8.2多重線、9H、アミジノフエニルおよびフエニ
ルＨ：6.82 二重線（Ｊ：16Hz）１Ｈ、アクリロ
イル２−Ｈ：6.44二重線（Ｊ：16Hz）1H、アク
リロイルＨ：2.42 二重線（Ｊ：２Hz）３Ｈ、メ
チルＨ。 参考例 15 ｏ−アニス酸のｐ−アミジノフエニルエステル
塩酸塩 イソプロパノールから再結晶させた製品の融点
149℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.50 広い幅のシングレツト４ＨD2Oと交換可能、アミ
ジンＨ：7.50および7.95不規則な多重線５Ｈ、ア
ミジノフエノールＨおよび２−Ｈ：7.0〜7.5 多重線３Ｈ、ベンゾイルの３−Ｈ、４−Ｈおよ
び５−Ｈ：3.86 シングレツト３Ｈ、メトキシ
Ｈ。 参考例 16 ３，４−ジメチル安息香酸のｐ−アミジノフエ
ニルエステル塩酸塩 イソプロパノールおよび食塩水から再結晶させ
た製品の融点、107℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.56 広い幅のシングレツト、４ＨD2Oと交換可能、ア
ミジンＨ：7.50〜7.95 不規則な三重線７Ｈ、ア
ミジノフエニルおよびベンゾイルのＨ：2.30シン
グレツト、６Ｈ、メチルＨ。 参考例 17 ３−メチル−４−メトキシ安息香酸のｐ−アミ
ジノフエニルエステル塩酸塩 イソプロパノールと2NHClの容積比10：１の
混液から再結晶させた製品の融点、210℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.54 二重線４ＨD2Oと交換可能、アミジンＨ：8.07 不規則な二重線４Ｈ、２−Ｈ＋ベンゾイル６−
Ｈ、アミジノフエニル2Hおよび６−Ｈ：7.60
二重線（Ｊ：９Hz）アミジノフエニル２Ｈ、3H
および5H：7.22 二重線（Ｊ：９Hz）1H、ベン
ゾイル5H：3.92 シングレツト３Ｈ、メトキシ
Ｈ：2.26 シングレツト３Ｈ、メトキシＨ。 参考例 18 ４−アセタミド安息香酸のｐ−アミジノフエニ
ルエステル塩酸塩 イソプロパノールと水との容積比１：２から再
結晶させた製品の融点、257℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：10.62 シングレツト１ＨD2Oと交換可能、アミジン
Ｈ：7.90 AA′BB′四重線４Ｈ、：7.50〜7.9 重復
AA′BB′四重線４Ｈ、ベンゾイルおよびアミジノ
フエニルＨ：2.09 シングレツト３Ｈ、アセチル
Ｈ。 実施例 １ ｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／ヒトプラ
スミノーゲン活性化因子複合体の溶液の製造 0.9％ｗ／ｖ食塩水溶液10.5ml中のストレプト
キナーゼ（５×104単位、スエーデン、ストツク
ホルム、A.B.Kabi製）を容款−ヒトプラスミノ
ーゲン（0.025ml4.9ナノモル）と混合した。混合
物を25℃で40分間培養してから、PH7.4の0.1Mの
トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、
0.9％ｗ／ｖの食塩および20％ｖ／ｖのグリセロ
ールを含む液2.0mlで希釈した。この溶液を、貯
蔵溶液としてジメチルスルホキシド中0.1Mとし
て調製したp′−アニス酸ｐ−アミドフエニルが最
終的に0.1ｍＭになるように25℃で５分間隔で３
回処理した。アシル化した酵素をＬ−リシンセフ
アローズ4B（2.5ml）の33％湿潤重量／容積の懸
濁液で０℃で10分間処理した。懸濁液を吸引ろ過
し、次いで前述のトリスヒドロキシメチルアミノ
メタン塩酸塩／グリセロール／食塩水緩衝液100
mlで４℃で洗つた。ゲルを、さらに0.1Mのアミ
ノカプタン酸を含有する前述のトリスヒドロキシ
メチルアミノメタン塩酸塩／グリセロール／食塩
水緩衝液（５ml）に再懸濁した。０℃に保ち、10
分後にゲルの懸濁液を1000ｇで２分間遠心分離す
ることによつて清澄させた。上澄液（４ml）を前
述のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸
塩／グリセロール／食塩水緩衝液（2.0）に対
して透析した。生成したアシル化活性化因子複合
体の溶液は擬似一次反応速度恒数2.7×10-4／秒
で37℃で遊離酵素に再生することができた。 実施例 ２ ３−メチルｐ−アニソイルストレプトキナー
ゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体溶
液の製造 この物質はアシル化を３−メチルｐ−アニス酸
ｐ−アミジノフエニルエステルの最終濃度が0.2
ｍＭとなるように２回にわたつて25℃で15分間隔
で実施し、続いて０℃で１時間処理したこと以外
は実施例１の記載の方法と同様に製造された。擬
似一次脱アシル化反応速度恒数は１×10-4／秒で
あつた。 実施例 ３ 凍結乾燥ｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／
ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体 0.9％ｗ／ｖの食塩水（0.9ml）中のストレプト
レプトキナーゼ（９×104単位）を溶解−ヒトプ
ラスミノーゲン（0.075ml、14.9ナノモル）と混
合した。混合物を25℃で30分間培養してからPH
7.4（4.0ml）の0.1Mトリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン塩酸塩緩衝液で希釈した。この溶液をジ
メチルスルホキシド中の10ｍＭの貯蔵溶液として
調製したｐ−アニス酸ｐ−アミジノフエニルで25
℃で５分間隔で３回にわけて処理し、最終濃度を
0.1ｍＭとした。アシル化酵素をＬ−リシンセフ
アローズ4B（5.0ml）の湿潤重量33％ｗ／ｖの懸
濁液と０℃で10分間混合し、懸濁液を吸引ろ過
し、４℃で前述のトリスヒドロキシメチルアミノ
メタン塩酸塩緩衝液（200ml）で洗つた。ゲルを
0.1Mのアミノカプロン酸を含むPH7.5（5.0ml）の
50ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩
酸塩緩衝液に再懸濁し、次にろ過し、同じ緩衝液
５mlで３回洗浄した。溶出液を合せ、PH7.4の5.0
ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸
塩緩衝液中の５％ｗ／ｖマニトール２に対して
４℃で２時間透析してから凍結乾燥して白色粉末
0.560ｇを得た。この物質は原料酵素活性の５％
以下の活性をもち、水性媒中37℃で再生すること
ができた。
治療に使用される酵素誘導体に関するものであ
る。 静脈血栓症は血液成分から塊状の固体すなわち
栓（plug）を静脈中に形成する。このような栓は
全部または一部分が転移して他の血管部位に移動
することがあり、この移転が起るとき、血栓
（thrombus）またはその断片を塞栓（embolus）
という。血栓または塞栓に関連する状態を一緒に
して血栓塞栓疾患または異常といい、総合的に見
ると、これらはヨーロツパ諸国で重疾患および死
亡の主な原因となつている。 現在静脈血栓症の治療のために提案されている
２種類の治療剤、すなわち凝固抑制剤および血栓
崩壊剤がある。現在最も一般的に使用されている
治療剤は凝固抑制剤であつて、その中でも最も広
く使用されているのは、一般的に最も効果的であ
ることが認められているヘパリン（heparin）お
よびジヒドロキシクマリン〔ワルフアリン、
（warfarin）〕である。凝固抑制剤の主な欠点は、
これらの凝固抑制剤には凝塊（clot）に対する直
接の溶解作用をもたないので、急性血栓症状の治
療に対してほとんど有用性をもたないことであ
る。第二に、これらの凝固抑制剤は凝塊系の機能
を低下させるので、この種の医薬を使用するとき
に特有な合併症として、相当に危険と思われてい
る出血が抑制できない。 静脈血栓症の治療に使用することを現在までに
提案されている血栓溶解剤は２種類に分類され
る。その中のひとつはフイブリンを直接溶解する
ことができるタンパク質分解酵素であり、他は凝
塊を溶解するブラスミンを体内で放出する溶解素
生成通路（lytic Pathway）を活性化させる酵素
性活性化剤である。血栓崩壊剤として使用するこ
とが提案されているタンパク質分解酵素の例に
は、たとえばブリナーゼ（brinase）、パパイン
（papain）、オクラーゼ（ochrase）、トリプシン
およびプラスミンがある。しかしながら、これら
の酵素は、静脈注射によつて投与されると、生体
内で抑制できないタンパク質分解変化を誘発する
ことができるので、きわめて毒性が強い。たとえ
ば、プラスミンは出血症候群を起すフイブリノー
ゲンその他の凝塊要素に変質する。またこれらの
酵素はプラスミノーゲン欠乏を起すことによつて
血栓症状を生じることがある。これらの理由のた
めに、このタイプの酵素を治療薬として使用する
ことはほとんどない。 血栓崩壊治療に最も有用であることが一般に認
められている医薬はストレプトキナーゼ
（streptokinase）とウロキナーゼ（urokinase）
の２種類である。これらは活性化因子であり、プ
ラスミノーゲンをプラスミンに転換させることに
よつて作用する。ストレプトキナーゼは溶血性連
鎖状球菌（haemolytic streptococci）の分泌物
であり、多量に安価に製造することができる。ウ
ロキナーゼは非常に少量しか得られず、きわめて
高価である。これらの医薬はともに大きい凝塊を
静脈の深部においてさえも溶解することができる
が、これらによつて生じる強力なフイブリン溶解
状態は同様にかなり危険である出血を誘発する傾
向をもつ。従つてこれらの医薬の使用は主静脈中
に重症の血栓性閉塞を持つ患者または肺動脈塞栓
症患者だけに厳重に制限される。さらに活性化因
子は天然の溶解素分泌系を刺戟するので、その全
身系の投与はプラスミノーゲン欠乏を生じ、その
ためにもし治療が長びくと、患者を血栓症にかさ
れやすい体質にすることがある。この作用はスト
レプトキナーゼおよびプラスミノーゲンの併用に
よつてある程度克服できるが、この折哀案は、こ
のような併用によるプラスミンの全身的な形成が
凝塊／溶解素生成通路制御機構を無力にする傾向
があるので、治療としてのフイブリン分解の問題
の適切な解決とならない。 本発明者らは、可逆的に失活できるある種の酵
素の使用によつて、今までに知られている血栓溶
解剤のほとんどすべての欠点を克服することが可
能であることを見出した。ストレプトキナーゼ／
プラスミノーゲン活性化因子複合体
（activatorcomplex）のある種の酵素が特に生体
内でフイプリンに対してある程度の選択性を示す
ことが認められた。 本発明者らは、触媒活性をおおうと同時にフイ
ブリンに対する親和性に影響を与えないでもとの
ままこれを保持するが、水性媒中で加水分解して
活性酵素を放出するようにこれらの酵素誘導体を
作り得ることを見出した。 従つて本発明によれば、、フイブリン溶解活性
に必須な触媒部位（site）が、PH7.4の等脹性水性
媒（isotonic aqueous media）中37℃での擬一
次加水分解速度恒数（pseudo−first order rate
constant for hydrolysis）が10-6〜10-3／秒であ
るような速度で加水分解によつて除去できるアシ
ル基によつてブロツクされているストレプトキナ
ーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体
（ただしｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキ
ナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体
は除く）の酵素誘導体が得られる。 生体内フイブリン溶解活性を測定するのに使用
される試薬は被験ウサギの下大静脈（inferior
vena cava）中に放射能によつてラベルされる凝
塊を形成することによつて実施される。試験薬
は、確実に静脈血と完全に混合するように、必ら
ず心臓を通らなければならない点で血流中に導入
される。特異性がない溶解素酵素（lytic
enzyme）は血中のタンパク質におかし、凝塊の
溶解が観察される前に死に到らしめる。フイブリ
ンに対してある程度の特異性をもつ酵素は致死量
より低い投与量で凝塊を溶解する。溶解が起つた
ことは、血流中に放射性の断片が遊離されること
によつて示される。 この試薬を実施するひとつの特定方法を次に示
す。 体重2.5〜3.5Kgのニユージーランド白ウサギに
麻酔をかけ、３本のカニユーレをそれぞれ前顔面
静脈（本明細書でカニユーレ１と呼ぶ）、左頚動
脈（カニユーレ２と呼ぶ）および左外腸骨静脈
（カニユーレ３と呼ぶ）に挿入する。次にウサギ
の開腹手術を実施し、左腎臓静脈との接合部付近
で下大静脈を露出させる。下大静脈の一部をその
接合部付近で結紮し、左脹骨静脈との接合部寄り
に近づいた点で下大静脈上に鉗子を置くことによ
つて隔離する。100μの放射性ヨウ素化したヒ
トフイブリノーゲン（human fibrinogen）およ
