DK160996B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et derivat af et in-vivo-fibrinolytisk enzym - Google Patents
Analogifremgangsmaade til fremstilling af et derivat af et in-vivo-fibrinolytisk enzym Download PDFInfo
- Publication number
- DK160996B DK160996B DK373479A DK373479A DK160996B DK 160996 B DK160996 B DK 160996B DK 373479 A DK373479 A DK 373479A DK 373479 A DK373479 A DK 373479A DK 160996 B DK160996 B DK 160996B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- group
- enzyme
- process according
- plasmin
- human
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 title description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 70
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 70
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 70
- -1 3-Methyl-4-methoxybenzoyl Chemical group 0.000 claims description 68
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 claims description 47
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 19
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 claims description 17
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 claims description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 14
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 14
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 claims description 13
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 13
- 125000003647 acryloyl group Chemical group O=C([*])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 11
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims description 10
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims description 9
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 9
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 claims description 6
- 108010056373 SK potentiator Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 6
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 6
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 6
- 101710196208 Fibrinolytic enzyme Proteins 0.000 claims description 5
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 claims description 5
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 125000005440 p-toluyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- CFOQGBUQTOGYKI-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) 4-(diaminomethylideneamino)benzoate Chemical group C1=CC(N=C(N)N)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 CFOQGBUQTOGYKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000005236 alkanoylamino group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 38
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 19
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 8
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 7
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 7
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 7
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 6
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 5
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- JWKAIXSLWGLVPE-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl) 4-methoxybenzoate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 JWKAIXSLWGLVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZEYHEAKUIGZSGI-UHFFFAOYSA-N 4-methoxybenzoic acid Chemical compound COC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ZEYHEAKUIGZSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- YYXYBWIDIWTCGS-UHFFFAOYSA-N chembl363685 Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(O)C=C1 YYXYBWIDIWTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanetriol;hydrochloride Chemical compound Cl.CNC(O)(O)O DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- ZCJLOOJRNPHKAV-ONEGZZNKSA-N (e)-3-(furan-2-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=CO1 ZCJLOOJRNPHKAV-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- YYPNJNDODFVZLE-UHFFFAOYSA-N 3-methylbut-2-enoic acid Chemical compound CC(C)=CC(O)=O YYPNJNDODFVZLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCXJEYYXVJIFCE-UHFFFAOYSA-N 4-acetamidobenzoic acid Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 QCXJEYYXVJIFCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLCKPRDGURCHGO-UHFFFAOYSA-N 4-carbamimidoyl-4-methoxy-2-phenylcyclohexa-1,5-diene-1-carboxylic acid Chemical compound COC1(CC(=C(C=C1)C(=O)O)C2=CC=CC=C2)C(=N)N GLCKPRDGURCHGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHSGDXCJYVZFTP-UHFFFAOYSA-N 4-ethoxybenzoic acid Chemical compound CCOC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 SHSGDXCJYVZFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 2
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003111 iliac vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 2
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- SYMNKMKOTLVJCE-IZZDOVSWSA-N (4-carbamimidoylphenyl) (e)-3-phenylprop-2-enoate Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 SYMNKMKOTLVJCE-IZZDOVSWSA-N 0.000 description 1
- ICWQQIIQYKWDKV-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl) 2,4-dimethoxybenzoate Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 ICWQQIIQYKWDKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTQMVLTVPSDZRE-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl) 2,4-dimethoxybenzoate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC1=CC(OC)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 MTQMVLTVPSDZRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZNNKYBXUDEHFK-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl) 4-methoxy-3-methylbenzoate hydrochloride Chemical compound Cl.C1=C(C)C(OC)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 VZNNKYBXUDEHFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXWXBLXPGAZOHE-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl) benzoate Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OC(=O)C1=CC=CC=C1 FXWXBLXPGAZOHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYKYOOPFBCOXSL-UHFFFAOYSA-N (4-hydroxyphenyl)acetonitrile Chemical compound OC1=CC=C(CC#N)C=C1 AYKYOOPFBCOXSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGUODWZIYDEQLG-UHFFFAOYSA-N 1-(4-carbamimidoylphenyl)naphthalene-2-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C=CC(=C2C3=CC=C(C=C3)C(=N)N)C(=O)O RGUODWZIYDEQLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKKRIUJCMCVYNM-UHFFFAOYSA-N 2-(4-carbamimidoylphenyl)-3-methylbut-2-enoic acid Chemical compound CC(=C(C1=CC=C(C=C1)C(=N)N)C(=O)O)C OKKRIUJCMCVYNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRUMPPXKBSWXMN-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydroxyphenyl)ethanimidamide;hydrochloride Chemical compound Cl.NC(=N)CC1=CC=C(O)C=C1 SRUMPPXKBSWXMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKIIKRJAQOSWFT-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[1-(2,2-difluoroethyl)piperidin-4-yl]oxy-4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound FC(CN1CCC(CC1)OC1=NN(C=C1C=1C=NC(=NC=1)NC1CC2=CC=CC=C2C1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)F SKIIKRJAQOSWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFCWURBGTORKKO-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxychromen-2-one Chemical compound C1=CC=CC2=C1OC(=O)C(O)=C2O ZFCWURBGTORKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMVGOFGFPUYULF-UHFFFAOYSA-N 3-(4-carbamimidoylphenyl)-2-phenylprop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C(=CC2=CC=C(C=C2)C(=N)N)C(=O)O PMVGOFGFPUYULF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003682 3-furyl group Chemical group O1C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- RURHILYUWQEGOS-VOTSOKGWSA-N 4-Methylcinnamic acid Chemical compound CC1=CC=C(\C=C\C(O)=O)C=C1 RURHILYUWQEGOS-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- FUWREDLHIUFGIA-UHFFFAOYSA-N 4-acetamido-4-carbamimidoyl-2-phenylcyclohexa-1,5-diene-1-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)NC1(CC(=C(C=C1)C(=O)O)C2=CC=CC=C2)C(=N)N FUWREDLHIUFGIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RERGZUQQJQQETF-UHFFFAOYSA-N 4-carbamimidoyl-4-ethoxy-2-phenylcyclohexa-1,5-diene-1-carboxylic acid Chemical compound CCOC1(CC(=C(C=C1)C(=O)O)C2=CC=CC=C2)C(=N)N RERGZUQQJQQETF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HITZTFCPBZDCCV-UHFFFAOYSA-N 4-carbamimidoyl-4-methoxy-3-methyl-2-phenylcyclohexa-1,5-diene-1-carboxylic acid Chemical compound CC1C(=C(C=CC1(C(=N)N)OC)C(=O)O)C2=CC=CC=C2 HITZTFCPBZDCCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BBYDXOIZLAWGSL-UHFFFAOYSA-N 4-fluorobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 BBYDXOIZLAWGSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010073975 Brinolase Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BGAQTHKLBKJGLY-UHFFFAOYSA-N Cl.C1=C(C)C(C)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 Chemical compound Cl.C1=C(C)C(C)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 BGAQTHKLBKJGLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYRIEOBTQWPQRI-UHFFFAOYSA-N Cl.C1=CC(CCCC)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 Chemical compound Cl.C1=CC(CCCC)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 FYRIEOBTQWPQRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010022086 Injection site pain Diseases 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- ZYQDEQFTXCPPJR-UHFFFAOYSA-N NC(=N)C1=CC=C(C(O)=O)C(C=2C=CC=CC=2)=C1 Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(C(O)=O)C(C=2C=CC=CC=2)=C1 ZYQDEQFTXCPPJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001263 acyl chlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 229940071248 anisate Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229960002473 brinase Drugs 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004401 m-toluyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1[H])C([H])([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical group [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 125000001038 naphthoyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000005441 o-toluyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(C(*)=O)=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003261 o-tolyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229950009058 phenyl acetylsalicylate Drugs 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005514 radiochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002796 renal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
- C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
- C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D307/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DK 160996 B
Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte enzymderivater, der kan anvendes til behandling af venøs thrombose. Analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et derivat af et in vivo-fibrinolytisk enzym 5 med en katalytisk position, der er essentiel for fibrinolytisk aktivitet, såsom urokinase, streptokinase-plasminogen-aktivatorkom-pleks, vasculær aktivator og pattedyrsplasmin, og hvor den katalytiske position i enzymet er blokeret af en gruppe, som kan fjernes ved hydrolyse med en sådan hastighed, at pseudo-førsteordens-has-10 tighedskonstanten for hydrolysen ligger i området mellem 10'6 sekund"^ og 10sekund"^· i isotoniske vandige miljøer ved pH-værdi 7,4 ved 37°C, bortset fra p-guanidinobenzoyl-humant plasmin og p-guanidinobenzoyl-streptokinase-plasminogenaktivatorkompleks, er ejendommelig ved, at et in vivo-fibrinolytisk enzym omsættes med et 15 blokerende middel med formlen
AB
hvor A er en sådan gruppe, som er selektiv for den katalytiske position, som er essentiel for den fibrinolytiske aktivitet, og som er i stand til at blive overført fra gruppen B til den katalytiske posi-20 tion, og B er en gruppe, som letter tilknytningen af A til enzymet, eller med en forbindelse med formlen
EF
hvor E er en lokaliserende gruppe, som er selektiv for den katalytiske position, og F er en gruppe, som er i stand til at blive over-25 ført fra den lokaliserende gruppe til den aktive position.
De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede enzymderivater har bl.a. den uventede, nyttige virkning, at de har en væsentlig mere effektiv lytisk virkning end de tilsvarende frie (ikke-blokerede) enzymer.
30 Venøs thrombose er dannelsen af en fast masse eller prop af blodbe-standdele i en vene. Sådanne propper eller thromber kan løsne sig som en helhed eller i dele og kan flytte sig til et andet sted i det
DK 160996 B
2 vasculære system; når dette optræder, kaldes thromben eller fragmentet deraf en embolus. Som samlet begreb kaldes de tilstande, der ^ er knyttet til thromber og emboli, thromboemboliske sygdomme eller lidelser, og når de ses som en helhed, repræsenterer de en domine-5 rende årsag til alvorlig sygdom og død i den vestlige verden.
For tiden forekommer der to klasser af terapeutiske midler, der foreslås til behandling af venøs thromboseT nemlig, anti-koagulanter og thrombolytika. For tiden er antikoagulanter de almindeligst anvendte terapeutiske midler; det mest anvendte er heparin (almindelig-10 vis anset som mest effektivt) og dihydroxycumarin (warfarin). Den væsentligste ulempe ved anti-koagulationsmidler er, at de ikke har nogen direkte lytisk virkning på blodproppen og derfor kun er lidet værdifulde ved behandling af en akut thrombotisk tilstand. Da de desuden undertrykker koagulationssysternet, er en indbygget komplika-15 tion ved anvendelse af sådanne midler en ukontrollabel blødning, som er erkendt som en betydelig risiko.
Thrombolytiske midler, der hidtil er foreslået til anvendelse til behandling af venøs thrombose, falder i to klasser. For det første de proteolytiske enzymer, som er i stand til direkte at lysere fibrin.
20 For det andet er der enzymiske aktivatorer, som aktiverer det lytiske system i kroppen, hvorved der frigøres plasmin, som lyserer proppen. Eksempler på proteolytiske enzymer, der er blevet foreslået til anvendelse som thrombolytiske midler, omfatter brinase, papain, ochrase, trypsin og plasmin. Disse enzymer er imidlertid yderst 25 giftige, da intravenøs administration af disse kan føre til ukontrolleret proteolytisk nedbrydning in vivo. For eksempel nedbryder plasmin fibrinogen og andre propdannende faktorer og forårsager derved et blødningssyndrom. Desuden kan sådanne midler forårsage plasminogen-udmattelse, hvorved der fremkaldes en thrombotisk tilstand. Af disse 30 grunde anvendes enzymer af denne type sjældent som terapeutiske midler.
De to midler, der generelt anses for at være mest nyttige til throm-bolytisk terapi, er streptokinase og urokinase. De er aktivatorer og virker ved at omdanne plasminogen til plasmin. Streptokinase er et 35 sekretionsprodukt fra hæmolytiske streptococcer, og det kan frem- 3
DK 160996 B
stilles billigt i store mængder. Urokinase kan kun fås i meget små mængder og er yderst kostbart. Selv om begge midler er i stand til at opløse store propper, selv i dybe vener, er den voldsomme fibrinolytiske tilstand, de forårsager, tilbøjelig til at inducere blødning, 5 hvilket igen er en betydelig risiko. Derfor er anvendelsen deraf stærkt begrænset til patienter, som har en alvorlig thrombotisk blokade i en hovedvene, eller som har pulmonær emboli. Da aktivatorer stimulerer det naturlige lytiske system, kan den systemiske administration af disse midler desuden resultere i plasminogen-udmattelse 10 og derved give en patient større risiko for en thrombotisk lidelse, hvis behandlingen fortsættes. I nogen udstrækning kan denne virkning imødegås ved anvendelse af streptokinase-plasminogen-kombinationer.
Dette er ikke en adækvat løsning på problemet med terapeutisk fibri-nolyse, da systemisk dannelse af plasmin ved sådanne kombinationer 15 har tendens til at overskygge de propdannende/lytiske kontrolmekanismer. Desuden løser disse kombinationer ingen af problemerne med ukontrollerbar blødning.
Det har nu vist sig, at det er muligt at overvinde de fleste af de u-lemper, der er knyttet til kendte thrombolytiske midler, ved at gøre 20 brug af visse enzymer, der kan deaktiveres reversibelt. Det er erkendt, at nogle enzymer såsom plasmin eller streptokinase/plasmino-gen-aktivatorkompleks udviser nogen selektivitet for fibrin, især in vivo. Selv om alle de strukturelle krav og karakteristiske træk ved sådanne enzymer ikke er blevet klarlagt, er der blevet fundet en 25 test, ved hvilken der kan findes enzymer med specificitet for fibrin in vivo. Herefter benævnes enzymer, som er positive ved denne test, som "in vivo-fibrinolytiske enzymer".
Det har vist sig, at der kan fremstilles derivater af disse enzymer, i hvilke den katalytiske aktivitet er maskeret, medens affiniteten 30 for fibrin forbliver uændret, men som kan hydrolysere i vandigt miljø til frigørelse af det aktive enzym.
Den foreliggende opfindelse bygger på denne erkendelse og angår en analogifremgangsmåde som ovenfor beskrevet. Med de fremstillede enzymderivater kan der fremstilles farmaceutiske præparater.
DK 160996 B
4
Den til bestemmelse af den in vivo-fibrinolytiske aktivitet anvendte test udføres ved at danne en radioaktivt mærket blodprop i inferior vena cava i en forsøgskanin. Det middel, der skal afprøves, indføres i blodstrømmen på et punkt, hvor det skal passere gennem hjertet, for ^ 5 at sikre, at midlet blandes grundigt med det venøse blod. Ikke-speci-fikke lytiske enzymer angriber blodproteiner og medfører døden, før der observeres lyse af blodproppen. Enzymer, som kan have en grad af specificitet for fibrin, lyserer blodproppen ved en dosis, som er under den letale dosis. Lysens indtræden påvises ved frigørelse af 10 radioaktive fragmenter til blodstrømmen.
Ved udtrykket "in vivo-fibrinolytisk enzym" forstås i nærværende beskrivelse et enzym, som, når det administreres systemisk til en kanin med en radioaktivt mærket blodprop i inferior vena cava, i løbet af højst 5 timer forøger blodets radioaktivitetsniveau til 15 mindst det dobbelte af baggrundsniveauet i løbet af 6 timer fra begyndelsen af administrationen uden at forårsage dyrets død.
En specifik måde at udføre denne test på er følgende:
En hvid New Zealand-kanin (2,5 - 3,5 kg) anæstetiseres, og der føres tre kanyler ind i den forreste ansigtsvene (i nærværende beskrivelse 20 betegnet kanyle 1), den venstre carotide arterie (i nærværende beskrivelse betegnet kanyle 2) og den venstre ydre iliacvene (i nærværende beskrivelse betegnet kanyle 3). Der udføres derefter laparotomi på kaninen for at blotlægge inferior vena cava nær dennes forbindelse med den venstre renale vene. En sektion af inferior vena cava isole-25 res ved at lukke en ligatur nær dette punkt og placere en klemme på inferior vena cava på et punkt, der ligger nærmere dets forbindelse med den venstre ydre iliacvene. En radioaktivt mærket prop induceres ved at injicere 50 eliter af en blanding fremstillet af radiioderet humant fibrinogen (100 /iliter) og kanin-thromboplastin (150 eliter) i 30 den isolerede del af venen. Mængden 50 pliter er bestemt arbitrært og repræsenterer en mængde mellem den minimale mængde, der kan måles nøjagtigt, og den maksimale mængde, der kan injiceres uden for megen forstyrrelse af de fysiologiske betingelser i den isolerede venedel.
Det er essentielt for målingen af eventuel radioaktivitet, der frigø-35 res i blodstrømmen, at den i venen injicerede mængde radioaktivitet 5
DK 160996 B
ikke er under 0,25 pC^, og en mængde i området mellem 0,25 og 1,0 pC^ er generelt passende. En tampon placeres over injektionsnålen på det sted, hvor den går ind i den ydre væg af inferior vena cava, medens injektionen udføres, for at absorbere eventuelt spild fra injektions-5 stedet og eventuelt ikke-propbundet radioaktivitet. Yderligere 50 pliter eller en blindprøve af fibrinogen-thromboplastin-blandingen føres ind i et tælleglas, og dets γ-strålingsniveau bestemmes, enten ved væske-scintillationstælling eller ved direkte γ-tælling under anvendelse af natriumiodid-krystalteknik. Blindprøven giver et mål 10 for den radioaktivitet, der er injiceret i dyret. Den første tampon holdes på plads længe nok til at opsamle alt det i starten gennem-sivede (5 minutter er almindeligvis tilstrækkeligt) og erstattes med en anden tampon. Den første tampon overføres til et tælleglas, og 7-strålingsniveauet måles. Kanylen 3 føres helt ind til den ovennævnte 15 klemme, og 10 minutter efter injektion af fibrinogen-thromboplastin-blandingen administreres heparinopløsning (0,5 ml 500 p/ml) via kanyle 3. Formålet med heparininjektionen er at begrænse blodprop-dannelsens udstrækning for at forhindre inkorporering af signifikante mængder ikke-mærket endogent kanin-fibrin i forsøgsproppen. Grunden 20 er, at hvis der blev inkorporeret signifikante mængder ikke-mærket materiale i proppen, så kunne lyse foregå udetekteret, da ikke-mær-kede lyseprodukter ville blive frigjort i blodstrømmen. Denne fejl ville være signifikant, hvis f.eks. den radioaktivt mærkede prop blev indkapslet i ikke-mærket materiale. Ligaturen åbnes delvis, så at 25 inferior vena cava er sammenklemt til mellem 40 og 60% af sin normale diameter. Sammenklemningen er nødvendig for at forhindre, at proppen flytter sig. Klemmen fjernes. Der administreres en heparinopløsning (1,0 ml, 500 μ/ml) via kanyle 2 for at antikoagulere dyret og forhindre dannelse af flere propper end den, der er nødvendig til for-30 søget. Det undersøges, om der er persisterende blødning, og såfremt der er, standses den ved anvendelse af en thrombin-imprægneret tampon. Der tages en 1,8 ml's blodprøve via kanyle 2 15 minutter efter injektionen af det radioaktive materiale, og den antikoaguleres ved tilsætning af trinatriumcitratpuffer (0,2 ml 3,8 vægt/volumenpro-35 cent). Den fortyndede blodprøve (Pq) undersøges for 7-stråling ved væske-scintillationstælling eller ved direkte 7-tælling under anvendelse af en natriumiodid-krystalmetode. Dette giver et mål for radioaktiviteten i blodstrømmen. Proppen vaskes derefter ved infusion af
DK 160996 B
6 saltvand (4,0 ml, 0,2 ml/minut) via kanyle 3 for at udvaske eventuelt exogent radioaktivt materiale i cirkulationen og medvirke til at forhindre blodpropudvidelse ved bortvask af eventuelle thrombogene stoffer. En anden blodprøve (P^q) udtages i citratpuffer som ovenfor 5 nævnt og tælles som ovenfor beskrevet 10 minutter efter Pq . Denne tælling udføres for at kontrollere, at der ikke er vasket yderligere radioaktivitet ud i blodstrømmen, og derved give en indikation af blodproppens stabilitet.
