FI67300B - Foerfarande foer framstaellning av in vivo fibrinolytiska enzymderivat foer anvaendning vid behandling ventrombos - Google Patents

Description

r-, KUULUTUSJULKAISU

jSK w ^11 utlAggningsskkift 6 7 300

Jgxfe C pjj Fr eySnnetljr 11 03 1935 ^ ^ (51) Kv.Hu/lm.CL3 A 61 K 37/48, C 12 N 9/68 SUOMI—FINLAND (21) rttMdMM-piiMMAn^ 793661 (22) H«fc>mhHht—AmBtaUnf^n 22.11.79 (23) AttMpttv·—GHdghatadag 22.11.79 (41) TvHmHkiMlwt —BBrltoWaatMt 23.05.81 PManttl· ja rekisterihallitut ........... . ._ . , * (441 MlhctvUalpMK» ]· tmnUuflnl—i pvm. — PManfe· och rcfisterityrtltMi ' AmBkM odi «LakrNM» pvMfcsnrf 30.11.84 (32)(33)(31) tyr*"*r m*»** (71) Beecham Group Limited, Brentford, Middlesex, Englanti-England(GB) (72) Richard Anthony Godwin Smith, Dorking, Surrey, Engl anti-Engl and(GB) (74) Berggren Oy Ab (54) Menetelmä in vivo fibrinolyyttiSten entsyymijohdannaiSten valmistamiseksi, jotka on tarkoitettu käytettäviksi käsiteltäessä laskimotukoksia -Förfarande för framstal1 ning av in vivo fibrinolytiska enzymderivat för användning vid behandling ventrombos

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää in vivo fibrinolyyttis-ten entsyymijohdannaisten valmistamiseksi, jotka ovat tarkoitetut käytettäviksi laskimotukosten käsittelyssä.

Laskimotukos muodostuu veren aineosista, jolloin laskimoon muodostuu kiinteä massa tai tulppa. Tällaiset tulpat tai tukokset voivat siirtyä kokonaan tai osaksi laskimossa paikasta toiseen.

Jos näin tapahtuu, nimitetään tällaista tukosta tai sen osaa nimellä embolus. Yhteisesti niitä tiloja, jotka liittyvät tukoksiin ja emboleihin, nimitetään tromboembolisiksi sairauksiksi tai häiriöiksi, ja yhdessä ne muodostavat länsimaissa pääasiallisen syyn vaikeisiin sairauksiin ja kuolemaan.

Nykyisin on olemassa kaksi eri ryhmää terapeuttisia aineita, joita on ehdotettu käytettäviksi verisuonitukosten käsittelyyn, nimittäin koaguloimisen estoaineet ja trombolyyttiset aineet. Nykyisin koaguloimisen estoaineet ovat yleisimmin käytettyjä terapeuttisia aineita, ja niistä laajimmin käytetään haperiinia (jota yleisesti pidetään tehokkaimpana) ja dihydroksikumariinia ("warfarin"). Koaguloimi- T~ - 2 67300 sen estoaineiden pääasiallisena haittana on se, että niillä ei ole suoraa hajottavaa vaikutusta tukokseen ja tämän johdosta niillä on vain vähän käyttökelpoisuutta käsiteltäessä akuuttisia tromboottisia tiloja. Toiseksi, koska ne hidastavat hyytymisjärjestelmän toimintaa, on vaikeutena tällaisten aineiden käytössä hallitsematon verenvuoto, johon liittyy huomattava riskivaara.

Sellaiset trombolyyttiset aineet, joita on ehdotettu nykyisin käytettäviksi verisuonitukosten tai tromboosien käsittelyssä, lankeavat kahteen eri ryhmään. Ensiksikin on olemassa proteo-lyyttisiä entsyymejä, jotka kykenevät hajottamaan fibriinin suoraan. Toiseksi on olemassa entsyymi-aktivaattoreita, jotka aktivoivat lyyttisen kulkutien kehossa vapauttaen plasmiinia, joka hajottaa tukoksen. Esimerkkejä sellaisista proteolyyt-tisistä entsyymeistä, joita on ehdotettu käytettäviksi trom-bolyyttisinä aineina, ovat esim. brinaasi, papaiini, okraasi, tryp-siini ja plasmiini. Nämä entsyymit ovat kuitenkin erittäin myrkyllisiä, koska niiden intravenööttinen antaminen voi aiheuttaa säätämättömän proteolyyttisen hajoamisen in vivo.

Esimerkiksi plasmiini hajottaa fibrinogeenin ja muut hyydytys-tekijät aiheuttaen verenvuoto-syndrooman. Lisäksi tällaiset aineet voivat aiheuttaa plasminogeenin vähenemisen aiheuttaen täten tromboottisen tilan. Näistä syistä käytetään tämäntyyppisiä entsyymejä erittäin harvoin terapeuttisina aineina .

Ne kaksi ainetta, joita yleisesti pidetään kaikkein käyttc-kelpoisimpina trombolyyttisessä terapiassa, ovat streptoki-naasi ja urokinaasi. Ne ovat aktivaattoreita ja niiden teho perustuu plasminogeenin muuttamiseksi plasmiiniksi. Strepto-kinaasi on hemolyyttisen streptokokin erittämä tuote ja sitä voidaan valmistaa halvalla suurissa määrissä. Urokinaasia on käytettävissä ainoastaan erittäin pienissä määrissä ja se on erittäin kallista. Vaikkakin nämä molemmat aineet kykenevät liuottamaan suuriakin tukoksia syvällä verisuonissa, on sillä voimakkkaalla fibrinolyyttisellä tilalla, jonka ne aiheuttavat, taipumus aikaansaada verenvuotoa, joka puolestaan on suuri vaara. Näin ollen niiden käyttö on rajoittunut pelkästään sellaisiin potilaisiin, joilla on vaikea trombootti- 3 67300 nen tukos pääverisuonissa tai keuhkoemboli. Koska lisäksi ak-tivaattorit stimuloivat luonnollista lyyttistä järjestelmää, voi niiden systemaattinen annostelu aikaansaada plasminogee-nin vähenemisen mikä edistää potilaan joutumista trombootti-seen tilaan mikäli käsittelyä jatketaan. Jossain määrin voidaan tätä vaikutusta välttää käyttämällä streptokinaasi-plasminogeeni-yhdistelmiä. Tämä kompromissi ei kuitenkaan ratkaise tyydyttävästi terapeuttista fibrinolyysiprobleemia, koska plasmiinin systeeminen muodostaminen tällaisien yhdistelmien avulla on taipuvainen heikentämään sitä hyydyttävää ja hajottavaa säätömekanismia, joka verisuonissa vallitsee. Lisäksi näiden yhdistelmien avulla ei voida tehdä mitään sää-tämättömän verenvuodon hallitsemiseksi.

Nyt on todettu, että on mahdollista välttää tunnettujen trom-bolyyttisten aineiden pääasialliset haitat käyttämällä määrättyjä entsyymejä, jotka voidaan deaktivoida palautuvasti. On todettu, että määrätyillä entsyymeillä, kuten plasmiinilla tai streptokinaasi/plasminogeeni-aktivaattorikompleksilla, on määrätty selektiivisyys fibriiniin nähden erikoisesti in vivo. Vaikkakaan tällaisten järjestelmien täydellisiä rakenteellisia vaatimuksia ja ominaisuuksia ei ole määrätty, on suunniteltu koe, jolla voidaan todeta sellaiset entsyymit, joilla on spesifisyyttä fibriinin suhteen in vivo. Seuraavassa nimitetään entsyymejä, jotka ovat positiivisia tässä kokeessa, "in vivo fibrinolyyttisiksi entsyymeiksi".

On todettu, että voidaan valmistaa näiden entsyymien sellaisia johdannaisia, joissa katalyyttinen aktiivisuus on peitetty samalla kun niiden affiniteetti fibriinin suhteen pysyy ennallaan, mutta jotka hydrolysoituvat vesipitoisessa väliaineessa vapauttaen aktiivisen entsyymin.

Esillä olevan keksinnön avulla aikaansaadaan näin ollen menetelmä in vivo fibrinolyyttisen entsyymijohdannaisen valmistamiseksi, joka entsyymi systemaattisesti annosteltuna ei pidemmän kuin 5 tunnin kuluessa kaniinille, jolla on radioaktiivisesti merkitty tukos, joka sijaitsee alemmassa onttolaskimossa, nostaa veren radioaktiivisuustason ainakin kaksinkertaiseksi taustatasoon verrattuna 6 tunnin kuluessa annostelun aloittamisesta aiheuttamatta eläimen kuolemaa, ja jolloin se katalyyttinen kohta, 67300 joka on oleellinen fibrinolyyttisen aktiivisuuden kannalta, on suojattu ryhmällä, joka on poistettavissa hydrolysoimalla siten, että hydrolyysin pseudoensimmäisen kertaluvun nopeusvakio tällä johdannaisella on alueella 10 ^ sek ^ - 10 ^ sek \ isotonisessa vesipitoisessa väliaineessa pH-arvossa 7,4 lämpötilassa 37°C, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että in vivo fibrinolyyttinen entsyymi saatetaan reagoimaan yhdisteen EF kanssa, jossa E on kiinnitysryhmä, joka on selektiivinen katalyyttisen kohdan suhteen, ja F on ryhmä, joka kykenee siirtymään kiinnitysryhmästä aktiiviseen kohtaan, edellyttäen, ettei johdannainen ole (i) p-guanidinobentsoyyli-ihmisplasmiini tai (ii) p-guanidinobentsoyyli-streptokinaasi-plasminogeeniaktivaat-torikompleksi.