び150μのウキギのトロンボプラスチン
（thromboplastin）よりなる混合物の50μの静
脈の隔離された部分に注射することによつて放射
性凝塊を誘発させる。50μという量は任意にき
められた量であつて、正確に測定できる最低量
と、隔離された静脈の部分内で生理学的条件に過
度の障害を与えることなしに注射できる最大量と
の間の量を表わす。血流中に放出される放射能を
測定するためには、静脈に注射される放射性活性
体の量が0.25μCiよりも少くならないようにすべ
きであつて、一般に0.25〜1.0μCiの量が便利であ
る。注射を注射部位から滲出液および凝塊しない
放射性活性体を吸収するようにおこなうために下
大静脈の外壁の入口点で注射針の上に凝塊綿棒
（clot swab）を置く。フイブリンノーゲン／ト
ロンボブラスチン混合物の第２の対照液50μを
計数用ビアルに移し、そのγ−放射線のレベルを
液体シンレーシヨンカウンターで計数するか、あ
るいはヨウ化ナトリウム結晶法を使用して直接γ
−計数することによつて測定する。対照液は動物
に注射された放射能の目安を与える。第１の凝塊
綿棒は全ての最初の滲出液を採取するのに十分な
時間、一般に５分間定置してから第２の綿球にと
りかえる。第１の凝塊綿棒を計数用ビアルに移
し、γ−放射レベルを計数する。カニユーレ３を
前述の鉗子からできるだけ離し、フイブリノーゲ
ン／トロンボプラスミン混合物の注射後10分後に
ヘパリンの溶液0.5ml（500μ／ml）をカニユーレ
３を通して投与する。ヘパリン注射の目的は試験
凝塊中に有意量のラベルされていない自己発生的
ウサギフイブリンが入りこむことを防止するため
に、凝塊形成の程度を制限することである。この
理由は、もし有意量の非ラベル物質が凝塊の中に
這入り込むと、非ラベル溶解生成物が血流中に放
出されるので、溶解の検出ができなくなることに
ある。しかたとえば放射性凝塊が非放射性物質で
包被されると、この誤差は無視できなくなる。 結紮を部分的に開いて、下大静脈をその正常直
径の40〜60％に絞窄する絞窄は凝塊の移動を防止
するために必要である。鉗子を除去し、カニユー
レ２を通り、ヘパリン溶液1.0ml（500μ／ml）を
投与して被験動物の凝固を防止し、実験の目的に
要求される凝塊以外の凝塊の形成を防止する。次
に出血をチエツクし、もし持続していたらトロン
ビン含侵綿棒を使用することによつて止血する。
放射性活性物質の注射後15分後にカニユーレ２か
ら血液試料1.8mlを抜取り、クエン酸三ナトリウ
ム緩衝液0.2ｇ（3.8％ｗ／ｖ）を加えることによ
つて凝固を防止する。希釈血液試料（P0）のγ
−放射能を液体シンチレーシヨンカウンターで計
数するか、あるいはヨウ化ナトリウム結晶法を使
用して直接γ−計数することによつて測定する。
この値は血液中の放射性活性の目安となる。次に
凝塊を4.0mlの食塩水を0.2ml／分の流量でカニユ
ーレ３を通して注入することによつて洗浄し、外
因性の放射性活性物質を循環液中に洗い流し、血
栓形成剤を洗い流すことによつて凝塊の生長の防
止を助成する。第２の血液試料（P10）を前述の
如く、クエン酸塩緩衝液中に取出し、P0から10
分後に前述の如くγ−放射能を計数する。この計
数は余計な放射性活性物質が血液中に洗い込まれ
ているかどうかをチエツクし、凝塊の安定性の目
安を得るためにおこなわれる。 試料P0の20分後に、食塩水の注入をやめ、さ
らに血液試料を採取（時間ｔ＝０）し、試験酵素
の注入を開始する。ｔ＝０に採取された血液試料
の放射能の量はバツクグランド放射能量の目安と
なる。 酵素の一投与量の全身注入によつて投与し、注
入開始後30分毎に６時間２mlずつの血液試料を採
取し、各試料の放射能をヨウ化ナトリウム結晶法
を使用する直接γ−計数または液体シンチレーシ
ヨンカウンターで計数することによつて測定し、
遊離プラスミン活性を生体外で測定する。 陽性の結果を得るために、被験動物に投与すべ
き投与量は致死をともなわず活性が観測されるま
で試行錯誤法によつて決定する。使用すべき投与
量の引手きとして、被験動物の体重Kgあたり活性
触媒部位の１×10-7〜５×10-6モルのヒトプラス
ミンの投与量が試験で陽性の結果を与え、同様に
ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化因
子複合体の投与量は１×10-10〜１×10-8モル／
Kgで陽性になる。従つてタンパク質分解活性部位
の濃度が不明の場合には、色素生成滴定または螢
光生成滴定によるか、あるいは酵素の分析的な純
な試料の分子量および比活性度を測定することに
よつて求めることができる。 投与量は前述の範囲の選択と同様に人為的に選
択される。選ばれた投与量の20％を実験の開始に
投与し、残りの量を２時間にわたつて投与する。
もし活性が観察されなければ、活性が観察される
まで、あるいは毒性が実験を制限するまで、投与
量を増加して実験を反復する。注入の期間を５時
間まで増すことができる。 本願明細書に記載されているような生体内フイ
ブリン溶解活性を有する酵素はたとえばウロキナ
ーゼ、ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活
性化因子複合体、血管活性化因子、特にヒト血管
活性化因子およびプラスミン、特に哺乳動物プラ
スミンたとえばブタ、ウシ、ウマ、サルおよびヒ
トのプラスミンである。 本発明で使用する酵素はストレプトキナーゼ／
ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体である。
本発明によつて、ストレプトキナーゼ／ヒトプラ
スミノーゲン活性化因子複合体のブロツクされた
誘導体、特にアシル誘導体を形成すると特に有利
なことが判明した。 本発明において、本発明の誘導体に使用される
ブロツクされた酵素は対応する誘離酵素を使用す
るよりも次の有利点をもつことがわかつた。 (a) ブロツクされている方がブロツクされていな
い酵素よりも効果がある。 (b) ブロツクされている酵素の生理学的活性に永
続性がある。 (c) ブロツクされている酵素はその毒性が比較的
に低毒性であるために１回の、場合によつては
多量の投与量を静脈注射によつて投与すること
ができる。これに対して現在おこなわれている
治療法では、酵素、活性化因子又は活性化因子
複合体を数時間または数日間の期間にわたつて
連続的に静脈注入しなければならない。 ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化
因子複合体はマツククリントツクおよびベル
（D.K.McclintockおよびP.H.Bell（Biochem.
Biophys.Res.Comm.43、694〜702、1972）によ
つて述べられている。 触媒部位のブロツク基の本質的な特徴はブロツ
ク基が擬似一次加水分解速度恒数が10-6／秒以上
であり、10-3／秒以下であるような速度で加水分
解によつ除去されなければならないことである。
好ましくは速度恒数10-5〜10-3／秒である。 10-3／秒以上の擬似一次速度恒数を有する誘導
体はフイブリンと結合する前に、許容できないほ
どの高レベルの遊離酵素を放出する。10-6／秒以
下の擬似一次速度恒数を有する誘導体は著しく緩
慢に酵素を放出するので、臨床用に合わない。 本発明による誘導体は予防剤としても、また治
療剤としても使用することができる。予防剤の目
的には、加水分解速度が少さく、従つて長い半減
期を有する誘導体が好ましい。この目的に合う誘
導体は擬似一次加水分解速度恒数５×10-4〜
10-5／秒および半減期3.5〜16時間を有する。治
療用にはもつて急速に加水分解する誘導体、すな
ちち半減期約30分〜２時間に相当する擬似一次加
水分解速度恒数５×10-4〜７×10-5／秒を有する
ものが好ましい。 擬似一次反応速度恒数は酵素誘導体を生理学的
条件、すなわちPH7.4および37℃の等脹性水性媒
中で加水分解することによつて測定される。定期
的に液を少量ずつ抜取り、Ｓ−2251（Ｈ−Ｄ−
Val−Leu−Lys−Ｐ−ニトロアニリツド2HCl）
のような色素産生または螢光産生プロテアーゼ基
質で培養し、基質の転換率を測定する。 加水分解は基質の転換率が最大に達する時間ま
で続ける。速度恒数Ｋは時間ｔに対する。 Ioge（１−At／Amax） （式中Amaxは試料が基質を転換させる最大速度
であり、Atは試料が時間ｔで基質を転換する速
度である）をプロツトすることによつて計算され
る。 本発明は誘導体に使用されるブロツク基の詳細
な同定は、選択された酵素の性質および誘導体の
使用目的によつてある程度変動する。 ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化
因子では、タンパク質分解活性に必須な触媒部位
は遊離ビドロキシル部分（mojety）を有するセ
リン残基を含む。好ましくはこの部位はベンゾイ
ル、置換ベンゾイル、アクリロイルまたは置換ア
クリロイルのようなアシル基でブロツクされる。
特定の置換ベンゾイルでブロツクされた酵素誘導
体の擬似一次加水分解速度恒数は、特定の置換基
と酵素との間に特別の交互作用がない限り、２種
類以上の置換ベンゾイル誘導体の擬似一次反応速
度が測定されていれば任意の置換基のハメツトの
σ値を基準にして評価することができる。 ｍ−およびｐ−置換基に対するハメツト値σm
およびσpは加水分解速度を許容できる程度に予
言することが一般的に認められている。さらに
σm値およびσp値の合計は１基以上の置換基を有
する他の置換ベンゾイル基の動力学的性質をかな
りの精度で計算することができる。ｏ−置換基に
対するハメツト値σoは合計しても立体効果のた
めにσm値およびσp値と同一信頼度をもたない。
しかしながらｏ−置換基が小さく、立体効果が無
視できる場合、すなわちフツ素、メチルおよびメ
トキシの場合にはσo値は単独またはσm値および
（または）σp値と合計して一般に認められている
誤差の範囲内で反応速度の計数に使用することが
できる。 好適なベンゾイル基および置換ベンゾイル基に
はベンゾイル基およびハロゲン、C1〜C6アルキ
ル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6アルカノイルオ
キシ、C1〜C6アルカノイルアミノ（RCONH−）
で置換されたベンゾイル基、たとえばベンゾイ
ル、ｐ−フルオロベンゾイル、ｏ−トルオイル、
ｍ−トルオイル、ｐ−トルオイル、ｏ−メトキシ
ベンゾイル、ｍ−メトキシベンゾイル、ｐ−メト
キシベンゾイル（即ち、アニソイル）、ｏ−エト
キシベンゾイル、ｍ−エトキシベンゾイル、ｐ−
エトキシベンゾイル、２，４−ジメトキシベンゾ
イル、３，４−ジメチルベンゾイル、４−ブチル
ベンゾイル、３−メチル−４−メトキシベンゾイ
ル、ｏ−アセトキシベンゾイル（すなわちアセチ
ルサリシロイル）およびｐ−アセタミドベンゾイ
ルがある。別の芳香族基にナフトイルがある。 この一般則に対する例外はベンゾイル基が塩基
性部分、たとえばアミノ、ジメチルアミノおよび
グアニジノを有する場合ある。この種の誘導体の
加水分解速度は計算値より10倍程度までおそくな
る。 好適な置換アクリロイル基には、C1〜C6アル
キルアクリロイル、フリルアクリロイル、シンナ
モイル、C1〜C6アルキルシンナモイル、特に３，
３−ジメチルアクリロイル、３−（２−フリル）
アクリロイル、シンナモイルおよびｐ−メチルシ
ンナモイルがある。 本発明の酵素誘導体はヒトに静脈注射によつて
投与するのに適する医薬組成物を調剤する常法に
従つて調剤される。 静脈注射投与用の代表的な酵素誘導体組成物は
滅菌等腸性水性緩衝液中の滅菌誘導体の溶液であ
る。必要に応じて、組成物に誘導体を溶液にして
おくための可溶化剤および注射部位の苦痛を緩和
するためのリグノカイン（Iignocaine）のような
局部麻酔剤を入れることができる。一般に酵素誘
導体はたとえば乾燥粉末または水を含まない原液
の形にしてアンプルのような密封容器または薬袋
に入れた単位投与量の形で供給され、活性単位数
で表わされた酵素の量ならびに遊離酵素が放出さ
れる時間を指示する。誘導体を注入によつて投与
しようとする場合には、誘導体は滅菌製薬剤「注
射用水」を入れた注入ビンとともに配給される。
誘導体を放射投与しようとするときには、誘導体
は注射用の滅菌水のアンプルとともに配給され
る。注射用または注入用組成物は投与前に各成分
を混合することによつて調製される。 物質の投与量は、フイブリン溶解所要量、溶解
に要求される速度、血栓塞栓症の病状および凝塊
の場所および大きさによつて変化する。たとえば
肺動脈塞栓症または生死に関係するような大型の
上昇回腸−股動脈血栓症の患者には急速に作用す
る物質の１服を投与しなければならない。一方手
術後の血栓形成を防止しようとする場合には、緩
効物質の少量を必要とする。投与しようとする定
量的な投与量および投与の方式は状況に応じて処
置を監督する医師によつて患者の性質を考慮に入
れて必然的に決定されなければならない。しかし
ながら、一般に、中程度の大きさの血栓を治療し
ようとしている患者には、体重１Kgに対して１日
１〜20mgの投与量が８回までの回数に分割して、
あるいは注入によつて一般に投与される。 本発明に使用できる酵素誘導体が知られてい
る。この誘導体およびその製造を記載している文
献とともに次に示す。 ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナー
ゼ／プラスミノーゲン活性因子複合体（D.K.
McClintock＆P.H.BeII、Biochem.Biophys.Res.
Comm.、43、694〜702、1972） 過去においてこの誘導体は前述の酵素の活性部
位滴定中に生成された。しかしながらこれらの誘
導体の単離および特性はまだ報告されたことはな
い。さらにこれらの酵素誘導体がフイブリン溶解
剤として有用なことは今までに認められていなか
つた。 本発明によれば、フイブリン溶解活性に必須な
触媒部位が、PH7.4の等張性水性媒中37℃での擬
似一次加水分解速度恒数が10-6／秒〜10-3／秒で
あるような速度で加水分解によつて除去できるア
シル基によつてブロツクされているストレプトキ
ナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子（ただ
しｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナー
ゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体は除
く）の酵素誘導体が得られる。 本発明の誘導体は逆ブロツキングによつて製造
することができる。 逆ブロツキング法はストレプトキナーゼ／ヒト
プラスミノーゲン活性化因子複合体を式 EF で示される化合物（式中Ｅはｐ−アミジノフエノ
キシまたはｐ−アセトアミジノフエノキシである
かまたはメタ−もしくはパラ−位で正に帯電した
部分を含有する構造的に類似する置換フエノキシ
基であり、Ｆはアシル基である）と反応させるこ
とよりなる。 基Ｅの例にはｐ−アミジノフエノキシまたはｐ
−アセトアミジノフエノキシであるかまたはメタ
−もしくはパラ−位で正に帯電した部分を含有す
る構造的に類似する置換フエノキシ基であり、基
Ｆはアシル基である。 逆ブロツキング試薬はたとえばp′−フルオロ安
息香酸ｐ−アミジノフエニル、p′−トルイル酸ｐ
−アミジノフエニル、p′−アニス酸ｐ−アミジノ
フエニル、安息香酸ｐ−アミジノフエニル、桂皮
酸ｐ−アミジノフエニル、p′−メチル桂皮酸ｐ−
アミジノフエニル、３−（２−フリル）−アクリル
酸ｐ−アミジノフエニル、２−ナフトエ酸ｐ−ア
ミジノフエニル、３，３−ジメチルアクリル酸ｐ
−アミジノフエニル、４−ブチル安息香酸ｐ−ア
ミジノフエニル、２，４−ジメトキシ安息香酸ｐ
−アミジノフエニル、アセチルサリチル酸ｐ−ア
ミジノフエニル、４−エトキシ安息香酸ｐ−アミ
ジノフエニル、p′−アニス酸ｐ−アセタミジノフ
エニル、ｏ−トルイル酸ｐ−アミジノフエニル、
３，４−ジメチル安息香酸ｐ−アミジノフエニル
３−メチル−４−メトキシ安息香酸ｐ−アミジノ
フエニルおよび４−アセタミド安息香酸ｐ−アミ
ジノフエニルである。 逆ブロツキング反応は、酵素、ブロツキング試
薬および製品に有害でないPH範囲、たとえばPH４
〜８、好ましくは5.0〜7.5で水性媒中で実施され
る。 反応は一般に等モルの酵素およびブロツキング
試薬を使用して実施されるが、過剰のブロツキン
グ試薬を使用することもできる。また希釈溶液、
すなわち酵素に対しては10-3モル以下およびブロ
ツキング試薬に対して10-2モル以下の濃度の溶液
中で反応をおこなうことが好ましい。一般に酵素
またはブロツキング試薬の濃度が10-7モル以下の
溶液では実施されない。 ブロツキング反応は中温、すなわち室温または
湿温以下、好ましくは10℃以下であり、また反応
媒の凍結温度以上で実施しなければならない。 反応を進行させる時間は使用されるブロツキン
グ試薬、反応を実施する温度およびブロツキング
反応に選ばれる酵素によつて変化する。ある特定
の状況に対する最適反応時間は反応液の一部を色
素または螢光産生基質で培養することによる酵素
活性の低下によつて選ぶことがきる。 反応が完結しながら、誘導体は、透析、アフイ
ニテイクロマトグラフイー（affinity
cnromatography）および限外ろ過のような標準
的な方法によつて精製され、次に水性媒から凍結
乾燥のような標準的方法によつて回収される。ま
た必要に応じて、ヒトの静脈注射投与に適合させ
るために、たとえば滅菌する。 式EFで示される逆ブロツキング試薬（式中Ｅ
はｐ−アミジノフエノキシであり、Ｆはアシル基
である）はｐ−ヒドロキシベンザミジンまたはそ
の塩を式 FX で示されるアシル化誘導体（式中Ｆは前述の基で
あり、Ｘはヒドロキシルまたはその活性化アシル
化誘導体である）で、場合によつては触媒の存在
下にアシル化することによつて製造することがで
きる。 活性化アシル化誘導体にはたとえば塩化または
臭化アシルがある。これらの誘導体は標準的方法
によつて製造することができる。 アシル化反応に好ましい触媒にはピリンジのよ
うな第三有機塩基およびジシクロヘキシルカルボ
ジイミドのようなカツプリング剤がある。 一般にアシル化反応は反応剤および製品に対し
て不活性な極性有機溶媒中で実施される。好適な
溶媒にはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびジ
メチルスルホキシドがある。別法として触媒がピ
リジンのような液体である場合には溶媒を使用し
ないで反応を実施することができる。 一般に反応は中温すなわち70℃以下、好ましく
は40℃以下、最適には室温で実施される。 反応を完結するまで進行させる時間は、使用す
る反応剤、溶媒および反応をおこなう温度によつ
て変化する。反応時間はたとえば薄層クロマトグ
ラフイーで反応を追跡することによつて決定する
ことができる。 反応が完結したら、製品を回収し、標準的な方
法によつて精製する。 Ｆが置換ベンゾイル基である逆ブロツキング試
薬は新規化合物であり、本発明の要件の一部を構
成する。 次に参考例及び実施例は本発明を説明するもの
である。参考例１〜18は逆ブロツキング試薬の製
造を例示する。 参考例 １ 安息香酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩酸
塩 ｐ−ヒドロキシベンズアミジン塩酸塩0.12ｇを
乾燥ピリジン1.0mlにとかし、これにピリジン1.0
ml中の塩化ベンゾイル0.141ｇを溶液を滴下した。
混合物を室温で１時間かきまぜてから、室温で４
日間放置した。混合物を乾固近くまで蒸発し、残
留物を乾燥ジエチルエーテルとすりつぶし、得ら
れる固体を約３mlの２−プロパノールとジエチル
エーテルの２：1v／ｖの混液から再結晶させ、
融点160℃の目的化合物0.223ｇを得た。 核磁気共鳴スペクトル分析（n.m.r.）δ（ジメ
チルスルホキシドd6）：9.65 二重線、４Ｈ、
D2Oで交換可能、アミジンのＨ：約8.0 多重線、
９Ｈ、フエニルおよびアミジノフエニル。 参考例２〜10は参考例１に記載の方法と同様に
して製造された。 参考例 ２ トランス桂皮酸のｐ−アミジノフエニルエステ
ル塩酸塩 融点、192℃ n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.55 二重
線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンのＨ：7.95
多重線、６Ｈ、アミジノフエニルおよびアクリ
ロイルのＨ：7.10 多重線、5H、フエニルの
Ｈ：6.96 二重線、Ｊ＝16Hz、１Ｈ、アクリロイ
ルのＨ。 参考例 ３ ｐ−アニス酸のp′−アミジノフエニルエステル
塩酸塩 ２−プロパノールから再結晶させた製品の融点
225℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシデd6）：9.50二重
線、4H：8.05 四重線、Ｊ＝６Hz、４Ｈ、アミ
ジノフエニルのＨ：7.38 四重線、Ｊ＝９Hz、
4H、ｐ−アニソールのＨ：3.90 シングレツト、
３Ｈ、メトシのＨ。 参考例 ４ ３，３−ジメチルアクリル酸のｐ−アミジノフ
エニルエステル塩酸塩 水から再結晶させた製品の融点、173℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.50 二重
線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンのＨ：7.95
および7.37 四重線、Ｊ＝９Hz、４Ｈ、アミジノ
フエニルのＨ：5.96 広い幅の二重線（Ｊ：１
Hz）、１Ｈ、アクリロイルＨ：2.09 シングレツ
ト３Ｈ、メチルＨ：1.90 シングレツト３Ｈ、メ
チルＨ。 参考例 ５ ４−ブチル安息香酸のｐ−アミジノフエニルエ
ステル塩酸塩 イソプロパノールと水との容積比１：４から再
結晶された製品の融点、190℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.55広い幅
の二重線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ：
7.6〜81 重復した四重線、８Ｈ、アミジノフエ
ニルおよびベンゾイルＨ：1.30 シングレツト９
Ｈ、ｔ−ブチルＨ。 参考例 ６ ２，６−ジメトキシ安息香酸のｐ−アミジノフ
エニルエステル塩酸塩 メタノールから再結晶させた製品の融点、213
〜214℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.48二重
線、４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ、8.01お
よび7.50AA′BB′四重線（Ｊ：８Hz）、４Ｈ、アミ
ジノフエニルＨ：8.03および6.75多重線、３Ｈ、
２，４−置換フエニルＨ：3.90シングレツト６
Ｈ、２×メトキシＨ。 参考例 ７ アセチルサリチル酸のｐ−アミジノフエニルエ
ステル塩酸塩 イソプロパノールから再結晶させた製品の融点
109〜111℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.62広い幅
の二重線 ４Ｈ、D2Oと交換可能アミジンＨ：
8.12および7.55 AA′BB′四重線（Ｊ：９Hz）４
Ｈ、アミジノフエニルＨ：2.26 シングレツト３
Ｈ、アセチルＨ。 参考例 ８ ４−エトキシ安息香酸のｐ−アミジノフエニル
エステル塩酸塩 イソプロパノールから再結晶させた製品の融点
211〜212℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.60広い二
重線、４Ｈ D2Oと交換可能 アミジンＨ：8.10
および7.56 AA′BB′四重線（Ｊ：９Hz）４Ｈ、ア
ミジノフエニルＨ：8.13および7.15AA′BB′四重
線、（Ｊ：９Hz）、４Ｈ、４−エトキシフエニル
Ｈ、4.19 四重線2H、−ＯCH2 CH3：9.38 三重
線3H、−OCH2 CH3 。 参考例 ９ ｏ−トルイル酸のｐ−アミジノフエニルエステ
ル塩酸塩 イソプロパノールとジエチルエーテルとの混液
から２回再結晶させた製品の融点、157〜９℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：広い二重
線４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ：8.20およ
び7.62 AA′BB′四重線４Ｈ、アミジノフエニル
Ｈ：7.3〜8.2 多重線４Ｈ、２−メチルフエニル
Ｈ：2.11 シングレツト3H、メチルＨ。 参考例 10 (a) ２−（４−ヒドロキシフエニル）アセトアミ
ジン塩酸塩 ｐ−ヒドロキシベンジルシアニド5.0ｇを無
水エタノール50mlにとかした溶液を室温で乾燥
HClガスで４時間にわたつて飽和させた。４℃
で72時間後乾燥ジエチルエーテル200mlおよび
軽質石油100mlを加え、２時間にわたつて白色
結晶を沈澱させた。固体をろ過によつて単離
し、直ちにアンモニア飽和エタノール300mlと
室温で３時間反応させ、反応混合物をスチーム
バス上で蒸発乾固し、残留物をエタノールで再
結晶させた。融点248℃ （分解） 収量、4.36ｇ n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.0〜9.8
エンペローブ５Ｈ D2Oと交換可能、アミジン
Ｈ、ヒドロキシルＨ：6.85＋7.38 AA′BB′四重
線４Ｈ、（Ｊ：９Hz）、フエニルＨ：3.70 シン
グレツト２Ｈ、ベンジルＨ。 (b) ４−メトキシ安息香酸のｐ−（ホルムアミジ
ノメチル）フエニルエステル イソプロパノールとジエチルエーテルとから
再結晶させた製品の融点、174〜176℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.42広い
幅の二重線４ＨD2Oと交換可能、アミジノＨ：
8.15および6.29 AA′BB′四重線（Ｊ：８Hz）４
Ｈ、４−メトキシフエニルＨ：7.69および7.13 AA′BB′四重線（Ｊ：８Hz）４Ｈ、アミジノ
フエニルＨ：3.90 シングレツト３Ｈ、メトキ
シＨ。 参考例 11 ｐ−トルイル酸のp′−アミジノフエニルエステ
ル塩酸塩 ｐ−ヒドロキシベンズアミジン塩酸塩1.72ｇお
よびｐ−トルイル酸1.36ｇを乾燥ピリジン5.0ml
とジメチルスルホキシド10.0mlとの混合物にとか
し、溶液Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド2.1ｇとともに室温で72時間かきまぜた。反応
混合物をろ過し、ろ液に乾燥ジエチルエーテル
200mlを加えて沈澱させ、生成する油状物を沈澱
後に結晶させ、等容積の２−プロパノールと1.4
−ジオキサンとから再結晶させて、融点164℃の
製品を得た。 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.6広い幅
の二重線D2Oと交換可能4H、アミジンＨ、8.15
四重線（Ｊ：約４Hz）アミジノフエニルＨ、：
7.60 四重線（Ｊ：約９Hz）4H、ベンゾイル
Ｈ：2.44 シングレツト３Ｈ、メチルＨ。 参考例12〜18の化合物は参考例11に記載の方法
によつて製造された。 参考例 12 ｐ−フルオロ安息香酸のp′−アミジノフエニル
エステル過塩酸塩 エーテルで沈除させた油状液を５％ｗ／ｖの過
塩素酸10mlから再結晶させた製品の融点、180℃ （分解） n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.3 二重線４Ｈ、D2Oと交換可能、アミジンＨ：8.25 四重線（Ｊ：約５Hz）５Ｈ、ベンゾイルの３−
および５−Ｈ：7.8 重復四重線6H、アミジオフ
エニルＨおよびベンゾイルの２−および６−Ｈ。 参考例 13 ３−（２−フリル）アクリル酸のｐ−アミジノ
フエニルエステル過塩素酸塩 ピリジン中でカツプリング反応をおこない、ろ
液は乾固付近まで蒸発し、残留物を希過塩素酸か
ら再結晶させた灰色の板状結晶。 融点、157℃ n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.35二重線
D2Oと交換可能、４Ｈ、アミジンＨ：7.7 四重線（Ｊ：約８Hz）４Ｈ、アミジノフエニル
Ｈ：7.9二重線、（Ｊ：約３Hz）１Ｈ、フリル５−
Ｈ：7.85および7.40 二重線（Ｊ：20Hz）１Ｈ、
２−アクリロイルＨ：7.10 二重線（Ｊ：約３
Hz）１Ｈ、フリル３−Ｈ：6.70 多重線１Ｈ、フ
リル４−Ｈ：6.44 二重線（Ｊ：15Hz）１Ｈ、ア
クリロイル３−Ｈ。 参考例 14 ｐ−メチル−トランス桂皮酸のｐ−アミジノフ
エニルエステル過塩素酸塩 ３−（２−フリル）アクリル酸エステルとして
単離 融点、155℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.15 二重線D2Oと交換可能４Ｈ、アミジンＨ：7.2〜
8.2多重線、9H、アミジノフエニルおよびフエニ
ルＨ：6.82 二重線（Ｊ：16Hz）１Ｈ、アクリロ
イル２−Ｈ：6.44二重線（Ｊ：16Hz）1H、アク
リロイルＨ：2.42 二重線（Ｊ：２Hz）３Ｈ、メ
チルＨ。 参考例 15 ｏ−アニス酸のｐ−アミジノフエニルエステル
塩酸塩 イソプロパノールから再結晶させた製品の融点
149℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.50 広い幅のシングレツト４ＨD2Oと交換可能、アミ
ジンＨ：7.50および7.95不規則な多重線５Ｈ、ア
ミジノフエノールＨおよび２−Ｈ：7.0〜7.5 多重線３Ｈ、ベンゾイルの３−Ｈ、４−Ｈおよ
び５−Ｈ：3.86 シングレツト３Ｈ、メトキシ
Ｈ。 参考例 16 ３，４−ジメチル安息香酸のｐ−アミジノフエ
ニルエステル塩酸塩 イソプロパノールおよび食塩水から再結晶させ
た製品の融点、107℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.56 広い幅のシングレツト、４ＨD2Oと交換可能、ア
ミジンＨ：7.50〜7.95 不規則な三重線７Ｈ、ア
ミジノフエニルおよびベンゾイルのＨ：2.30シン
グレツト、６Ｈ、メチルＨ。 参考例 17 ３−メチル−４−メトキシ安息香酸のｐ−アミ
ジノフエニルエステル塩酸塩 イソプロパノールと2NHClの容積比10：１の
混液から再結晶させた製品の融点、210℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：9.54 二重線４ＨD2Oと交換可能、アミジンＨ：8.07 不規則な二重線４Ｈ、２−Ｈ＋ベンゾイル６−
Ｈ、アミジノフエニル2Hおよび６−Ｈ：7.60
二重線（Ｊ：９Hz）アミジノフエニル２Ｈ、3H
および5H：7.22 二重線（Ｊ：９Hz）1H、ベン
ゾイル5H：3.92 シングレツト３Ｈ、メトキシ
Ｈ：2.26 シングレツト３Ｈ、メトキシＨ。 参考例 18 ４−アセタミド安息香酸のｐ−アミジノフエニ
ルエステル塩酸塩 イソプロパノールと水との容積比１：２から再
結晶させた製品の融点、257℃、 n.m.r.δ（ジメチルスルホキシドd6）：10.62 シングレツト１ＨD2Oと交換可能、アミジン
Ｈ：7.90 AA′BB′四重線４Ｈ、：7.50〜7.9 重復
AA′BB′四重線４Ｈ、ベンゾイルおよびアミジノ
フエニルＨ：2.09 シングレツト３Ｈ、アセチル
Ｈ。 実施例 １ ｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／ヒトプラ
スミノーゲン活性化因子複合体の溶液の製造 0.9％ｗ／ｖ食塩水溶液10.5ml中のストレプト
キナーゼ（５×104単位、スエーデン、ストツク
ホルム、A.B.Kabi製）を容款−ヒトプラスミノ
ーゲン（0.025ml4.9ナノモル）と混合した。混合
物を25℃で40分間培養してから、PH7.4の0.1Mの
トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、
0.9％ｗ／ｖの食塩および20％ｖ／ｖのグリセロ
ールを含む液2.0mlで希釈した。この溶液を、貯
蔵溶液としてジメチルスルホキシド中0.1Mとし
て調製したp′−アニス酸ｐ−アミドフエニルが最
終的に0.1ｍＭになるように25℃で５分間隔で３
回処理した。アシル化した酵素をＬ−リシンセフ
アローズ4B（2.5ml）の33％湿潤重量／容積の懸
濁液で０℃で10分間処理した。懸濁液を吸引ろ過
し、次いで前述のトリスヒドロキシメチルアミノ
メタン塩酸塩／グリセロール／食塩水緩衝液100
mlで４℃で洗つた。ゲルを、さらに0.1Mのアミ
ノカプタン酸を含有する前述のトリスヒドロキシ
メチルアミノメタン塩酸塩／グリセロール／食塩
水緩衝液（５ml）に再懸濁した。０℃に保ち、10
分後にゲルの懸濁液を1000ｇで２分間遠心分離す
ることによつて清澄させた。上澄液（４ml）を前
述のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸
塩／グリセロール／食塩水緩衝液（2.0）に対
して透析した。生成したアシル化活性化因子複合
体の溶液は擬似一次反応速度恒数2.7×10-4／秒
で37℃で遊離酵素に再生することができた。 実施例 ２ ３−メチルｐ−アニソイルストレプトキナー
ゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体溶
液の製造 この物質はアシル化を３−メチルｐ−アニス酸
ｐ−アミジノフエニルエステルの最終濃度が0.2
ｍＭとなるように２回にわたつて25℃で15分間隔
で実施し、続いて０℃で１時間処理したこと以外
は実施例１の記載の方法と同様に製造された。擬
似一次脱アシル化反応速度恒数は１×10-4／秒で
あつた。 実施例 ３ 凍結乾燥ｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／
ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体 0.9％ｗ／ｖの食塩水（0.9ml）中のストレプト
レプトキナーゼ（９×104単位）を溶解−ヒトプ
ラスミノーゲン（0.075ml、14.9ナノモル）と混
合した。混合物を25℃で30分間培養してからPH
7.4（4.0ml）の0.1Mトリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン塩酸塩緩衝液で希釈した。この溶液をジ
メチルスルホキシド中の10ｍＭの貯蔵溶液として
調製したｐ−アニス酸ｐ−アミジノフエニルで25
℃で５分間隔で３回にわけて処理し、最終濃度を
0.1ｍＭとした。アシル化酵素をＬ−リシンセフ
アローズ4B（5.0ml）の湿潤重量33％ｗ／ｖの懸
濁液と０℃で10分間混合し、懸濁液を吸引ろ過
し、４℃で前述のトリスヒドロキシメチルアミノ
メタン塩酸塩緩衝液（200ml）で洗つた。ゲルを
0.1Mのアミノカプロン酸を含むPH7.5（5.0ml）の
50ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩
酸塩緩衝液に再懸濁し、次にろ過し、同じ緩衝液
５mlで３回洗浄した。溶出液を合せ、PH7.4の5.0
ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸
塩緩衝液中の５％ｗ／ｖマニトール２に対して
４℃で２時間透析してから凍結乾燥して白色粉末
0.560ｇを得た。この物質は原料酵素活性の５％
以下の活性をもち、水性媒中37℃で再生すること
ができた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ フイブリン溶解活性に必須な触媒部位が、PH
7.4の等張性水性媒中37℃での擬似一次加水分解
速度恒数が10-6／秒〜10-3／秒であるような速度
で加水分解によつて除去できるアシル基によつて
ブロツクされているストレプトキナーゼ／ヒトプ
ラスミノーゲン活性化因子複合体（ただしｐ−グ
アニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／ヒトプ
ラスミノーゲン活性化因子複合体は除く）の酵素
誘導体。 ２ アシル基がベンゾイル基、またはハロゲン、
C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C6ア
ルカノイルオキシまたはC1〜C6アルカノイルア
ミノ基で置換されたベンゾイル基である特許請求
の範囲第１項記載の誘導体。 ３ アシル基がアクリロイル基またはC1〜C6ア
ルキル、フリル、フエニルまたはC1〜C6アルキ
ルフエニルで置換されたアクリロイル基である特
許請求の範囲第１項記載の誘導体。 ４ 酵素誘導体はｐ−アニソイルストレプトキナ
ーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体で
ある特許請求の範囲第１項記載の誘導体。 ５ ストレプトキナーゼ／ヒトプラスミノーゲン
活性化因子複合体を式 EF で示される化合物（式中Ｅはｐ−アミジノフエノ
キシまたはｐ−アセトアミジノフエノキシ基であ
るかまたはメタ−もしくはパラ−位で正に帯電し
た部分を含有する構造的に類似する置換フエノキ
シ基であり、Ｆはアシル基である）と反応させる
ことよりなる、フイブリン溶解活性に必須な触媒
部位が、PH7.4の等張性水性媒中37℃での擬似一
次加水分解速度恒数が10-6／秒〜10-3／秒である
ような速度で加水分解によつて除去できるアシル
基によつてブロツクされているストレプトキナー
ゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体（た
だしｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナー
ゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体は除
く）の酵素誘導体を製造する方法。
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