20 minutter efter Pq standses saltvandsinfusionen, og der udtages en 10 yderligere blodprøve (tid t=0), og infusionen af testenzymet startes. Mængden af stråling fra t=0-blodprøven er et mål for baggrundsstrålingen.
En enzymdosis administreres ved systemisk infusion, og der udtages 2 ml's blodprøver hvert 30. minut i 6 timer efter infusionens start.
15 Hver prøve undersøges for radioaktivitet ved direkte 7-tælling under anvendelse af en natriumiodid-krystalmetode eller ved væskescintil-lationstælling, og den frie plasminaktivitet måles ex vivo.
Den dosis, der skal administreres til forsøgsdyret for at opnå et positivt resultat, bestemmes ved "trial and error", indtil der er 20 fundet en aktivitet, som ikke forårsager døden. Som ledetråd for den dosis, der skal anvendes, giver en dosis af humant plasmin i området mellem 1 x 10”^ og 5 x 10mol aktive katalytiske positioner/kg forsøgsdyr et positivt resultat i testen; på lignende måde er en dosis streptokinase/plasminogen-aktivatorkompleks positiv i området -10 « 25 mellem 1 x 10 og 1 x 10 0 mol/kg. Den proteolytiske aktive positionskoncentration bestemmes således, hvis den ikke kendes, enten ved chromogen eller fluorogen titrering eller ved bestemmelse af molekylvægten og den specifikke aktivitet i en analyseren prøve af enzymet.
En dosis udvælges arbitrært i lighed med de ovenfor angivne områder.
30 20% af den valgte dosis administreres ved forsøgets start, og den resterende del administreres i løbet af 2 timer. Hvis der ikke iagttages nogen aktivitet, gentages forsøget med stigende doser, indtil der iagttages aktivitet, eller indtil toxiciteten begrænser forsøget. Infusionsperioden kan forlænges op til 5 timer.
7
DK 160996 B
Eksempler på enzymer, som har in vivo-fibrinolytisk aktivitet som her defineret, er urokinase; streptokinase-plasminogenaktivatorkompleks; vasculær aktivator, især human vasculær aktivator, og plasminer, især pattedyrsplasminer, f.eks. ovint, porcint, bovint og equint plasmin, 5 abeplasmin og humant plasmin.
Foretrukne enzymer til anvendelse ifølge opfindelsen er humant plasmin og streptokinase/humant plasminogenaktivatorkompleks. Det har vist sig, at det er særlig fordelagtigt at danne et blokeret derivat, især et acylderivat, af en blanding af humant plasmin og streptokina-10 se/humant plasminogen-aktivatorkompleks. Denne blanding fremstilles bekvemt ved at aktivere humant plasminogen ved hjælp af streptokinase på sædvanlig måde og ikke fjerne alt aktivatorkomplekset.
Det har vist sig, at de blokerede enzymer, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, har følgende fordele frem for de 15 tilsvarende frie enzymer: a) de er mere effektive end det frie enzym; b) de har længere varende biologisk aktivitet; og c) de kan administreres som en enkelt, ofte stor, intravenøs dosis på grund af deres relativt lave toxicitet, hvorimod enzymer, aktivatorer 20 eller aktivatorkomplekser i den sædvanlige terapi må indgives ved kontinuerlig intravenøs infusion i perioder på flere timer eller dage.
Enzymer såsom plasminer kan fremstilles på kendt måde som beskrevet f.eks. i B.A.K. Chibber et al., Methods in Enzymol., Vol. 34 p.
25 424-432; K.C. Robbins og K. Summaria, Methods in Enzymol., Vol. 45 p.
257-273. Alternativt kan plasminogen isoleres ved metoder, som er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.013.507, 1.066.467, 1.078.141 og 1.096.953, og derefter omdannes til plasmin ved standardmetoder.
Human vasculær aktivator kan isoleres efter den af D.S. Pepper et 30 al., Progress in Chem. Fibrinolysis and Thrombolysis, 1978, 3.,
DK 160996 B
8 91-98, Raven Press New York, beskrevne metode. Streptokinase-plas-minogenaktivatorkompleks er beskrevet af D.K. McClintock og P.H.
Bell, Bio chem. Biophys Res. Comm. 43, 694-702, 1971. Urokinase kan isoleres fra human urin som beskrevet af T. Macaig et al., Methods in ^ 5 Enzymol. Vol. 34 p. 451-459, og G.H. Barlow, Methods in Enzymol. Vol.
45 p. 239-245 Academic Press.
Det vigtigste træk ved den blokerende gruppe på den katalytiske position er, at den skal kunne fjernes ved hydrolyse ved en hastighed, hvor pseudo-førsteordens-hastighedskonstanten for hydrolyse ikke 10 er under 10sekund-^ og ikke over 10-3 sekund-^-. Hastighedskonstanten bør fortrinsvis ligge i området mellem 10"5 og 10'3 sekund-*-.
Derivater med en pseudo-førsteordens-hastighedskonstant på mere end O 4 10sekund-·1- frigør uacceptabelt høje fri enzymniveauer, før de hæfter til fibrin. Derivater med en pseudo-førsteordens-hastigheds-15 konstant på mindre end 10 sekund"^ frigør enzym for langsomt til at have nogen klinisk anvendelighed.
De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede enzymderivater kan anvendes enten profylaktisk eller terapeutisk. Til profylakse-formår fortrækkes et derivat med en langsom hydrolysehastighed og 20 derfor lang halveringstid. Sådanne derivater, der er egnet til dette formål, har en pseudo-førsteordens-hastighedskonstant for hydrolyse i området mellem 5 x 10-3 og 10'3 sekund-^ og halveringstid på 3,5 - 16 timer. Til terapeutiske formål foretrækkes et hurtigere hydrolyserende derivat, dvs. et derivat, som har en pseudo-førsteordens-has-25 tighedskonstant for hydrolyse i området mellem 5 x 10-^ og 7 x 10-3 sekund-1, hvilket svarer til en omtrentlig halveringstid på mellem 1/2 og 2 timer.
Pseudo-førsteordens-hastighedskonstanten bestemmes ved at hydrolysere enzymderivatet under fysiologiske betingelser, dvs. i isotonisk 30 vandigt miljø ved pH-værdi 7,4 og 37°C. Med regelmæssige intervaller udtages prøver, som inkuberes med et chromogent eller fluorogent proteasesubstrat såsom S -2251 (H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid-2HCl), og substratets omdannelseshastighed måles.
DK 160996 B
9
Hydrolysen følges, indtil det tidspunkt, hvor omdannelseshastigheden i substratet når en maksimalværdi. Hastighedskonstanten k beregnes
At derefter ved at afbilde log« (1- /A ) som en funktion af t, hvor °e max A^ax er den maksimale hastighed, med hvilken en prøve omdanner sub-5 stratet, og At er den hastighed, med hvilken en prøve omdanner substratet til tidspunktet t.
Den præcise identitet af den blokerende gruppe, der anvendes i derivaterne fremstillet ifølge opfindelsen, afhænger i en vis udstrækning af naturen af det valgte enzym og den anvendelse, der skal gøres af 10 derivatet.
I tilfælde af f.eks. plasmin og streptokinase/plasminogen-aktivator omfatter den katalytiske position, der er essentiel for proteolytisk aktivitet, en serinrest med en fri hydroxygruppe. Positionen blokeres bekvemt af acylgrupper såsom benzoyl, substitueret benzoyl, acryloyl 15 eller substitueret acryloyl. Pseudo-førsteordens-hastighedskonstan-ten for hydrolyse af et givet substitueret benzoyl-enzymderivat kan bestemmes på basis af Hammett-a-værdien for en hvilken som helst substituent, når først pseudo-førsteordens-hastighedskonstanten for to eller flere substituerede benzoylderivater er blevet bestemt under 20 forudsætning af, at der ikke er nogen særlig vekselvirkning mellem en given substituent og enzymet.
Det er almindelig anerkendt, at Hammet-værdierne for meta- og para-substituenterne (am og σρ) giver en acceptabel forudsigelse af hydrolysehastighederne. Desuden kan crm- og ap-værdierne adderes med 25 rimelig nøjagtighed til beregning af de genetiske egenskaber ved andre substituerede benzoylgrupper, der bærer mere end én substituent. Hammett-værdierne for ortho-substituenter (σ0) kan ikke adderes med samme pålidelighed som am og σρ-værdierne på grund af steriske virkninger. Når ortho-substituentens værdi imidlertid er lille og 30 derfor medfører en negligibel sterisk virkning, dvs. i tilfælde af fluor, methyl og methoxy, kan a0-værdierne inden for generelt accepterede fejlgrænser anvendes alene eller lagt sammen med am- og/-eller σρ-værdierne til beregning af reaktionshastigheder.
DK 160996 B
10
Under disse begrænsninger kan en substitueret benzoylgruppe, i hvilken phenylringen bærer én eller flere substituenter, især meta-og/eller para-substituenter, hvor summen af Hammett-σ-værdierne ligger i området mellem 0,1 og -1,1, anvendes ifølge opfindelsen til ^"^5 5 at blokere humant plasmin. En substitueret benzoylgruppe, i hvilken phenylringen bærer én eller flere substituenter, især meta- og/eller para-substituenter, således, at siammen af Hammett-σ-værdierne ligger i området mellem -0,9 og +0,3, kan anvendes ifølge opfindelsen til at blokere den katalytiske position i porcint plasmin.