Se koe, jota käytettiin määrättäessä fibrinolyyttinen aktiivisuus in vivo, suoritettiin muodostamalla radioaktiivisesti merkitty tukkeuma kokeiltavan kaniinin alempaan onttolaskimoon. Kokeiltava aine lisätään vereen sellaisessa kohdassa, jossa sen on mentävä sydämen lävitse sen seikan takaamiseksi, että tämä aine sekoittuu perusteellisesti laski-moveren kanssa. Ei-spesifiset lyyttiset entsyymit vaikuttavat veren proteiineihin ja aiheuttavat kuoleman ennen kuin tukkeutuman minkäänlaista hajoamista voidaan todeta. Entsyymit, joilla on määrätty spe-sifisyysaste fibriinin suhteen, hajottavat tukkeuman annoksena, joka on pienempi kuin tappava annos. Hajoamisen tapahtuminen voidaan todeta radioaktiivisten osasten vapautumisena verenkiertoon.

Termillä "in vivo fibrinolyyttinen entsyymi", jota käytetään tässä selityksessä, tarkoitetaan sellaista entsyymiä, joka nostaa, systemaattisesti annosteltuna ei pidemmän kuin 5 tunnin kuluessa kaniinille, jolla on radioaktiivisesti merkitty tukos, joka sijaitsee alemmassa onttolaskimossa, veren radioaktiivisuustason ainakin kaksinkertaiseksi taustatasoon verrattuna 6 tunnin kuluessa annostelun aloittamisesta aiheuttamatta eläimen kuolemaa.

Eräs tapa tämän kokeen suorittamiseksi on seuraava:

Uusseelantilainen valkoinen kaniini (2,5-3,5 kg) anestetoidaan ja kolme kanyylia sovitetaan pään etupuoliseen valtimoon (nimitetään tässä selityksessä kanyyliksi 1), vasempaan sydänvaltimoon (nimitetään kanyyliksi 2) ja vasempaan ulkopuoliseen sykkyräsuolilaskimoon (nimitetään kanyyliksi 3). Kaniinille suoritetaan sitten vatsan avaus alemman onttolaskimon paljastamiseksi lähellä sen yhtymäkohtaa vasemman munuaislaskimon kanssa. Osa alemmasta onttolaskimosta erotetaan sulkemalla sidelangan avulla lähellä tätä kohtaa ja sovittamalla puristin alempaan onttolaskimoon sellaiseen kohtaan, joka on vielä lähempänä sen yhtymäkohtaa vasemman ulkopuolisen sykkyräsuolilaskimon kanssa. Sitten aikaansaadaan radioaktiivisella aineella merkitty tukos injektoimalla 50 yUl 5 67300 seosta, joka sisältää radio-jodattua ihmisen fibrinogeenia (100 ^ul) ja kanin termoplastiinia (150 ^,ul) , laskimon eristettyyn kohtaan. 50 ^,ul määrä on määrätty arvioimalla, ja se on sellainen määrä, joka on sen minimimäärän, joka voidaan mitata tarkasti ja sen maksimimäärän välissä, joka voidaan injektoida häiritsemättä liian suuressa määrin fysiologisia tiloja eristetyssä laskimon osassa. Mitattaessa radioaktiivisuus, joka vapautuu verenkiertoon on tärkeätä, että radioaktiivisuuden se määrä, joka on injektoitu laskimoon, ei ole pienempi kuin 0,25 yUC.^, ja määrä, joka on alueella 0,25-1,0 on yleensä sopiva. Vanutuppo sovitetaan injek tioneulan ympärille sen lävistyskohdassa alemman onttolaski-mon seinän lävitse injektiota suoritettaessa niin, että se absorboi injektiokohdassa tapahtuvan vuodon ja poisvuotaneen radioaktiivisuuden. Toinen fibrinogeeni-tromboplastiini-seoksen 50 yul suuruinen osa (sokea koe) johdetaan laskemis-ampulliin ja sen γ-säteilytaso määrätään joko nestetuikelas-kurin avulla tai suorittamalla suora γ-säteilyn laskeminen käyttäen natriumjodidikidetekniikkaa. Tämä koe antaa sen radioaktiivisuuden määrän joka on injektoitu eläimeen. Ensimmäinen tukko pidetään paikoillaan tarpeeksi kauan keräämään kaikki alussa tapahtuva vuoto (5 min on yleensä riittävä) ja korvataan sitten toisella tupolla. Ensimmäinen tuppo siirretään sitten laskuampulliin ja mitataan γ-säteilyn taso. Kanyyli 3 siirretään edellä mainitun puristimen kohdalle, ja 10 minuutin kuluttua fibrinogeeni-tromboplastiini-seoksen injektoimisen jälkeen annetaan hepariiniliuosta (0,5 ml; 500 yU/ml) kanyylin 3 avulla. Hepariini-injektion tarkoituksena on rajoittaa hyytymisen määrää tarkoituksella estää merkitsemättömien endogeenisten kaniinin fibriinin huomattavien määrien kerääntyminen kokeiltavaan tukokseen. Syy tähän on se, että mikäli huomattavia määriä merkitsemätöntä materiaalia yhtyisi tukokseen, sen hajoaminen voisi jäädä huomaamatta, koska merkitsemättömiä hajoamistuotteita vapautuisi verenkiertoon. Tämä virhe voisi tulla huomattavaksi mikäli esimerkiksi säteilevällä aineella merkitty tukos kapseloituisi merkitsemättömän materiaalin sisään.

Sidos avataan sitten osittain niin, että alempi onttolaski-mo supistetaan välille 40 ja 60 % normaalihalkaisijaStaan.

____ - · τ~ ___ 67300 Tällainen kutistaminen vaaditaan tarkoituksella estää tukoksen pois siirtyminen. Puristin poistetaan. Hepariiniliuos-ta (1,0 ml; 500 ^u ml) annetaan kanyylin 2 kautta eläimen an-tikoaguloimiseksi ja tukosten muodostumisen estämiseksi sen lisäksi mikä on tarpeellista kokeen suorittamiseksi. Sitten tutkitaan mahdolliset jatkuvat verenvuotokohdat ja ne pysäytetään käyttämällä trombiinilla kyllästettyä vanutukkoa. Verinäyte (1,8 ml) otetaan kanyylin 2 kautta 15 min radioaktiivisen materiaalin injektoimisen jälkeen ja antikoaguloidaan lisäämällä trinatriumsitraatti-puskuria (0,2 ml; 3,8 % paino/-tilavuus). Laimennettu verinäyte (PQ) tutkitaan γ-säteilyn suhteen käyttäen neste-tuikelaskentaa tai suoraa γ-laskentaa käyttäen natrjumjodidikide-menetelmää. Tällöin saadaan veren radioaktiivisuus. Tukos pestään sitten infusoimalla suolaliuosta (4,0 ml; 0,2 ml min 1) kanyylin 3 kautta mahdollisen eksogeenisen radioaktiivisen materiaalin huuhtelemiseksi verenkiertoon ja tukoksen kasvamisen estämiseksi pesemällä pois mahdolliset trombogeeniset aineet. Toinen verinäyte (P-^q) otetaan sitraattipuskuriin edellä esitetyllä tavalla ja radioaktiivisuus määrätään edellä kuvatulla tavalla 10 minuutin kuluttua PQ-ajankohdasta. Tämä laskenta suoritetaan sen seikan tarkistamiseksi, ettei 1 isä-radioaktiivisuutta ole huuhtoutunut verenkiertoon, jolloin saadaan osoitus tukoksen stabiilisuudesta.

Kaksikymmentä minuuttia PQ-ajankohdan jälkeen lopetetaan suolaliuoksen infuusio, otetaan lisäverinäyte (aika t = o) ja aloitetaan koe-entsyymin infuusio. Säteilymäärä verinäytteestä t = o on taustasäteilyn mittapuu.

Entsyymiannos annetaan systemaattisen infuusion avulla ja 2 ml:n verinäytteitä otetaan joka 30:s minuutti 6 tunnin ajan infuusion aloittamisesta lähtien. Kunkin näytteen radioaktiivisuus mitataan suoran γ-laskennan perusteella käyttäen natriumjodidikide-menetelmää tai neste-tuikelaskentaa, ja vapaa plasmiiniaktiivisuus mitataan ex vivo.

Se annos, joka on annosteltava koe-eläimelle positiivisen tuloksen aikaansaamiseksi, määrätään kokeellisesti ja siksi, kunnes tämä aktiivisuus on saatu kuolemaa aiheuttamatta.

67300

Ohjeena tämän käytettävän annoksen saamiseksi voitiin tode- _7 ta, että ihmisen plasmiiniannos, joka oli alueella 1 x 10 5 x 10 ^ moolia aktiivisia katalyyttisiä kohtia per kg koe- eläintä, antoi positiivisen tuloksen tässä kokeessa. Samalla tavoin streptokinaasi/plasminogeeni-aktivaattorikompleksi — 10 —8 on positiivinen alueella 1 x 10 - 1 x 10 moolia/kg.

Näin ollen määrätään proteolyyttinen aktiivinen väkevyys, mikäli se on tuntematon, joko kromogeenisen tai fluorogeeni-sen titrauksen avulla tai määräämällä entsyymin analyyttisesti puhtaan näytteen molekyylipaino ja spesifinen aktiivisuus.

Annos valitaan kokeellisesti samalla tavoin kuin edellä on esitetty. 20 % valitusta annoksesta annetaan kokeen alussa ja loppuosa 2 tunnin kuluessa. Mikäli minkäänlaista aktiivisuutta ei voida todeta, toistetaan koe lisäämällä annoksia siksi, kunnes aktiivisuus todetaan, tai siksi, kunnes myrkyl-lisyysraja on ylitetty. Infuusiojakso voidaan pidentää aina 5 tunniksi.

Esimerkkejä sellaisista entsyymeistä, joilla on in vivo fibrinolyyttinen aktiivisuus edellä esitetyllä tavalla määrättynä, ovat urokinaasi, streptokinaasi-plasminogeeni-aktivaattori-kompleksi, verisuoni-aktivaattori, erikoisesti ihmisen verisuoniaktivaattori, ja plasmiinit, erikoisesti imettäväisten plasmiinit, esim. lampaan, sian, naudan, hevosen, apinan ja ihmisen plasmiini.

Edullisimpia entsyymejä, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti, ovat ihmisen plasmiini ja streptokinaasi/ihmisen plasminogeeni-aktivaattorikompleksi. On todettu, että on erittäin edullista muodostaa suojattu johdannainen, erikoisesti asyylijohdannainen, käyttäen seosta, joka sisältää ihmisen plasmiinin ja streptokinaasi/ihmisen plasminogeeni-aktivaattorikompleksin. Tällainen seos valmistetaan sopivasti aktivoimalla ihmisen plasminogeeni streptokinaasin avulla tavanomaisella tavalla, jolloin ei poisteta kaikkea aktivaattorikompleksia.

On todettu, että suojatuilla entsyymeillä, joita käytetään keksinnön mukaisissa seoksissa, on seuraavat edut vastaavien vapaiden entsyymien käyttöön verrattuna: 3 67300 a) ne ovat tehokkaampia kuin vapaa entsyymi; b) niiden biologinen aktiivisuus on pitkäaikaisempi; c) niitä voidaan antaa yhtenä, usein suurena intravenööt-tisenä annoksena, koska niiden myrkyllisyys on suhteellisen alhainen, kun taas nykyisessä terapiassa entsyymit, aktivaat-torit ja aktivaattorikompleksit on annettava jatkuvina intra-venööttisinä infuusioina useiden tuntien tai vuorokausien kuluessa.

Entsyymit, kuten plasmiinit, voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä, kuten ovat esittäneet esim. B.A.K. Chibber ym., Methods in Enzymol, Voi. 34, s. 424-432; K.C. Robbins ja K. Summaria, Methods in Enzymol, Voi 45, s. 257-273. Vaihtoehtoisesti plasminogeeni voidaan erottaa menetelmillä, jotka on esitetty brittiläisissä patenttijulkaisuissa n:ot 1013507, 1065467, 1078141 ja 1096953, ja ne voidaan sitten muuttaa tavanomaisilla menetelmillä plasmiiniksi.

Ihmisen verisuonen aktivaattori voidaan erottaa menetelmällä, jonka ovat esittäneet D.S. Pepper ym., Progress in Chem. Fibrinolysis and Trombolysis, 1978, 3.,91-98, Raven Press New York. Streptokinaasi-plasminogeeni-aktivaattorikompleksia ovat kuvanneet D.K. McClintock ja P.H. Bell, Bio chem.

Biophys Res. Comm. 43, 694-702, 1971. Urokinaasi voidaan erottaa ihmisen virtsasta siten kuin ovat esittäneet T. Macaig ym., Methods in Enzymol, Voi. 34, s. 451-459, ja G.H. Barlow, Methods in Enzymol, Voi. 45, s. 239-245, Academic Press.

Katalyyttisen kohdan suojaryhmän tärkein piirre on se, että se täytyy voida poistaa hydrolysoimalla nopeudella jossa hydrolyysin pseudo-ensimmäisen kertaluvun nopeusvakio ei ole pienempi _6 -1 —3-*l kuin 10 sek eikä suurempi kuin 10~ sek' . Tämä nopeus- -5 -3 —1 vakio on edullisesti alueella 10 - 10 sek .

Sellaiset johdannaiset, joiden pseudo-ensimmäisen kertaluvun nopeusvakio on suurempi kuin 10~^ sek vapauttavat liian suuria määriä vapaata entsyymiä ennen vaikuttamistaan fibriiniin. Sellaiset johdannaiset joiden pseudo-ensiasteen nopeusvakio on pienempi kuin 10 6 sek vapauttavat entsyymiä liian hitaasti jotta niillä olisi kliinistä käyttöä.

67300

Keksinnön mukaisia seoksia voidaan käyttää joko profylaktisina tai terapeuttisina aineina. Profylaktisissa tarkoituksissa on sellainen johdannainen edullisempi, jonka hydrolyy-sinopeus on alhainen ja jolla tämän johdosta on pitkä puoliintumisaika. Tähän tarkoitukseen sopivien johdannaisten hydrolyysin pseudo-ensirmäisen kertaluvun nopeusvakio on alueella 5 x 10-5-10 ^ sek 1 ja puoliintumisaika 3,5-16 tuntia. Terapeuttisissa tarkoituksissa on nopeammin hydrolysoituva johdannainen edullisempi, so. sellainen, jonka hydrolyysin pseudo-ensias- -4 -5 -] teen nopeusvakio on alueella 5 x 10 - 7 x 10 sek , mikä vastaa puoliintumisaikaa suunnilleen 30 minuutista 2 tuntiin.

Pseudo-ensirrmäisen kertaluvun nopeusvakio määrätään hydrolysoimalla entsyymi johdannainen fysiologisissa olosuhteissa, so. isotonisessa vesipitoisessa väliaineessa pH-arvossa 7,4 ja lämpötilassa 37°C. Näytteitä otetaan säännöllisin väliajoin ja niitä haudotaan kromogeenisen tai fluorogeenisen proteaasisubstraa-tin, kuten S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilidi 2HC1), kanssa ja mitataan substraatin muuttumisnopeus.

Hydrolyysiä seurataan siksi, kunnes substraatin muuttumisnopeus saavuttaa maksimin. Nopeusvakio k lasketaan sitten kaavasta: lo?e U-At/Ä ) t maks jossa Amaks on se maksiminopeus, jolla substraatti muuttuu näytteessä, ja At on se nopeus, jolla substraatti muuttuu ajankohtana t.

Sen suojaryhmän tarkka rakenne, jota käytetään keksinnön mukaisissa johdannaisissa, riippuu osittain valitun entsyymin luonteesta ja siitä tarkoituksesta, johon tätä johdannaista käytetään.

Kun kysymyksessä on esim. plasmiini ja streptokinaasi/plas-minogeeni-aktivaattori, käsittää se katalyyttinen kohta, joka on oleellinen proteolyyttisen aktiivisuuden kannalta, serii-nijäännöksen, jossa on vapaa hydroksyyliryhmä. Tämä kohta on tavallisesti suojattu asyyliryhmillä, kuten bentsoyyli-, substituoitu bentsoyyli-, akryloyyli- tai substituoiduilla ··*·' ? · 10 67300 akryloyyliryhmillä. Jokaisen määrätyn substituoidun bentso-yyli-entsyymi-johdannaisen hydrolyysin pseudo-ensimmäisen kertaluvun no-peusvakio voidaan määrätä kunkin substituentin Hammett cjr=-arvon perusteella kunhan kahden tai useamman substituoidun bentsoyyli-johdannaisen pseudo-ensimmäisen kertaluvun nopeusvakio on määrätty, edellyttäen, ettei esiinny mitään erikoisreaktiota kysymyksessä olevan substituentin ja entsyymin välillä.

Yleisesti tunnustetaan, että meta- ja parasubstituenttien (crm ja σ' ) Hammett-arvot antavat tyydyttävällä tarkkuudella hydrolyysinopeuden. Lisäksi voidaan <jm- ja cf^-arvot laskea yhteen riittävällä tarkkuudella muiden substituoitujen bentso-yyliryhmien, joissa on useampi kuin yksi substituentti, kineettisten ominaisuuksien laskemiseksi. Orto-substituenttien (ö^) Hammett-arvoja ei voida laskea yhteen samalla tarkkuudella kuin °m ÖL -arvoja steerisistä vaikutuksista johtuen.

ir

Kuitenkin silloin, kun ortosubstituentti on pieni ja aikaansaa tämän johdosta mitättömän steerisen vaikutuksen, so. fluorin, metyylin ja metoksin kysymyksessä ollessa, voidaan σ' -arvoa käyttää pelkästään yleisesti hyväksytyn virhearvion puitteissa tai laskea yhteen öjfj,- ja/tai σ' -arvon kanssa reak-tionopeuksien laskemiseksi.

Näissä rajoissa voidaan substituoitua bentsoyyliryhmää, jossa fenyylirenkaassa on yksi tai useampi substituentti, erikoisesti meta- ja/tai para-substituentti, jolloin Hammett σ'-arvojen summa on alueella 0,1 ja -1,1, käyttää keksinnön mukaisesti ihmisplasmiinin salpaamiseksi. Substituoitua bentsoyyliryhmää, jossa fenyylirenkaassa on yksi tai useampi substituentti, erikoisesti meta- ja/tai para-substituentti niin, että Hammett-CT-arvojen summa on välillä -0,9 ja +0,3, voidaan käyttää keksinnön mukaisesti sian plasmiinin katalyyttisen kohdan salpaamiseksi.

•

Sopivia bentsoyyli- ja substituoituja bentsoyyliryhmiä ovat bentsoyyli, joka mahdollisesti on substituoitu halogeenilla, C1_g-alkyyli,C1_6-alkoksi, C-^^-alkanoyylioksi, C^_g-alka-noyyliamino (RC0NH-). Esimerkkejä näistä ovat bentsoyyli, p-fluoribentsoyyli, o-, m- tai p-toluoyyli, o-, m- tai p-metoksibentsoyyli (so. anisovyli), o-, m- tai p-etoksibent-

II

11 6730 0 soyyli, 2,4-dimetoksibentsoyyli, 3,4-dimetyylibentsoyyli, 4-butyylibentsoyyli, 3-metyyli-4-metoksibentsoyyli, o-ase-toksibentsoyyli (so. asetyylisalisyloyyli) ja p-asetamido-bentsoyyli. Eräs toinen aromaattinen ryhmä on naftoyyli.

Poikkeuksena tähän yleiseen sääntöön on se, kun bentsoyyli-ryhmä sisältää emäksisen ryhmän, esim. amino-, dimetyyli-amino- tai guanidinoryhmän. Tällaisten johdannaisten hydro-lyysinopeus on aina kymmenen kertaa pienempi kuin laskettu arvo.

Esimerkkejä tällaisista johdannaisista ovat p-guanidino-bent-soyyli-ihmis- ja -sika-plasmiini.

Erään toisen sarjan asyyliryhmistä, joita voidaan käyttää salpaamaan ihmis- ja sika-plasmiinit keksinnön mukaisesti, muodostavat aryloyyli ja substituoitu aryloyyli, erikoisesti kinnamoyyli ja substituoidut kinnamoyyli-ryhmät, joissa on yksi tai useampi substituentti, erikoisesti meta- ja/tai para-substituentti, joissa Hammett (^-arvojen summa on välillä -1,0 ja +0,15 ja joita koskevat myös edellä esitetyt rajoitukset .

Sopivia substituoituja akryloyyliryhmiä ovat esim. C^_g- alkyyliakryloyyli, furyyli-akryloyyli, kinnamoyyli ja C.

J.— O

alkyyli-kinnamoyyli. Näiden spesifisiä esimerkkejä ovat 3,3-dimetyyliakryloyyli, 3-(2-furyyli)akryloyyli, kinnamoyyli ja p-metyylikinnamoyyli.

Keksinnön mukaiset seokset muodostetaan tavanomaisilla menetelmillä sellaisiksi farmaseuttisiksi seoksiksi, jot ka on tarkoitettu intravenööttiseen annosteluun ihmisiä varten.

Tavanomaisia seoksia intravenööttistä annostelua varten ovat steriilin johdannaisen liuokset steriilissä isotonisessa, vesipitoisessa puskurissa. Mikäli tarpeellista, seos voi sisältää myös liukoisuutta lisäävän aineen johdannaisen pitämiseksi liuoksessa, ja paikallisanesteettisen aineen, kuten lignokaiinin, kivun vähentämiseksi injektiokohdassa. Taval- 12 67300 lisesti entsyymijohdannainen annetaan annosyksikön muodossa, esim. kuivana jauheena tai vedettömänä konsentraattina, hermeettisesti suljetussa astiassa, kuten ampullissa tai pullossa, jossa on esitetty entsyymimäärä aktiivisuusyksiköissä, sekä aika, jonka kuluessa vapaa entsyymi vapautuu. Mikäli johdannainen annostellaan infusoimalla, markkinoidaan johdannaista infuusiopullossa, joka sisältää steriiliä, farmaseuttista, injektioon tarkoitettua vettä. Mikäli johdannainen annostellaan injektoimalla, markkinoidaan johdannaista ampullissa, joka sisältää myös steriiliä, injektioon sopivaa vettä. Injektoitava tai infusoitava seos muodostetaan sekoittamalla aineosat keskenään ennen annostelua.

Annettavan tuotteen määrä riippuu vaadittavasta fibrinolyy-siasteesta ja siitä nopeudesta, jolla tämä halutaan aikaansaada, tromboembolisen tilan vaikeudesta ja tukkeuman sijainnista ja koosta. Esimerkiksi potilas, jolla on keuhkoemboli tai suuri hengenvaarallinen nouseva reisivaltimon tukkeutuma, vaatii nopeasti vaikuttavan materiaalin annostelun. Toiselta puolen haluttaessa estää leikkauksen jälkeinen tukkeuma tarvitaan vähäinen määrä hitaasti vaikuttavaa materiaalia. Tarkka käytetty annos ja annostelutapa on määriteltävä, ottaen huomioon sairauden laatu ja olosuhteet, hoitavan lääkärin toimesta. Yleensä kuitenkin sellainen potilas, jota käsitellään keskisuuren trombin johdosta, saa tavallisesti vuorokaudessa annoksen, jonka suuruus on 1-20 mg kg-·*" kehon painoa, joko injektoimalla aina kahdeksan annosta tai käyttämällä infuu-siota.

Seuraavissa kirjallisuusviitteissä on esitetty kahden entsyymi-johdannaisen valmistus: 1. p-guanidinobentsoyyli-ihmisplasmiini,T. Chase ja E. Shaw, Biochem. 8, n:o 5, 2212-2224, 1969.

2. p-guanidinobentsoyyli-streptokinaasi-plasminogeeni-aktivaattorikompleksi, D.K. McClintock ja P.H. Bell, Biochem. Biophys. Res. Comm. 43, 694-702, 1971.

13 67300

Viime aikoina on näitä kahta johdannaista valmistettu edellä mainittujen entsyymien aktiivisten kohtien titrausten perusteella. Näiden johdannaisten erottamista ja karakterisoimista ei koskaan ole raportoitu. Lisäksi ei koskaan aikaisemmin ole todettu, että nämä entsyymijohdannaiset ovat käyttökelpoisia fibrinolyyttisiä aineita.

Keksinnön mukaiset johdannaiset voidaan valmistaa käyttämällä käänteistä suojaamista. Tässä menetelmässä käytetään, kuten edellä on esitetty, ainetta EF.

Esimerkkejä ryhmästä E silloin, kun suojattava entsyymi on plas-miini tai streptokinaasi/plasminogeeni-aktivaattori, ovat p-amidinofenyyli ja p-asetamidinofenyyli, tai rakenteellisesti samalla tavoin substituoidut fenyyliryhmät, jotka sisältävät positiivisesti varatun ryhmän meta- tai para-asemassa.

Esimerkkejä käänteisistä suojausaineista ovat seuraavat: p-amidinofenyyli-p'-fluoribentsoaatti, p-amidinofenyyli-p'-toluaatti, p-amidinofenyyli-p‘-anisaatti, p-amidinofenyyli-bentsoaatti, p-amidinofenyyli-kinnamaatti, p-amidinofenyyli-p1-metyylikinnamaatti, p-amidinofenyyli-3-(2-furyyli)-akry-laatti, p-amidinofenyyli-2-naftoaatti, p-amidinofenyyli-3,3-dimetyyliakrylaatti, p-amidinofenyyli-4-butyylibentsoaatti, p-amidinofenyyli-2,4-dimetoksibentsoaatti, p-amidinofenyyli-asetyylisalisylaatti, p-amidinofenyyli-4-etoksibentsoaatti, p-asetamidinofenyyli-p1-anisaatti, p-amidinofenyyli-o-toluaat-ti, p-amidinofenyyli-o-anisaatti, p-amidinofenyyli-3,4-dimetyy-libentsoaatti, p-amidinofenyyli-3-metyyli-4-metoksibentsoaatti ja p-amidinofenyyli-4-asetamidobentsoaatti.

Käänteiset suojausreaktiot suoritetaan vesipitoisessa väliaineessa pH-alueella, joka ei ole haitallinen entsyymille, suojausaineelle tai tuotteelle, esim. pH-alueella 4-8 ja edullisesti alueella 5,0-7,5.

Reaktio toteutetaan tavallisesti käyttäen ekvimolaarisia 14 6 7300 määriä entsyymiä ja suojausainetta, mutta ylimäärin suojaus-ainetta voidaan myös käyttää. On myös edullista suorittaa reaktio laimeassa liuoksessa, so. pienemmässä kuin 10 mo-laarisessa entsyymin suhteen ja pienemmässä kuin 10 molaa-risessa suojausaineen suhteen. Yleensä reaktiota ei suoriteta sellaisessa liuoksessa, jossa entsyymin tai suojausaineen väkevyys on pienempi kuin 10 ^ moolia.

Suojausreaktio on suoritettava kohtuullisissa lämpötiloissa, so. huoneen lämpötilassa tai sen alapuolella tai tarkemmin sanoen lämpötilassa alle 10°C, mutta reaktioväliaineen jäätymispisteen ylittävässä lämpötilassa.

Reaktioaika riippuu käytetystä suojausreagenssista, siitä lämpötilasta, jossa reaktio suoritetaan ja suojaukseen valitusta entsyymistä. Optimiaika määrätyissä olosuhteissa voidaan valita seuraamalla entsymaattisen aktiivisuuden pienenemistä inkuboimalla näyte-eriä kromogeenisen tai fluorogeenisen substraatin kanssa.

Reaktion päättymisen jälkeen puhdistetaan johdannainen tavanomaisilla menetelmillä, esim. dialysoimalla, affiniteetti-kromatograafisesti tai ultrasuodattamalla, ja otetaan sitten talteen tavanomaisilla menetelmillä, kuten jäädytyskuivaa-malla, vesipitoisesta väliaineesta. Mikäli välttämätöntä voidaan tuote käsitellä esim. steriloimalla intravenööttistä annostelua varten ihmisille.

Käänteisiä suojausaineita

EF

jossa E on p-amidinofenoksi ja F on asyyliryhmä, voidaan valmistaa asyloimalla p-hydroksibentsamidiinia tai sen suolaa asyloimisjohdannaisella

FX

jossa F on määritelty edellä ja X on hydroksyyli tai sen aktivoitu asyloimisjohdannainen, mahdollisesti katalyytin läsnäollessa.

Esimerkkejä aktivoiduista asyloimisjohdannaisista ovat asyy- ’ Il 67300 likloridi ja -bromidi. Nämä johdannaiset voidaan valmistaa tavanomaisilla menetelmillä.

Sopivia katalyyttejä tätä menetelmää varten ovat esim. terti-ääriset, orgaaniset emäkset, kuten pyridiini, ja kiinnitys-aineet, kuten disykloheksyylikarbodi-imidi.

Asyloimisreaktio toteutetaan tavallisesti polaarisessa, orgaanisessa liuottimessa, joka on inertti reagenssien ja tuotteen suhteen. Esimerkkejä sopivista liuottimista ovat N,N-dimetyyliformamidi ja dimetyylisulfoksidi. Vaihtoehtoisesti silloin, kun katalyytti on neste, kuten pyridiinin kysymyksessä ollessa, voidaan reaktio toteuttaa ilman liuotinta.

Reaktio toteutetaan yleisesti kohtuullisissa lämpötiloissa, so. lämpötilassa alle 70°C ja yleensä alle 40°C, ja ympäristön lämpötila on kaikkein sopivin.

Reaktioaika reaktion saattamiseksi tapahtumaan täydellisesti riippuu käytetyistä spesifisistä reagensseista, liuottimesta ja siitä lämpötilasta, jossa reaktio toteutetaan. Tämä voidaan määritellä seuraamalla reaktiota esimerkiksi ohutkerros-kromatografian avulla.

Kun reaktio on päättynyt, otetaan tuote talteen ja puhdistetaan tavanomaisilla menetelmillä.

Käänteiset suojausaineet, joissa F on substituoitu bentso-yyliryhmä, ovat uusia ja muodostavat keksinnön erään toteuttamismuodon .

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä:

Esimerkit 1-18 kuvaavat käänteisten suojausaineiden valmistusta .

Esimerkki 1

Bentsoeh-appo-p-amidinofenyyli-esteri · HC1 p-hydroksibentsamidiini · HCl (0,172 g) liuotettiin kuivaan pyridiiniin (1,0 ml) ja siihen lisättiin tipottain bentso-yylikloridin (0,141 g) liuos pyridiinissä (1,0 ml). Seosta 67300 sekoitettiin 1 h ympäristön lämpötilassa ja sen annettiin seistä 4 vrk ympäristön lämpötilassa. Tuote haihdutettiin melkein kuiviin, sitä hangattiin kuivan dietyylieetterin kanssa ja kiinteä aine kiteytettiin uudelleen 2-propanoli/-dietyylieetteristä 2:1 tilavuus/tilavuus (noin 3 ml). Saanto 0,223 g, sp. 160°C.

N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d^): 9,65. Kaksoisjuova. 4H. Vaihdettavissa D20:n kanssa. Amidiini H.: n. 8,0 Monijuova.

9H. Fenyyli ja amidinofenyyli.

Esimerkkien 2-10 mukaiset yhdisteet valmistettiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1 on esitetty.

Esimerkki 2

Trans-kanelihappo-p-amidinofenyyliesteri · HCl Sp. 192°C.

N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d^): 9,55 kaksoisjuova 4H. Vaihdettavissa D20:n kanssa. Amidiini H.: 7,95. Monijuova.

6H. Amidinofenyyli ja akryloyyli H.: 7,10. Monijuova 5H.

Fenyyli H.: 6,96. Kaksoisjuova (J: 16 Hz) 1H. Akryloyyli H.

Esimerkki 3 p-anishappo-p1-amidinofenyyliesteri · HCl

Kiteytettiin uudelleen 2-propanolista. Sp. 225°C.

£ N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d ): 9,50. Kaksoisjuova 4H.

8,05: nelijuova (J: 6 Hz) 4H

Amidinofenyyli H.: 7,38. Nelijuova. (J: 9 Hz) 4H. p-anisoyyli H.: 3,90.

Yksi viiva 3H. Metoksi H.

Esimerkki 4 3,3-dimetyyliakryylihappo-p-amidinofenyyliesteri-hydro- kloridi_

Kiteytettiin uudelleen vedestä. Sp. 173°C. N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d®). 9,50 kaksoisjuova 4H vaihdettavissa Ö20:n kanssa, amidiini H; 7,95 ja 7,37 nelijuova (J=9 Hz) 4H, amidinofenyyli H; 5,96 leveä kaksoisjuova (J=l Hz) 1H, akryloyyli H; 2,09 yksi juova 3H, metyyli H; 1,90 yksi juova 3H, metyyli H.

Esimerkki 5 4-butyyli-bentsoehappo-p-amidinofenyyliesterl-hydrokloridi • · · i li 17 67300

Kiteytettiin uudelleen isopropanoli/vedestä (1:4 tilavuus/-tilavuus). Sp. 190°C. N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d^) . 9,55 leveä kaksoisjuova 4H vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H. 7,6-8,1 päällekkäinen nelijuovien 8H kanssa amidinofe-nyyli + bentsoyyli H. 1,30 yksi juova 9H t-butyyli H.

Esimerkki 6 2,4-dimetoksibentsoehappo-p-amidinofenyyli-esteri-hydro- kloridi__

Kiteytetty uudelleen metanolista, sp. 213-214°C. N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d®): 9,48 kaksoisjuova vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H; 8,01 ja 7,50 AA1BB' nelijuova (J:8Hz) 4H, amidinofenyyli H; 8,03 ja 6,75 monijuova 3H, 2,4 substituoitu fenyyli H; 3,90 yksi juova _6H, 2 x metoksi H.

Esimerkki 7

Asetyylisalisyylihappo-p-amidinofenyyliesteri-hydrokloridi Kiteytettiin uudelleen isopropanolista, sp. 109-111°C.

N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d^): 9,62 leveä kaksoisjuova 4H vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H; 8,12 ja 7,55 AA'BB' nelijuova (J:9 Hz) £H, amidinofenyyli H; 2,26 yksi juova 3H, asetyyli H.

Esimerkki 8 4-etoksibentsoehappo-p-amidinofenyyliesteri-hydrokloridi Kiteytettiin uudelleen isopropanolista, sp. 211-212°C.

N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d^): 9,60 leveä kaksoisjuova 4H vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H; 8,10 ja 7,56 AA'BB’ nelijuova (J:9 Hz) 4H amidinofenyyli H; 8,13 ja 7,15 ΑΑ'ΒΒ' nelijuova (J:9 Hz) ^H, 4-etoksifenyyli H; 4,19 neli-juova 2H, -OCHqCH^; 9,38 kolmoisjuova 3H, -OCH^CH^.

Esimerkki 9 O-toluhappo-p-amidinofenyyliesteri-hydrokloridi Kiteytettiin kahdesti isopropanoli/dietyylieetteristä. Sp. 157-159°C. N.M.R. δ (dimetyylisulfoksidi d6): leveä kaksoisjuova 4H vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H; 8,20 ja 7,62 ΑΑ'ΒΒ' nelijuova 4H, amidinofenyyli Hj 7,3-8,2 moni-juova _4H, 2-metyylifenyyli Hj 2,11 yksi juova 3H, metyyli H.

18 67300

Esimerkki 10 (a) 2-(4-hydroksifenyyli)-asetamidiini-hydrokloridi p-hydroksibentsyylisyanidia (5,0 g) liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (50 ml) ja liuos kyllästettiin kuivalla HCl-kaasulla 4 tunnin kuluessa ympäristön lämpötilassa. Seistyään lämpötilassa 4°C 72 tuntia lisättiin kuivaa dietyylieetteriä (200 ml) ja kevytpetrolia (100 ml) ja valkoisten kiteiden annettiin muodostua 2 tuntia. Kiinteä aine erotettiin suodattamalla ja saatettiin reagoimaan välittömästi kyllästetyn eta-noliammoniakin kanssa (300 ml) 3 tuntia ympäristön lämpötilassa. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin höyryhauteella ja jäännös kiteytettiin uudelleen etanolista. Saanto 4,36 g, sp. 248°C (hajoaa). N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d^) 9,0-9,8 vaippamainen jjH, joka on vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H, hydroksyyli H. 6,85 + 7,37 AA'BB' nelijuova 4H (J:9 Hz) fenyyli H; 3,70 yksi juova 2H, bentsyyli H.

(b) 4-metoksibentsoehapon p- (formafnidinometyyli) fenyyli- esteri________

Kiteytettiin uudelleen isopropanoli/dietyylieetteristä.

Sp. 174-176°C. N.M.R. δ (dimetyylisulfoksidi d^): 9,42 leveä kaksoisjuova 4H vaihdettavissa D^Osn kanssa, amidiini H; 8,15 ja 6,29 ΑΑ'ΒΒ' nelijuova (J:8 Hz) £H, 4-metoksifenyyli H; 7,69 ja 7,13 ΑΑ'ΒΒ' nelijuova (J:8 Hz) 4H, amidinofenyyli H; 3,90 yksi juova 3H, metoksi H.

Esimerkki 11 p-toluhappo-p1-amidinofenyyliesteri · HCl p-hydroksibentsamidiini HCl (1,72 g) ja p-toluhappoa (1,36 g) liuotettiin seokseen, jossa oli kuivaa pyridiiniä (5,0 ml) ja dimetyylisulfoksidia (10,0 ml) ja sekoitettiin N,N-disyk-loheksyylikarbodi-imidin (2,1 g) kanssa 72 tuntia ympäristön lämpötilassa. Tuote suodatettiin ja suodos saostettiin kuivan dietyylieetterin (200 ml) avulla. Saatu öljy kiteytyi saostamisen jälkeen ja kiteytettiin uudelleen 2-propanoli/l,4-dioksaanista 1:1 tilavuus/tilavuus. Sp. 164°C.

N.M.R. δ (dimetyylisulfoksidi d^): 9,6 leveä kaksoisjuova vaihdettavissa D20:n kanssa. 4H. Amidiini H.: 8,15 nelijuova (J:c. 4Hz) 4H. Amidinofenyyli H.: 7,60 nelijuova (J: c. 9Hz) 4H. Bentsoyyli H.: 2,44 yksi juova 3H. Metyyli H. Esimerkkien

II

1 9 67300 12-18 mukaiset yhdisteet valmistettiin esimerkissä 11 kuvatulla menetelmällä.

Esimerkki 12 p-fluoribentsoehappo-p'-amidinofenyyliesteri-perkloraatti Eetterillä saostettu öljy kiteytettiin uudelleen 5 %:sesta paino/tilavuus perkloorihaposta (10 ml), sp. 180°C (hajoaa). N.M.R. 6 (dimetyylisulfoksidi d^) . : 9,3 kaksoisjuova 4H. Vaihdettavissa D20:n kanssa. Amidiini H.: 8,25 nelijuova (J: c.

5 Hz) 5H. 3,5 H bentsoyylissä.: 7,8 päällekkäiset nelijuovat 6H. Amidinofenyyli H ja 2,6 H bentsoyylissä.

Esimerkki 13 3-(2-furyyli)-akryylihappo-p-amidinofenyyliesteri-perkloraatti________

Kytkeminen suoritettiin pyridiinissä. Suodos haihdutettiin melkein kuiviin ja jäännös kiteytettiin uudelleen laimeasta perkloorihaposta. Vaaleita levyjä, sp. 157°C. N.M.R. 6 (dimetyylisulfoksidi d^): 9,35 kaksoisjuova vaihdettavissa Ö20:n kanssa 4H, amidiini H. : 7,7 nelijuova (J:c. 8 Hz) 4H amidi-nofenyyli H.: 7,9 kaksoisjuova (J: c. 3 Hz) 1H 5-furyyli H. : 7,85/7,40 kaksoisjuova (J: 20 Hz) 1H 2-akryloyyli H. : 7,10 kaksoisjuova (J: c. 3 Hz) 1H. 3-furyyli H.: 6,70 monijuova 1H 4-furyyli H.: 6,44 kaksoisjuova (J: 15 Hz) 1H 3-akrylo-yyli H.

Esimerkki 14 p-metyyli-trans-kanelihappo-p-amidinofenyy1iesteri-perklo-raatti____

Erotettiin samalla tavoin kuin 3-(2-furyyli)-akrylihappo-esteri. Sp. 155°C.

N.M.R. 6 (dimetyylisulfoksidi d6): 9,15 kaksoisjuova vaihdettavissa D20:n kanssa. 4H. Amidiini H.: 7,2-8,2 monijuova 9H. Amidinofenyyli ja fenyyli H.: 6,82 kaksoisjuova (J: 16 Hz) 1H 2-akryloyyli H. : 6,44 kaksoisjuova (J: 16 Hz) 1H. Akry-loyyli H.: 2,42 kaksoisjuova (J: 2 Hz) 3H. Metyyli H.

Esimerkki 15 O-anishappo-p-amidinofenyyliesteri-hydrokloridi Kiteytettiin uudelleen isopropanolista. Sp. 149°C. N.M.R.

. _ , f 20 67300 6 (dimetyylisulfoksidi d6) 9,50 leveä juova 4H vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H; 7,50 ja 7,95 epäsäännöllinen monijuova Ml, amidinofenyyli H ja 2-H; 7,0-7,5 monijuova 3H 3,4,5 bentsoyyli H; 3,86 yksi juova 3H, metoksi H.

Esimerkki 16 3,4-dimetyyli-bentsoehappo-p-amidinofenyyliesteri-hydro- kloridi ______

Kiteytettiin uudelleen isopropanoli/suolaliuoksesta, sp. 107°C. N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d^) 9,56 leveä juova 4h vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H; 7,50-7,95 epäsäännöllisiä kolmoisjuovia 7H amidinofenyyli ja bentsoyyli H. 2,30 yksi juova 6H, metyyli H.

Esimerkki 17 3- metyyli-4-metoksi-bentsoehappo-p-amidinofenyyliesteri- hydrokloridi_________

Kiteytettiin uudelleen isopropanoli/2N HCl:stä (10:1 tila-vuus/tilavuus). Sp. 210°C. N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d®).

9,54 kaksoisjuova 4H vaihdettavissa D20:n kanssa,amidiini H. 8,07 epäsäännöllinen kaksoisjuova 4H. 2-H + 6-H bentsoyyli, 2H, 6H amidinofenyyli; 7,60 kaksoisjuova (J=9 Hz) 2H, 3H, 5H amidinof enyyli; 7,22 kaksoisjuova (J=9 Hz) _1H 5H bentsoyyli; 3,92 yksi juova 311 metoksyyli H; 2,26 yksi juova _3H, metyyli H.

Esimerkki 18 4- asetamidobentsoehappo-p-amidinofenyyljesteri-hydrokloridi Kiteytettiin uudelleen isopropanoli/vedestä 1:2 tilavuus/ti-lavuus. Sp. 257°C. N.M.R. δ(dimetyylisulfoksidi d6) 10,62 yksi juova 1H vaihdettavissa D20:n kanssa, amidiini H. 7,90 AA1BB ’ nelijuova _4H päällekkäin 7,50-7,9 AA' BB ' nelijuova 4H, bentsoyyli ja amidinofenyyli H. 2,09 yksi juova 3H, asetyyli H.

Esimerkki 19

Erotettu jäädytyskuivattu p-anisoyyli-ihmlsplasmilni Ihmisplasmiinia (0,15 mikromoolia) 20 %:sessa tilavuus/ti-lavuus glyseroli/0,9 %:sessa paino/tilavuus suolaliuoksessa (4,2 ml) käsiteltiin 50 mikrolitralla 0,1 M p-amidinofenyy- li-p'-anisaatin (valmistettu esimerkin 3 mukaisesti) liuosta

II

67300 dimetyylisulfoksidissa lämpötilassa 22°C. 7,5 minuutin kuluttua lisättiin vielä 50 mikrolitraa asyloimisainetta. Tuotetta dialysoitiin 2 tuntia käyttäen 2 1 edellä esitettyä glyseroli/ suolaliuosta ja lisättiin sitten seokseen, jossa oli L-lysiini-SEPHAROSE 4B (Pharmacia Fine Chemicals, 23 g kostea paino) ja 0,1 M trietanoliamiinihydrokloridipuskuria, pH 7,0 (20 ml).

Seosta inkuboitiin 10 min lämpötilassa 4°C ja suodatettiin sitten ja geeli pestiin 100 ml :11a edellä mainittua puskuria. Geeli sekoitettiin sitten liuoksen kanssa, jossa oli ε-amino-kapronihappoa 0,2 M edellä mainitussa puskurissa ja inkuboitiin lämpötilassa 4°C 10 min. Kun oli suodatettu ja pesty vielä 55 ml :11a ε-aminokapronihappoliuosta, dialysoitiin suodos käyttäen kahta 50 mM ammoniumbikarbonaattipuskuriliuosta, pH

7,0 (5 1), lämpötilassa 4°C 2 tuntia. Lopullinen talteenotettu tuote sekoitettiin tuotteen "Dextran T 70" (Pharmacia) kanssa ja jäähdytyskuivattiin. Saatiin 1,98 g valkoista kiinteätä ainetta. Tämä inaktivoitu materiaali voitiin aktivoida uudelleen täydellisesti vapaaksi plasmiiniksi suunnilleen 2 tunnissa edellä mainituissa deasyloimisolosuhteissa.

Esimerkkien 1, 2 ja 4-18 mukaiset asyloimisaineet saatettiin myös reagoimaan ihmisplasmiinin kanssa esimerkin 19 mukaisella menetelmällä, jolloin saatiin vastaava suojattu plasmiini. Käytettäessä esimerkin 10 mukaista asyloimisainetta on edullista käyttää asyloimisaineen suurta väkevyyttä tai antaa reaktion tapahtua pidemmän aikaa täydellisen reaktion varmistamiseksi. Viime mainittujen yhdisteiden deasyloimisnopeudet on esitetty sivulla 26 olevassa taulukossa 1.

22 67300

Esimerkki 20

Trans-kinnamoyyli-sikaplasmiiniliuoksen valmistus Sikaplasmiinin (1,73 mikromoolia) 10 %:sessa tilavuus/tila-vuus glyseroli-0,9 %:sessa paino/tilavuus suolaliuoksessa (26 ml) käsiteltiin p-amidinofenyyli-transkinnamaatilla (3,02 mg) suspendoituna 0,9 %:seen paino/tilavuus suolaliuokseen (1 ml) sekoittamalla 20 min lämpötilassa 4°C. Seos jäädytettiin sitten lämpötilassa -20°C ja sitä varastoitiin tässä lämpötilassa yli yön. Sulamisen jälkeen seos dialysoitiin edellä mainitussa glyseroli/saliiniseoksessa (2 1) lämpötilassa 4°C 2 tuntia. Tuotetta varastoitiin lämpötilassa 0°C siksi, kunnes se käytettiin. Johdannaisen aktiivisuus oli pienempi kuin 0,5 % alkuperäisen entsyymin aktiivisuudesta ja se voitiin uudelleenaktivoida 2 tunnin kuluessa deasyloi-misolosuhteissa.

Esimerkki 21 p-anisoyyli-streptokinaasi-ihmisplasminogeeni-aktivaatto-ri-kompleksin liuoksen valmistus__ 4

Streptokinaasia (5 x 10 yksikköä A.B. Kabi, Tukholma,

Ruotsi) 0,9 %:sessa paino/tilavuus suolaliuoksessa (10,5 ml) sekoitettiin lys-ihmisplasminogeenin (0,025 ml; 4,9 nanomoo-lia) kanssa. Seosta inkuboitiin lämpötilassa 25°C 40 min ja se laimennettiin sitten 0,1 M trishydroksimetyyliaminometaa-ni-hydrokloridilla, 0,9 % paino/tilavuus suolaliuosta, 20 % tilavuus/tilavuus glyserolia, pH 7,4 (2,0 ml). Tätä liuosta käsiteltiin 3 erällä 0,1 mM (lopullinen väkevyys) p-amidino-fenyyli-p'-anisaattia (valmistettu perusliuoksena 0,1 M dimetyylisulfoksidissa) 3 viiden minuutin jaksoa lämpötilassa 25°C. Asyloitua entsyymiä sekoitettiin L-lysiini-SEPHAROSE 4B 33 %:sen märän paino/tilavuus suspension (2,5 ml) kanssa 10 min lämpötilassa 0°C. Suspensio suodatettiin imusuodatta-malla ja pestiin edellä mainitulla tris/glyseroli/suolaliuospusku-rilla (100 ml) lämpötilassa 4°C. Geeli suspendoitiin uudelleen tris/glyseroli/suolaliuospuskuriin (5 ml), joka sisälsi lisäksi 0,1 M aminokapronihappoa 10 minuutin kuluttua lämpötilassa 0°C kirkastettiin geelisuspensio sentrifugoimalla 2

II

23 67300 min nopeudella 1000 g ja sakan yläpuolella oleva neste (4 ml) dialysoitiin käyttäen tris/glyseroli/suolaliuospusku-ria (2,0 1) lämpötilassa 4°C 2 tuntia. Saatu asyyliaktivaat-tori-kompleksin liuos voitiin regeneroida vapaaksi entsyymiksi lämpötilassa 37°C pseudo-ensimmäisen kertaluvun nopeusvakion -4 -1 ollessa 2,7 x 10 sek Esimerkki 22 3-metyyli-p-anisoyyli-streptokinaasi-ihmisplasminogeeni- aktivaattorikompleksiljuoksen valmistus_ Tämä tuote valmistettiin samalla tavoin kuin esimerkissä 21 lukuunottamatta sitä, että asyloiminen suoritettiin käyttäen 2 erää 0,2 mM (lopullinen väkevyys) 3-metyyli-p-anisiinihappo-p-amidinofenyyliesteriä ja kahta 15 minuutin jaksoa lämpötilassa 25°C, jota seurasi 1 tunnin jakso lämpötilassa 0°C.

Pseudo-ensimmäisen kertaluvun deasyloimisnopeusvakio oli 1 x 10-4 sek .

Esimerkki 23 p-anisoyyli-ihmisplasmiinin ja p-anisoyyli-streptokinaasi-ihmisplasminogeeni-aktivaättorlkompleksin seoksen valmistus Lys-ihmisplasminogeenia (216 mg; 2,56 mikromoolia) liuotettuna väkevyyteen 6,8 mg/ml 0,1 M trishydroksimetyyliamino-metaani-hydrokloridiin, 0,9 paino/tilavuus suolaliuokseen, 20 % tilavuus/tilavuus glyseroliin, pH 7,4, käsiteltiin strep-tokinaasilla (A.B. Kabi, Ruotsi, 1,2 x 104 yksikköä, noin 2,67 nanomoolia) . Seosta inkuboitiin lämpötilassa 25°C 1 tunti ja lisättiin 33 %: seen tilavuus/tilavuus glyseroliin. Tämä liuos (9,0 ml) asyloitiin 2 erällä 0,1 mM (lopullinen väkevyys) ρ-amidinofenyyli-p-anisaattia kahdessa 15 minuutin jaksossa lämpötilassa 25°C ja dialysoitiin sitten 1 tunti käyttäen 2 litraa edellä mainittua puskuria. Saadussa liuoksessa oli vähemmän kuin 1 % alkuperäisestä plasmiiniaktiivi-suudesta ja se oli sopivassa muodossa käytettäväksi kaniini-koekärjestelmässä.

Esimerkki 24 (3H-metoksi)-p-amidinofenyyli-p'-anisaatin stökiömetrinen reaktio ihmis- ja sikaplasmiinien kanssa__ (a) Ihmisplasmiini — 5

Ihmisplasmiinin liuoksia (2,67 x 10 M, 0,2 ml, 5,34 nano- - - τ 24 67300 moolia) saatettiin reagoimaan 2 erän kanssa tritioidun p-amidinofenyyli-p-anisaatin 2 mM liuosta (spesifinen radioaktiivisuus 22,8 mC^/m moolia) kahden 7,5 minuutin erän aikana lämpötilassa 25°C. Kun oli lisätty 10 %:sta paino/tila-vuus trikloorietikkahappoliuosta asetonissa (1,8 ml), saos-tettiin proteiini ja erotettiin sentrifugoimalla nopeudella 1500 g 3 minuutin kuluessa. Proteiinipallo pestiin kahdella erällä happo/asetonia (2 ml) ja liuotettiin 2 N natriumhydrok-sidiliuokseen (1,0 ml). Tämän liuoksen neste-tuikelaskenta osoitti, että keskimäärin 0,130 ^u Ci oli liittynyt proteiiniin mikä vastasi 5,73 nanomoolia anisiinihappoa.

(b) Sikaplasmiini

Samankaltainen koe käyttäen sikaplasmiinin liuosta (käytet-- 5 tiin 5,29 x 10 M; 10,54 nanomoolia) antoi anisiinihapon keskimääräiseksi radiokemialliseksi analyysiksi 9,58 nanomoolia .

Esimerkki 25 Jäädytyskuivattu p-anisoyyli-streptokinaasi-ihmisplasmino-geeniaktivaattori-kompleksi_' _ 4

Streptokinaasia (9 x 10 yksikköä) 0,9 %:sessa paino/tila-vuus suolaliuoksessa (0,9 ml) sekoitettiin lys-ihmisplasmino-geenin (0,075 ml; 14,9 nanomoolia) kanssa. Seosta inkuboitiin lämpötilassa 25°C 30 min ja se laimennettiin sitten 0,1 il trishydroksimetyyli-aminometaani-hydrokloridillä, pH 7,4 (4,0 ml). Tätä liuosta käsiteltiin 3 erällä 0,1 mM (lopullinen väkevyys) p-amidinofenyyli-p-anisaattia (valmistettu perusliuoksena 10 mM dimetyylisulfoksidissa) kolme 5 minuutin jaksoa lämpötilassa 25°C. Asyloitu entsyymi sekoitettiin 33 %:sen kostean paino/tilavuus L-lysiini-("Sepharose 4B") suspension kanssa (5,0 ml) 10 min lämpötilassa 0°C. Suspensio suodatettiin imusuodattamalla ja pestiin edellä mainitulla tris-HCl-puskurilla (200 ml) lämpötilassa 4°C. Geeli suspen-doitiin uudelleen 0,1 M aminokapronihappoon 50 mM tris-HCl, pH 7,4 (5,0 ml), ja suodatettiin sitten, pestiin kolmella 5 ml:n erällä samaa puskuria. Yhdistetyt eluaatit dialysoitiin käyttäen 215 %:sta paino/tilavuus mannitolia tris-HCl-pus-kurissa (5,0 mM), pH 7,4, 2 tuntia lämpötilassa 4°C ja jää-dytyskuivattiin sitten valkoiseksi jauheeksi (0,560 g). Tämän materiaalin entsyymiaktiivisuus oli pienempi kuin 5 % f.*** t · · 25 6 7 3 0 0 alkuperäisestä aktiivisuudesta ja se voitiin regeneroida vesipitoisessa väliaineessa lämpötilassa 37°C.

Hydrolyysiarvot

Niiden entsyymijohdannaisten pseudo-ensimmäisen kertaluvun nopeusvakiot (K), jotka on valmistettu esimerkeissä 1-18 kuvatuista asyloimisaineista, on esitetty alla olevassa taulukossa 1.

Taulukko 1

Aktiivisessa kohdassa seriini-substituoitujen plas- miinien deasyloimisnopeudet, pH 7,4, 37°C_

Asyyliryhmä Ihmisplasmiini Sianplasmiini -14 -14 _ K sek x 10 K sek x 10 p-fluoribentsyyli - 3,30

Bentsoyyli 5,20 1,90 p-toluoyyli 2,30 0,74 p-anisoyyli 1,10 0,33

Trans-kinnamoyyli - 4,20 p-metyyli-t-kinnamoyyli - 2,92 3-(2-furyyli)-akryloyyli 1,33 1,50 o-anisoyyli 1,82 p-asetamidobentsoyyli 2,70 asetyylisalisyloyyli 4,70 3.3- dimetyyliakryloyyli 0,69 3.4- dimetyylibentsoyyli 0,55 3-metyyli-4-metoksibentsoyyli 0,70 o-toluoyyli 1,71 p-etoksibentsoyyli 1,10 2.4- dimetoksibentsoyyli 1,10

Claims (11)

1. Menetelmä in vivo fibrinolyyttisen entsyymijohdannaisen valmistamiseksi, joka entsyymi systemaattisesti annosteltuna ei pidemmän kuin 5 tunnin kuluessa kaniinille, jolla on radio-aktiivisesti merkitty tukos, joka sijaitsee alemmassa ontto-laskimossa, nostaa veren radioaktiivisuustason ainakin kaksinkertaiseksi taustatasoon verrattuna 6 tunnin kuluessa annostelun aloittamisesta aiheuttamatta eläimen kuolemaa, ja jolloin se katalyyttinen kohta, joka on oleellinen fibrinolyyttisen aktiivisuuden kannalta, on suojattu ryhmällä, joka on poistettavissa hydrolysoimalla siten, että hydrolyysin pseudoensimmäi- sen kertaluvun nopeusvakio tällä johdannaisella on alueella ~6 “1 —3 -I 10 sek - 10 sek , isotonisessa vesipitoisessa väliaineessa pH-arvossa 7,4 lämpötilassa 37°C, tunnettu siitä, että in vivo fibrinolyyttinen entsyymi saatetaan reagoimaan yhdisteen EF kanssa, jossa E on kiinnitysryhmä, joka on selektiivinen kata-lyyttisen kohdan suhteen, ja F on ryhmä, joka kykenee siirtymään kiinnitysryhmästä aktiiviseen kohtaan, edellyttäen, ettei johdannainen ole (i) p-guanidinobentsoyyli-ihmisplasmiini tai (ii) p-guanidinobentsoyyli-streptokinaasi-plasminogeeniakti-vaattorikompleksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että F on bentsoyyli tai bentsoyyli, joka on substituoitu halogeenilla, C^_6-alkyylillä, C^g-alkoksilla, C^g-alkanoyyli-oksilla tai C^_g-alkanoyyliaminolla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että E on p-amidinofenyyli tai p-asetamidinofenyyli.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että E on p-amidinofenoksiryhmä tai p-asetamidinofenyyli-ryhmä ja F on bentsoyyliryhmä, substituoitu bentsoyyliryhmä, akryloyyliryhmä tai substituoitu akryloyyliryhmä. 2? 67300

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on ihmisplasmiini.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on streptokinaasi/ihmisplasmino-geeniaktivaattorikompleksi.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on ihmisplasmiinin ja strepto-kinaasi/ihmisplasminogeeniaktivaattorikompleksin seos.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrolyysin avulla poistettavissa oleva ryhmä on asyyliryhmä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä on bentsoyyli, bentsoyyli, joka on substituoitu halogeenilla, _g-alkyylillä, C^_g-alkoksilla, C^g-alkanoyylioksilla tai C1_g-alkanoyyliaminolla, akryloyyli tai substituoitu akryloyyli.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä on bentsoyyliryhmä tai bentsoyyliryhmä, jonka meta- ja/tai para-asemassa on yksi tai useampi halogeeni-, C^g-alkyyli-, C^_g-alkoksi-, _g-alkanoyylioksi- tai C^_g-alkanoyyliaminosubstituentti, jolloin Hammet ja Op-arvojen summa on alueella välillä +0,1 ja -1,1.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asyyliryhmä on akryloyyli, joka mahdollisesti on substituoitu C^_g-alkyylillä, furyylillä, fenyylillä tai C^_g-alkyylifenyylillä. 28 67300