JPH04503062A - フィブリン溶解 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フィブリン溶解 本発明は、フィブリンの沈殿に関連する病理症状の治療のための、フィブリンの 分解又は崩壊（これはフィブリン溶解ともいう）、並びに組成物及び方法に関す る。

フィブリンは止血及び傷を治すことにおいて大きな役割を果たし、そして生化学 反応の複雑な系の結果としてヒト及び動物の体内に貯庫される。フィブリンのこ のような大きな機能にもかかわらず、フィブリンの形成はまた、多くの病理症状 及び炎症障害の原因となる０例えば、フィブリン沈殿はアテローム硬化症、リウ マチ様関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、心筋梗塞、肺塞栓症、静 脈血栓症、自己免疫神経障害、肉芽腫性疾病、寄生虫感染及び同種移植拒絶反応 に関連する。転移、またの名を「続発性」腫瘍は血栓塞栓症につながる。支質中 のある固化した腫瘍を囲む多量のフィブリン沈殿物はまゆ様のものとして寄与し 、白血球、マクロファージ及びその他の炎症性の細胞が腫瘍に到達することを妨 げる。

フィブリン沈殿物は腎疾病並びに過形成性１［及びケロイドにも関連しうる。フ ィブリンの付着は術後性の手術においても重大な問題である。

ウロキナーゼ及びｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性体）はプラスミノーゲン活 性体（ＰＡ’　ｓ）であって、現在、フィブリン溶解を及ぼすために、さらに詳 しくは、フィブリン凝集体の溶解又は崩壊を及ぼすために実験的及び臨床的の両 方に用いられている。フィブリン崩壊に効果的ながらも、これらの物質は更なる 欠点を有する。ウロキナーゼは、フィブリンの存在とは無関係にプラスミノーゲ ンを活性化させてプラスミンを付与しくｔ　ＰＡとは異なる）、そしてそれ故フ ィブリン溶解を及ぼすためには大量の投与せねばならず、これは高額となり且つ 不必要な出血をもたらす。ｔＰＡは生体内では半減期が短く、そしてそれ故長時 間にわたって大量の投与をせねばならず、これも不必要な出血及び高額をもたら す。

驚くべきことに、リンホカイン、インターロイキン−４（ＩＬ−４）は、フィブ リン分解をもたらすプラスミノーゲン活性体を生成するためにヒト及び動物細胞 を活性化させることがこの度発見された。また、ＩＬ−４はヒトモノサイトの凝 血促進活性（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を阻害し、これに よってモノサイト表面のフィブリン形成は低められる。

ＩＬ−４はリンホカインであってＢセル及びＴセル成長因子活性を示すものであ る（豪州特許出願番号６７３３４／８７公開）。

このリンホカインはまた、ヒトモノサイトのサイトカインＩＬ−１，ＴＮＦの生 産の制御活性及びＰ　Ｇ　Ｅ　ｇの制御を示す。

ＩＬ−４は単体として精製され、そしてこのタンパク質の遺伝情報はクローンさ れて組換ＤＮＡ工学による大量のＩＬ−４の生産が可能となっている（Ｓｃｈｅ ｒｉｎｇ−Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｊｌｏｎ　；豪州特許出願ＮＣＬ６ ７３３４／８７の公開文に記＠）、ＩＬ−４（ヒト）は多数のメーカーからの商 業的入手が可能である。

サイトカインの生産の制御におけるＩＬ−４の活性に基づき、もっとも驚くべき ことは、Ｉ　Ｌ−４は適当な標的細胞によるプラスミノーゲン活性体（ＰＡ）　 、特にｔ−ＰＡ及びウロキナーゼの生産を促進するのに効果的であったことであ る。

本発明により、病理症状に関連する、又はそのような症状を導きうる、フィブリ ン沈殿物を分解するための、そしてフィブリンの沈殿を防ぐ方法が提供され、こ れは、このような処置を必要とする対象者に、治療的有効量のＩＬ−４又はＩＬ −４活性を有すその誘導体であって、任意的に１もしくは複数の医薬として許容 されるキャリアー又は賦形剤と一体となったものを投与することを含んで成る。

本発明により処置できる病理症状は、フィブリン沈殿により完全に、又は少なく ともある程度引き起こされた症状である。これらには、静脈血栓症、肺塞栓症、 腎臓障害、過形成性廠痕、冠状動脈梗塞、転移、炎症、散在性腺管内凝血、アテ ローム硬化症、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、自己 免疫神経障害、肉芽腫性疾病、寄生虫感染、同種移植拒絶反応及びフィブリン沈 殿に関連するその他の症状が挙げられる。このような症状に苦しむ対象者にＩＬ −４を投与することは、プラスミノーゲン活性体、特に標的細胞による、プラス ミノーゲンの活性化を引き起こし、そして逐次フィブリン分解を引き起こすｔＰ Ａ及びウロキナーゼ（プロウロキナーゼ）の増大をもたらしうる。また、このよ うな患者におけるフィブリンの形成は減少しうる。

ＩＬ−４により刺激されたときにｔ−ＰＡを生産する顕著なセルタイプはモノサ イト／マクロファージセルタイプである。重要なこととして、これらのセルタイ プはしばしばトロンビ（ｔｈｒｏｍｂｉ）、及びその他のフィブリン沈殿物に密 着し、そしてそれ故、Ｉ　Ｌ−４との接触により刺激されてプラスミノーゲン活 性体を生産した場合、効率の高い局部的フィブリン分解を引き起こしうる。この ことは患者への大量のプラスミノーゲン活性体の投与の必要性を回避し、それ故 、不必要な出血の副作用を少なくし、且つプラスミノーゲン活性体の大量投与に 起因する高い価格を引き下げる。

内皮細胞もＩＬ−４によって刺激されてウロキナーゼ（プロウロキナーゼ）を生 産することができる。このことも重要であり、なぜならフィブリン沈殿物は一般 に内皮細胞に付着しているからである。

その他のヒト又は動物の対象体における標的細胞もまた、１Ｌ−４の刺激によっ てフィブリンの低下を及ぼすことができる。モノサイト以外のその他の多くの標 的細胞もＩＬ−４の作用の結果として血液凝固活性を失うことがある。

好ましくは、本発明において用いられたＩＬ−４は組換えＤＮＡ工学によって作 られる。ヒト対象者を処置する場合、ＩＬ−４はヒト由来であることがもちろん 望ましい。動物を処置する場合、動物Ｉ　Ｌ−４が好ましい。

公開された豪州特許出願Ｎα６７３３４／８７において記載されたＩ　Ｌ　−４ のＢセル、Ｔセル及びマスト細胞を刺激する作用、並びにその他のＩＬ−４の固 有活性を存するすべてのＩ　Ｌ−４誘導体又は類似体を本発明に用いることがで きる。ＩＬ−４誘導体又は類似体の正確な性質は重要ではない、むろん、この誘 導体又は類似体は定義されたＩ　Ｌ−４生物学活性を有せねばならず、そして、 標的細胞、例えばマクロファージ／モノサイトを刺激してプラスミノーゲン活性 体を生産させるための活性を有せねばならない、前述の出１１Ｎａ６７３３４／ ８７はＩＬ　−４誘導体及び類似体の製造のための方法を教示する０本明細書に おいて用いられる語Ｉ　Ｌ−４はヒトＩ　Ｌ−４、動物由来のＩ　Ｌ−４であっ て例えばネズミ、ヒツジ又はウシＩＬ−４、並びにそれらの誘導体又は類似体で あって固有ＩＬ−４活性を有するものを含む。便宜上これらの物質は以降「活性 物質」と称することがある。

ＩＬ−４は好都合な手段、例えば経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内 、皮肉又は座薬のルートにおいて投与できる。

Ｔ　Ｌ−４はまた、ヒト又は動物対象体に、ある予定時間間隔、例えば３０分か ら２４時間にわたる持続注入によって投与されうる。投与は、適当なポンプに連 結した、又は重力による、静脈内カテーテルを介しての方法で行われうる。

フィブリン分解を及ぼすために対象体に投与されるＩＬ−４の盪及び摂取量は、 多数の要因、例えば投与の方法、処置すべき症状の性質、処置すべき対象体の体 重及び処置を行う医師の判断に依存するであろう。一般には、ＩＬ−４は１キロ グラムの体重当りに、１日当り０．１〜から２．０００ｍｇの間の量において投 与されうる。単位投与量、例えば錠剤又はカプセルにおける活性成分の量は約０ ．１■から１００ｍｇへと変更できる。

ＩＬ−４は失活を防ぐための物質により被覆されうるか又はそれと−緒に投与さ れうる。例えば、この活性物質はアジュバント中にて、酵素阻害剤を同時投与す ることによって、又はリポソーム中にて投与される。ここで考えられるアジュバ ントには、レソルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレン オレイル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。酵素阻害剤に は、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェ−１・（Ｄ ＦＰ）及びトラジオールが含まれる。リポソームには、水中油中水型Ｐ４０乳剤 及び常用のリポソームが含まれる。

分散体は、グリセロール中、液状ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中 、並びに油中にて調製されることができる。通常の保存及び使用条件のもとで、 これらの調製物は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含む。

注射利用のために適切な医薬製剤は、無菌の注射可能な溶液又は分散体の即時調 製品のため無菌水性溶液（水溶性の）又は分散体及び無菌のパウダーを含む。す べてのケースにおいて、この製剤は除菌すべきであり、そしである程度容易に注 射可能な状態の流体にすべきである。これは製造及び保存の条件のもとて安定で なくてはならず、また微生物、例えば細菌及びカビの汚染を防がなくてはならな い。キャリアーは、例えば無菌水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロー ル、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール等）、それらの適当 な混合物、並びに植物油を含む溶剤又は分散媒体であることができる。適当な流 体は、例えばレシチンのような被覆剤の利用により、分散体のケースにおける目 的の粒径の維持により、そして界面活性剤の利用により維持できる。微生物の作 用を防ぐことは、種々の抗菌剤及び抗カヒ剤、例エバパラベン、クロロブタノー ル、フェノール、ソルビン酸、及びサーメロザール等によりもたらされうる。多 くのケースにおいて、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含ませることが好 ましいであろう。注射可能な組成物の延長吸収は、吸収を遅らせる試薬の組成物 、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの利用により引き起こされ ることができる。

無菌の注射可能な溶液は、必要量の活性物質を前記に掲げた種々のその他の成分 を有する適当な溶剤に混入させることで調製され、そして必要ならばその後無菌 濾過する。一般に、分散体は、種々の無菌した活性成分を、無菌媒体であって塩 基性分散媒体及び前記に掲げたもの中から必要なその他の成分を含むもの中に混 入させることによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌パ ウダーのケースにおける好ましい調製方法は、活性成分に任意の望ましい成分が 加ったパウダーを、あらかじめ無菌濾過したそれらの溶液から作る真空乾燥及び 凍結乾燥技術である。

前述の通りにＩ　Ｌ−４が適切に保護される場合、活性成分は例えば不活性の希 釈剤もしくは食品キャリアーと共に経口投与でき、又はそれらは硬いもしくは軟 い外皮カプセル中に閉入することができ、又はそれらは錠剤へと圧縮されること ができ、又はそれらは食品の中に混入させることができる。

経口治療投与のためには、活性物質は賦形剤と一体化されることができ、そして 消化性の錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリフサ−（ｅｌｉｘｉｒ）、 懸濁物、シロップ、ウェーハー等の形で用いられる。

錠剤、トローチ、ビル、カプセル等は以下のものも含む：バインダー、例えばガ ムトラガカンス、アカシア、コーンスターチもしくはゼラチン；賦形剤、例えば リン酸二カルシウム；分解剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギ ン酸等；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；並びに甘味料、例えばスク ロース、ラクトースもしくはサッカリン、又は風味料、例えばペパーミント、シ ラタマノキの油もしくはサクロンボ風味を加えることができる。その他の種々の 材料を、被覆剤として、又は投与量の単位の物理的形態を整えるために存在しう る。例えば、錠剤、ピル又はカプセルはシェラツク、砂糖又は両方によって被覆 されうる。シロップ又はエリフサ−は、活性成分、甘味料としてスクロース、防 腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、着色剤及び風味料、例えばサクロンボ 又はオレンジ風味を含むことがある。

もちろん、いずれの投与単位形態の調製において用いられるすべての材料は、医 薬として純粋でなくてはならず、そして用いた量において実質的に無毒なもので なくてはならない。

更に、この活性物質は持効性の調製物及び製剤の中に混入される。

本明細書で用いた語「医薬として許容されるキャリアー」及び「賦形剤」は前述 した任意、且つ全ての溶剤、分散媒体、被覆剤、抗菌剤及び抗カビ剤、等張及び 吸収遅延剤、等を含む。このようなキャリアー及び賦形剤は当業界においてよく 知られ、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｓａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅ ｎｃｅ　ａｎｄＵ、Ｓ、Ｐｈａｒｓ＋ａｃｏｐｅｉａ　（１９８４）　；　Ｍａ ｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏａ＋ｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照 のこと。

この活性物質はまた、−又は複数の抗−トロンボ溶解剤、例えばｔＰＡ、プロウ ロキナーゼ、ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼから選ばれたものと組合せて 投与されうる。ＩＬ−４をこのような試薬と投与する場合、フィブリン溶解活性 が強化される。

活性物質はまた、−もしくは複数の抗凝血剤、例えばヘパ、リン、ワルファリン 、アスピリン、アニシンジオン、フェニントン、及びビスヒドロキシクマリン； 並びに／又は−もしくは複数の血管拡張剤、例えばニトリル（例えばアミルニト リル、ニトログリセリン、ナトリウムニトリル、イソソルビドジニトレート）、 パパベリン、ニコチン酸及びシクランデラーテと組合わせて投与されうる。抗凝 血剤、及び血管拡張剤は、血栓症及びその他フィブリン沈殿物への到達を高め、 それ故フィブリン分解を促進する。

本発明はまた、血栓溶解組成物を有するその他の見地であって、−もしくは複数 の医薬として許容されるキャリアー又は賦形剤を有する組合せにおけるＩ　Ｌ− ４を含んで成るものに関連し、そして前述の−もしくは複数の抗−血栓溶解剤、 及び／又は−もしくは複数の抗凝血剤、及び／又は−もしくは複数の血管拡張剤 を任意的に含む。

フィブリン分解を引き起こし、そしてフィブリン及びトロンビ形成を防ぐことに おけるＩＬ−４の作用は、出願人の知る従来技術に基づき、驚くべき、且つ予想 しえなかったものであり、フィブリン形成に関連する疾病のための新規の治療方 法を提供する。

以下の実施例は更に本発明の実列を示す。本発明の範囲はこれらの実施例により 限定されるものでは−ない。

裏施五上 材料及び方法 モノサイトの　び立 モノサイトを、Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、１＋＋ｗ＋ｕｎｏ １．１４１　：　１５１６に記載の通り、向流遠心清浄（ｃｏｕｎｔｃｕｒｒｅ ｎｔ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）により末梢静脈血か ら単離した。形態学基準、非特異性エステラーゼ染色及び食作用性により同定さ れた〉９５％のモノサイトを含む細胞画分をプールし、そして先の文献に記載の 通りに１８ｈ培養した（１％の仔牛血清を含むα−モディファイイーグル培地（ α−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）中において０．８〜１ ．０Ｘ１０６）。培養を停止するために、上滑液を遠心して非吸着性細胞を除去 した。ＰＢＳで２回洗浄後、吸着性細胞及び非吸着性細胞をプールし、そしてＰ ＢＳ中の０．２％のトリトンＸ−１００により溶解させた。

ヱＡｆｆばＬパ１区上 １０Ｍの０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，１中に溶解したモノサイトの上滑 液又は溶解物（５０ｍ）及びヒトプラスミノーゲン（０，８ｇ）を、Ｈａａ＋１ ｌｔｏｎ　（１９８１）　Ｊ、１ｓａ＋ｕｎｏｌ。

１２６　：　８５１の方法に従い、予め＋ｔｓ１−フィブリンで被覆した０、２ ８ｃｍ”のウェルに加えた。２〜３時間後、溶解した＋１５７−フィブリン分解 生成物を測定した。ＰＡ活性はＵ−ＰＡ標準品（Ｌｅｏ、　Ｐｈａｒａ＋ａｃｅ ｕｔｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）の活性に従って表した。

モノサイト由来のプラスミノーゲン固有のフィブリン溶解活性は、常にプラスミ ノーゲン依存活性のく５％であった。

五生立折上 ＩｇＧ（イムノグロブリン）を、プロティンＡセファローズＣＬ　−４８（Ｐｈ ａｒ＋ｗａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた標準方法によ り、ヒトｕ−ＰＡ及びヒトｔ−ＰＡに対するウサギ抗血清（ロット１００及び１ ５３；それぞれは叶、Ｗ−Ｄ、Ｓｃｈｌｅｕｎｉｎｇ、　ＣＨＵＶ＋　Ｌａｕｓ ａｎｎｅ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄより供給）から単離した。

マウスミエローマＩ　ｇ　Ｇ、ＨＯＰ　ＣＹ　（Ｄｒ、Ａ、Ｂｕｒｇｅｓｓ、　 Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 、　ＭｅｌｂｏｕｒｎｅｌＡｕｓｔｒａｌｉａ）を無関係な抗体として用いた。

前記の培養上清液、細胞溶解液又はＰＡ標準品（ｕ−ＰＡ）　、ＭＭ　１３８メ ラノーマ細胞系（叶、ＲＪｈｉｔｅｈｅａｄ、　Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）、０ ．　２ＩＵ／ｍｌ）からの培養上清液としてのｔＰＡを、残留ＰＡ活性の測定前 にＩｇＧ（最終濃度１４／ｓｌ）と共に３７°Ｃで１時間インキュベートした。

免疫沈殿実験において、プロティンＡセファローズＣＬ−４Ｂ及び最終濃度が０ ．２５％となるようトリトンｘ−ｉｏｏを加えた。

一定間隔の撹拌を伴った室温で３０分間の更なるインキュベートの後、Ｖａｓｓ ａｌｌｉ、　Ｊ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　 １５９：　１６４３に記載の通りにペレットを洗浄したが、ただし洗浄バッファ ーにＳＤＳは含ませなかった。

盈ＤＳ−、ｌヱユづ２Ｌ℃云乙り二重 Ｒｏｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｂ、Ｂ、Ａ、７４５　：　８２．の方 法に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥチモグラフィーを行った。分離ゲル（１０％）はカ ゼイン（２ｒａｇ／　ｏｗｌ、　Ｓｉｇｏ＋ａ）及びヒトプラスミノーゲン（６ 可／ｒａ　１　）を含み、そしてそれを室温で１時間、１５ｍＡで予備電気泳動 した。０．０６２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６゜８．１．２５％のＳＤＳ、１ ０％のグリセロール中で平衡化したサンプル（２０ｍ）を、重層ゲル（４％）に 載せる前に７０°Ｃで１０分間インキュベートし、次いでＬａｅｓ＋ｍｌｉ、　 Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０（１９７０）のバッファー系を用いて１２ｍ Ａで２時間電気泳動させた。電気泳動後、ゲルを２．５％のトリトンＸ−１００ 中で洗浄し、次いで０．１Ｍのトリス、ｐＨ８，０中で１８時間、３７°Ｃでリ ンスした。ゲルを０，２５％の５０％のメタノール／７％の酢酸中のクマジープ ルーＲ−２５０に６０分間浸して染色し、次いで３０％のメタノール／１０％の 酢酸中で２時間脱色した。

ｔ−ＰＡ、ｍＲＮＡの 全モノサイトＲＮＡをＣｈｉｒｇｗｊｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ１８　：　５２９２の方法に従って調製し、そしてシーンスクリ ーンプラスナイロン膜（Ｄｕｐｏｎｔ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）　へ移す前にホル ムアルデヒド含有の１％アガロースゲル上で分画した（５Ｉｒｇ／列）。このフ ィルターを＞　２　Ｘ　１０　’ｃｐ−／ｍｌの５ｔｐ−標識化ｔＰＡ０ｍＲＮ Ａを含む標準ハイブリダイゼーションバッファー中で、６０℃で１夜ハイブリダ イズした。

ｃＲＮＡプローブはベクターｐＧＥＭ−４ブルー（Ｐ　ｒ　ｏ　ｇｅｍａ、Ｍａ 　ｄ　ｉ　ｓ　ｏ　ｎ、ＭＡ）の中にクローンした、ｐＤＡ　１１４　Ｂ　（Ｆ ｉｓｃｈｅｒ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、 　２６０：　１１２２３）由来の２．３ｋｂ旦■上上土フラグメントを含むプラ スミドから調製され、そしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ＋　ＭＡ）による転写開始前にＸｂａｌにより 直鎖状にした。ハイブリダイゼーション後、このフィルターを２ＸＳＳＣにより ３回洗浄し、次いでｌｘ／ｍｌのＲＮ　ａ　ｓ　ｅ　Ａ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）で、３７”Ｃ，２０分間 処理した。

血　准゛　のゞ モノサイト凝血促進活性は、細胞の血小板欠乏血漿の部分的トロンボプラスチン （凝血）時間を短くする能力によって測定される。ヒトモノサイト（４Ｘ１０’ 細胞／ｍｌ）は糖脂質又は刺激されたリンパ球からの上滑液にて３７°Ｃ１１８ 時間により活性化され、その表面に凝血促進活性が現れる。凍結融解され、そし て超音波処理された細胞サンプルの活性を、クエン酸処理血小板欠乏ヒト血漿を 用いて、プロトロンビン測定における試験を行った。この凝血活性は細胞懸濁物 （０，８Ｘ１０’細胞１０．１＋ａｌ）を０．１ｍｌの血漿にて３７°Ｃで１分 間インキュベートすることで簡単に行われる。次いでＣａ　ＣＩｚ　（３０ｍＭ ：　Ｏ，１ｍ１）を加え、そして凝血時間を手動で測定した。結果はｍＵ活性／ １０ｂ細胞として示した。ヒト血漿の凝血時間に対するウサギ脳トロンボプラス チンの希釈率の減少の標準曲線を用いてｍＵを計算した。

災立医Ｉ 土上二ａｃ、ｋ　＋’；れたヒトモノサイトによるｔ−ＰＡの■ 実施例１に従って調製したヒトモノサイト（１×１０ｂ／ｍｌ）を０．　２５　 Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−４ＣＧｅｎｚｙｍｅ）とインキュベートした。

プラスミノーゲン活性体（ＰＡ）活性（実施例１に記載の通りにプラスミノーゲ ン固有フィブリン溶解活性により測定）は、ＩＬ−４に２時間さらした後の、モ ノサイト溶解物中に検出され、そして３時間で培養上清液中に分泌された（ＰＡ の最大生産は６時間の１．Ｌ−４刺激の後に見い出された）。

モノサイト培養上清液に検出されたＰＡ活性の全ては、抗ｔＰＡＩｇＧによりブ ロックされたが、しかし抗ウロキナーゼ■ｇＧによってはされなかった。ＰＡの 見かけ上の分子量が測定できる技術である５ＤＳ−カゼインチモグラフィーによ り、ｔＰＡ標準品の特徴とする状態で移動した７０ｋＤのバンドが見い出せた。

従ってＩＬ−４はヒトモノサイトを刺激してｔ−ＰＡを生産させる。

ス】１１１ １Ｌ−４により刺激された内皮細胞によるＰＡ活性の生成：中太動脈内皮細胞（ １０５細胞）をＲＰＭＩ／１０％ＦＳＣ中で４８時間インキュベートし、等張の 生理食塩水中で洗浄し、その後２．５ニー’−７ト／ｎ＋１の精製ヒトＩＬ−４ （Ｇｅｎ　ｚ　ｙｍｅ）存在下又は非存在下でｃｒ−ＭＥＭ　（１ｍｌ）中で培 養した。２４時間後、コンディショニングした培地を集め、そしてプラスミノー ゲン固有フィブリン溶解活性としてのＰＡ活性について測定した。ＰＡ活性は、 ＩＬ−４によって刺激されたそれらの細胞において検出された。結果は以下の遣 手大動脈細胞（コントロール）　０．０９±０．０１２．５ユニット／ｍｌによ り刺激　０．３２±０．０１された中太動脈細胞　。

Ｉ　Ｌ−４３ＤＳ−カゼインチモグラフィーにより、ウロキナーゼタイプにおけ る増大されたウロキナーゼタイプＰＡ活性及びｔ−ＰＡ活性が認められた。

実施■土 ＩＬ−４によるヒトモノサイトの凝血促進活性の阻害二実施例１に従って調製し たヒトモノサイト（４ＸＩＯ６細胞）を、１１００ｎ／ｍｌの糖脂質（ＬＰＳ） と共に、ヒト組換えＩＬ−４（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｐｌｏｕｇｈ）と共に、又は 種々のＩＬ−４濃度の伴ったＬＰＳと一緒にインキュベートした。

前記の反応液中に室温で１８時間さらした後のモノサイト溶解物中における凝血 促進活性（ＰＣＡ）（実施例１において記載のクエン酸血漿の凝血時間の短縮に より測定）を測定した。

ヒトモノサイト（コントロール）　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

２５ユニｔト／ｍｌのＩＬ−４に　Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｄ。

より処理したヒトモノサイト 以下のものにより処理した ヒトモノサイト Ｌ　Ｐ　Ｓ　（１００ｎｇ／ｍｌ）　２０．９±０．８　１９．４±０．５Ｌ　 Ｐ　Ｓ　（ｌｏＯｎｇ／ｍｌ）　４．６±０．１　１．４±０．１＋ＩＬ　−４ （２，５０／ｍ１） Ｌ　Ｐ　Ｓ　（１００ｎｇ／ｎ＋１）　＋０．５　４．２±０．２　５．１±０ ．２Ｌ　Ｐ　Ｓ　（ｌｏＯｎｇ／ｍｌ）　＋０．Ｉ　Ｕ／ｍｌ）　１３．９±０ ．４　８．５±０．７Ｎ、Ｄ、＝未測定 国際調査報告 Ｉｎ＋ｅｒ＋＋ａｔ＋ａｎ＊ｌ　Ａｐａ、、＜ａ＋ｌｅ＋＋　ｌｌａにｌＮＪ　 匍沖叩ｕ［＋ｒｏ翳乞ｎ罰Σ凡−■了αＱＬ　５ＥＡＲＯＩ　ｍ　ＯＮｎ灯りせ 込貫　ＡＰｌシａα工ＯＮ　、　Ａ５．２５ＤＳ／１８３ 第４頁の続き ［相］Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号少発　明　者　ハート、ブ ルーデンス　ハミル　オーストラリア国。

トン　４．アベニュ　スト 、サウス　オーストラリア、ミルスウッド　５０３・リート　努

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．病理症状又はそのような症状へと導きうることに関連する、フィブリン沈殿 物を分解、且つこのような沈殿物の形成を妨げるための方法であって、このよう な処置を必要とする対象者に、一又は複数の医薬として許容されるキャリアー又 は賦形剤と任意的に組合わされた治療上有効な量のＩＬ−４又はＩＬ−４活性を 有するその誘導体を投与することを含んで成る方法。
2. ２．処置される前記の病理症状が、静脈血栓症、肺塞栓症、腎疾病、過形成性■ 痕、冠状動脈梗塞、転移、炎症、散在性脈管内凝血、アテローム硬化症、リウマ チ様関節炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫神経障害、肉芽腫 性疾病、寄生虫感染、同種移植拒絶反応及びその他のフィブリン沈殿に関連する 症状である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記ＩＬ−４又はその誘導体を、フィブリン沈殿物の部分又はその近くに局 部的に投与する、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記ＩＬ−４又はその誘導体を、静脈内・筋肉内、鼻腔内、皮内、腹腔内、 座薬又は経口により投与する、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記ＩＬ−４又はその誘導体の治療上に有効な量が、処置すべき対象体の体 重１ｋｇ当り、約０．１μｇから約２００ｍｇの間である、請求項１に記載の方 法。
6. ６．前記ＩＬ−４又はその誘導体を、予定時間で対象体に持続注入する、請求項 １に記載の方法。
7. ７．前記ＩＬ−４又はその誘導体を、ｔＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナー ゼ又はプロウロキナーゼから選ばれる、一もしくは複数の血栓溶解剤と共に投与 する、請求項１に記載の方法。
8. ８．前記ＩＬ−４又はその誘導体を、血液凝固阻止剤、例えばヘパリン、ワルフ ァリン、アスピリン、アニシンジオン、フェニンドン及びビスヒドロキシクマリ ンと共に投与する、請求項１に記載の方法。
9. ９．医薬として許容されるキャリアー又は賦形剤と組合せた、ＩＬ−４又はＩＬ −４活性を有するその誘導体を含んで成る、血栓溶解組成物。
10. １０．ｔＰＡ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ及びストレプトキナーゼより成 るグループから選ばれた１もしくは複数の血栓溶解剤又はその活性体を含む、請 求項９に記載の血栓溶解組成物。
11. １１．１又は複数の抗凝血剤を含んで成る、請求項９又は１０に記載の血栓溶解 組成物。
12. １２．前記の抗凝血剤がヘパリン、ワルファリン、アスピリン、アニシンドン、 フェニドン及びビスヒドロキシクマリンより成るグループから選ばれたものであ る、請求項１１に記載の血栓溶解組成物。
13. １３．１又は複数の血管拡張剤を更に含んで成る、請求項９から１１のいずれか の１項に記載の血栓溶解組成物。
14. １４．前記の血管拡張剤が、ニトリル、パパベリン、ニコチン酸及びシクランデ ラーテより成るグループから選ばれたものである、請求項１３に記載の組成物。