10 Egnede benzoyl- og substituerede benzoylgrupper omfatter benzoyl, der eventuelt er substitueret med halogen, g-alkyl, g-alkoxy, g- alkanoyloxy og g-alkanoylamino (RCONH-). Eksempler herpå er benzoyl, p-fluorbenzoyl, o-, m- eller p-toluoyl, o-, m- eller p-methoxy-benzoyl (dvs. anisoyl), o-, m- eller p-ethoxybenzoyl, 2,4-dimethoxy-15 benzoyl, 3,4-dimethylbenzoyl, 4-butylbenzoyl, 3-methyl-4-methoxyben-zoyl, o-acetoxybenzoyl (dvs. acetylsalicyloyl) og p-acetamidobenzoyl.
En yderligere aromatisk gruppe er naphthoyl.
En undtagelse fra denne generelle regel indtræder, når benzoylgruppen indeholder en basisk del såsom amino, dimethylamino og guanidino.
20 Hydrolysehastigheden for sådanne derivater er op til 10 gange langsommere end den beregnede værdi.
Eksempler på sådanne derivater er p-guanidinobenzoyl-humant plasmin og -porcint plasmin.
Andre serier af acylgrupper, der kan anvendes til at blokere humane 25 og porcine plasminer ifølge opfindelsen, er acryloyl og substitueret acryloyl, især cinnamoyl og substituerede cinnamoylgrupper, som indeholder én eller flere substituenter, især meta- og/eller parasub-stituenter, i hvilke stammen af Hammett-σ-værdierne ligger i området mellem -1,0 og +0,15, med de ovenfor anførte begrænsninger.
30 Egnede substituerede acryloylgrupper er g-alkylacryloyl, furyl-acryloyl, cinnamoyl og g-alkylcinnamoyl. Specifikke eksempler er 3,3-dimethylacryloyl, 3-(2-furyl)acryloyl, cinnamoyl og p-methylcin-namoyl.
11
DK 160996 B
Typiske præparater til intravenøs administration er opløsninger af de sterile derivater i sterile isotoniske vandige puffere. Om nødvendigt kan præparatet også omfatte et solubiliserende middel for at holde derivatet i opløsning og et lokalanæstetikum såsom lignocain for at 5 lindre smerte på injektionsstedet. Generelt anvendes enzymderivatet i enhedsdosisform, f.eks. som et tørt pulver eller vandfrit koncentrat, i en hermetisk lukket beholder, f.eks. en ampul eller pakning, som angiver mængden af enzym i aktivitetsenheder, samt en angivelse af den tid, inden for hvilken det frie enzym frigøres. Når derivaterne 10 skal administreres ved infusion, dispenseres de i en infusionsflaske indeholdende sterilt vand til injektionsbrug. Når derivatet skal administreres ved injektion, dispenseres derivatet i en ampul med sterilt vand til injektionsbrug. Det injicerbare eller infunderbare præparat fremstilles ved at blande bestanddelene før administra-15 tionen.
Mængden af det stof, der administreres, afhænger af den nødvendige grad af fibrinolyse og den hastighed, med hvilken den er nødvendig, den thromboemboliske tilstands alvor og blodproppens størrelse og position. F.eks. vil en patient med en pulmonær emboli eller en stor 20 livstruende stigende ileo-femoral thrombe behøve administration af en bolus af hurtigt virkende materiale. Når det på den anden side ønskes at forhindre dannelse af post-operative thromber, kræves der en lille mængde af et langsomt virkende stof. Den nøjagtige anvendte dosis og administrationsform skal bestemmes efter lidelsens art og omstændig-25 hederne af den læge, der overvåger behandlingen. En patient, der behandles for en thrombe af middelstørrelse, vil imidlertid almindeligvis få en daglig dosis på mellem 1 og 20 mg/kg legemsvægt, enten ved injektion i op til 8 doser eller ved infusion.
Der kendes et antal enzymderivater, der kan anvendes analogt med de 30 ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede enzymderivater. De er anført nedenfor sammen med en litteraturreference omhandlende deres fremstilling: 1. p-Guanidinobenzoyl-humant plasmin, T. Chase og E. Shaw, Biochem., 8, No. 5, 2212-2224, 1969.
DK 160996 B
12 2. p-Guanidinobenzoyl-streptokinase-plasminogenaktivatorkompleks, D.K. McClintock og P.H. Bell, Biochem. Biophys. Res. Comm. 43, 694-702, 1971.
Disse to derivater er hidtil blevet dannet ved aktivitets-positions-5 titreringer af de ovenfor anførte enzymer. Isoleringen og karakteriseringen af disse derivater har aldrig været omtalt. Det har desuden aldrig tidligere været erkendt, at disse enzymderivater er nyttige som fibrinolytiske midler.
De omhandlede enzymderivater kan fremstilles på to måder, nemlig ved 10 direkte eller omvendt blokering.
Den direkte blokeringsmetode består i omsætning af enzymet med et middel med formlen
AB
hvor A er en gruppe, som er selektiv for den katalytiske position, 15 der er essentiel for den fibrinolytiske aktivitet, og som er i stand til at blive overført fra gruppen B til den katalytiske position, og B er en fraspaltelig enhed, som letter fæstnelsen mellem enzymet og A; hvorefter det således dannede enzymderivat eventuelt isoleres.
Midler, der virker på denne måde, er kendte. Et eksempel er p-ni-20 trophenyl-p'-guanidinobenzoat. Guanidinobenzoyldelen bliver selektivt anbragt i nabostilling til den katalytiske position, og dens tilknytning lettes af p-nitrophenyl-frasplatningsgruppen.
Den omvendte blokeringsmetode består i anvendelse af et middel
EF
25 hvor E er en lokaliserende gruppe, som lokaliserer midlet i den katalytiske position, og F er en gruppe, som er i stand til at blive overført fra den lokaliserende gruppe til den katalytiske position, hvorefter det således dannede derivat eventuelt isoleres.
13
DK 160996 B
Eksempler på gruppen E, når det enzym, der skal blokeres, er plasmin eller streptokinase/plasmin-aktivator, omfatter p-amidinophenyl og p· acetamidinophenyl eller strukturelt lignende substituerede phenyl-grupper indeholdende en positivt ladet del i meta- eller para-stil-5 ling. Eksempler på omvendte blokeringsmidler er: p-amidinophenyl-p'-fluorbenzoat, p-amidinophenyl-p'-toluat, p-amidinophenyl-p'-anisat, p-amidinopheny1-benzoat, p-amidinopheny1-c innamat, p-amidinopheny1-p'-methylcinnamat, p-amidinophenyl-3-(2-furyl)acrylat, p-amidinophenyl - 2 - naphthoat, p-amidinophenyl-3,3-dimethylacrylat, p-amidinophenyl-10 4-butyl-benzoat, p-amidinophenyl-2,4-dimethoxybenzoat, p-amidino phenyl -acetylsalicylat, p-amidinophenyl-4-ethoxybenzoat, p-acetamidinophenyl -p' -anisat, p-amidinophenyl-o-toluat, p-amidinophenyl-o-anisat, p-amidinophenyl-3,4-dimethylbenzoat, p- amidinophenyl-3-me-thyl-4-methoxy-benzoat og p-amidinophenyl-4-acetamidobenzoat.
15 De direkte og omvendte blokeringsreaktioner udføres i vandigt miljø i et pH-område, som ikke ødelægger enzymet, blokeringsmidlet eller produktet, f.eks. mellem pH-værdi 4 og 8, fortrinsvis ved en pH-værdi i området mellem 5,0 og 7,5.
Reaktionen udføres almindeligvis under anvendelse af equimolære 20 mængder af enzym og blokeringmiddel, men der kan anvendes overskud af blokeringsmiddel. Det foretrækkes også at udføre reaktionen i fortyndet opløsning, dvs. mindre end 10"^ molær med hensyn til enzym og
O
mindre end 10~Δ molær med hensyn til blokeringsmiddel. Reaktionen udføres almindeligvis ikke i en opløsning, hvor koncentrationen af 25 enzym eller blokeringsmiddel er mindre end 10molær.
Blokeringsreaktionen bør udføres ved moderat temperatur, dvs. stuetemperatur eller derunder, navnlig under 10°C, men over reaktionsmediets frysepunkt.
Den tid, i hvilken reaktionen lades løbe, afhænger af det anvendte 30 blokeringsmiddel, den temperatur, ved hvilken reaktionen udføres, og det enzym, der er udvalgt til blokering. Den optimale tidsperiode for de forskellige omstændigheder, kan udvælges ved at følge nedgangen i
DK 160996 B
14 enzymaktivitet ved at inkubere prøver med et chromogent eller fluoro-gent substrat.
Efter endt reaktion renses derivatet ved standardmetoder, f.eks. dialyse, affinitetschromatografi eller ultrafiltrering, hvorefter de 5 isoleres ved standardmetoder såsom frysetørring fra vandigt miljø. Om nødvendigt kan materialet tildannes til intravenøs administration til mennesker, f.eks. ved sterilisering.
De omvendte blokeringsmidler
EF
10 hvor E er p-amidinophenoxy, og F er en acylgruppe, kan fremstilles ved at acylere p-hydroxybenzamidin eller et salt deraf med et acy-lerende derivat med formlen
FX
hvor F har den ovenfor anførte betydning, og X er hydroxy eller et 15 aktiveret acylerende derivat deraf, eventuelt i nærværelse af en katalysator.
Eksempler på aktiverede acylerende derivater omfatter acylchlorid og -bromid. Disse derivater kan fremstilles ved standardmetoder.
Egnede katalysatorer til denne fremgangsmåde omfatter tertiære or-20 ganiske aminer såsom pyridin og koblingsmidler såsom dicyclohexyl-carbodiimid.
Acyleringsreaktionen udføres almindeligvis i et polært organisk opløsningsmiddel, som er inert overfor reagenserne og produktet. Eksempler på egnede opløsningsmidler omfatter N,N-dimethylformamid og 25 dimethylsulfoxid. Når katalysatoren er en væske som i tilfælde af pyridin, kan reaktionen også udføres i fravær af opløsningsmiddel.
Reaktionen udføres almindeligvis ved moderat temperatur, dvs. ved under 70°C og navnlig tinder 40°C; stuetemperatur er mest bekvemt.
15
DK 160996 B
Den tid det tager for reaktionen at løbe til ende, afhænger af de pågældende anvendte reagenser, opløsningsmidlet og den temperatur, ved hvilken reaktionen udføres. Den kan bestemmes ved at følge reaktionen, f.eks. ved tyndtlagschromatografi.
5 Når reaktionen er færdig, isoleres og renses produktet ved standardmetoder.
Til illustration af den thrombolytiske virkning af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser i forhold til virkningen af de tilsvarende, ikke-blokerede enzymer er udført forsøg 10 i henhold til venøs thrombose i kaninmodel med følgende resultater:
Forbindelse % lyse antal dyr
Frit humant plasmin 7+1 7 p-Anisoylplasmin 21 ± 4 12 (ifølge eksempel 19) 15 Streptokinase plasminogen 5+1 5 aktivator type 1 p-Anisoylstreptokinase 27+7 5 plasminogen type 1 24+7 6 (ifølge eksempel 21) 20 * resultater opnået ved gentagelse af forsøg.
Af disse resultater ses klart, at de blokerede enzymderivater fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er væsentligt mere effektive end de tilsvarende frie enzymer.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående 25 eksempler.
DK 160996 B
16 EKSEMPEL 1.
Benzoesyre -p - amidinophenylester-HCl.
0,172 g p-hydroxybenzamidin-HCl opløses i 1,0 ml tørt pyridin, og en opløsning af 0,141 g benzoylchlorid i 1,0 ml pyridin tilsættes dråbe-5 vis. Blandingen omrøres i 1 time ved stuetemperatur og lades henstå i 4 dage, også ved stuetemperatur. Materialet inddampes til næsten tørhed og tritureres med tørt diethylether, og det faste stof omkrystalliseres af ca. 3 ml 2-propanol/diethylether i volumen/volumen-forholdet 2:1. Der fås 0,223 g, smeltepunkt 160°C.
10 NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^) : 5 = 9,65. Dublet. 4ff. Udskiftelig med D20. Amidin H.: ca. 8,0. Multiplet. 9H. Phenyl og amidino-phenyl.
Forbindelserne ifølge eksempel 2-10 fremstilles på lignende måde som beskrevet i eksempel 1: 15 EKSEMPEL 2.
trans-Kanelsyre-p-amidinophenylester-HCl.
Smeltepunkt 192°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ = 9,55. Dublet 4ff. Udskiftelig med D20. Amidin H.: 7,95. Multiplet. 6H. Amidinophenyl og acryloyl 20 H. : 7,10. Multiplet 5H. Phenyl H.: 6,96. Dublet (J: 16Hz) IR. Acryloyl H.
EKSEMPEL 3.
p-Anissyre-p'-amidinophenylester-HCl.
Omkrystalliseret af 2-propanol, smeltepunkt 225°C.
DK 160996 B
17 NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d®): S — 9,50. Dublet. 4H. Amidino-phenyl H.: 7,38. Kvartet. (J:9Hz) UH. p-Anisoyl H.:3,90. Singlet 3H.
Methoxy H.
EKSEMPEL 4.
5 3,3-Dimethylacrylsyre-p-amidinophenylester-hydrochlorid.
Omkrystalliseret af vand, smeltepunkt 173°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ = 9,50 dublet UH udskiftelig med D2O, amidin H; 7,95 og 7,37 kvartet (J-9HZ) AH, amidinophenyl H; 5,96 bred dublet (J=*lHz), IH acryloyl H; 2,09 singlet 3H, methyl H; 10 1,90 singlet 3H methyl H.
EKSEMPEL 5.
4-Butyl-benzoesyre-p-amidinophenylester-hydrochlorid.
Omkrystalliseret af isopropanol/vand i volumen/volumen-forholdet 1:4, smeltepunkt L90°C.
15 NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): S - 9,55 bred dublet AH udskiftelig med D2O, amidin H. 7,6-8,1 overlappende kvartetter 8H amidinophenyl + benzoyl H. 1,30 singlet 9H tert.butyl H.
EKSEMPEL 6.
2,4-Dimethoxybenzoesyre-p-amidinophenylester-hydrochlorid.
20 Omkrystalliseret af methanol, smeltepunkt 213 - 214°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ - 9,48 dublet AH udskiftelig med D2O, amidin H; 8,01 og 7,50 AA'BB' kvartet (J:8Hz) AH, amidi- 18
DK 160996 B
nophenyl H; 8,03 og 6,75 multiplet 3H, 2,4 substitueret phenyl H; 3,90 singlet 6H, 2x methoxy H.
EKSEMPEL 7.
Acetylsalicylsyre-p-amidinophenyles ter-hydrochlorid.
5 Omkrystalliseret af isopropanol, smeltepunkt 109 - 111°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): S = 9,62 bred dublet 4H udskiftelig med D2O, amidin H; 8,12 og 7,55 AA'BB' kvartet (J:9Hz) AH, amidinophenyl H; 2,26 singlet 3H, acetyl H.
EKSEMPEL 8.
10 4-Ethoxybenzoesyre-p-amidinophenylester-hydrochlorid.
Omkrystalliseret af isopropanol, smeltepunkt 211 - 212eC.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ = 9,60 bred dublet AH udskiftelig med D2O amidin H; 8,10 og 7,56 AA'BB' kvartet (J:9Hz) AH, amidinophenyl H; 8,13 og 7,15 AA'BB' kvartet (J:9Hz) AH, 4-ethoxy-15 phenyl H; 4,19 kvartet 2H, -ØCT2CH3; 9,38 triplet 3H,-ΟΟΗ2θ#3.
EKSEMPEL 9.
o-Toluylsyre-p-amidinophenylester-hydrochlorid.
To gange omkrystalliseret af isopropanol/diethylether, smeltepunkt 157 - 159°C.
20 NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ — bred dublet AH udskiftelig med D2O, amidin H; 8,20 og 7,62 AA'BB' kvartet AH, amidinophenyl H; 7,3 - 8,2 multiplet AH, 2-methylphenyl H; 2,11 singlet 3H, methyl H.
DK 160996 E
19 EKSEMPEL 10.
a) 2-(4-Hydroxyphenyl)acetamidin-hydrochlorid.
5,0 g p-hydroxybenzylcyanid opløses i 50 ml absolut ethanol, og opløsningen mættes med tør HCl-gas i løbet af 4 timer ved stuetem-5 peratur. Efter henstand ved 4°C i 72 timer tilsættes 200 ml tørt diethylether og 100 ml petroleumsether, og i løbet af 2 timer udfældes hvide krystaller. Det faste stof isoleres ved filtrering og omsættes straks med 300 ml mættet ethanolisk ammoniak i 3 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed på dampbad, 10 og remanensen omkrystalliseres af ethanol. Der fås 4,36 g, smeltepunkt 248°C (sønderdeling).
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): S - 9,0 - 9,8 skjuler 5H udskiftelig med D2O, amidin H, hydroxy H. 6,85+7,37 AA'BB' kvartet 4H (J:9Hz) phenyl H; 3,70 singlet 2H benzyl H.
15 b) p-Formamidinomethylphenylester af 4-methoxybenzoesyre.
Omkrystalliseret af isopropanol/diethylether, smeltepunkt 174 - 176eC.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): S = 9,42 bred dublet 4H udskiftelig med D2O, amidin H; 8,15 og 6,29 AA'BB' kvartet (J:8Hz) 4H, 4-20 methoxyphenyl H; 7,69 og 7,13 AA'BB' kvartet (J:8Hz) 4H, amidino-phenyl H; 3,90 singlet 3H, methoxy H.
EKSEMPEL 11.
p-Toluylsyre-p'-amidinophenylester-hydrochlorid.
1,72 g p-hydroxybenzamidin og 1,36 g p-toluylsyre opløses i en blan-25 ding 5,0 ml tørt pyridin og 10,0 ml dimethylsulfoxid og omrøres med 2,1 g Ν,Ν-dicyclohexylcarbodiimid i 72 timer ved stuetemperatur.
20
DK 160996 B
Produktet filtreres, og filtratet udfældes med 200 ml tørt diethyl-ether. Den resulterende olie krystalliserer efter udfældning og omkrystalliseres af 2-propanol/l,4-dioxan i volumen/volumenforholdet 1:1. Smeltepunkt 164°C.
5 NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): 5=9,6 bred dublet udskiftelig med D2O. 4ff. Amidin H.: 8,15 kvartet (J:ca. 4Hz) 4ff. Amidinophenyl H.: 7,60 kvartet (J: ca. 9Hz) 4ff. Benzoyl H.: 2,44 singlet 3ff. Methyl H.
Forbindelserne ifølge eksempel 12 - 18 fremstilles på den i eksempel 10 11 beskrevne måde.
EKSEMPEL 12.
p-Fluorbenzoesyre-p' -amidinophenylester-perchlorat.
Ether-udfældet olie omkrystalliseres af 10 ml 5 vægt/volumenprocents perchlorsyre, smeltepunkt 180°C (sønderdeling).
15 NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): 5 = 9,3 dublet 4ff. Udskiftelig med D2O. Amidin H.: 8,25 kvartet (J: ca. 5Hz) 5ff. 3,5 H i benzoyl.: 7,8 overlappende kvartetter 6ff. Amidinophenyl H og 2,6 H i benzoyl.
EKSEMPEL 13.
3-(2-Furyl)acrylsyre-p-amidinophenyles ter-perchlorat.
20 Koblingen foretages i pyridin. Filtratet inddampes til omtrentlig tørhed, og remanensen omkrystalliseres af fortyndet perchlorsyre. Der fås off-white plader, smeltepunkt 157°C.
NMR-Spektrum (dime thylsulf oxid -d^): S = 9,35 dublet udskiftelig med D2O 4ff amidin H.: 7,7 kvartet (J: ca. 8Hz) 4ff. Amidinophenyl H.: 7,9 25 dublet (J: ca. 3Hz) Iff 5-furyl H.: 7,85/7,40 dublet (J: 20Hz) Iff.
DK 160996 B
21 2-Acryloyl H. : 7,10 dublet (J: ca. 3Hz) lif. 3-Furyl H.: 6,70 multiplet. Iff 4-furyl H.: 6,44 dublet (J: 15Hz) IH 3-acryloyl H.
EKSEMPEL 14.
p-Methyl-trans-kanelsyre-p-amidinophenyles ter-perchlorat.
5 Forbindelsen isoleres som beskrevet for 3-(2-furyl)acrylsyreester, smeltepunkt 155°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): 6 = 9,15 dublet udskiftelig med D2O. 4H. Amidin H.: 7,2 - 8,2 multiplet 9H. Amidinophenyl og phenyl H.: 6,82 dublet (J: 16Hz) 1H 2-acryloyl H.: 6,44 dublet (J: 16Hz) 1H.
10 Acryloyl H.: 2,42 dublet (J: 2Hz) 3H. Methyl H.
EKSEMPEL 15.
O-Anissyre-p-amidinophenyles ter-hydrochlorid.
Forbindelsen omkrystalliseres af isopropanol, smeltepunkt 149°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ = 9,50 bred singlet 4H udskif-15 telig med D2O, amidin H; 7,50 og 7,95 uregelmæssig multiplet 5ff, amidinophenyl H og 2-H; 7,0 - 7,5 multiplet 3H 3,4,5 benzoyl H; 3,86 singlet 3H methoxy H.
EKSEMPEL 16.
3,4-Dimethyl-benzoesyre-p-amidinophenylester-hydrochlorid.
20 Forbindelsen omkrystalliseres af isopropanol/saltvand, smeltepunkt 107°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ = 9,56 bred singlet 4H udskif-
DK 160996 B
22 telig med D2O, amidin H; 7,50 - 7,95 uregelmæssige tripletter 7H amidinophenyl og benzoyl H. 2,30 singlet 6H methyl H.
EKSEMPEL 17. ^ 3- Methyl-4-methoxybenzoesyre-p-amidinophenylester-hydrochlorid.
5 Forbindelsen omkrystalliseres af isopropanol/2N HC1 i volumen/volu-menforholdet 10:1, smeltepunkt 210°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^) : δ = 9,54 dublet 4H udskiftelig med D2O, amidin H. 8,07 uregelmæssige dubletter AH. 2-H + 6-H benzoyl, 2H, 6H amidinophenyl; 7,60 dublet (J=9HZ) 2H, 3H, 5H amidino-10 phenyl; 7,22 dublet (J=9Hz) IH 5H benzoyl; 3,92 singlet 3H methoxyl H; 2,26 singlet 3H methyl H.
EKSEMPEL 18.
4- Acetamidobenzoesyre -p - amidinophenyles ter-hydrochlor id.
Forbindelsen omkrystalliseres af isopropanol/vand i volumen/volumen-15 forholdet 1:2, smeltepunkt 257°C.
NMR-Spektrum (dimethylsulfoxid -d^): δ = 10,62 singlet IH udskiftelig med D2O, amidin H. 7,90 AA'BB' kvartet AH overlappende 7,50 - 7,9 AA'BB' kvartet AH, benzoyl og amidinophenyl H. 2,09 singlet 3H, acetyl H.
20 EKSEMPEL 19.
Isoleret frysetørret p-anisoyl-humant plasmin.
0,15 mikromol humant plasmin i 4,2 ml 20 volumen/volumenprocents glycerol/0.9 vægt/volumenprocents saltopløsning behandles med 50 mikroliter af en 0,1M opløsning af p-amidinophenyl-p'-anisat (frem-
DK 160996 B
23 stillet som beskrevet i eksempel 3) i dimethylsulfoxid ved 22°C.
Efter 7,5 minutter tilsættes yderligere 50 mikroliter acylerings-middel. Produktet dialyseres i 2 timer mod 2 liter af den ovennævnte glycerol/saltvand-blanding og sættes derefter til en blanding af L-5 lysin-"Sepharose" 4B (Pharmacia Fine Chemicals, 23 g våd vægt) og 20 ml 0,1M triethanolamin-hydrochlorid-puffer, pH-værdi 7,0. Blandingen inkuberes i 10 minutter ved 4°C og filtreres, idet gelen vaskes med 100 ml af den ovennævnte puffer. Gelen blandes derefter med en opløsning af e-aminocapronsyre, 0,2M, i den ovenfor nævnte puffer og 10 inkuberes ved 4°C i 10 minutter. Efter filtrering og vask med yderligere 55 ml af e-aminocapronsyreopløsningen dialyseres filtratet mod 2 portioner 50mM ammoniumhydrogencarbonatpuffer, pH-værdi 7,0 (5 liter) ved 4°C i 2 timer. Det endelige retentat blandes med dextran T 70 (Pharmacia) og frysetørres. Der fås 1,98 g af et hvidt fast stof.
15 Dette inaktiverede materiale kan genaktiveres kvantitativt til frit plasmin på ca. 2 timer under de til deacylering angivne betingelser.
Acyleringsmidlerne fra eksempel 1, 2 og 4 - 18 omsættes også med humant plasmin efter den i eksempel 19 beskrevne metode til dannelse af det tilsvarende blokerede plasmin. Ved acyleringsmidlet ifølge 20 eksempel 10 foretrækkes det at anvende en højere koncentration af acyleringsmidlet eller at lade reaktionen løbe i længere tid for at sikre fuldstændig reaktion. Deacyleringshastighederne for de sidstnævnte forbindelser er angivet nedenfor i tabel I.
EKSEMPEL 20.
25 Fremstilling af en opløsning af trans-cinnamoyl-porcint plasmin.
1,73 mikromol porcint plasmin i 26 ml 10 volumen/volumenprocents glycerol i 0,9 vægt/volumenprocents saltopløsning behandles med 3,02 mg p-amidinophenyl-transcinnamat suspenderet i 1 ml 0,9 vægt/volumenprocents saltvand ved omrøring i 20 minutter ved 4°C. Blandingen 30 fryses derefter ved -20°C og henstår ved denne temperatur natten over. Efter optøning dialyseres blandingen i 2 liter af den ovennævnte glycerol/saltvandsblanding ved 4°C i 2 timer. Produktet oplagres
«I
DK 160996 B
24 ved 0°C indtil brug. Derivatet har mindre end 0,5% af det oprindelige enzyms aktivitet og kan genaktiveres på 2 timer under deacylerings-betingelser.
EKSEMPEL 21.
5 Fremstilling af en opløsning af p-anisoy1-streptokinase-humant plas-minogenaktivatorkompleks.
Streptokinase (5 x 10^ enheder, A.B. Kabi, Stockholm, Sverige) i 10,5 ml 0,9 vægt/volumenprocents saltopløsning blandes med 0,025 ml (4,9 nanomol) lys-humant plasminogen. Blandingen inkuberes ved 25°C i 40 10 minutter og fortyndes derefter med 2,0 ml 0,1M tris-hydroxymethyl -aminomethan-hydrochlorid, 0,9 vægt/volumenprocents saltopløsning og 20 volumen/volumenprocents glycerol, pH-værdi 7,4. Denne opløsning behandles med 3 portioner 0,lmM (s lutkoncentrat ion) p-amidinophenyl-p'-anisat (fremstillet som 0,1M stamopløsning i dimethylsulfoxid) i 3 15 perioder på hver 5 minutter ved 25°C. Det acylerede enzym, blandes med en 33 våd vægt/volumenprocents opløsning af L-lysin-"Sepharose"® 4B (2,5 ml) i 10 minutter ved 0eC. Suspensionen sugefiltreres og vaskes med 100 ml af den ovennævnte tris/glycerol/saltvandspuffer ved 4eC.
Gelen gensuspenderes i 5 ml af tris/glycerol/saltvandspufferen, der 20 desuden indeholder 0,1M aminocapronsyre. Efter 10 minutters forløb ved 0°C klares gelsuspensionen ved centrifugering i 2 minutter ved 1000 g, og de 4 ml overstående væske dialyseres mod 2,0 liter tris/-glycerol/saltvandspuffer ved 4°C i 2 timer. Den resulterende opløsning af acyl-aktivatorkomplekset kan regenereres til frit enzym ved 25 37°C med en pseudo-førsteordens-hastighedskonstant på 2,7 x 10"^ sekund*1.
EKSEMPEL 22.
Fremstilling af en opløsning af 3-methyl-p-anisoyl-streptokinase-hu-mant plasminogenaktivatorkompleks.
30 Dette stof fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel 22, bortset fra, at acyleringen udføres med 2 portioner 0,2mM (slutkon-
DK 160996 B
25 centration) 3-methyl-p-anissyre-p-amidinophenylester i 2 perioder på hver 15 minutter ved 25°C efterfulgt af 1 time ved 0°C. Den pseudo-førsteordens-deacyleringshastighedskonstant er 1 x 10'^ sekund"^·.
EKSEMPEL 23.
5 Fremstilling af en blanding af p-anisoyl-humant plasmin og p-anisoyl-streptokinase-humant plasminogenaktivatorkompleks.
Lys-humant plasminogen (216 mg, 2,56 mikromol opløst til en koncentration på 6,8 rag/ml i 0,1M tris-hydroxymethylaminomethan-hydro-chlorid, 0,9 vægt/volumenprocents saltopløsning, 20 volumen/volumen-10 procents glycerol), pH-værdi 7,4, behandles med streptokinase (A.B.
Kabi, Sverige, 1,2 x 10^ enheder, ca. 2,67 nanomol). Blandingen inkuberes ved 25°C i 1 time og indstilles på 33 volumen/ volumenprocents glycerol. Denne opløsning (9,0 ml) acyleres med 2 portioner 0,1 millimol (slutkoncentration) p-amidinophenyl-p-anisat i 2 peri-15 oder på hver 15 minutter ved 25eC og dialyseres derefter i 1 time mod 2 liter af den ovennævnte puffer. Den resulterende opløsning viser mindre end 1% af det oprindelige plasminaktivitet og er i en form, der er egnet til anvendelse i kanintestsystemet.
EKSEMPEL 24.
20 Støkiometrisk omsætning mellem (%-methoxy)-p-amidinophenyl-p'-anisat med humane og porcine plasminer.
a) Humant plasmin.
Opløsninger af humant plasmin (2,67 x 10-¾. 0,2 ml, 5,34 nanomol) omsættes med 2 portioner af en 20mM opløsning af tritieret p-ami-25 dinophenyl-p-anisat (specifik radioaktivitet: 22,8 mC^/millimol) i 2 perioder på hver 7,5 minutter ved 25eC. Efter tilsætning af 1,8 ml af en 10 vægt/volumenprocents trichloreddikesyreopløsning i acetone udfældes proteinet, og det isoleres ved centrifugering ved 1500 g i 3 minutter. Proteinpillen vaskes med 2 portioner syre/acetone (2 ml) 30 og opløses i 1,0 ml 2N natriumhydroxidopløsning. Væskescintillations-
DK 160996 B
26 tælling på denne opløsning viser en middelværdi på 0,130 μ Gi knyttet til protein, hvilket svarer til 5,73 nanomol anissyre.
b) Porcint plasmin.
m
Der udføres lignende forsøg under anvendelse af en opløsning af 5 svineplasmin (5,29 x iO‘%, 10,54 nanomol), som viser en middel-radiokemisk analyse for anissyre på 9,58 nanomol.
EKSEMPEL 25.
Frysetørret p-anisoyl-streptokinase-humant plasminogenaktivatorkom-pleks.
10 9 x 10^ enheder streptokinase i 0,9 ml 0,9 vægt/volumenprocents
saltopløsning blandes med 0,075 ml (14,9 nanomol) lys-humant plasminogen. Blandingen inkuberes ved 25°G i 30 minutter og fortyndes derefter med 4,0 ml 0,1M tris-hydroxymethylaminomethan-hydrochlorid, pH-værdi 7,4. Denne opløsning behandles med 3 portioner 0,lmM (slut-15 koncentration) p-amidinophenyl-p-anisat (fremstillet som en lOmM
stamopløsning i dimethylsulfoxid) i 3 perioder på hver 5 minutter ved 25°C. Det acylerede enzym blandes med 5,0 ml af en 33 våd vægt/volumenprocents suspension af L-lysin-"Sepharose"® 4B i 10 minutter ved 0°C. Suspensionen sugefiltreres og vaskes med 200 ml af den oven-20 nævnte tris-HC1-puffer ved 4°C. Gelen gensuspenderes i 0,1M amino -capronsyre, 50mM tris-HCl, pH-værdi 7,4 (5,0 ml) og filtreres og vaskes 3 gange med hver gang 5 ml af samme puffer. Det samlede eluat dialyseres imod 2 liter af en 5 vægt/volumenprocents mannitolopløs-ning i tris-HCl-puffer (5,0mM), pH-værdi 7,4, i 2 timer ved 4eC og 25 frysetørres, hvorved der fås 0,560 g af et hvidt pulver. Dette materiale har mindre end 5% af den oprindelige enzymaktivitet og kan regenereres i vandigt miljø ved 37°C.
Claims (15)
1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et derivat af et in vivo- fibrinolytisk enzym med en katalytisk position, der er essentiel for DK 160996 B fibrinolytisk aktivitet, såsom urokinase, streptokinase-plasminogen-aktivatorkompleks, vasculær aktivator og pattedyrsplasmin, og hvor den katalytiske position i enzymet er blokeret af en gruppe, som kan fjernes ved hydrolyse med en sådan hastighed, at pseudo-førsteordens-5 hastighedskonstanten for hydrolysen ligger i området mellem 10'^ * sekund” 1 og 10sekund"^- i isotoniske vandige miljøer ved pH-værdi 7,4 ved 37eC, bortset fra p-guanidinobenzoyl-humant plasmin og p-guanidinobenzoyl-streptokinase-plasminogenaktivatorkompleks, kendetegnet ved, at et in vivo-fibrino lytisk enzym 10 a) omsættes med et blokerende middel med formlen AB hvor A er en sådan gruppe, som er selektiv for den katalytiske position, som er essentiel for den fibrinolytiske aktivitet, og som er i stand til at blive overført fra gruppen B til den katalytiske posi-15 tion, og B er en gruppe, som letter tilknytningen af A til enzymet, eller b) omsættes med en forbindelse med formlen EF hvor E er en lokaliserende gruppe, som er selektiv for den kataly-20 tiske position, og F er en gruppe, som er i stand til at blive overført fra den lokaliserende gruppe til den aktive position.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at midlet AB er p-nitrophenyl-p-guanidi-nobenzoat.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at E er en eventuelt substitueret ben-zoylgruppe. DK 160996 B
3-Methyl-4-methoxybenzoyl 0,70
25 O-Toloyl 1,71 p-Ethoxybenzoyl 1,10 2.4- Dimethoxybenzoyl 1,10
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at E er p-amidinophenyl eller p-aceta-midinophenyl.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 5 kendetegnet ved, at enzymet er humant plasmin.
5 Tabel I Deacyleringshastigheder for de aktiverede positioner i serinsubsti-tuerede plasminer, pH-værdi 7,4, 37°C. Humant Plasmin Porcint plasmin Acylgruppe K sekund"^ x 10^ K sekund"^ x 10^ 10 _ p-Fluorbenzoyl - 3,30 Benzoyl 5,20 1,90 p-Toluoyl 2,30 0,74 p-Anisoyl 1,10 0,33
15 Trans-cinnamoyl - 4,20 p-Methyl-t-cinnamoyl - 2,92 3-(2-Furyl)acryloyl 1,33 1,50 N-Methyl-p-guanidinobenzoyl 2,0 O-Anisoyl 1,82 20 p-Acetamidobenzoyl 2,70 Acetylsalicycloyl 4,70 3.3- Dimethylacryloyl 0,69 3.4- Dimethylbenzoyl 0,55
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymet er streptokinase/humant plas-minogenaktivatorkompleks.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at enzymet er en blanding af humant plasmin og streptokinase/humant plasminogenaktivatorkompleks.
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at den gruppe, der kan fjernes ved hydrolyse, er en acylgruppe.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at acylgruppen er en benzoyl-, substitueret benzoyl-, acryloyl- eller substitueret acryloylgruppe.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at acylgruppen er en benzoylgruppe eller 20 en substitueret benzoylgruppe med én eller flere meta- og/eller para-substituenter, hvor summen af Hammett-ajj,- og -Op-værdierne ligger i området mellem +0,1 og -1,1.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at acylgruppen er benzoyl, der eventuelt 25 er substitueret med halogen, g-alkyl, g-alkoxy, g-alkanoyl-oxy, Cl g-alkanoylamino, amino eller p-guanidino.
12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at acylgruppen er acryloyl, der eventuelt er substitueret med g-alkyl, furyl, phenyl eller g-alkylphenyl. DK 160996 B
13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymderivatet er p-anisoyl-humant plasmin. h
14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 5 kendetegnet ved, at enzymderivatet er p-anisoyl-strepto-kinase-humant plasminogenaktivatorkompleks.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at at enzymderivatet er en blanding af p-anisoyl-humant plasmin og p-anisoy1-streptokinase-humant plasmino-10 genaktivatorkompleks.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB7835960 | 1978-09-07 | ||
| GB7835960 | 1978-09-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK373479A DK373479A (da) | 1980-04-11 |
| DK160996B true DK160996B (da) | 1991-05-13 |
| DK160996C DK160996C (da) | 1991-10-28 |
Family
ID=10499512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK373479A DK160996C (da) | 1978-09-07 | 1979-09-06 | Analogifremgangsmaade til fremstilling af et derivat af et in-vivo-fibrinolytisk enzym |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4285932A (da) |
| EP (1) | EP0009879B1 (da) |
| JP (3) | JPS5537198A (da) |
| AR (1) | AR220575A1 (da) |
| AU (1) | AU524295B2 (da) |
| CA (1) | CA1134295A (da) |
| DE (1) | DE2966301D1 (da) |
| DK (1) | DK160996C (da) |
| ES (1) | ES8101385A1 (da) |
| HK (1) | HK65986A (da) |
| HU (1) | HU182458B (da) |
| IE (1) | IE48478B1 (da) |
| IL (1) | IL58079A0 (da) |
| LU (1) | LU88326I2 (da) |
| MY (1) | MY8500995A (da) |
| NZ (1) | NZ191320A (da) |
| ZA (1) | ZA794294B (da) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ191320A (en) * | 1978-09-07 | 1982-09-14 | Beecham Group Ltd | In vivo fibrinolytic enzyme having active site blocked by hydrolytically removable group pharmaceutical compositions |
| JPS55167275A (en) * | 1979-06-15 | 1980-12-26 | Kowa Co | Preparation of amidinophenyl ester derivative |
| DE3065190D1 (en) * | 1979-11-05 | 1983-11-10 | Beecham Group Plc | Enzyme derivatives, and their preparation |
| FR2500825B1 (fr) * | 1981-02-27 | 1985-08-23 | Torii & Co Ltd | Nouveau carboxylate de 4-amidino-phenyle substitue, son procede de preparation et agent anti-complement en comprenant |
| IT1170913B (it) * | 1981-04-23 | 1987-06-03 | Manetti & Roberts Italo Brit | Procedimento per la produzione di un principio attivo fibrinolitico vasale prodotto enzimatico specifico angiochinasi cosi' ottenuto e sue applicazioni farmaceutiche |
| EP0091240B1 (en) * | 1982-04-07 | 1985-12-27 | Beecham Group Plc | Enzyme derivatives, process for preparing them and pharmaceutical compositions containing them |
| WO1984001960A1 (en) * | 1982-11-11 | 1984-05-24 | Beecham Group Plc | Pharmaceutically active compounds |
| EP0109653A3 (en) * | 1982-11-17 | 1986-01-29 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for preparing urokinase complex |
| GB8319538D0 (en) * | 1983-07-20 | 1983-08-24 | Beecham Group Plc | Compounds |
| JPS60136520A (ja) * | 1983-12-23 | 1985-07-20 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | フイブリン吸着性ウロキナ−ゼ複合体 |
| GB8334499D0 (en) * | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Derivatives |
| GB8609948D0 (en) * | 1986-04-23 | 1986-05-29 | Beecham Group Plc | Compounds |
| GB8334498D0 (en) * | 1983-12-24 | 1984-02-01 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US4880776A (en) * | 1983-12-24 | 1989-11-14 | Beecham Group P.L.C. | Plasmin A-chain urokinase B-chain hybrid protein |
| GB8400653D0 (en) * | 1984-01-11 | 1984-02-15 | Beecham Group Plc | Conjugates |
| US5174994A (en) * | 1985-11-11 | 1992-12-29 | Leuven Research & Development Vzw | Pharmaceutical composition having thrombolytic activity |
| EP0266032A1 (en) * | 1986-08-29 | 1988-05-04 | Beecham Group Plc | Modified fibrinolytic enzyme |
| GB8707369D0 (en) * | 1987-03-27 | 1987-04-29 | Beecham Group Plc | Enzyme derivatives |
| US5009888A (en) * | 1987-04-13 | 1991-04-23 | Genzyme Corporation | Therapeutic enzyme-antibody complexes |
| GB8715302D0 (en) * | 1987-06-30 | 1987-08-05 | Ordidge R J | Nmr spectroscopy |
| EP0297882B1 (en) * | 1987-07-01 | 1993-08-25 | Beecham Group Plc | Hybrid plasminogen activators |
| US5302390A (en) * | 1987-07-01 | 1994-04-12 | Beecham Group Plc | Hybrid proteins of human plasminogen and human t-PA, pharmaceutical compositions and methods of treatment |
| US5256642A (en) * | 1988-04-01 | 1993-10-26 | The Johns Hopkins University | Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof |
| US6458360B1 (en) | 1990-04-25 | 2002-10-01 | The Johns Hopkins University | Soluble complement regulatory molecules |
| GB9011861D0 (en) * | 1990-05-26 | 1990-07-18 | Beecham Group Plc | Novel compounds |
| GB9013345D0 (en) * | 1990-06-14 | 1990-08-08 | Beecham Group Plc | Novel compounds |
| US20040072757A1 (en) * | 1990-09-04 | 2004-04-15 | Cor Therapeutics, Inc. | Agents affecting thrombosis and hemostasis |
| US5597799A (en) * | 1990-09-04 | 1997-01-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant agents affecting thrombosis |
| US5583107A (en) * | 1990-09-04 | 1996-12-10 | Cor Therapeutics, Inc. | Agents affecting thrombosis and hemostasis |
| WO1992018139A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-29 | Brigham And Women's Hospital | Chimeric molecule with plasminogen activator activity and affinity for atherosclerotic plaques |
| GB9301289D0 (en) * | 1993-01-22 | 1993-03-17 | Smithkline Beecham Plc | Novel composition |
| US5589571A (en) * | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
| US7544500B2 (en) | 1999-11-13 | 2009-06-09 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Process for the production of a reversibly inactive acidified plasmin composition |
| NZ589557A (en) | 2008-06-04 | 2012-08-31 | Talecris Biotherapeutics Inc | Immobilised streptokinase, method and kit for preparing plasmin |
| ES2552337T3 (es) | 2009-03-03 | 2015-11-27 | Grifols Therapeutics Inc. | Procedimientos para la preparación de plasminógeno |
| US9226953B2 (en) | 2009-07-10 | 2016-01-05 | Thrombogenics Nv | Variants of plasminogen and plasmin |
| EP2480249B1 (en) | 2009-08-28 | 2015-01-28 | ThromboGenics N.V. | Plasmin for the treatment of filtration failure after trabeculectomy |
| ES2583082T3 (es) | 2011-01-05 | 2016-09-19 | Thrombogenics N.V. | Variantes de plasminógeno y plasmina |
| RU2604810C2 (ru) | 2011-08-12 | 2016-12-10 | Тромбодженикс Н.В. | Варианты плазминогена и плазмина |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ191320A (en) * | 1978-09-07 | 1982-09-14 | Beecham Group Ltd | In vivo fibrinolytic enzyme having active site blocked by hydrolytically removable group pharmaceutical compositions |
-
1979
- 1979-08-15 NZ NZ191320A patent/NZ191320A/xx unknown
- 1979-08-16 CA CA333,909A patent/CA1134295A/en not_active Expired
- 1979-08-16 ZA ZA00794294A patent/ZA794294B/xx unknown
- 1979-08-17 AU AU50046/79A patent/AU524295B2/en not_active Expired
- 1979-08-20 US US06/068,205 patent/US4285932A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-08-20 IL IL58079A patent/IL58079A0/xx unknown
- 1979-08-22 AR AR277800A patent/AR220575A1/es active
- 1979-08-30 EP EP79301773A patent/EP0009879B1/en not_active Expired
- 1979-08-30 DE DE7979301773T patent/DE2966301D1/de not_active Expired
- 1979-09-04 ES ES483888A patent/ES8101385A1/es not_active Expired
- 1979-09-06 IE IE1696/79A patent/IE48478B1/en not_active IP Right Cessation
- 1979-09-06 HU HU79BE1364A patent/HU182458B/hu not_active IP Right Cessation
- 1979-09-06 DK DK373479A patent/DK160996C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-09-07 JP JP11430579A patent/JPS5537198A/ja active Granted
-
1980
- 1980-12-16 US US06/216,799 patent/US4337244A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-12-30 MY MY995/85A patent/MY8500995A/xx unknown
-
1986
- 1986-09-04 HK HK659/86A patent/HK65986A/en not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-11-24 JP JP1306342A patent/JPH02154687A/ja active Pending
-
1992
- 1992-07-13 JP JP4207007A patent/JPH05304957A/ja active Pending
-
1993
- 1993-06-24 LU LU88326C patent/LU88326I2/fr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0009879B1 (en) | 1983-10-12 |
| IE791696L (en) | 1980-03-07 |
| AU5004679A (en) | 1980-03-13 |
| AU524295B2 (en) | 1982-09-09 |
| EP0009879A1 (en) | 1980-04-16 |
| DK373479A (da) | 1980-04-11 |
| ES483888A0 (es) | 1980-12-16 |
| DK160996C (da) | 1991-10-28 |
| IE48478B1 (en) | 1985-02-06 |
| JPH02154687A (ja) | 1990-06-14 |
| HK65986A (en) | 1986-09-12 |
| JPH0231952B2 (da) | 1990-07-17 |
| US4285932A (en) | 1981-08-25 |
| HU182458B (en) | 1984-01-30 |
| MY8500995A (en) | 1985-12-31 |
| CA1134295A (en) | 1982-10-26 |
| ZA794294B (en) | 1980-08-27 |
| NZ191320A (en) | 1982-09-14 |
| LU88326I2 (fr) | 1994-05-04 |
| IL58079A0 (en) | 1979-12-30 |
| DE2966301D1 (en) | 1983-11-17 |
| JPS5537198A (en) | 1980-03-15 |
| AR220575A1 (es) | 1980-11-14 |
| US4337244A (en) | 1982-06-29 |
| ES8101385A1 (es) | 1980-12-16 |
| JPH05304957A (ja) | 1993-11-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK160996B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af et derivat af et in-vivo-fibrinolytisk enzym | |
| CA1174621A (en) | Enzyme derivatives | |
| Smith et al. | Fibrinolysis with acyl-enzymes: a new approach to thrombolytic therapy | |
| CA1330036C (en) | Inhibition of arterial thrombotic occlusion or thromboembolism | |
| Gardell et al. | Effective thrombolysis without marked plasminemia after bolus intravenous administration of vampire bat salivary plasminogen activator in rabbits. | |
| Toombs | Alfimeprase: pharmacology of a novel fibrinolytic metalloproteinase for thrombolysis | |
| Levin et al. | Serum-mediated suppression of cell-associated plasminogen activator activity in cultured endothelial cells | |
| US4604285A (en) | Protein C enzyme derivatives | |
| US4532129A (en) | Composition containing and method of using a fibrinolytic active principle | |
| Dubber et al. | In vitro and in vivo studies with Trasylol, an anticoagulant and a fibrinolytic inhibitor | |
| RU2143490C1 (ru) | Бифункциональный вариант урокиназы, плазмида, содержащая синтетический структурный ген, кодирующий бифункциональную урокиназу, плазмида (варианты), способ получения плазмиды, способ получения бифункционального варианта урокиназы, тромболитическое средство | |
| US5977056A (en) | Treatment of thrombotic events | |
| Summaria et al. | In vitro comparison of fibrinolytic activity of plasminogen activators using a thrombelastographic method: in vivo evaluation of the B-chain-streptokinase complex in the dog model using pre-titered doses | |
| Silberman et al. | Effects of ancrod (Arvin) in mice: studies of plasma fibrinogen and fibrinolytic activity | |
| US4999194A (en) | Two-chain urokinase plasminogen activators for treatment of thrombotic disease | |
| Barlow | Pharmacology of fibrinolytic agents | |
| CN113350355B (zh) | GSK923295和伊斯平斯作为重组tPA激动剂在制备溶栓药物中的应用 | |
| Freiman et al. | The effect of fibrinogen concentration on susceptibility of clots to in vitro clot lysis with plasmin | |
| FI67300B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av in vivo fibrinolytiska enzymderivat foer anvaendning vid behandling ventrombos | |
| NO166314B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av en plasminogenaktivatoravledet fra human nyre. | |
| RU2121362C1 (ru) | Пролонгированное тромболитическое средство и способ его получения | |
| Summaria | Thromboelastographic study of fibrinolytic agents | |
| EP0487660B1 (en) | Treatment of thrombotic events | |
| Prentice et al. | Evaluation of a new preparation of urokinase | |
| Hibbs et al. | Determination of the deacylation rate of p-anisoyl plasminogen streptokinase activator complex (APSAC, EMINASE) in human plasma, blood and plasma clots |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |