CN113350355B

CN113350355B - GSK923295和伊斯平斯作为重组tPA激动剂在制备溶栓药物中的应用

Info

Publication number: CN113350355B
Application number: CN202110693899.XA
Authority: CN
Inventors: 徐芃; 李金宇; 黄明东; 刘玉蓉; 吴钜洪; 袁彩; 江龙光
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2041-06-22
Also published as: CN113350355A

Abstract

本发明公开了小分子化合物GSK923295和伊斯平斯作为重组组织型纤溶酶原激活物激动剂（tPA）在制备溶栓药物中的应用，其首次发现GSK923295和伊斯平斯具有提高重组tPA的酶活性的效果，能够提高tPA类溶栓药物的溶栓活性，因而可作为其辅助成分用于开发治疗血栓性疾病的药物，具有广泛的应用前景。

Description

GSK923295和伊斯平斯作为重组tPA激动剂在制备溶栓药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及小分子化合物GSK923295和伊斯平斯作为重组组织型纤溶酶原激活物激动剂在制备溶栓药物中的应用。

背景技术

血栓性疾病是血管内促凝、抗凝和纤溶过程失衡造成的血管堵塞、血流降低等现象，主要分为静脉血栓（venous thrombosis，VT）和动脉血栓（arterial thrombosis，AT）。根据我国国家血管中心的“中国心血管病报告”记录，2010年中国人死亡的主要原因前三位为：脑卒中（170万），缺血性心脏病（94.8万）和慢性阻塞性肺疾病（93.4万）。前两位都是血栓性疾病，而第三位则也纤维蛋白形成有关。此外，世界卫生组织（WHO）数据表明，全球四分之一的死亡原因与血栓形成相关，前三位的心脑血管病死因均与血栓有关。因此，血栓性疾病已成为导致全球人口死亡的第一位原因。血栓性疾病涉及的很重要的一个方面便是静脉血栓栓塞性疾病：即静脉血栓栓塞症（VTE）。VTE目前在全球范围内都呈现上升的趋势，据报道，在全球，每16秒就有一个人新发VTE相关的疾病，每37秒就有一个人死于VTE相关的疾病，防治形势并不乐观。同时，VTE也是目前国内各级医院住院患者非预期死亡的重要原因，是当前医疗纠纷的主要根源。因此，无论国内还是国际上，与血栓类疾病的对抗是提高人类生命健康和生活质量的重要问题。

组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA）是丝氨酸蛋白酶家族的成员之一。在心肌梗死的治疗中，支架植入正变得越来越流行，但这类手术需要良好的医疗条件和高超的手术技巧，所以溶栓治疗仍被世界上许多医院用于治疗急性心肌梗死和脑卒中的重要方案。目前临床上使用的溶栓剂主要分为三类：重组tPA（recombinanttPA）类、尿激酶和链激酶。其中，重组tPA类溶栓剂是使用最广的溶栓药物，占据目前临床使用率的60%以上。例如，目前临床上最广泛使用的重组tPA类溶栓药物为阿替普酶，是美国FDA在1987年批准作为治疗急性心肌梗塞的第一款重组tPA药物。1990年美国FDA又批准其用于治疗急性肺栓塞，1999年美国FDA再次批准其用于治疗急性缺血性卒中，并且目前是急性缺血性卒中唯一的溶栓治疗药物。重组tPA类药物通过将无活性的纤溶酶原激活激活成纤溶酶进而消化纤维蛋白来溶解血栓，疏通血管。但重组tPA在临床应用上会带来严重出血的风险。

小分子化合物GSK923295（分子量为592.13，其化学结构式为

），原为一级特异性变构抑制剂CENP-E驱动蛋白ATPase的变构抑制剂，Ispinesib（伊斯平斯，分子量为517.06，其化学结构式为

），原是第一个KSP（Kinesin Spindle Protein）小分子变构抑制剂，两者药代动力学特征明确，且有显著的抗肿瘤活性，但到目前为止，未发现任何有关这两种小分子作为重组组织型纤溶酶原激活物激动剂的相关报道。本发明报道首次发现了GSK923295和伊斯平斯对重组tPA酶活性的增强效果，其对tPA水解酶活性的提高具有专一性（不提高其他同类蛋白酶的抑制效果）。同时，GSK923295和伊斯平斯能通过提高重组tPA活性进而提高纤溶酶原激活效率和血浆中血栓的溶解效率，因此可作为激活剂用于提高tPA类溶栓剂的治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供两种小分子化合物GSK923295和伊斯平斯的新应用，即用于作为重组组织型纤溶酶原激活物激动剂，以提高重组tPA酶活性，从而为临床上所用溶栓药提供了两款安全有效的小分子增效剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明要求保护小分子化合物GSK923295或伊斯平斯的新应用，即是将GSK923295或伊斯平斯作为重组组织型纤溶酶原激活物激动剂用于制备溶栓药物。

该应用具体是将小分子化合物GSK923295或伊斯平斯作为辅助成分，与重组组织型纤溶酶原激活物（重组tPA）共同制成所述溶栓药物。

本发明主要以重组tPA作为药物受体，以小分子化合物GSK923295或伊斯平斯作为激动剂制成一种药用制剂，通过对该制剂进行生物学活性测定发现，GSK923295或伊斯平斯不仅可以增强重组tPA的酶活性，也可以增强纤溶酶原转化为纤溶酶的能力以及提高血浆的纤溶活性，这为该制剂在血栓性疾病治疗方面的应用提供了理论依据；体外溶栓实验结果显示，小分子GSK923295和伊斯平斯是两种有效的重组tPA类溶栓药物的增强剂，在血浆水平上能够促进重组tPA的纤溶作用并加速血块的溶解；肺栓塞动物模型实验结果显示，小分子GSK923295和伊斯平斯可以促进溶栓，是一种有效的重组tPA的增强剂；出血风险评价实验结果显示，重组tPA分别与GSK923295或伊斯平斯联用后并无明显的出血，出血风险较低，在体内是相对安全的。因此，小分子化合物GSK923295和伊斯平斯在制备防治血栓性疾病的药物方面可发挥很大作用。

本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）本发明首次发现了小分子化合物GSK923295和伊斯平斯具有增强重组tPA活性的功能，这为GSK923295和伊斯平斯提供了一种新的用途。

（2）GSK923295和伊斯平斯具备促进溶栓功能，能够对血栓性疾病（如肺栓塞）起到治疗作用。

（3）安全性评价中GSK923295和伊斯平斯的出血风险经过验证，证明其在提高重组tPA溶栓效果的同时，并不会增加其出血风险，因而有望在降低用药量的条件下降低其副作用的发生。

附图说明

图1为实施例1中在化学发色底物S2288存在条件下，GSK923295和伊斯平斯分别与重组tPA联用后对其催化活性的影响情况图。

图2为实施例2中GSK923295和伊斯平斯分别与重组tPA联用后对纤溶酶原的催化活性的影响情况图。

图3为实施例3中重组tPA分别与GSK923295和伊斯平斯的复合物、单独的重组tPA以及生理盐水组在PPP中血块的形成与降解随时间变化的对比图。

图4为实施例4中重组tPA分别与GSK923295和伊斯平斯的复合物、单独的重组tPA以及生理盐水组分别在0.5 h、1 h、3 h和6 h时相对血栓量的变化情况图。

图5为实施例5中重组tPA分别与GSK923295和伊斯平斯的复合物、单独的重组tPA以及生理盐水组分别对小鼠出血时间（A）和出血量（B）的影响情况图。

具体实施方式

为更好地理解本发明的内容，以下结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围不局限于实施例表述的范围。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

所用重组tPA是在tPA的基础上通过常规分子克隆及蛋白表达技术得到，其蛋白序列为IKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVALPPADLQLPDWTECELSGYGKHEYLSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLQRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPVD。

实施例1：GSK923295和伊斯平斯对重组tPA的酶活性实验以及酶动力学参数（K _cat、K _m、K _cat /K _m值）

实验方法：

酶活性测定采用生色底物法（chromogenic assay），其具体操作是在200 μL反应体系（20mM Tris•HCl，pH7.4，150 mM NaCl）中，将10 nM重组tPA与10 µM GSK923295或伊斯平斯在透明96孔板中预先孵育15 min，再加入100 µM显色底物S2288/S2366，并立即放入多功能酶标仪中，在405 nm处检测吸光度（30 s/read检测60 min），同时以未添加的小分子化合物的孔作为对照。另外，在反应体系（20mM Tris•HCl，pH7.4，150 mM NaCl）中，将重组tPA与10 µM小分子GSK923295或伊斯平斯预先孵育15 min，再加入一系列浓度梯度的显色底物S2288，并立即放入多功能酶标仪中，在405 nm处检测60 min，同时以未添加小分子化合物的孔作为对照。最后使用GraphPad Prism 7软件中的非线性回归进行拟合，得到K _cat和K _m，并计算K _cat /K _m。每个测试至少重复3次。结果如图1及表1所示。

实验结果：

表1 GSK923295和伊斯平斯分别与重组tPA联用的酶动力学参数

如图1所示，在显色底物检测试验中，小分子化合物GSK923295和伊斯平斯可以显著增强重组tPA的活性。K _cat /K _m是一个用来衡量酶催化效率的指标，如表1所示，与没有添加小分子化合物的对照相比，添加小分子化合物后重组tPA的催化速率分别提高到1.7倍和1.8倍，表明GSK923295和伊斯平斯对于重组tPA具有特异性增强作用。

实施例2：GSK923295和伊斯平斯对纤溶酶原的酶活性实验

实验方法：

为了研究增强作用是否只限于显色底物，我们检测了其裂解生理底物纤溶酶原的能力，其机理是利用在纤溶酶原作为天然底物检测中，S2403是纤溶酶的特定底物，最终产物纤溶酶可通过纤溶酶特异性显色底物（S2403）来定量。其具体操作：首先将10 nM重组tPA和100 nM纤溶酶原添加到96孔板里，再加入10 µM GSK923295或伊斯平斯，最后加入100 μMS2403，并立即放入多功能酶标仪中，在405 nm处测量60分钟，同时以未添加小分子化合物的孔作为对照。每个测试至少重复3次。结果如图2所示。

实验结果：

如图2所示，加入GSK923295后的重组tPA酶活性为单独的重组tPA的2倍，加入伊斯平斯后的酶活性为单独的重组tPA的1.4倍。说明GSK923295和伊斯平斯可以增强重组tPA催化纤溶酶原转化为纤溶酶的能力。

实施例3：GSK923295和伊斯平斯分别与重组tPA的复合物的体外溶栓实验

实验方法：

抽取健康志愿者的血液，加入到柠檬酸钠（3.2%，体积比为9：1）抗凝管中。在室温条件下，2000 g离心10 min获得贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）。为了检测溶栓活性，将300 nM重组tPA分别与10 µM GSK923295、10 µM伊斯平斯或空白对照（等体积缓冲液）加入到96孔板中，再加入30% PPP缓冲液（20mM Tris 7.4，150mM NaCl，0.05% Tween-20），孵育15 min，最后加入10mM CaCl₂以激活血凝块形成，再在多功能酶标仪中于37℃、405 nm处以30s/read进行实时监测反应。最后使用GraphPad Prism 7软件绘制血块凝结曲线。结果如图3所示。

实验结果：

如图3所示，单独加入300 nM的外源重组tPA时，需要16.75±1.06 min才能溶解近50%的血块；当10 µM的GSK923295或伊斯平斯分别与外源重组tPA同时加入时，血块能够在20 min内完全溶解，溶解50%的血块所需时间分别缩短至4.25±1.06 min和5.75±0.35min；而对照组血块一直没有溶解。证明GSK923295和伊斯平斯是一种有效的溶栓药物增强剂，在血浆水平上能够促进重组tPA的纤溶作用并加速血块的溶解。

实施例4：GSK923295和伊斯平斯分别与重组tPA的复合物在肺栓塞动物模型中的溶栓效果

实验方法：

ICR雄性小鼠被随机分成四组，每组包含6只小鼠，首先收集SD大鼠的全血于含有柠檬酸钠（3.2%，体积比为9：1）的抗凝管中，通过2000 g离心10 min来分离血浆，获得贫血小板血浆PPP。将PPP（500 µL）与3 µL ZnPc5K（4.5 mM）、11.5 µL凝血酶（10 U/ml）以及46.5µL CaCl₂（240 mM）混合，在37℃孵育过夜后，将形成的血浆凝块切成小块并研磨成颗粒，然后重悬于1 mL生理盐水中。通过尾静脉（10 µL/g）将标记有ZnPc5K的凝块微粒分别注射到各试验组ICR雄性小鼠中。稳定10 min后，将重组tPA（10 mg/kg）分别与5 mg/kg GSK923295或伊斯平斯联用，并以重组tPA为阳性对照，0.9%的生理盐水为阴性对照，通过尾静脉注射到小鼠体内，分别在注射0.5 h、1 h、3 h、6 h时，通过小动物活体成像仪FMT记录肺中ZnPc5K的荧光信号。结果见图4。

实验结果：

ZnPc5K的荧光信号强弱可以用来表示血栓的数量，如图4所示，将0.5 h时生理盐水对照组ZnPc5K的浓度表示为100%，则1 h、3 h和6 h分别减少了-12.7%、35.6%和56.8%；与生理盐水对照组相比，重组tPA与GSK923295的复合物、重组tPA与伊斯平斯的复合物以及单独的重组tPA在0.5 h时血栓分别减少了52.9%、32.1%和31.4%，在1 h分别减少了54.4%、16.0%和35.7%，在3 h分别减少了64.8%、62.5%和44.6%，在6 h分别减少了75.0%、69.7%和57.6%。表明伊斯平斯和GSK923295可以增强体内溶栓性能，是有效的tPA增强剂。

实施例5：通过尾出血实验评价出血风险

实验方法：

为了评估小分子GSK923295和伊斯平斯在体内的安全性，我们进行了尾部出血试验，其分组给药的操作与实施例4相似，即将ICR雄性小鼠随机分成四组，每组包含6只小鼠，通过尾静脉分别注射重组tPA（10 mg/kg）与小分子GSK923295和伊斯平斯（5 mg/kg）的复合物到小鼠体内，并以单独注入重组tPA为阳性对照组，注入0.9%的生理盐水为阴性对照组。稳定 10 min后，使用干净的剪刀在小鼠尾部末端0.5 cm处切断，立即浸于装有37℃预热生理盐水的10ml试管中，并且在停止出血时（无出血1 min）记录出血时间。在室温条件下，2000 g离心小鼠血浆10 min以收集红细胞，再加入2 mL裂解液（8.3 g/L NH₄Cl，1.0 g/LKHCO₃，and 0.037 g/L EDTA）裂解红细胞，然后在575 nm处测量样品的吸光度值，进而通过血红蛋白的含量来定量出血量。如图5所示。

实验结果：

如图5所示，重组tPA与GSK923295联用的出血时间约为155±44.95 s，重组tPA与伊斯平斯联用的出血时间约为133.3±26.9 s，重组tPA组的出血时间约为144.5±30.48s，而阴性对照组的出血时间为112±33.11 s。另外，在575 nm处，重组tPA与GSK923295联用的吸光度为0.64±0.41，重组tPA与伊斯平斯联用的吸光度约为0.53±0.21，重组tPA组的吸光度约为0.62±0.32，而阴性对照组的吸光度为0.43±0.088。由此可见，与注射生理盐水的小鼠相比，重组tPA与GSK923295联用后，尾部出血时间和出血量会有少许增加，而重组tPA与伊斯平斯联用后，尾部出血时间和出血量有少量降低，但两者并无显著差异。这些结果表明，重组tPA分别与GSK923295和伊斯平斯联用未增加出血风险，在体内是相对安全的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> GSK923295和伊斯平斯作为重组tPA激动剂在制备溶栓药物中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 254

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys

20 25 30

Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys

35 40 45

Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg

50 55 60

Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu

65 70 75 80

Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp

85 90 95

Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu

100 105 110

Ser Ser Val Val Arg Thr Val Ala Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu

115 120 125

Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Tyr

130 135 140

Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu

145 150 155 160

Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Gln Arg Thr Val

165 170 175

Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln

180 185 190

Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val

195 200 205

Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly

210 215 220

Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr

225 230 235 240

Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro Val Asp

245 250

Claims

1.小分子化合物作为重组组织型纤溶酶原激活物激动剂在制备溶栓药物中的应用，其特征在于：将小分子化合物作为增效成分，与重组组织型纤溶酶原激活物共同制成所述溶栓药物；

所述小分子化合物为GSK923295或伊斯平斯；

所述重组组织型纤溶酶原激活物的蛋白序列为IKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVALPPADLQLPDWTECELSGYGKHEYLSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLQRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRPVD。