CN106890320A - 一种用于预防或治疗急性及慢性血栓的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纤溶酶原在溶解新鲜和陈旧血栓方面的作用。与现有其它溶解血栓的药物相比，本发明纤溶酶原可特异性溶解血栓而不会造成出血等副作用。本发明的药物还具有可溶解新鲜和陈旧血栓且具有半衰期长和溶血栓强度可控的优势，因此，纤溶酶原可能成为全新的溶解体内血栓的策略。

Description

一种用于预防或治疗急性及慢性血栓的方法

技术领域

本发明涉及一种新的使用纤溶酶原预防和/或治疗血栓的方法。纤溶酶原可特异性溶解血栓而不会造成出血等副作用。本发明的药物还具有可溶解新鲜和陈旧血栓且具有半衰期长和溶血栓强度可控的优势，因此，纤溶酶原可能成为全新的溶解体内血栓的策略。

背景技术

血栓的形成及危害

血栓是指人体或动物在存活期间因某些诱因，血液有形成分在循环血中异常发生的血凝块，或者在心脏内壁或血管壁上发生的血液沉积物。其包括心肌梗死、脑栓塞、肺血栓、深部静脉血栓和周围血管栓塞等，是严重危害人类健康的疾病，其发病率、致残率、致死率都很高。据世界卫生组织统计，世界上每年死于血栓塞疾病的人数约为2600万，远高于其他死亡原因，成为危害人类健康头号敌人^[1]。

纤溶酶是纤溶酶原激活系统(PA系统)的关键组分。它是一种广谱的蛋白酶，能够水解细胞外基质(ECM)的几个组分，包括纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖^[2]。此外，纤溶酶能将一些金属蛋白酶前体(pro-MMP)激活形成具有活性的金属蛋白酶(MMP)。因此纤溶酶被认为是胞外蛋白水解作用的一个重要的上游调节物^[3,4]。纤溶酶是由纤溶酶原通过两种生理性的PA：组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白水解形成的。由于纤溶酶原在血浆和其他体液中相对水平较高，传统上认为PA系统的调节主要通过PA的合成和活性水平实现。PA系统组分的合成受不同因素严格调节，如激素、生长因子和细胞因子。此外，还存在纤溶酶和PA的特定生理抑制剂。纤溶酶的主要抑制剂是α2-抗纤溶酶(α2-antiplasmin)。某些细胞表面具有直接水解活性的uPA特异性细胞表面受体(uPAR)^[5,6]。

纤溶酶原(plasminogen，plg)是一个单链糖蛋白，分子量约为92kDa^[7,8]。纤溶酶原主要在肝脏合成，大量存在于胞外液中。血浆中纤溶酶原含量约为2μM。因此纤溶酶原是组织和体液中蛋白质水解活性的一个巨大的潜在来源^[9,10]。纤溶酶原存在两种分子形式：谷氨酸-纤溶酶原(Glu-plasminogen)和赖氨酸-纤溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纤溶酶原具有一个氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被称为谷氨酸-纤溶酶原。然而，在纤溶酶存在时，谷氨酸-纤溶酶原在Lys76-Lys77处水解成为赖氨酸-纤溶酶原。与谷氨酸-纤溶酶原相比，赖氨酸-纤溶酶原与纤维蛋白具有更高的亲和力，并可以更高的速率被PA激活。这两种形式的纤溶酶原的Arg560-Val561肽键可被uPA或tPA切割，导致二硫键连接的双链蛋白酶纤溶酶的形成^[11]。纤溶酶原的氨基末端部分包含五个同源三环，即所谓的kringle，羧基末端部分包含蛋白酶结构域。一些kringle含有介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP特异性相互作用的赖氨酸结合位点。最新发现一个为38kDa的纤溶酶原片段，其中包括kringle1-4，是血管生成的有效抑制剂。这个片段被命名为血管抑素，可通过几个蛋白酶水解纤溶酶原产生。

纤溶酶的主要底物是纤维蛋白，纤维蛋白的溶解是预防病理性血栓形成的关键^[12]。纤溶酶还具有对ECM几个组分的底物特异性，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和明胶，表明纤溶酶在ECM重建中也起着重要作用^[8,13,14]。间接地，纤溶酶还可以通过将某些蛋白酶前体转化为活性蛋白酶来降解ECM的其他组分，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的一个重要的上游调节器^[15]。此外，纤溶酶具有激活某些潜在形式的生长因子的能力^[16-18]。在体外，纤溶酶还能水解补体系统的组分并释放趋化补体片段。

现有溶血栓治疗方法

目前减少血栓的相关药物治疗是常见的非手术治疗方法包括溶栓疗法、抗凝疗法、抗血小板药物和血管扩张药物。现在最常用最有效的方法就是采用溶栓疗法，常用的溶血栓药物有三代：第一代以链激酶(SK)和尿激酶(UK)为代表，溶栓能力强，但没有溶栓特异性，容易出现全身溶栓亢进而导致出血^[19,20]。第二代以组织型纤溶酶原激活剂tPA为代表，其溶栓作用优 于SK、UK，但在体内半衰期短^[21]。第三代以基因工程技术，单克隆技术对第一代，第二代药物进行改造，但基本都在试验阶段。这些药物都基于增加纤溶平衡中的激活剂，产生纤溶酶(Plm)促进纤溶，从而达到溶栓目的 ^[22]。

目前已批准的溶栓药物分为两类：绝大多数溶栓药物使用的是纤溶酶原激活剂，包括天然和不同重组形式的tPA、uPA，以及链激酶(streptokinase)。纤溶酶原激活剂自身不能溶解血栓，必须将血栓附近的纤溶酶原分子激活成活性的纤溶酶后才能进行溶栓作用。最近几年，活性纤溶酶获得批准用于直接局部溶栓，具体方法是将导管通到血栓部位的情况下局部释放活性纤溶酶从而直接溶栓。

纤溶酶原(plg)是纤溶酶(Plm)的非活性形式，传统上认为其在体内是过量和惰性的，机体的溶解血栓过程只有通过纤溶酶原在其激活剂的作用下激活为有活性的纤溶酶，活性纤溶酶进而行使溶解纤维蛋白血凝块(fibrin clot)的功能。传统上认为纤溶酶原本身不起溶解血栓的作用。

然而，本发明惊奇地发现天然纤溶酶原具有良好的溶解新鲜和陈旧血栓的功能，且具有安全性好，溶解血栓强度便于调节，特异性好等优点。

本发明的溶栓机理与目前已知的溶栓策略完全不同。现有技术溶解血栓的方法是通过增加溶栓反应的催化剂，即纤溶酶原激活剂，包括tPA、uPA、链激酶及其衍生物或者溶栓反应的产物，即活性纤溶酶来实现。本发明溶解血栓的方法是通过调节溶栓反应的底物纤溶酶原的策略来实现的。

相对于现有技术中的溶栓药物，本发明的纤溶酶原溶栓至少具备以下优点。

1.良好的溶栓效果

外周动脉堵塞(peripheral arterial occlusion,PAO)和深静脉血栓(deep veinthrombosis,DVT)的情况下形成的长的血栓和逐步收缩的陈旧血栓，现有技术的溶栓药物效果较差^[23-25]，而本发明使用纤溶酶原或者纤溶酶原与PA的组合，对上述血栓实现了良好的溶栓效果。因此，本发明可以有效解决tPA,uPA的上述问题。

2.半衰期长

目前的溶栓物质一个重要特点是体内半衰期过短，如天然uPA的体内半衰期为5-10分钟，天然tPA的体内半衰期为3-5分钟，天然纤溶酶的体内半衰 期更是极为短暂。即使目前通过基因工程改造以图延长这些物质的半衰期，但是效果并不理想，半衰期过短仍然极大地限制了这些物质的应用。

然而，纤溶酶原的体内半衰期长达53小时，这说明使用纤溶酶原或者纤溶酶原与PA的组合，均能显著的延长体内溶血栓的作用期，达到持续、稳定溶栓的目的。

3.更具温和性和可调控性

对于活性纤溶酶来讲，由于其是一个高活性的蛋白酶，因此通过使用活性纤溶酶来溶栓必须是一个非常快速的反应过程，从而导致目前的使用中必须通过导管直接引到血栓部位。

对于纤溶酶原激活剂来讲，由于其在溶栓反应中处于催化剂的位置，添加少量的纤溶酶原激活剂会在很短时间里迅速形成大量活性纤溶酶，是一个剧烈的酶反应过程。

然而，本发明实验证明通过调节溶栓反应的底物纤溶酶原溶解血栓的过程更温和，而且，通过不同纤溶酶原使用量和溶栓效果的研究发现，纤溶酶原溶栓速率也可以通过纤溶酶原的剂量来调控。

4.特异性和副作用低

现有技术使用纤溶酶原激活剂作为溶栓药物的一个主要副作用是出血，特别是肠道和脑部的出血。由于正常体内纤溶酶原广泛存在于所有的体液，正常情况下体内存在生理性的纤维蛋白沉积，而纤溶酶原激活剂的增加往往发生于创伤、出血、剧烈运动等特殊情况下。因此，一旦注射纤溶酶原激活剂，体内会非特异性地广泛发生激活纤溶酶原形成活性纤溶酶这一反应，从而造成原有正常的纤维蛋白沉积的溶解并发生出血。在临床上，颅内出血风险是一个主要的出血风险。有报道指出，在持续2-24小时的持续给药过程中，颅内出血的发生率为1％-2％，目前还没有更好的办法避免出血这种风险。

在本发明中，由于纤溶酶原不是活性酶，因此注射纤溶酶原后不会非特异性地广泛发生激活纤溶酶原形成活性纤溶酶这一反应。这一反应发生的部位取决于哪里表达纤溶酶原激活剂，也就是发生血栓的部位。本发明实验证明纤溶酶原可以特异性地吸附于血栓部位，具有溶栓特异性，并且实验证明未发生出血的副作用。

5.有效溶解陈旧血栓

目前的溶栓药物的溶栓作用集中在血栓形成的初期，即“新鲜血栓”。如在缺血性中风中的研究中证实，在血栓形成3个小时内注射重组tPA可以有效的溶解血栓。后续的研究证明，重组tPA最多可以在血栓形成4.5小时内溶解血栓，如果超过4.5小时的话，注射重组tPA的风险可能要超过有效作用。因此，在目前药物的情况下，要尽可能的在血栓形成的早期(小于4.5小时)注射重组tPA^[26，27]。换句话说，目前本领域急需找到一种强有力的陈旧血栓溶栓药物。

在本发明中，单独使用纤溶酶原(以及生理水平的tPA)或者使用纤溶酶原和纤溶酶原激活剂(tPA或uPA)，均可有效地溶解新鲜血栓(血栓形成0.5小时)，或者陈旧血栓(20小时)，甚至极其陈旧血栓(72小时)。这些数据清楚地表明了纤溶酶原在溶解陈旧血栓上的巨大优势。

因此，纤溶酶原有望成为一种新的更具优势的溶栓新药。

发明简述

一方面，本发明涉及预防和/或消除受试者动、静脉血栓的方法，包括给药受试者纤溶酶原。本发明还包括纤溶酶原用于预防和/或消除受试者动、静脉血栓的用途。在一个实施方案中，其中所述血栓包括新鲜血栓和陈旧血栓。在一个实施方案中，所述血栓为血液系统疾病、循环系统疾病、自身免疫疾病、代谢紊乱疾病或感染性疾病导致的血栓。在一个实施方案中，所述血栓为继发于糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一个实施方案中，所述血栓为大小血管病变导致的血栓。

同时，本发明涉及一种新的预防和/或治疗血栓相关疾病的方法，该方法包括向受试者体内给药有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于预防和/或治疗血栓相关疾病的用途。本发明涉及一种新的预防和/或消除受试者病理性血栓的方法，该方法通过全身或局部给药纤溶酶原来溶解所述血栓。以上所述血栓为新鲜血栓和/或陈旧血栓，所述血栓相关疾病为新鲜血栓和/或陈旧血栓诱导或导致的疾病。所述受试者为哺乳动物，优选为人。

在一个实施方案中，所述受试者纤溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。

在一个实施方案中，本发明的血栓为静脉血栓和/或动脉血栓。所述血栓相关疾病包括门静脉血栓导致的胰腺炎、肝硬化；肾静脉血栓导致的肾 栓塞；颈内静脉血栓引起的全身性败血症、肺栓塞、脑血栓；动脉血栓导致的器官的梗死，包括但不限于：脑梗塞、心肌梗死、血栓性中风、房颤、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一个实施方案中，所述血栓相关疾病为糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心脏病、糖尿病性肠病、包括糖尿病性神经痛等的糖尿病性神经病变。

在一个实施方案中，上述血栓是继发的和/或局部的血栓；上述血栓相关疾病是继发的和/或局部的血栓相关疾病。

在一个实施方案中，纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。在一个实施方案中，纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤溶酶原。在一个实施方案中，纤溶酶原为人天然纤溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、马、狗的纤溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或通过直肠。在一个实施方案中，所述局部给药通过在血栓区域应用含有纤溶酶原的敷料和/或导管来进行。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10- 100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。

上述纤溶酶原可以单独施用，也可以与其它药物联合使用以预防和/或治疗与病理性血栓发生相伴的其它疾病，所述其它药物包括，例如，心血管疾病治疗药物、心律失常治疗药物、糖尿病治疗药物等，。

另一方面，本发明涉及纤溶酶原在制备预防和/或消除受试者动、静脉血栓的药物、制品、药盒中的用途。本发明还涉及一种制药方法，包括将纤溶酶原与药学可接受载体共同制备成预防和/或消除受试者动、静脉血栓的药物、制品、药盒。在一个实施方案中，其中所述血栓包括新鲜血栓(急性血栓)和陈旧血栓(慢性血栓)。在一个实施方案中，所述血栓为血液系统疾病、循环系统疾病、自身免疫疾病、代谢紊乱疾病或感染性疾病导致的血栓。在一个实施方案中，所述血栓为继发于糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一个实施方案中，所述血栓为大小血管病变导致的血栓。

同时，本发明涉及纤溶酶原在制备预防和/或消除受试者病理性血栓的药物、制品、药盒中的用途，以及纤溶酶原在制备预防和/或治疗受试者血栓相关疾病的药物、制品、药盒中的用途。本发明还涉及一种制备药物的方法，包括将纤溶酶原与药学可接受载体一起制备成预防和/或消除受试者病理性血栓的药物、制品、药盒，或预防和/或治疗受试者血栓相关疾病的药物、制品、药盒。所述血栓为新鲜血栓和/或陈旧血栓，所述血栓相关疾病为新鲜血栓和/或陈旧血栓诱导的疾病。所述受试者为哺乳动物，优选为人。

在一个实施方案中，所述受试者纤溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。

在一个实施方案中，上述血栓为静脉血栓和/或动脉血栓。所述血栓相关疾病包括门静脉血栓导致的胰腺炎、肝硬化；肾静脉血栓导致的肾栓塞；颈内静脉血栓引起的全身性败血症、肺栓塞、脑血栓；动脉血栓导致的器官的梗死，包括但不限于：脑梗塞、心肌梗死、血栓性中风、房颤、不稳 定性心绞痛、顽固性心绞痛、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一个实施方案中，所述血栓相关疾病为糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心脏病、糖尿病性肠病、包括糖尿病性神经痛等的糖尿病性神经病变。

在一个实施方案中，上述血栓是继发的和/或局部的血栓；上述血栓相关疾病是继发的和/或局部的血栓相关疾病。

在一个实施方案中，纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。在一个实施方案中，纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤溶酶原。在一个实施方案中，纤溶酶原为人天然纤溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或通过直肠。在一个实施方案中，所述局部给药通过在血栓区域应用含有纤溶酶原的敷料和/或导管来进行。

上述纤溶酶原可以单独施用，也可以与其它药物联合使用以治疗与病理性血栓发生相伴的其它疾病，所述其它药物包括，例如，心血管疾病治疗药物，心律失常治疗药物，糖尿病治疗药物等。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001- 800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。

另一方面，本发明涉及用于预防和/或消除受试者动、静脉血栓的纤溶酶原，以及用于预防和/或消除受试者动、静脉血栓的、包含纤溶酶原的药物组合物。在一个实施方案中，其中所述血栓包括新鲜血栓和陈旧血栓。在一个实施方案中，所述血栓为血液系统疾病、循环系统疾病、自身免疫疾病、代谢紊乱疾病或感染性疾病导致的血栓。在一个实施方案中，所述血栓为继发于糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一个实施方案中，所述血栓为大小血管病变导致的血栓。同时，本发明涉及用于预防和/或治疗血栓相关疾病的纤溶酶原，以及用于预防和/或治疗血栓相关疾病的、包含纤溶酶原的药物组合物。上述血栓为新鲜血栓和/或陈旧血栓，所述血栓相关疾病为新鲜血栓和/或陈旧血栓诱导的疾病。在一个实施方案中，上述血栓为静脉血栓和/或动脉血栓。所述血栓相关疾病包括门静脉血栓导致的胰腺炎、肝硬化；肾静脉血栓导致的肾栓塞；颈内静脉血栓引起的全身性败血症、肺栓塞、脑血栓；动脉血栓导致的器官的梗死，包括但不限于：脑梗塞、心肌梗死、血栓性中风、房颤、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一个实施方案中，所述血栓相关疾病为糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心脏病、糖尿病性肠病、包括糖尿病性神经痛等的糖尿病性神经病变。

在一个实施方案中，上述血栓是先天的、继发的和/或局部的血栓；上述血栓相关疾病是先天的、继发的和/或局部的血栓相关疾病。

在一个实施方案中，纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。在一个实施方案中，纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1 个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤溶酶原。在一个实施方案中，纤溶酶原为人天然纤溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、马、狗的纤溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或通过直肠。在一个实施方案中，所述局部给药通过在血栓区域应用含有纤溶酶原的敷料和/或导管来进行。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。

另一个方面，本发明涉及用于预防和/或消除受试者动、静脉血栓的、包含纤溶酶原的制品或药盒。在一个实施方案中，其中所述血栓包括新鲜血栓和陈旧血栓。在一个实施方案中，所述血栓为血液系统疾病、循环系统疾病、自身免疫疾病、代谢紊乱疾病或感染性疾病导致的血栓。在一个实施方案中，所述血栓为继发于糖尿病的大、小血管、微血管血栓。在一个实施方案中，所述血栓为大小血管病变导致的血栓。在一个实施方案中，所述制品或药盒包含含有有效剂量的纤溶酶原的容器。进一步的，所述制品或药盒还包含包含含有一种或多种其它药物的容器，其中所述其它药物为伴随血栓形成的其它疾病的治疗药物。该药盒还可包含使用说明书，说 明所述纤溶酶原可以用于预防和/或治疗所述动、静脉血栓，或血栓相关疾病，并且可以进一步说明，所述纤溶酶原可以在其它药物施用之前，同时，和/或之后施用。在一个实施方案中，所述其它药物可以是心血管疾病治疗药物，心律失常治疗药物，糖尿病治疗药物等，以治疗与病理性血栓发生相伴的其它疾病。在具体的上述方案中，上述血栓为新鲜血栓和/或陈旧血栓，所述血栓相关疾病为新鲜血栓和/或陈旧血栓诱导的疾病。在一个实施方案中，上述血栓为静脉血栓和/或动脉血栓。所述血栓相关疾病包括门静脉血栓导致的胰腺炎、肝硬化；肾静脉血栓导致的肾栓塞；颈内静脉血栓引起的全身性败血症、肺栓塞、脑血栓；动脉血栓导致的器官的梗死，包括但不限于：脑梗塞、心肌梗死、血栓性中风、房颤、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、糖尿病大小血管栓塞等。

在一个实施方案中，所述血栓相关疾病为糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心脏病、糖尿病性肠病、包括糖尿病性神经痛等的糖尿病性神经病变。

在一个实施方案中，上述血栓是先天的、继发的和/或局部的血栓；上述血栓相关疾病是先天的、继发的和/或局部的血栓相关疾病。

在一个实施方案中，纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。在一个实施方案中，纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤溶酶原。在一个实施方案中，纤溶酶原为人天然纤溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一个实施方案中，所述受试者纤溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。

本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的所有亚组合，并且在本文中公开，就像每一个此类亚组合单独且明确在本文中公开一样。

发明详述

1.定义

“血栓”是凝血过程中形成的产物。凝血过程是机体保持封闭高压循环系统完整性的防御机制。在正常情况下，该过程应保持非活化状态，但当组织受到损伤时，需要立即启动该机制以减少血液外渗。当血管受损时，在凝血酶的作用下溶于血浆中的纤维蛋白原(fibrinogen)将最终转变为不溶于水的纤维蛋白(fibrin)多聚体，并彼此交织成网，将血细胞网罗在内，形成血凝块，完成凝血过程。在该过程中，血凝块与伤处的大小比例至关重要。因此初始血凝块形成的分子(纤维蛋白，凝血酶)和溶解血凝块的分子(纤溶酶、纤溶酶原激活剂等)间应存在平衡。但在病理过程中，该平衡的破坏将导致过量的血凝块形成分子，进而形成血栓(thrombus)，该血栓为“病理性血栓”。

在人体中，血栓可在具有血流的任何位置发生，目前主要将其分为两大类：静脉血栓和动脉血栓。静脉血栓由在静脉中产生的血凝块导致。最常见的静脉血栓类型为：深静脉血栓(DVT)，其通常影响肢体静脉如股静脉，导致受影响部位的疼痛和红肿；门静脉血栓，其可影响肝门静脉，进而导致胰腺炎、肝硬化、憩室炎或胆管癌；肾静脉血栓，导致肾栓塞；颈内静脉血栓，其可引起全身性败血症、肺栓塞等多种并发症；脑静脉血栓，导致患者呈现头痛、视觉异常中风等症状。动脉血栓则可能导致在体内几乎任何器官的梗死，其引发的病症包括但不限于：脑梗塞、心肌梗死、血栓性中风、动脉粥样硬化疾病、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、短暂性脑缺血发作、肺栓塞等。

“血栓相关疾病”为血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引起的疾病。本发明血栓相关疾病的术语明确涵盖由血栓形成和血栓栓塞引起的所有疾病。

血栓形成(thrombosis)是指在一定条件下，血液有形成分在血管内(多数为小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，相应部位血液供应障碍的病理过程。依血栓组成成分可分为血小板血栓、红细胞血栓、纤维蛋白血栓、混合血栓等。按血管种类可分为动脉性血栓、静脉性血栓及毛细血管性血栓。

血栓栓塞(thromboembolism)是血栓由形成部位脱落，在随血流移动的过程中部分或全部堵塞某些血管，引起相应组织和(或)器官缺血、缺氧、坏死(动脉血栓)及淤血、水肿(静脉血栓)的病理过程。

静脉血栓形成以下肢深静脉血栓形成最为多见，常见于深静脉如腘静脉、股静脉、肠系膜静脉及门静脉等。多为红细胞血栓或纤维蛋白血栓。主要表现有：(1)血栓形成的局部肿胀、疼痛；(2)血栓远端血液回流障碍：如远端水肿、胀痛、皮肤颜色改变、腹水等；(3)血栓脱落后栓塞血管引起相关脏器功能障碍，如肺梗死的症状、体征等。

动脉血栓形成多见于冠状动脉、脑动脉、肠系膜动脉及肢体动脉等，血栓类型早期多为血小板血栓，随后为纤维蛋白血栓。临床表现有：(1)发病多较突然，可有局部剧烈疼痛，如心绞痛、腹痛、肢体剧烈疼痛等；(2)相关供血部位组织缺血、缺氧所致的器官、组织结构及功能异常，如心肌梗死、心力衰竭、心源、性休克、心律失常、意识障碍及偏瘫等；(3)血栓脱落引起脑栓塞、肾栓塞、脾栓塞等相关症状及体征；(4)供血组织缺血性坏死引发的临床表现，如发热等。毛细血管血栓形成常见于DIC、TTP及溶血尿毒症综合征(HUS)等。临床表现往往缺乏特异性，主要为皮肤粘膜栓塞性坏死、微循环衰竭及器官功能障碍。

“糖尿病”是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。

“糖尿病并发症”是由糖尿病过程中血糖控制不良导致的身体其他器官或组织的损害或功能障碍，其中包括肝脏、肾脏、心脏、视网膜、神经系 统的损害或功能障碍等。据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。而这些糖尿病的并发症主要是由于患者各器官的大血管、小血管和微血管受损所致。

“糖尿病性大血管病变”主要指主动脉及各器官动脉等发生的动脉粥样硬化。其发病机理包括以下方面：(1)持续性高血糖使血液粘滞度和凝固性升高，进而引起动脉血管弹性减弱乃至丧失；(2)脂类代谢异常，其促使胆固醇和胆固醇脂在细胞内堆积，导致动脉粥样硬化发生与发展；(3)动脉壁内皮细胞损伤，血流动力学改变使血液机械性地长期冲击血管内皮，引起内皮损伤，进而导致血小板、纤维蛋白等在损伤部位粘附聚集形成血栓，并可进一步导致炎症；(4)参与凝血机制的糖蛋白因子增多，促进血小板和纤维蛋白聚集粘附于损伤的内皮下层而溶解能力下降，进而形成血栓。

“糖尿病性微血管病变”指糖尿病患者机体各器官或组织微循环不同程度的异常导致的微血管病变。微血管病变形成的过程大致为：微循环功能性改变，内皮损伤，基膜增厚，血粘度增高，红细胞聚集，血小板粘附和聚集，最后导致微血栓形成和/或微血管闭塞。

上述的两种“糖尿病性血管病变”导致组织或器官局部血管损伤、血流不畅、细胞缺氧、形成血凝块、血栓和炎症，并进一步影响周边的组织及器官功能，进而导致糖尿病并发症，例如，糖尿病性心脏病、糖尿病性肠病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性神经病变。

“糖尿病性肾病”是糖尿病微血管并发症，主要指糖尿病性肾小球硬化症，一种以血管损害为主的肾小球病变，其特征包括蛋白尿、高血压、水肿、肾小球硬化症、血管结构改变和小管间质性疾病(tubulointerstitial disease)。糖尿病肾病的第一临床证据通常是尿液中存在白蛋白尿，例如微白蛋白尿(microalbuminuria)或大量白蛋白尿(macroalbuminuria)。

“糖尿病性神经病变”或称为“糖尿病性神经病”是由糖尿病引起的神经系统损伤造成，包括感觉神经受损、运动神经受损和自主神经受损。其中感觉神经受损通常较为严重，常见症状包括但不限于：肢体疼痛、感觉减退、麻木、灼热、冰凉，以及糖尿病神经性疼痛，包括但不限于糖尿病并发症引发的自发性疼痛、痛觉减退(hypoalgesia)、痛觉超敏(hyperalgesia)等等。

“糖尿病性神经痛”是糖尿病神经病变的最常见形式，通常由糖尿病感觉神经受损所致。主要的疼痛通常伴有温度和触觉丧失，疼痛发生以下肢感觉居多，同时也发生在上肢和躯干。一般可分为周围和中枢神经疼痛。周围神经疼痛通过周围神经的损伤引起，而中枢神经疼痛通过中枢神经系统和/或脊髓损伤引起。

“糖尿病肝损伤”是指由糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化的病变。其主要由糖尿病引起的大血管、微血管病变导致。已知糖尿病可引起的肝损伤包括：肝酶学异常，其可引起肝细胞内二氧化碳蓄积、酸中毒、氧供减少、氧消耗增加，使肝脏转氨酶活性增加，胆红素代谢紊乱，重者可引起肝细胞坏死；脂肪肝，在引起脂肪肝的所有病因中，糖尿病占第三位，其中21％～78％糖尿病患者伴有脂肪肝；肝炎、硬化和肝癌，其中糖尿病患者中病毒性肝炎的患病率约为正常人的2-4倍，原发性肝癌的发生率约为正常人的4倍。

在临床上，由糖尿病引起的肝病及其相关症状包括但不限于：肝酶学异常、肝区不适和触痛、肝肿大、脾肿大、肝脾肿大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬化、肝坏死和肝癌等。

“糖尿病性心血管病”指由糖尿病引起的心血管系统的组织学和功能变化的病变，其为最常见的糖尿病并发症之一，主要由糖尿病引起的大血管、微血管病变导致。其中，患者临床可表现为心电图异常、心脏扩大、心率失常、心绞痛、无痛性心肌梗死、心力衰竭。据统计，大约70％～80％的糖尿病患者最后死于心血管并发症。

“糖尿病视网膜病变”也称“糖尿病视网膜病”，指由糖尿病引起的视网膜组织学和功能变化的病变，主要由糖尿病引起的大血管、微血管病变导致。糖尿病性视网膜病变是最常见的糖尿病眼病，常造成视力减退或失明。据统计，50％的糖尿病患者在病程的10年左右将出现该病变，15年以上则达80％。糖尿病病情越重，年龄越大，发病的几率越高。

通过CT或MRI等技术检查患者血栓组织时，可见病灶呈新鲜或陈旧血栓。首发病灶在急性发作期为新鲜灶，病灶组织缺血中心部分坏死，部分有恢复可能，周边区域未受影响。此时的治疗目的应主要是防止“中心梗死区”扩大。而陈旧血栓则为组织缺血中心的完全坏死，治疗目的应致力于使梗死区周边组织功能继续得到改善。陈旧性血栓存在较高的复发风险， 因此对陈旧性血栓的患者，治疗和预防同样重要，在减少症状程度的同时也应降低高复发率。目前的多种溶栓药物对于急性期的新鲜血栓治疗效果尚可，但治疗陈旧性血栓则效果较差。

“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，能将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体。

“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源plasminogen氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为92kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的PLG包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。

Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-plasminogen(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域^[28，29]，有文献报道了δ-plasminogen的氨基酸序列(序列8)^[30]，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。Mini-plasminogen由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)^[31]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而Micro-plasminogen仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)^[32]，也有专利CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利 CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。

本发明的“新鲜血栓”和“急性血栓”可以互换使用；“陈旧血栓”和“慢性血栓”可以互换使用。

在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纤溶酶原活性片段”指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。

目前，对于血液中纤溶酶原及其活性测定的方法包括：对组织纤溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤溶酶-抗纤溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤溶酶原活性成正比。此外 也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤溶酶原活性进行测定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性、碱性、疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸、蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。

“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中使用的，术语“治疗”、“处理”和“消除”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(1)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(2)抑制疾病，即阻滞其形成；和(3)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠，小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会 根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。

2.本发明纤溶酶原的制备

纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in PeptideSynthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein PeptLett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。

可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。

合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。

大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。

其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

除微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的纤溶酶原(例如编码主题抗-Tau抗体的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、高效液相层析(HPLC)、凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。

3.药物配制剂

可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体、赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkoniumchloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。

本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物、抗心律失常的药物、治疗糖尿病的药物等。

本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)、L-谷氨酸 与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

4.给药和剂量

可以通过不同方式，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、颅内、鞘内、动脉内(例如经由颈动脉)、肌内、鼻内、表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现本发明药物组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。

在一些情况中，可以以下方式修饰或配制本发明的纤溶酶原药物组合物，从而提供其穿过血脑屏障的能力。可以通过各种肠内和胃肠外施用路径，包括口服、静脉内等对患有血栓和/或血栓相关疾病的个体施用此类纤溶酶原的组合物。

用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与促进穿过血脑屏障的药剂配制在一起。在一些情况中，本发明的纤溶酶原直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与结合内源血脑屏障(BBB)受体的多肽融合。连接纤溶酶原与结合内源BBB受体的多肽，促进穿过BBB。结合内源BBB受体的合适的多肽包括 抗体，例如单克隆抗体，或其抗原结合片段，其特异性结合内源BBB受体。合适的内源BBB受体包括但不限于胰岛素受在一些情况中，抗体是囊封于脂质体中的。体、转铁蛋白受体、脂蛋白受体、和胰岛素样生长因子受体。参见例如美国专利公开文本No.2009/0156498。

医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以为例如每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1～10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估、定期评估血栓和血栓相关疾病的治疗效果和安全性。

5.治疗效力和安全性评价

治疗效力

对纤溶酶原的治疗效力评价主要通过监测以下指标的来进行：

(1)治疗1周后血栓溶解率。例如，可以通过导管注入造影剂，每日评估溶栓情况，对每一个血管区域进行评分，完全开放者为0分，部分闭塞者为1分，完全闭塞为2分。按照溶栓前总分减去溶栓后总分，除以溶栓前总分所得的比率划分不同的溶栓等级，一级＜50％，二级为50％～90％，三级为血栓完全溶解。

(2)6个月后血管通畅率，例如可通过内窥镜、CT血管造影分析、彩色多普勒超声等方法评估血管通畅率。通过治疗后血管通畅率百分比与治疗前是否有统计学显著的提高来判断治疗有效性。

(3)6个月后血管闭塞和/或静脉返流率。通过统计治疗后血管闭塞和/或静脉返流率的降低来判断药剂对于溶栓率的改善。

(4)其他评估指标；例如，血管腔内回声改变、血管壁厚度对比、和2年后血栓后遗症发生率等。例如，血管壁厚度和腔内回声可以通过灰阶超声进行评估，而髂、股静脉血流和股静脉瓣膜功能膜不全可以使病人采取站立姿势用多普勒超声进行评估。

安全性评估

对纤溶酶原药物治疗血栓后的安全性进行评估，所述评估主要包括监测治疗后不良事件的发生率。一般将严重出血、栓塞、中风和死亡定为严重不良事件，而次要出血和其他轻微症状的并发症定为次要不良事件。

对于安全性评估而言，最为常见的不良事件是出血，如颅内出血(又称出血性中风，包括蛛膜下出血、硬膜下出血等)。本发明所述严重出血一般指颅内出血或出血严重程度足以导致死亡、手术、停止治疗或需要输血的出血事件，包括“大出血(majorhemorrhage)事件”和“威胁生命的出血事件”。而次要出血是指导管鞘边的出血、和/或改变溶血栓药剂、抗凝剂或抗血小板药物的剂量、或通过压迫可以止住的出血。所述“大出血”、“大出血事件”具体是指血色素含量降低至少2.0g/L或输血至少2单位的血液，或关键部位或器官中的症状性出血。而比“大出血”严重程度更高的出血事件，即大出血事件的子类，称为“威胁生命的出血事件”，包括致命性出血、症状性颅内出血、血色素降低至少5.0g/L或需要输血超过4单位的血液或需要心肌收缩剂或必需手术的出血。

此外，对于评估具有大出血事件风险因子的患者，视情况严重程度对其施用剂量进行微调并对其用药后不良事件进行随访监测至少3个月，优选为6个月及以上。所述大出血风险包括但不限于(1)年龄75岁及以上，(2)具有先前出血事件的病史，(3)具有降低的肌酸酐清除率，其小于80mL/分钟或小于50mL/分钟。

6.制品或药盒

本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗血栓的本发明纤溶酶原。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原。所述容器上或 所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述血栓和血栓相关疾病。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水、林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤物、针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。

附图说明：

图1显示在125ng tPA存在的条件下，37℃温育1小时，不同剂量纤溶酶原对20小时陈旧血栓溶解效果。

图2显示125ng tPA存在时，37℃温育2小时，不同剂量纤溶酶原对20小时陈旧血栓的溶解效果。

图3显示在10ng tPA条件下，37℃温育2小时，不同剂量的纤溶酶原对20小时陈旧血栓溶栓效果。

图4显示在125ng tPA条件下，37℃温育2小时，不同剂量的纤溶酶原对72小时陈旧血栓的溶栓效果。

图5显示在10ng tPA条件下，37℃温育2小时，不同剂量的纤溶酶原对72小时陈旧血栓的溶栓效果。

图6显示20小时陈旧血栓在加入10ng的tPA和1mg的plg或者单独加入5μg的tPA后随着时间的延长血栓溶栓率的变化。

图7显示在100ng uPA条件下，37℃温育1小时，不同剂量的纤溶酶原对20小时陈旧血栓溶效果。

图8显示在1ng uPA条件下，37℃温育2小时，不同剂量的纤溶酶原对20小时陈旧血栓溶效果。

图9显示纤溶酶原对于体内血栓的特异性吸附实验结果。

图10显示在125ng tPA条件下，37℃温育2小时，不同浓度的纤溶酶原对于30分钟新鲜血栓的溶栓效果。

图11显示24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原15天后血清中D-二聚体的浓度检测结果。

图12显示24-25周糖尿病小鼠给予PBS(A)或纤溶酶原(B)31天心脏纤维蛋白免疫组化染色结果。

图13显示24-25周糖尿病小鼠给予PBS(A)或纤溶酶原(B)31天后肾脏纤维蛋白免疫组化染色结果。

图14 24-25显示周糖尿病小鼠给予PBS(A)或纤溶酶原(B)31天后肝脏纤维蛋白免疫组化染色结果。

图15 24-25周糖尿病后期神经损伤小鼠给予PBS(A)或纤溶酶原(B)15天后坐骨神经纤维蛋白免疫组化染色。

实施例

材料与方法:

体内实验：

实验动物

C57小鼠(6-8周龄)购自南方医科大学实验动物中心。购买的小鼠饲养在屏障环境动物房内。db/db小鼠购自南京生物医药研究所。

实验设计及给药方式

对照组和实验组所有动物经手术方式游离颈动脉后，用含10％FeCl3的滤纸外敷5min进行单侧颈动脉血栓造模，造模后1h内开始静脉注射纤溶酶原，对照组静脉注射等体积PBS来进行。3小时后取出相应颈静脉血栓及对侧静脉附近的肌肉。将血栓及对侧静脉附近肌肉使用研磨器进行匀浆，离心后取上清，将上清利用BCA法检测其总蛋白，酶联免疫法检测匀浆液中的纤溶酶原含量，计算出一定蛋白总量中的纤溶酶原含量。研究纤溶酶原体内溶栓的特异性。

此外，24-25周龄db/db小鼠作为对照组和实验组动物，分别尾静脉给予溶媒PBS或纤溶酶原。31天后摘眼球取血行D-二聚体检测，取神经、肝、肾、心脏行纤维蛋白免疫组化染色，研究纤溶酶原体内溶栓效果。

血液D-二聚体分析

小鼠摘眼球取血，获得血浆，按照D-二聚体试剂盒(武汉优尔生，中国)进行实验操作,试验完成后使用酶标仪(Biotek美国)在450nm处进行读数，进行数据分析。

免疫组化分析

取神经、肝、肾、心脏，在10％中性福尔马林固定24小时以上。固定后的组织经过乙醇梯度脱水，包埋在石蜡中，并进行石蜡切片，切片厚度 5μm，切片脱蜡至水后水洗1次，然后用PAP笔圈出组织。以0.3％甲醇稀释的双氧水孵育15分钟，水洗3次。10％与二抗同源的正常血清封闭10分钟，吸走多余血清。一抗室温孵育30分钟或4度过夜，TBS洗3次。HRP标记的二抗室温孵育30分钟，TBS洗3次。按DAB试剂盒(vector laboratories，Inc.,USA)显色，苏木素复染30秒，流水返蓝5分钟，然后TBS洗1次。梯度脱水透明并封片。用到的抗体有：标志物抗体有Fibrin(ogen)(Abcam)。切片在光学显微镜(Olympus，BX43)下观察。

体外溶血栓实验设计：

取健康人血浆于ELISA 96孔板中，加入固定量的凝血酶(Sigma,美国)形成血栓，然后进行下面的不同实验。加入固定量tPA、uPA(sigma，美国)和不同量的纤溶酶原，固定量的纤溶酶原和不同量的tPA、uPA、链激酶(sigma，美国)，对照组加入PBS。孵育不同时间至有血栓溶解，在酶标仪(Biotek，美国)上OD405的波长观察记录吸光值读数和每次测量的时间。进行分析数据。

实施例1 20小时陈旧血栓在125ng tPA条件下，37℃温育1小时，不同剂量纤溶酶原的溶栓效果

采集2只SD大鼠全血至Eppendorf(EP)管内，37℃温育20h后弃上清，形成陈旧血栓^[33，34]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、125ng tPA对照组、20μg tPA对照组，0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组以及2mg纤溶酶原组，每组3管。PBS空白对照组加入1mL PBS；125ng tPA对照组加入1mL PBS和125ng tPA；20μg tPA对照组加入1mL PBS和20μg tPA；0.2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，温育1小时后吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下tPA的含量为5-10ng/mL^[35]，而当剧烈运动或静脉淤血情况下，体内tPA的含量会增至20倍至100倍，即达 到100ng/mL以上^[36]。因此，本实验中使用的tPA剂量为125ng/mL以模仿体内血栓情况下自然产生的tPA含量。

结果显示，对于体外20个小时形成的陈旧血栓，在125ng的tPA条件下，添加纤溶酶原0.2mg、1mg、2mg的溶栓率比单独添加125ng tPA的溶栓率有明显的升高，统计差异均极显著，说明在体内出现血栓时自然产生的tPA水平的情况下，添加0.2mg或更多的纤溶酶原1小时可以显著促进溶栓。在125ng tPA条件下，添加纤溶酶原1mg就可以达到体内注射剂量20μg tPA(根据Boehringer Ingelheim公司生产的注射用阿普替酶说明书在体内血栓情况下溶栓需使用的剂量换算成的大鼠所需注射剂量)相同的溶栓效果。即达到同样的溶栓率，如果体内存在1mg纤溶酶原，所需tPA量可以减少到原有的1/160。此外，在125ng tPA条件下，添加纤溶酶原1mg达到了纤溶酶原溶栓的峰值，再添加多1倍的纤溶酶原其溶栓率有下降趋势，说明纤溶酶原的添加存在饱和度，饱和度在1到2mg左右(图1)。

实施例2 20小时陈旧血栓在125ng tPA条件下，37℃温育2小时，不同剂量纤溶酶原的溶栓效果

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育20h后弃上清，形成陈旧血栓^[33，34]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、125ng tPA对照组、20μg tPA对照组，0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组以及2mg纤溶酶原组，每组3管。PBS空白对照组开始时加入1mL PBS；125ng tPA对照组加入1mLPBS和125ngtPA；20μg tPA对照组加入1mL PBS和20μg tPA；0.2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，温育2小时后，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下tPA的含量为5-10ng/mL^[35]，而当剧烈运动，或静脉淤血情况下，体内tPA的含量会增至20倍至100倍，即达到100ng/mL以上^[36]。因此，本实验中使用的tPA剂量为125ng/mL以模仿体内血栓情况下自然产生的tPA含量。

结果显示，对于在体外20个小时形成的陈旧血栓，与实施例1相比，每组随着反应时间的延长，溶栓率也相应增加。在125ng的tPA条件下，添加纤溶酶原0.2mg、1mg、2mg的溶栓率比单独添加125ng tPA的溶栓率有明显的升高，统计差异均极显著。说明在体内出现血栓时自然产生的tPA剂量的情况下，添加0.2mg或更多的纤溶酶原2小时可以显著促进溶栓。在反应2小时后，1mg、2mg纤溶酶原组的溶栓效果要优于体内正常注射剂量20μg tPA对照组(根据Boehringer Ingelheim公司生产的注射用阿普替酶说明书在体内血栓情况下溶栓需使用的剂量换算成的大鼠所需注射剂量)，即达到同样的溶栓率，如果体系内存在1mg纤溶酶原，所需tPA量可以减少到体系内没有1mg纤溶酶原时所需tPA量(20μg)的不到1/160(图2)。

实施例3 20小时陈旧血栓在10ng tPA条件下溶栓率随着纤溶酶原剂量增加而升高

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育20h后弃上清，形成陈旧血栓^[33，34]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、10ng tPA对照组、0.2mg纤溶酶原对照组，0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组以及2mg纤溶酶原组，每组3管。PBS空白对照组开始时加入1mL PBS；10ng tPA对照组加入1mL PBS和10ngtPA；0.2mg纤溶酶原对照组加入1mL PBS和0.2mg纤溶酶原；0.2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和10ng tPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和10ng tPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和10ng tPA以及2mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，温育2小时后，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下tPA的含量为5-10ng/mL^[35]，因此，本实验中使用的tPA剂量为10ng/mL以模仿体内正常生理情况下自然产生的tPA含量。

结果显示，对于在体外20个小时形成的陈旧血栓，在体内正常生理情况下自然产生的tPA含量(10ng)的条件下，添加纤溶酶原的各组溶栓率均高于只添加体内生理剂量tPA的对照组的溶栓率，统计差异均极显著。而且随着纤溶酶原添加剂量的增加，相应的溶栓率也呈梯度升高趋势，说明 了可以通过调节纤溶酶原的剂量调节溶解20小时血栓的速度。此外，在0.2mg纤溶酶原存在的情况下，添加体内生理水平的tPA(10ng)的组的溶栓效率要极显著地高于不添加tPA的组，而只添加0.2mg的纤溶酶原的溶栓效果与添加对照PBS的溶栓效果类似，说明生理水平的tPA对于纤溶酶原发挥溶栓作用起到关键作用(图3)。

实施例4 72小时陈旧血栓在125ng tPA条件下溶栓率随着纤溶酶原剂量增加而升高

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育72小时后弃上清，形成陈旧血栓^[36]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、125ng tPA对照组、0.2mg纤溶酶原对照组，0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组以及2mg纤溶酶原组，每组3管。PBS空白对照组开始时加入1mL PBS；125ng tPA对照组加入1mL PBS和125ng tPA；0.2mg Plg对照组加入1mLPBS和0.2mg Plg；0.2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，温育2小时后，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下tPA的含量为5-10ng/mL^[35]，而当剧烈运动，或静脉淤血情况下，体内tPA的含量会增至20倍至100倍，即达到100ng/ml以上^[36]。因此，本实验中使用的tPA剂量为125ng/ml以模仿体内血栓情况下自然产生的tPA含量。

结果显示，对于体外72个小时形成的陈旧血栓，在125ng tPA条件下，添加纤溶酶原的溶栓率要高于单独添加125ng tPA的溶栓率，且差异极显著，说明在体内出现血栓时自然产生的tPA剂量(125ng)的情况下，添加0.2mg或更多的纤溶酶原2小时可以显著促进溶解72小时的陈旧血栓。而且随着添加纤溶酶原剂量梯度的增加，其溶栓率也呈梯度递增趋势，说明了可以通过调节纤溶酶原的剂量调节溶解陈旧血栓的速度。此外，添加纤溶酶原4mg的溶栓率在本次实验中超过了体内正常注射剂量20μg tPA(根据Boehringer Ingelheim公司生产的注射用阿普替酶说明书在体内血栓情况下 溶栓需使用的剂量换算成的大鼠所需注射剂量)的溶栓率，说明在体内出现血栓时自然产生的tPA剂量(125ng)的情况下，只添加纤溶酶原溶解陈旧血栓的效果优于现有溶栓药物的效果(图4)，表明纤溶酶原可以成为溶栓效果更优的溶栓物质。

此外，在实施例2中，相较于对照PBS组，单独添加125ng的tPA能显著增加溶解20小时血栓的能力。但是，在本实施例中，对于72小时的陈旧血栓，与体内情况类似，单独添加125ng的tPA组与对照PBS组的溶栓效果几乎相同，说明随着血栓逐渐陈旧，生理情况下自然产生的tPA的溶栓能力逐步下降，从侧面说明了实施例使用的模型能够一定程度模仿体内情况。

实施例5 72小时陈旧血栓在10ng tPA条件下溶栓率随着纤溶酶原剂量增加而升高

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育72h后弃上清，形成陈旧血栓^[36]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、10ng tPA对照组、20μg tPA对照组，0.2mg纤溶酶原对照组，0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组，2mg纤溶酶原组以及4mg纤溶酶原组，每组3管。PBS空白对照组加入1mL PBS；10ng tPA对照组加入1mL PBS和10ng tPA；20μg tPA对照组加入1mL PBS和20μg tPA；0.2mg Plg对照组加入1mL PBS和0.2mg Plg；0.2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和10ng tPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和10ng tPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和10ng tPA以及2mg纤溶酶原；4mg纤溶酶原组加入1mL PBS和10ng tPA以及4mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，反应2小时，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下tPA的含量为5-10ng/mL^[35]，因此，本实验中使用的tPA剂量为10ng/mL以模仿体内正常生理情况下自然产生的tPA含量。

此实验结果表明，对于在体外72个小时形成的陈旧血栓，在体内正常生理tPA含量10ng/mL的条件下，添加纤溶酶原的溶栓率要高于单独添加 10ng tPA的溶栓率，且差异极显著。说明在体内出现血栓时自然产生的tPA剂量(10ng)的情况下，添加0.2mg或更多的纤溶酶原2小时可以显著促进溶解72小时的陈旧血栓。并且随着添加纤溶酶原剂量的增加，其溶栓率也呈梯度增加，说明了可以通过调节纤溶酶原的剂量调节溶解陈旧血栓的速度。而且添加4mg纤溶酶原组的溶栓率接近正常tPA注射剂量(根据Boehringer Ingelheim公司生产的注射用阿普替酶说明书在体内血栓情况下溶栓需使用的剂量换算成的大鼠所需注射剂量)的溶栓率(图5)，说明在生理水平的tPA剂量(10ng)的情况下，只添加纤溶酶原后其溶解陈旧血栓的效果就可以达到现有溶栓药物的效果，在这个意义上，纤溶酶原有希望成为一种新的陈旧血栓溶解药物。

实施例6纤溶酶原温和溶解20小时陈旧血栓

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育20h后弃上清，形成陈旧血栓^[33，34]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为两组，每组12个样品。第一组为tPA对照组，加入1mL PBS及5μg tPA；第二组为纤溶酶原组，加入1mL PBS、10ng tPA及1mg纤溶酶原。预实验证明，这两组对于20小时陈旧血栓在2小时内的溶解率类似(数据未显示)。所有反应在37℃培养箱中进行，分别在第0.5h、1h、1.5h、2h取样，每个时间点两组分别取三个样品，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下tPA的含量为5-10ng/mL^[35]，因此，本实验中使用的tPA剂量为10ng/mL以模仿体内正常生理情况下自然产生的tPA含量。

实验显示，对于20小时陈旧血栓，两组总溶栓率随着时间的延长而升高，但在0到0.5小时和0.5到1小时两个区间，纤溶酶原组的溶栓曲线斜率均低于tPA组(图6)。表1显示10ng tPA存在条件下，1mg纤溶酶原溶栓效率与单独5ug tPA的溶栓效率随时间变化的对比。如表1所示，纤溶酶原组2小时的总溶栓率的75％集中在约1小时内，而tPA对照组2小时总溶栓率的75％集中在约0.5小时。这些数据清楚地说明，相对于tPA，纤溶酶原的溶栓速度相对于tPA的溶栓速度更为温和(图6，表1)。

表1 10ng tPA存在条件下，1mg纤溶酶原溶栓效率与单独5ug tPA溶栓效率的随着时间的变化。

实施例7在100ng uPA条件下，纤溶酶原促进20小时陈旧血栓溶解

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育20h后弃上清，形成陈旧血栓^[33，34]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、100ng uPA对照组、0.2mg纤溶酶原对照组，0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组以及2mg纤溶酶原组，每组3管。PBS空白对照组开始时加入1mL PBS；100ng uPA对照组加入1mL PBS和100ng uPA；0.2mg纤溶酶原对照组加入1mLPBS和0.2mg纤溶酶原；0.2mg纤溶酶原组加入1mLPBS和100ng uPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和100ng uPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和100ng uPA以及2mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，温育1小时后，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在以纤溶酶原为底物的酶促反应过程中tPA米氏常数为0.18×10^{- 7}mol/L^[37]，而uPA的米氏常数为2.43×10-7mol/L^[38]，也就是说，在相同的反应条件，相同的反应时间内tPA的亲和力约为uPA的10倍，所以本次实验中，根据实施例3使用的10ng tPA/ml估算出uPA的使用剂量为100ng/ml。

结果显示，对于在体外20个小时形成的陈旧血栓，在改变纤溶酶原激活剂10ngtPA为100ng uPA后，添加纤溶酶原0.2mg、1mg、2mg各组的溶 栓率比单独添加100ng uPA的溶栓率有明显的升高，统计差异均极显著(**P<0.01；***P<0.001)。说明在100ng的uPA剂量的情况下，添加0.2mg或更多的纤溶酶原1小时可以显著促进溶栓，并且随着纤溶酶原添加剂量梯度的增加，其溶栓率也显著升高(图7)。说明100ng uPA条件下，纤溶酶原能够促进陈旧血栓溶解。

实施例8在1ng uPA条件下，纤溶酶原促进20小时陈旧血栓溶解

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育20h后弃上清，形成陈旧血栓^[33，34]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、1ng uPA对照组、0.2mg Plg对照组，0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组以及2mg纤溶酶原组，每组3管。PBS空白对照组加入1mL PBS；1ng uPA对照组加入1mL PBS和1ng uPA；0.2mg Plg对照组加入1mL PBS和0.2mg Plg；0.2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和1ng uPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和1ng uPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mLPBS和1ng uPA以及2mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，温育2小时后，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下uPA的含量为1ng/mL^[35]，因此，本实验中使用的uPA剂量为1ng/mL以模仿体内正常生理情况下自然产生的uPA含量。

结果显示，对于在体外20个小时形成的陈旧血栓，在把uPA的使用量降为体内正常含量1ng时，陈旧血栓的溶栓率的溶栓总体较为缓慢。但1mg和2mg的纤溶酶原组溶栓率显著高于1ng uPA对照组，具有统计差异。说明1ng uPA条件下，添加纤溶酶原对于陈旧血栓的溶解有显著的促进作用(图8)。

实施例9小鼠静脉注射tPA及纤溶酶原后再出血实验

选择11周龄C57野生型雄性小鼠55只，使用3％戊巴比妥进行全身麻醉，分别剪尾3mm，将尾巴置于37℃温水中，观察尾巴出血状况^[39],。止血后随机分成两组，tPA组5只，纤溶酶原组50只。tPA组眼眶静脉注射tPA 400μg/0.05mL/只；纤溶酶原组眼眶静脉注射1mg/0.05mL/只纤溶酶原， 实验过程中始终将小鼠尾静脉放置于37℃温水中，观察实验出血状况20分钟，并记录。

实验结果显示，静脉注射400μg tPA能够致使受伤小鼠原已凝结的尾部伤口发生再出血现象，此为tPA药物的一个普遍的副作用。但静脉注射1mg纤溶酶原的小鼠没有此种副作用出现(表2)，说明纤溶酶原相较于tPA的安全性更好。

表2小鼠静脉注射tPA或纤溶酶原后体内出血实验结果

实施例10纤溶酶原对体内血栓的特异性吸附实验

选择野生型雄性小鼠9只，随机分为3组，溶媒PBS对照组、0.2mg纤溶酶原组和1mg纤溶酶原组，每组3只。使用3％戊巴比妥进行全身麻醉，将小鼠颈静脉分离，用浸有10％的FeCl₃溶液的吸水纸(3mm×5mm)敷于颈静脉5分钟形成静脉血栓。形成血栓后立即开始给予纤溶酶原或溶媒PBS。溶媒PBS对照组尾静脉注射100ul的PBS，1mg纤溶酶原组和0.2mg纤溶酶原组分别尾静脉注射给予1mg、0.2mg纤溶酶原。3小时后取出相应颈静脉血栓及对侧静脉附近的肌肉。将血栓及对侧静脉附近肌肉使用研磨器进行匀浆，离心后取上清，将上清利用BCA法检测其总蛋白，酶联免疫法检测匀浆液中的纤溶酶原含量，计算出一定蛋白总量中的纤溶酶原含量。

结果显示，血栓形成后血栓中纤溶酶原的含量均明显高于肌肉中的纤溶酶原含量。而且静脉注射纤溶酶原后血栓中纤溶酶原的含量进一步增加。这些结果说明在体内血栓的存在下，纤溶酶原能够特异性地结合到血栓上(图9)并进一步发挥溶血栓作用，而tPA一旦注射进入血管，就会非特异性地在血管内催化溶栓反应。该实验结果说明纤溶酶原相较于tPA有显著的特异性溶栓优点。

实施例11 30分钟的新鲜血栓在添加纤溶酶原后的溶栓率显著升高

采集2只SD大鼠全血至EP管内，37℃温育30分钟后，弃上清，形成新鲜血栓^[33]。加入PBS反复清洗5-10次，直至所加PBS溶液变澄清。 用吸水纸尽量吸干血栓水分，然后将血栓平均分布各个EP管内，称量血栓重量，尽量使每管血栓重量一致。将血栓分为PBS空白对照组、125ng tPA对照组、0.2mg纤溶酶原组，1mg纤溶酶原组以及2mg纤溶酶原组,每组2管。PBS空白对照组加入1mL PBS；tPA对照组加入1mL PBS和125ng tPA；0.2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及0.2mg纤溶酶原；1mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及1mg纤溶酶原；2mg纤溶酶原组加入1mL PBS和125ng tPA以及2mg纤溶酶原。所有反应在37℃培养箱中进行，温育2小时后，吸去上清，吸水纸尽量吸干血栓，并称血栓的重量，计算溶栓率。

根据文献报道，在正常生理情况下tPA的含量为5-10ng/mL^[35]，而当剧烈运动，或静脉淤血情况下，体内tPA的含量会增至20倍至100倍，即达到100ng/mL以上^[36]。因此，本实验中使用的tPA剂量为125ng/mL以模仿体内血栓情况下自然产生的tPA含量。

此实验说明对于在体外30分钟形成的新鲜血栓，在梯度增加纤溶酶原使用剂量的条件下，溶栓率呈梯度升高趋势，并且纤溶酶原各组溶栓率均高于单独添加tPA对照组的溶栓率，统计差异极其显著。这些结果说明在体内出现血栓时自然产生的tPA水平的情况下，添加0.2mg或更多的纤溶酶原1小时可以显著促进溶栓(图10)，说明纤溶酶原不仅能够促进溶解陈旧血栓，也能够促进溶解新鲜血栓。

实施例12纤溶酶原促进糖尿病造成的微血栓的溶解

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第16天摘眼球取血，全血静置后血清用于检测血液中D-二聚体含量。

结果显示，给药15天后，给纤溶酶原组血清中D-二聚体含量显著上升(图11)，说明给纤溶酶原后，由于糖尿病造成的微血栓显著溶解。

实施例13纤溶酶原促进糖尿病晚期小鼠心脏组织血栓溶解

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给 纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取心脏在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的心脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次，以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下400倍下观察。

纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白^[40-42]，因此可将纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。

结果显示，与给溶媒PBS对照组(图12A)相比，给纤溶酶原组(图12B)的小鼠心脏组织纤维蛋白阳性着色较浅，说明给纤溶酶原组心脏组织沉积的纤维蛋白减少，反映纤溶酶原能够促进糖尿病所致心脏组织损伤修复，也说明纤溶酶原能够促进心脏组织血栓的溶解。

实施例14纤溶酶原促进糖尿病后期小鼠肾脏组织血栓溶解

24-25周龄db/db雄鼠20只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各10只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取肾脏在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肾脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白^[40-42]，因此可将纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。

结果显示，给纤溶酶原组(图13B)比给溶媒PBS对照组(图13A)纤维蛋白原阳性着色浅。说明注射纤溶酶原能够显著降低糖尿病小鼠肾脏纤维蛋白沉积，反映出纤溶酶原对糖尿病小鼠肾脏损伤有显著的修复作用，也说明纤溶酶原能够促进肾脏组织血栓的溶解。

实施例15纤溶酶原促进糖尿病晚期肝组织血栓溶解

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白^[40-42]，因此可将纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。

研究发现，与给溶媒PBS对照组(图14A)相比，给纤溶酶原组(图14B)的小鼠其肝脏组织纤维蛋白阳性着色浅，说明注射纤溶酶原能够显著降低糖尿病小鼠肝脏纤维蛋白沉积，反映出纤溶酶原对糖尿病小鼠肝脏损伤有显著修复作用，也说明纤溶酶原能够促进肝脏组织血栓的溶解。

实施例16纤溶酶原促进糖尿病后期神经损伤小鼠神经组织血栓溶解

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第16天处死小鼠并取坐骨神经在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的坐骨神经经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次，然后用PAP笔圈出组织。以3％TBS稀释的双氧水孵育15分钟，水洗3次。10％正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时，吸走多余血清。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)室温孵育1小时或4℃孵育过夜，TBS洗3次。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗3次。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下400倍下观察。

纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白^[40-42]，因此可将纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。纤维蛋白也是组织损伤后形成血栓的主要成分，因此，也可将纤维蛋白水平作为血栓的一个标志。

研究发现，与给溶媒PBS对照组(图15A)相比，给纤溶酶原组(图15B)的小鼠其坐骨神经纤维蛋白的水平降低，说明纤溶酶原具有降解纤维蛋白水平的功能，损伤得到一定程度的修复，也说明纤溶酶原能够促进神经组织周围血栓的溶解。

实验结果总结：

本发明实施例实验包括纤溶酶原体外溶栓和体内溶栓两部分。

体外溶栓模拟体内溶栓条件，选取10ng/mL tPA模仿正常生理情况下体内自然产生的tPA量，125ng/mL tPA模仿体内血栓情况下自然产生的tPA量，来研究纤溶酶原的溶栓能力。

本发明实验研究显示，10ng/mL tPA或125ng/mL tPA条件下，无论是20小时的陈旧血栓还是72小时的陈旧血栓，纤溶酶原都具有非常好的溶栓效果，并且随着纤溶酶原剂量的增大溶栓效率随之增大。

纤溶酶原对新鲜血栓具有很强的溶解能力，温育两小时溶栓率可达到80％以上。

我们也研究了uPA存在条件下纤溶酶原溶栓效果。1ng/mL uPA或100ng/mL uPA条件下，纤溶酶原同样都具有非常好的溶栓效果，并且随着纤溶酶原剂量的增加溶栓效率随之增大。

体内实验中，糖尿病后期小鼠连续15天每天给予2mg纤溶酶原，血清中D-二聚体的含量显著增加。同时，心脏、肝脏、肾脏、神经组织纤维蛋白水平显著下降，说明纤溶酶原能明显促进这些组织中由糖尿病组织损伤引发的血栓的溶解，纤维蛋白降解，证明给药实验动物纤溶酶原同样可以达到显著的溶栓效果。

小鼠颈静脉血栓模型实验显示，纤溶酶原能够非常特异地结合体内血栓。

此外，我们研究显示与tPA相比纤溶酶原对血栓的溶解更加温和，并且小鼠的tail-bleeding实验表明纤溶酶原没有出血副作用。

综上所述，纤溶酶原具有非常好的溶栓能力，特别是针对陈旧血栓，并且具有特异性高、温和、见效快以及无出血副作用的特点。

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序列表

<110> 深圳瑞健生命科学研究院有限公司

<120> 一种用于预防或治疗急性及慢性血栓的方法

<130> PCK02769

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620

tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser

180 185 190

Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys

195 200 205

Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro

210 215 220

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys

245 250 255

Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val

260 265 270

Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His

275 280 285

Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn

305 310 315 320

Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser

325 330 335

Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr

340 345 350

Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly

355 360 365

Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser

370 375 380

Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala

385 390 395 400

Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro

405 410 415

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu

420 425 430

Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val

435 440 445

Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe

450 455 460

Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly

465 470 475 480

Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile

485 490 495

Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys

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Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn

515 520 525

Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro

530 535 540

Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly

545 550 555 560

Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln

565 570 575

Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu

580 585 590

Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser

595 600 605

Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val

610 615 620

Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu

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Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala

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Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr

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Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr

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Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val

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Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val

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Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser

725 730 735

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys

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Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro

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Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile

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Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

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<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的核酸序列

<400> 3

atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60

cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120

ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180

tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240

aagtcctcca taatcattag gatgagagat gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300

tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360

ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420

acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480

gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540

tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600

atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660

ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720

ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc aacaagcgct gggaactttg tgacatcccc 780

cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840

gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gtgtccgggc acacctgtca gcactggagt 900

gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960

gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020

caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080

caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140

gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200

tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260

ctgacaatga actactgcag gaatccagat gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320

gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380

gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440

tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500

ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560

aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620

ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680

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gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400

acttggattg agggagtgat gagaaataat taa 2433

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的氨基酸序列

<400> 4

Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser

1 5 10 15

Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser

20 25 30

Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu

35 40 45

Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe

50 55 60

Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg

65 70 75 80

Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys

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Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

100 105 110

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

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Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

165 170 175

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

180 185 190

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala

195 200 205

Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

210 215 220

Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

225 230 235 240

Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

245 250 255

Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr

260 265 270

Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

275 280 285

Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro

290 295 300

His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

305 310 315 320

Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

325 330 335

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

340 345 350

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

355 360 365

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

370 375 380

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

385 390 395 400

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

405 410 415

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

420 425 430

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

435 440 445

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

450 455 460

Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

465 470 475 480

Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

485 490 495

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

500 505 510

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

515 520 525

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

530 535 540

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

545 550 555 560

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

565 570 575

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

580 585 590

Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly

595 600 605

Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu

610 615 620

Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His

625 630 635 640

Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

645 650 655

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

660 665 670

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

675 680 685

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

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Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

705 710 715 720

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

725 730 735

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

740 745 750

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

755 760 765

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

770 775 780

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

785 790 795 800

Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

805 810

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG（Lys-纤溶酶原）核酸序列

<400> 5

aaagtgtatc tctcagagtg caagactggg aatggaaaga actacagagg gacgatgtcc 60

aaaacaaaaa atggcatcac ctgtcaaaaa tggagttcca cttctcccca cagacctaga 120

ttctcacctg ctacacaccc ctcagaggga ctggaggaga actactgcag gaatccagac 180

aacgatccgc aggggccctg gtgctatact actgatccag aaaagagata tgactactgc 240

gacattcttg agtgtgaaga ggaatgtatg cattgcagtg gagaaaacta tgacggcaaa 300

atttccaaga ccatgtctgg actggaatgc caggcctggg actctcagag cccacacgct 360

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tgtgacatcc cccgctgcac aacacctcca ccatcttctg gtcccaccta ccagtgtctg 540

aagggaacag gtgaaaacta tcgcgggaat gtggctgtta ccgtgtccgg gcacacctgt 600

cagcactgga gtgcacagac ccctcacaca cataacagga caccagaaaa cttcccctgc 660

aaaaatttgg atgaaaacta ctgccgcaat cctgacggaa aaagggcccc atggtgccat 720

acaaccaaca gccaagtgcg gtgggagtac tgtaagatac cgtcctgtga ctcctcccca 780

gtatccacgg aacaattggc tcccacagca ccacctgagc taacccctgt ggtccaggac 840

tgctaccatg gtgatggaca gagctaccga ggcacatcct ccaccaccac cacaggaaag 900

aagtgtcagt cttggtcatc tatgacacca caccggcacc agaagacccc agaaaactac 960

ccaaatgctg gcctgacaat gaactactgc aggaatccag atgccgataa aggcccctgg 1020

tgttttacca cagaccccag cgtcaggtgg gagtactgca acctgaaaaa atgctcagga 1080

acagaagcga gtgttgtagc acctccgcct gttgtcctgc ttccagatgt agagactcct 1140

tccgaagaag actgtatgtt tgggaatggg aaaggatacc gaggcaagag ggcgaccact 1200

gttactggga cgccatgcca ggactgggct gcccaggagc cccatagaca cagcattttc 1260

actccagaga caaatccacg ggcgggtctg gaaaaaaatt actgccgtaa ccctgatggt 1320

gatgtaggtg gtccctggtg ctacacgaca aatccaagaa aactttacga ctactgtgat 1380

gtccctcagt gtgcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 1440

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 1500

agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 1560

gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 1620

ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 1680

ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 1740

atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 1800

accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 1860

aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1920

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1980

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 2040

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 2100

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 2145

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG（Lys-纤溶酶原）氨基酸序列

<400> 6

Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser

35 40 45

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln

50 55 60

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

65 70 75 80

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

85 90 95

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala

100 105 110

Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

115 120 125

Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

130 135 140

Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

145 150 155 160

Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr

165 170 175

Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

180 185 190

Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro

195 200 205

His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

210 215 220

Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

225 230 235 240

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

245 250 255

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

260 265 270

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

275 280 285

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

290 295 300

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

325 330 335

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

340 345 350

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

355 360 365

Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

370 375 380

Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

385 390 395 400

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

405 410 415

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

420 425 430

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

435 440 445

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

450 455 460

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

465 470 475 480

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

485 490 495

Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly

500 505 510

Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu

515 520 525

Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His

530 535 540

Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

545 550 555 560

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

565 570 575

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

580 585 590

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

595 600 605

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

610 615 620

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

625 630 635 640

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

645 650 655

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

660 665 670

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

675 680 685

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

690 695 700

Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

705 710

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> delta-plg（delta-纤溶酶原）核酸序列

<400> 7

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 540

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 600

agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 660

gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 720

ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 780

ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 840

atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 900

accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 960

aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1020

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1080

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 1140

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 1200

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 1245

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg（delta-纤溶酶原）氨基酸序列

<400> 8

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

165 170 175

Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His

180 185 190

Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met

195 200 205

His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala

210 215 220

Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile

225 230 235 240

Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile

245 250 255

Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu

260 265 270

Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala

275 280 285

Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe

290 295 300

Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu

305 310 315 320

Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His

340 345 350

Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

355 360 365

Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp

370 375 380

Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val

385 390 395 400

Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

405 410

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg（小纤维蛋白溶酶原）核酸序列

<400> 9

gtcaggtggg agtactgcaa cctgaaaaaa tgctcaggaa cagaagcgag tgttgtagca 60

cctccgcctg ttgtcctgct tccagatgta gagactcctt ccgaagaaga ctgtatgttt 120

gggaatggga aaggataccg aggcaagagg gcgaccactg ttactgggac gccatgccag 180

gactgggctg cccaggagcc ccatagacac agcattttca ctccagagac aaatccacgg 240

gcgggtctgg aaaaaaatta ctgccgtaac cctgatggtg atgtaggtgg tccctggtgc 300

tacacgacaa atccaagaaa actttacgac tactgtgatg tccctcagtg tgcggcccct 360

tcatttgatt gtgggaagcc tcaagtggag ccgaagaaat gtcctggaag ggttgtaggg 420

gggtgtgtgg cccacccaca ttcctggccc tggcaagtca gtcttagaac aaggtttgga 480

atgcacttct gtggaggcac cttgatatcc ccagagtggg tgttgactgc tgcccactgc 540

ttggagaagt ccccaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 600

aatctcgaac cgcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacga 660

aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720

gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780

tggggagaaa cccaaggtac ttttggagct ggccttctca aggaagccca gctccctgtg 840

attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900

ctctgtgctg ggcatttggc cggaggcact gacagttgcc agggtgacag tggaggtcct 960

ctggtttgct tcgagaagga caaatacatt ttacaaggag tcacttcttg gggtcttggc 1020

tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080

gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg（小纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

<400> 10

Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala

1 5 10 15

Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr

20 25 30

Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly

35 40 45

Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala

50 55 60

Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg

65 70 75 80

Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly

85 90 95

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys

100 105 110

Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln

115 120 125

Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala

130 135 140

His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly

145 150 155 160

Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr

165 170 175

Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val

180 185 190

Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu

195 200 205

Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala

210 215 220

Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro

225 230 235 240

Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys

245 250 255

Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg

275 280 285

Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly

290 295 300

His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

305 310 315 320

Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser

325 330 335

Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg

340 345 350

Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

355 360 365

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）核酸序列

<400> 11

gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60

gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120

tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180

cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240

gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300

acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360

atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420

actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480

cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540

accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600

ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660

cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720

tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

<400> 12

Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys

1 5 10 15

Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro

20 25 30

Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu

50 55 60

Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln

65 70 75 80

Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu

85 90 95

Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser

100 105 110

Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro

115 120 125

Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu

145 150 155 160

Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly

165 170 175

Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr

180 185 190

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys

195 200 205

Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala

210 215 220

Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr

225 230 235 240

Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的核酸序列

<400> 13

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660

acttggattg agggagtgat gaga 684

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的氨基酸序列

<400> 14

Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile

20 25 30

Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro

35 40 45

Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn

50 55 60

Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu

65 70 75 80

Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val

85 90 95

Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val

100 105 110

Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln

115 120 125

Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile

130 135 140

Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln

145 150 155 160

Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn

195 200 205

Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu

210 215 220

Gly Val Met Arg

225

Claims (10)

1.纤溶酶原在制备预防和/或消除受试者动、静脉血栓的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述血栓包括新鲜血栓和陈旧血栓。

3.权利要求1或2的用途，其中所述血栓为血液系统疾病、循环系统疾病、自身免疫疾病、代谢紊乱疾病或感染性疾病导致的血栓。

4.权利要求1-3任一项的用途，其中所述血栓为继发于糖尿病的大、小血管、微血管血栓。

5.权利要求1-4任一项的用途，其中所述血栓为大小血管病变导致的血栓。

6.纤溶酶原在制备预防和/或治疗受试者血栓相关疾病的药物中的用途，其中所述纤溶酶原通过消除血栓预防和/或治疗受试者所述血栓相关疾病。

7.根据权利要求6的用途，其中所述血栓相关疾病为门静脉血栓导致的胰腺炎、肝硬化；肾静脉血栓导致的肾栓塞；颈内静脉血栓引起的全身性败血症、肺栓塞、脑血栓、深静脉血栓；动脉和静脉血栓导致的器官的梗死，包括但不限于：脑梗塞、心肌梗死、血栓性中风、房颤、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、短暂性脑缺血发作、肺栓塞。

8.根据权利要求6的用途，其中所述血栓相关疾病为糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肝病、糖尿病性心脏病、糖尿病性肠病、糖尿病性神经病变。

9.根据权利要求1-8任一项的用途，其中所述纤溶酶原可与伴随血栓形成的其它疾病的治疗药物联合施用。

10.根据权利要求1-10任一项的用途，其中所述纤溶酶原为与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的蛋白质。