JP2004534837A - 架橋したかつ共有結合したウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｓｃｕＰＡ）−ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｓｕＰＡＲ）複合体の線維素溶解剤としての使用 - Google Patents
架橋したかつ共有結合したウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｓｃｕＰＡ）−ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体（ｓｕＰＡＲ）複合体の線維素溶解剤としての使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、架橋したscuPA/suPAR複合体及び/又はtcuPA/suPAR架橋複合体、血栓溶解性を有する共有結合した単一化合物の調製方法、及び架橋したscuPA/suPAR又はtcuPA/suPAR複合体の、血栓溶解性疾患の予防及び/又は治療への使用に関する。本発明は、さらに、組み合わせの組成物及び/又は治療計画に関連し、改良された治療効果に達し及び/又は副作用を削減するために架橋したscuPA/suPAR複合体又はtcuPA/suPAR複合体と、１種以上の現在用いられているプラスミノゲン活性体とを含む。
Description
【０００１】
（関連特許文献）
本出願は、1999年6月4日に出願された同時係属出願09/325,917と、PCT/IL00/00208から2001年10月5日米国の国内段階に入った、番号が付されていない同時係属出願との部分継続出願であり、両出願は、血栓塞栓症における非架橋のscuPA/suPAR及びtcuPAの医療的使用の開示に対する具体的な参考としてここに組み込まれる。
（技術分野）
本発明はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(“scuPA”)の一本鎖単位と、可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(“suPAR”)の少なくとも１単位とを含む新規な化学的複合体の調製方法、及びその新規な化学的複合体、並びに血栓塞栓性疾患における線維素溶解性薬剤として得られたscuPA/suPAR架橋複合体としての使用に関する。本発明は、また血栓塞栓疾患の予防及び/又は治療における医薬組成物の使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
血栓塞栓症疾患の治療において広く用いられている、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)は、一本鎖からなるプロ酵素(scuPA)として生物学的に合成される。scuPAを制限的にタンパク分解すると、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(tcuPA)中に２本鎖を形成し、これは前記酵素の活性型であると考えられる。
uPAの重要なレギュレーターは、プラスミノゲン活性化因子阻害剤１(PAI-1)であり、これはtcuPAと相互作用して、非活性複合体を形成する。tcuPA が受容体uPARに結合すると、PAI-1の阻害効果に対するtcuPAの感受性はほんのわずか減少する。
ツカダ(M.Tsukada)らによる米国特許第4,996,005号明細書において、一本鎖プロウロキナーゼ及びプラスミノゲンの組み合わせは、全身的なフィブリン溶解を引き起こさず一本鎖プロウロキナーゼの線維素溶解性活性を高めることが示されている。使用された一本鎖プロウロキナーゼの典型例には、一本鎖ペプチド結合構造を有する分子量50,000〜55,000のものが含まれていた。そして、プラスミノゲンにはヒト又は動物の血清、血漿、腹水、胎盤抽出物、及び胎盤組織抽出物に由来する資源が含まれていた。
ハヤシ(S.Hayashi)らの米国特許第5,004,609号明細書は、ウロキナーゼと分子量97,5000+3,000を有するウロキナーゼ阻害剤との複合体、及び血栓を溶解する能力を有するその複合体を形成する方法を記載している。
グレウィッチ(V.Grewich)らの米国特許第5,626,841号明細書は、血栓溶解治療の後の患者に血栓溶解治療の完了後に単一ボーラスのプロウロキナーゼを患者にそして閉塞の危険の期間後１〜１０日毎に１回、投与することによる、患者の再閉塞を阻害する付加的な治療方法を記載している。
プロウロキナーゼは、心筋梗塞、肺塞栓症、又は深部静脈血栓溶解の患者における、治療上の血栓溶解用の臨床試験においても使用されてきている。ウェルゼル(Welzel)らの米国特許法第5,055,295号明細書を参照されたい。しかし、ウロキナーゼは血中半減期が短く、フィブリン親和性を顕著に欠く。従って、その治療上使用する場合には、合併症を引き起こすかもしれないかなりの投与量のボーラス注入(bolus-infusion)投与を必要とする。Marder VJ et al.e.g.N.Eng.J.Med.1988,318:1512-1520を参照されたい。フィブリノゲンと結合したuPAを用いたプラスミノゲン活性化因子製剤を形成することによりさらに効果的な血栓溶解が、試みられた。Maksimenko Av et al.,e.g.AmNY Acad Sci 1990,613:479-482を参照されたい。
同様に、A.A.Higaziらによる、同時継続の米国出願第09/325,917号において、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子と可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体との組み合わせ、例えば生理学的条件の下で天然非架橋scuPA/suPAR複合体が、血栓塞栓症の予防及び/又は治療における医薬組成物として有用であると記述されている。該組成物は、生理学的条件下において、ヒトIgG又は少なくとも１種のヒトIgG由来のペプチドの存在下、線維素溶解活性が改善されると記述されていた。
A.A.Higaziらによる、別の同時係属の出願（出願番号は付されていない）には、生理学的な条件下、suPAR(tcuPA/suPAR)と結合するとき２本鎖ウロキナーゼ組成物が線維素溶解活性を有することが記述されている。
しかし、scuPAのsuPARへの結合は可逆的で、この結合を中断すると、天然の非架橋性のscuPA/suPAR(scuPA)複合体の活性が低下する。J.Biol.Chem 1995,270:17375-17380を参照されたい。さらに線維素溶解においてウロキナーゼ(scuPA)、及びその受容体(suPAR)の役割は血管の位置、凝血の物性、及び組織機能への影響力に依存するかもしれず、生理学的因子は、suPARの低親和性に寄与してscuPAと結合する２量体、又はオリゴマーを形成する。J.B.C.2000,275:24304-24312を参照されたい。本発明は、scuPAのsuPARへの最適な架橋及び/又は共有結合を達成すること、及び化学的に調製された単一化合物、例えば、架橋した及び/又は共有結合したscuPA/suPAR複合体の存在下、ウロキナーゼの活性を最大にすることを指向している。これは、生理学的条件下に生じかつ時として条件の制御が困難な結合に依存するのに代わり、スルホスクシンイミジルの存在下4℃のリン酸バッファー生理食塩水中にてscuPAをsuPARに共有結合で架橋することにより達成された。その結果得られた化合物は新規な特性を有し、例えば、対応する天然の酵素-受容体複合体、例えば架橋した及び/又は共有結合したscu/PA/suPAR複合体の活性を保持しながら、解離することは出来ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、例えば化学的に結合した、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(scuPA)と、１分子以上の可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(suPAR)とから成る scuPA/suPAR複合体のような線維素溶解活性を有する架橋した及び/又は共有結合した単一化合物の調製、及びその使用に関する。
さらに具体的に述べると、これらの化合物は例えば心筋梗塞、脳-血管現象、肺塞栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓溶解、フィブリン血塊（クロット）の形成に関連する血栓塞栓症、冠動脈疾患、高コレステロール血症、高血圧、虚血性血管疾患、糖尿病、異常ヘモグロビン症、又は、血小板血症や、赤血球増加症のような脊髄増殖性疾患の予防及び/又は治療に有用である。
また、本発明は、特定の実験条件下においてスルホサクシンイミジルスボレート(suborate)の存在下、等モルで又は過剰濃度のsuPARでのscuPA及びsuPARの架橋した共有結合複合体の新たな合成方法を提供する。また、本発明は、等モルの又は過剰モルのsuPARの下架橋した、共有結合tcuPA/suPAR複合体の新規な合成方法を提供する。
また本発明は哺乳類の血塊溶解方法を企図し、そのような方法は、非架橋及び/又は共有結合したscuPA/suPARを含む医薬組成物を生理的バッファーと組み合わせて、血塊を溶解するに治療上効果的な量で、哺乳類に投与することを含む。
また、本発明は、哺乳類における血塊溶解方法を企図し、前記方法は、非架橋及び/又は共有結合したscuPA/suPAR又はtcuPA/suPARから成る薬物を、生理的バッファー及び効果的な量のヒトIgGを組み合わせて、血塊を溶解するに治療上効果的な量で、哺乳類に投与することからなる。
哺乳類における血栓塞栓症治療のための医薬キットは、生理的バッファーと組み合わせて所望であれば、これらの混合物及びストレプトキナーゼ、rt-PA又はアルテプラーゼ、rt-PA誘導体（レテプラーゼ、ラノテプターゼ、及びTNK-rt-PA）、血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤、プラスミノゲンストレプトキナーゼ複合体(APSC)又はアニストレプラーゼ、tcu-PA、又はウロキナーゼ、組換えscuPA（uPA前駆体又はプロウロキナーゼ）、ストレプトキナーゼ、及び誘導体を含むプラスミノゲンの他の活性化因子と組合わせて、血塊を溶解するに治療上効果的な量の架橋性及び/又は共有結合性活性化因子scuPA/scuPA又はtcuPA/suPARを含む医薬組成物の殺菌容器から構成される。
さらに別の態様において、本発明は架橋した共有結合のscuPA/suPAR化合物を安定化させる方法であって、scuPA/suPARタンパクを凍結乾燥させ、次いで哺乳類における血栓塞栓症の予防及び/又は治療に治療上効果的な量で再構成する方法に関する。
さらに、本発明は哺乳類における血栓塞栓症の治療用の医薬キットを企図しており、前記キットは凍結乾燥された形態の、血栓塞栓症治療のために治療上効果的な量のscuPA/suPARを含む殺菌された容器と、再構成液体を含む少なくとも１種の殺菌された容器とを含む。上記キットはさらに所望ならば血栓塞栓症治療に治療上効果的な量の天然の非架橋のscuPA/suPAR又はtcuPA/suPAR複合体などの他の線維素溶解剤を含んでもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明に従えば、架橋した及び/又は共有結合したscuPA/suPARがscuPAの１部分を、１以上の部分のsuPARと結合することにより、化学的に調製できる。また、本発明に従って、架橋された及び/又は共有結合したscuPA/suPARは凍結乾燥することにより安定化できる。本発明はさらに、血栓塞栓症の予防及び/又は治療に使用されうる医薬組成物及びキットを提供し、本発明の架橋した及び/又は共有結合のscuPA/suPAR複合体と、補足的な作用メカニズム及び本発明の組成物と異なる薬物動態学特性を有する他のプラスミノゲン活性化因子との組み合わせ又は混合物を使用して、血栓塞栓症治療の効力の増加を目的とした新たな取り組みを提供する。
（通常用いられている血栓溶解剤）
承認された又は急性心筋梗塞患者において臨床試験中の血栓溶解剤は、ストレプトキナーゼ、rt-PA、アルテプラーゼ、rt-PA誘導体（レテプラーゼ、ラノテプラーゼ、及びTNK-rt-PA）、アニソール化(anisolylated)プラスミノゲンストレプトキナーゼ複合体(APSC)又はアニストレプラーゼ、tcu-PA、ウロキナーゼ、組換えscuPA（uPA前駆体又はプロウロキナーゼ）、ストレプトキナーゼ、及び誘導体を含む。
血栓溶解治療は世界中で年に750,000人以上の患者に施されており、一方でその数の３倍以上の人々がこの治療から潜在的な薬効が得られる。
肺の脈管構造における内因性の線維素溶解に対して、scuPAが該モデルでtPAが成すのと同程度に寄与することが分かったが、内因性の１本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(scuPA)及びその受容体suPARの線維素溶解における役割は依然として不明である。Blood 2000,96:1820-1826を参照されたい。内因性scuPAのその受容体の結合によって、in vivoで線維素溶解活性が増加し、その活性は、内皮細胞機能における不均一性だけでなく、フィブリン血塊の物性（大きさ、年、細胞組成物）と関係するかもしれない。
しかし、精製されたscuPAのsuPARの結合、及び形成したscuPA/suPARによるscuPAの活性化は可逆的である。重要なことに、scuPAのsuPARへの結合の阻害によって、scuPAの活性が失なわれる。J.Biol.Chem 1995,270:1735-17380を参照されたい。これは、線維素溶解剤としてのscuPAの機能における主な欠点である。
従って、得られるscuPA/suPARの量を増大する点において、ある程度の成功は達成されたが、該scuPA/suPARを安定化させ、かつscuPA及びscuPARへの変換を最適化させる手段が必要とされた。米国同時継続出願第09/325,917号を参照されたい。ここで参考としてその内容の全てが組込まれている。
本発明は、架橋した及び/又は共有結合したscuPA/suPAR単一化合物を調製する方法を提供することによりこの重要な目的を、達成する。この新規な方法は、スルホスクシンイミジル及び、以下に詳細に記載される実験条件の存在下において、等モル濃度のscuPA及びsuPAR又は高濃度(n)のscuPARにおいてscuPA/suPAR複合体を化学的に架橋することから成る。化学的に修飾された等モルのscuPA/suPAR複合体、又はscuPA/n(SuPAR)複合体は共有結合で架橋され、解離できない。本発明の架橋した及び/又は複合体組成物の酵素活性は、以下に詳説する未修飾の天然の組成物に匹敵する。
本発明の別の態様において、様々な割合で、scuPA又はtcuPAに対してsuPARを過剰とすることにより、その結果形成する複合体の安定性及び/又は活性が増加することが分かった。これらの同一の複合体は不安定で、従来の方法によっては検出できなかった。J.Biol.Chem.2000,275:24304-24312を参照されたい。従って、本発明においてscuPA又はtcuPAに対してモル過剰のsuPARを使用して調製された複合体を化学的に架橋し及び/又は共有結合させることにより、等モル濃度及び/又は天然の非架橋酵素に比べて高い分子量及び大きい活性及び有効性を有する新規な複合体が開発される。
本発明の好ましい態様は１分子のscuPA及び１分子のsuPARから成る架橋した及び/又はscuPA/suPARの単一化学化合物複合体を含み、天然の非架橋型より高い線維素溶解活性を示す。
本発明の更に好ましい態様は、scuPA又はtcuPA１分子と、２分子以上のsuPARとから調製されかつ、天然の非架橋型よりも大きい線維素溶解活性を示す架橋した単一化合物複合体、又はtcuPA/suPARを含む。
血栓症の臨床上の治療は、カテーテルを用いた静脈内、又は局所的な血栓溶解剤の投与から構成される。ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子は、通常組換えウロキナーゼ、又は一本鎖型scuPAと同様に投与され、よって二本鎖ウロキナーゼtcuPAを形成する。t-PA及びscu-PAは、in vitro及び動物モデル試験においてフィブリン特異性であること、すなわち全身性プラスミノゲンは主に影響されることなく、フィブリン結合プラスミノゲンを選択的に活性化することが分かった。
しかし、scu-PAによる血栓溶解治療は重大な欠点を有する。該プラスミノゲン活性化因子の治療上の投与量は、投与量による血漿フィブリノゲン濃度の低下で証明されるように、フィブリン特異性、全身線維素溶解活性の喪失に大きく影響することが分かった。その結果、scuPAによる血栓溶解治療はしばしば出血により複雑化する。scuPA活性が増大すればscuPAの投与量を下げ、結果的に副作用も減らせるのでscu-PAの線維素溶解活性の改善のためいくつかの試みがなされた。
ここで記載されている研究は、化学的に架橋した、共有結合のscuPA/suPAR複合体の使用によりscuPAの活性を増大させる改良された方法を示し、scuPAの活性を増大させ、それに従いscuPAの投与量及び副作用を下げることが分かった。
本発明は、また、本発明の架橋した、共有結合のscuPA/suPAR複合体の存在下、t-PA及びscuPAの組み合わせ投与方法の血栓溶解活性を増加させることによる、改良された血栓溶解治療方法を提案する。この相乗効果は、２種のプラスミノゲン活性化因子の異なる作用機構に基づく。例えばt-PAはフィブリンに強く結合しフィブリン血塊に結合したプラスミノゲンと複合体を形成する。scuPAは、血漿中のフィブリン血塊とは有意には結合しない。フィブリン結合プラスミノゲンに対するその選択性は、フィブリンに結合したときにプラスミノゲン中に配座変化が生じこれによってscuPAによる作用に対しいっそう敏感になる。換言すれば、t-PA及びscuPAは、フィブリン血塊に結合した異なる種類のプラスミノゲンを活性化するようにみえる。
従って、本発明はscuPAの投与量を減らし、その結果、副作用の可能性を低下しながら、血栓溶解活性の改善を達成するための、t-PA、scuPA、及び架橋した共有結合のscuPA/suPARの組合わせを提供する。
scuPA/suPARと、tcu-PA、scuPA、IgG、ストレプトキナーゼ、アシル化されたプラスミノゲン-ストレプトキナーゼ活性化因子複合体、これらの混合物、及び他のプラスミノゲン活性化因子を含む他の血栓溶解剤との組み合わせもまた本発明の範囲内である。
非架橋のscuPA/suPAR複合体の線維素溶解活性は、血漿血塊を用いた場合のtcuPAの活性に比べて大きかった。本発明は、tcuPAより大きな線維素溶解活性をも有する、架橋した共有結合のscuPA/suPAR複合体を提供する。
本発明は、効果的な量のIgGと組み合わせて架橋した、共有結合のscuPA/suPAR複合体を含む医薬組成物も提供する。
臨床試験により、急性心筋梗塞の併用血栓溶解治療において、再閉塞が梗塞関連動脈の残した傷害よりむしろ全身的止血因子により多く決定されることが示された。急性心筋梗塞患者に対して、組織及びウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を併用して投与すると低い合併症率での有意な有効性が示された。前記併用血栓溶解活性は、かなり低量の投与量を使用し、その結果経費と副作用を低減しながら、単独療法におけると同程度の血管造影の明白性を示す。scuPAの相補的な効果は、tPAと、ストレプトキナーゼ、又は tPAと、アニソイル化されたプラスミノゲン-ストレプトキナーゼ活性化因子複合体の組み合わせとは逆に特に有望である。急性心筋梗塞患者へのtPAのボーラスの連続投与、及びプロウロキナーゼの注入により、低い再閉塞率で、心臓血管を迅速かつ効率的に再疎通する。The Gusto Angiographic Investigations N.Eng.J.Med 1993,329:1615:1622、Cannon CP et al.J Am Coll Cardiol.1994,24:1602-1610、Zarich Sw et al.J Am Coll Cardiol 1995,26:374-379を参照されたい。
本発明は、架橋した、共有結合のscuPA/scuPAR及びtPA、scuPA/scuPAR及びストレプトキナーゼ、scuPA/suPAR及びAPSAC、scuPA/suPAR及びtcuPA、又は血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤、scuPA/suPAR及び、E6010、TNK-t-pa、n-PA及び他の組換えDNA技術により得られた新規な血栓溶解誘導体を用いた連結的な血栓溶解治療用の投与計画を提供する。
（投与及び剤形）
scuPA/suPAR複合体は血栓塞栓症疾患の予防及び治療を目的とする、動物への投与のための医薬品製剤へと処方できる。
多くのscuPA/suPAR化合物は、製剤的に相溶性のバッファーを含むタンパクの調製剤として提供できる。
治療上の化合物又は医薬組成物は、静脈注射で、腹腔内で、カテーテルで局所的に、皮下で、筋肉内に、くも膜下腔内に、経口に、直腸に、局所的に、エアロゾルで、投与してもよい。
腸管外投与の適した剤形は、水性の、又は非水性の等張性の滅菌溶液を含み、また酸化防止剤、防腐剤を含有する。前記剤形は、単位投与量や、多糖密封された容器に入っていてもよい。
scuPA/suPAR複合体の注用の患者投与は、約10mg〜約100mgの範囲である。投与量及び間隔は、線維素溶解活性を維持するに十分な活性部分の血清濃度を提供するように個的に調節してよい。薬理学的な組成物に対する種々の送達システムが用いられ、リポソームやエマルジョンが挙げられるがこれに限定されるものでない。医薬組成物はまた、適当な固体、又はゲル相担体、又は武形剤を含んでもよい。そのような担体又は武形剤には例えば炭酸カルシウムや、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールのような高分子が挙げられるがこれに限定されるものでない。
、又は１以上の前述の血栓溶解剤との組み合わせた効果的な量の投与のscuPA/suPAR複合体単独の哺乳類の血栓溶解疾患を治療しうる。哺乳動物における別の血栓症の場合又は他の血栓溶解剤がscuPA/suPAR複合体と共に投与されるとき、前記血栓溶解剤に適当と当業者に知られているプロトコル及び投与量範囲に従い、投与される。
本発明は、本発明の１つの特徴を説明するものとして意図した実施例に開示された態様により発明の範囲が限定されるものでなく、機能的に等価ないかなる方法も本発明の範囲に含まれる。実際、ここで示し、かつ記載された例に加えて、本発明の種々の改良は上記記載から当業者にとって明らかとなるであろう。このような改良は特許請求の範囲の範囲内に入るよう意図されている。
【実施例１】
【０００５】
（実施例）
非架橋天然scuPA/suPARとともに、血清血塊中の複合体の活性を示すために、共有結合scuPA/suPAR複合体の化学合成、及びin vitro研究を以下にさらに詳細に記載した。以下の材料、方法、及び検討は、本発明を支持し、かつ説明するが、いかなる場合にも限定を意図するものでない。
種々の濃度のsuPAR及びそのリガンドscuPAを、リン酸バッファー生理食塩水中4℃で１時間インキュベートした。この調製物を傾けて混合した。スルホスクシンイミジルスボレート(BS3)を最終濃度5mg/mlまでそれぞれの調製物に添加し、前記調製物を室温で更に１時間インキュベートした。
また、本発明はいくつかの他の化学的方法によって例えば、紫外線照射を用い、又はスルホスクシンイミジルスボレートと異なる他の架橋を用い、又は分子生物学的組換えによって、scuPAとsuPARから成るハイブリッド分子合成することによって、架橋したscuPA/suPAR複合体を調製する際用いる別のルーチンの化学的方法を企図しており、それゆえ本発明の範囲に入る。
得られた資料は２種の異なる方法によって分析した。
(i)架橋した複合体の形成を確認するために、DTT(50L)が90 OLのアリコートに添加し、次いで、沸騰水中に４分加熱した。グリセロールを添加した後反応セットをSDS-PAGE MINI-GEL上で評価した。上層ゲルは4.5%AABであり、下層ゲルは10%AABであった。電圧は50ボルトに固定した。操作時間は1:15であった。この実験の結果は図１に示されており、Iの図から安定な架橋scuPA-suPAR複合体が形成されたことが分かる。レーンAはscuPA単独を示す。レーンBはSDS-安定scuPA/suPAR複合体に相当するより高い分子量のバンドが現れているのでscuPA-suPAR複合体を示す。
(ii)scuPA/suPARの結合化学反応が活性に影響しなかったことを確認するために、反応混合物の一部分をBlood,1998,92:2075-2083に詳細に記載されているように、基質として血清血塊を用いて調べた。図２は、架橋した複合体の線維素溶解活性が非架橋種の線維素溶解活性と類似することを示す結果を提示する。従って、scuPA/suPARの共有結合はscuPA/suPAR複合体の安定性を付与し、これが今度は化学的に生成したsuPA/suPAR複合体の線維素溶解活性を変えることなくsuPAを向上する。単一化合物suPA/suPARの共有結合は非可逆的なので、この複合体を使用すると、最適な血栓溶解活性に対する効果容量が低下し、それが今度は高投与量により生じる副作用を軽減する。加えて、減少した架橋複合体の解離は、全体的に単離したscuPAかつ、内因性のウロキナーゼ受容体又は内皮細胞上に存在する他の受容体との相互作用を阻害して、もって、突然変異又は血管作動性効果のような望まない効果を減少させる。
当業者であれば、単なる平凡な実験を用いて、ここで記載されている本発明の特定の態様と等価なものを認識し、かつ確認できるであろう。このような等価物は、特許請求の範囲に含まれるものとして企図されている。
本発明の範囲は、本発明の１特徴を示すものとして企図された実施例に開示された態様により限定されず、機能的に等価ないかなる方法も本発明の範囲内である。実際、ここで示しまた記載されている内容に追加して本発明の種々の改良は、上記から当業者に明らかとなるであろう。このような修正は特許請求の範囲内に含まれることを企図している。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、suPARに結合したscuPAのSDS-PAGE分析の図表であり、安定な架橋した及び/又は共有結合したscuPA-suPAR複合体の形成を示す。レーンAはscuPA単独を示す。レーンBは、scuPA-suPAR複合体を示す。SDS-安定scuPA-suPAR複合体に相当する、より高い分子量のバンドの存在を示す。レーンCは、suPAR単独を示す。
【図２】図２は、架橋した及び/又は共有結合したscuPA-suPAR複合体の線維素溶解活性を示すグラフである。25nMのscuPA（黒抜き四角）、非架橋のscuPA/suPAR複合体、又は架橋したscuPA/suPAR複合体（三角）の放射性標識された血漿血塊を開裂する能力（白抜き四角）が下に示されたように測定された。放出された放射能は、架橋した及び/又は共有結合の複合体が、非架橋のscuPA/suPAR複合体の放射能と比較して、その線維素溶解活性を維持したことを示す。
（関連特許文献）
本出願は、1999年6月4日に出願された同時係属出願09/325,917と、PCT/IL00/00208から2001年10月5日米国の国内段階に入った、番号が付されていない同時係属出願との部分継続出願であり、両出願は、血栓塞栓症における非架橋のscuPA/suPAR及びtcuPAの医療的使用の開示に対する具体的な参考としてここに組み込まれる。
（技術分野）
本発明はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(“scuPA”)の一本鎖単位と、可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(“suPAR”)の少なくとも１単位とを含む新規な化学的複合体の調製方法、及びその新規な化学的複合体、並びに血栓塞栓性疾患における線維素溶解性薬剤として得られたscuPA/suPAR架橋複合体としての使用に関する。本発明は、また血栓塞栓疾患の予防及び/又は治療における医薬組成物の使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
血栓塞栓症疾患の治療において広く用いられている、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)は、一本鎖からなるプロ酵素(scuPA)として生物学的に合成される。scuPAを制限的にタンパク分解すると、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(tcuPA)中に２本鎖を形成し、これは前記酵素の活性型であると考えられる。
uPAの重要なレギュレーターは、プラスミノゲン活性化因子阻害剤１(PAI-1)であり、これはtcuPAと相互作用して、非活性複合体を形成する。tcuPA が受容体uPARに結合すると、PAI-1の阻害効果に対するtcuPAの感受性はほんのわずか減少する。
ツカダ(M.Tsukada)らによる米国特許第4,996,005号明細書において、一本鎖プロウロキナーゼ及びプラスミノゲンの組み合わせは、全身的なフィブリン溶解を引き起こさず一本鎖プロウロキナーゼの線維素溶解性活性を高めることが示されている。使用された一本鎖プロウロキナーゼの典型例には、一本鎖ペプチド結合構造を有する分子量50,000〜55,000のものが含まれていた。そして、プラスミノゲンにはヒト又は動物の血清、血漿、腹水、胎盤抽出物、及び胎盤組織抽出物に由来する資源が含まれていた。
ハヤシ(S.Hayashi)らの米国特許第5,004,609号明細書は、ウロキナーゼと分子量97,5000+3,000を有するウロキナーゼ阻害剤との複合体、及び血栓を溶解する能力を有するその複合体を形成する方法を記載している。
グレウィッチ(V.Grewich)らの米国特許第5,626,841号明細書は、血栓溶解治療の後の患者に血栓溶解治療の完了後に単一ボーラスのプロウロキナーゼを患者にそして閉塞の危険の期間後１〜１０日毎に１回、投与することによる、患者の再閉塞を阻害する付加的な治療方法を記載している。
プロウロキナーゼは、心筋梗塞、肺塞栓症、又は深部静脈血栓溶解の患者における、治療上の血栓溶解用の臨床試験においても使用されてきている。ウェルゼル(Welzel)らの米国特許法第5,055,295号明細書を参照されたい。しかし、ウロキナーゼは血中半減期が短く、フィブリン親和性を顕著に欠く。従って、その治療上使用する場合には、合併症を引き起こすかもしれないかなりの投与量のボーラス注入(bolus-infusion)投与を必要とする。Marder VJ et al.e.g.N.Eng.J.Med.1988,318:1512-1520を参照されたい。フィブリノゲンと結合したuPAを用いたプラスミノゲン活性化因子製剤を形成することによりさらに効果的な血栓溶解が、試みられた。Maksimenko Av et al.,e.g.AmNY Acad Sci 1990,613:479-482を参照されたい。
同様に、A.A.Higaziらによる、同時継続の米国出願第09/325,917号において、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子と可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体との組み合わせ、例えば生理学的条件の下で天然非架橋scuPA/suPAR複合体が、血栓塞栓症の予防及び/又は治療における医薬組成物として有用であると記述されている。該組成物は、生理学的条件下において、ヒトIgG又は少なくとも１種のヒトIgG由来のペプチドの存在下、線維素溶解活性が改善されると記述されていた。
A.A.Higaziらによる、別の同時係属の出願（出願番号は付されていない）には、生理学的な条件下、suPAR(tcuPA/suPAR)と結合するとき２本鎖ウロキナーゼ組成物が線維素溶解活性を有することが記述されている。
しかし、scuPAのsuPARへの結合は可逆的で、この結合を中断すると、天然の非架橋性のscuPA/suPAR(scuPA)複合体の活性が低下する。J.Biol.Chem 1995,270:17375-17380を参照されたい。さらに線維素溶解においてウロキナーゼ(scuPA)、及びその受容体(suPAR)の役割は血管の位置、凝血の物性、及び組織機能への影響力に依存するかもしれず、生理学的因子は、suPARの低親和性に寄与してscuPAと結合する２量体、又はオリゴマーを形成する。J.B.C.2000,275:24304-24312を参照されたい。本発明は、scuPAのsuPARへの最適な架橋及び/又は共有結合を達成すること、及び化学的に調製された単一化合物、例えば、架橋した及び/又は共有結合したscuPA/suPAR複合体の存在下、ウロキナーゼの活性を最大にすることを指向している。これは、生理学的条件下に生じかつ時として条件の制御が困難な結合に依存するのに代わり、スルホスクシンイミジルの存在下4℃のリン酸バッファー生理食塩水中にてscuPAをsuPARに共有結合で架橋することにより達成された。その結果得られた化合物は新規な特性を有し、例えば、対応する天然の酵素-受容体複合体、例えば架橋した及び/又は共有結合したscu/PA/suPAR複合体の活性を保持しながら、解離することは出来ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、例えば化学的に結合した、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(scuPA)と、１分子以上の可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(suPAR)とから成る scuPA/suPAR複合体のような線維素溶解活性を有する架橋した及び/又は共有結合した単一化合物の調製、及びその使用に関する。
さらに具体的に述べると、これらの化合物は例えば心筋梗塞、脳-血管現象、肺塞栓症、末梢血管疾患、深部静脈血栓溶解、フィブリン血塊（クロット）の形成に関連する血栓塞栓症、冠動脈疾患、高コレステロール血症、高血圧、虚血性血管疾患、糖尿病、異常ヘモグロビン症、又は、血小板血症や、赤血球増加症のような脊髄増殖性疾患の予防及び/又は治療に有用である。
また、本発明は、特定の実験条件下においてスルホサクシンイミジルスボレート(suborate)の存在下、等モルで又は過剰濃度のsuPARでのscuPA及びsuPARの架橋した共有結合複合体の新たな合成方法を提供する。また、本発明は、等モルの又は過剰モルのsuPARの下架橋した、共有結合tcuPA/suPAR複合体の新規な合成方法を提供する。
また本発明は哺乳類の血塊溶解方法を企図し、そのような方法は、非架橋及び/又は共有結合したscuPA/suPARを含む医薬組成物を生理的バッファーと組み合わせて、血塊を溶解するに治療上効果的な量で、哺乳類に投与することを含む。
また、本発明は、哺乳類における血塊溶解方法を企図し、前記方法は、非架橋及び/又は共有結合したscuPA/suPAR又はtcuPA/suPARから成る薬物を、生理的バッファー及び効果的な量のヒトIgGを組み合わせて、血塊を溶解するに治療上効果的な量で、哺乳類に投与することからなる。
哺乳類における血栓塞栓症治療のための医薬キットは、生理的バッファーと組み合わせて所望であれば、これらの混合物及びストレプトキナーゼ、rt-PA又はアルテプラーゼ、rt-PA誘導体（レテプラーゼ、ラノテプターゼ、及びTNK-rt-PA）、血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤、プラスミノゲンストレプトキナーゼ複合体(APSC)又はアニストレプラーゼ、tcu-PA、又はウロキナーゼ、組換えscuPA（uPA前駆体又はプロウロキナーゼ）、ストレプトキナーゼ、及び誘導体を含むプラスミノゲンの他の活性化因子と組合わせて、血塊を溶解するに治療上効果的な量の架橋性及び/又は共有結合性活性化因子scuPA/scuPA又はtcuPA/suPARを含む医薬組成物の殺菌容器から構成される。
さらに別の態様において、本発明は架橋した共有結合のscuPA/suPAR化合物を安定化させる方法であって、scuPA/suPARタンパクを凍結乾燥させ、次いで哺乳類における血栓塞栓症の予防及び/又は治療に治療上効果的な量で再構成する方法に関する。
さらに、本発明は哺乳類における血栓塞栓症の治療用の医薬キットを企図しており、前記キットは凍結乾燥された形態の、血栓塞栓症治療のために治療上効果的な量のscuPA/suPARを含む殺菌された容器と、再構成液体を含む少なくとも１種の殺菌された容器とを含む。上記キットはさらに所望ならば血栓塞栓症治療に治療上効果的な量の天然の非架橋のscuPA/suPAR又はtcuPA/suPAR複合体などの他の線維素溶解剤を含んでもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明に従えば、架橋した及び/又は共有結合したscuPA/suPARがscuPAの１部分を、１以上の部分のsuPARと結合することにより、化学的に調製できる。また、本発明に従って、架橋された及び/又は共有結合したscuPA/suPARは凍結乾燥することにより安定化できる。本発明はさらに、血栓塞栓症の予防及び/又は治療に使用されうる医薬組成物及びキットを提供し、本発明の架橋した及び/又は共有結合のscuPA/suPAR複合体と、補足的な作用メカニズム及び本発明の組成物と異なる薬物動態学特性を有する他のプラスミノゲン活性化因子との組み合わせ又は混合物を使用して、血栓塞栓症治療の効力の増加を目的とした新たな取り組みを提供する。
（通常用いられている血栓溶解剤）
承認された又は急性心筋梗塞患者において臨床試験中の血栓溶解剤は、ストレプトキナーゼ、rt-PA、アルテプラーゼ、rt-PA誘導体（レテプラーゼ、ラノテプラーゼ、及びTNK-rt-PA）、アニソール化(anisolylated)プラスミノゲンストレプトキナーゼ複合体(APSC)又はアニストレプラーゼ、tcu-PA、ウロキナーゼ、組換えscuPA（uPA前駆体又はプロウロキナーゼ）、ストレプトキナーゼ、及び誘導体を含む。
血栓溶解治療は世界中で年に750,000人以上の患者に施されており、一方でその数の３倍以上の人々がこの治療から潜在的な薬効が得られる。
肺の脈管構造における内因性の線維素溶解に対して、scuPAが該モデルでtPAが成すのと同程度に寄与することが分かったが、内因性の１本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(scuPA)及びその受容体suPARの線維素溶解における役割は依然として不明である。Blood 2000,96:1820-1826を参照されたい。内因性scuPAのその受容体の結合によって、in vivoで線維素溶解活性が増加し、その活性は、内皮細胞機能における不均一性だけでなく、フィブリン血塊の物性（大きさ、年、細胞組成物）と関係するかもしれない。
しかし、精製されたscuPAのsuPARの結合、及び形成したscuPA/suPARによるscuPAの活性化は可逆的である。重要なことに、scuPAのsuPARへの結合の阻害によって、scuPAの活性が失なわれる。J.Biol.Chem 1995,270:1735-17380を参照されたい。これは、線維素溶解剤としてのscuPAの機能における主な欠点である。
従って、得られるscuPA/suPARの量を増大する点において、ある程度の成功は達成されたが、該scuPA/suPARを安定化させ、かつscuPA及びscuPARへの変換を最適化させる手段が必要とされた。米国同時継続出願第09/325,917号を参照されたい。ここで参考としてその内容の全てが組込まれている。
本発明は、架橋した及び/又は共有結合したscuPA/suPAR単一化合物を調製する方法を提供することによりこの重要な目的を、達成する。この新規な方法は、スルホスクシンイミジル及び、以下に詳細に記載される実験条件の存在下において、等モル濃度のscuPA及びsuPAR又は高濃度(n)のscuPARにおいてscuPA/suPAR複合体を化学的に架橋することから成る。化学的に修飾された等モルのscuPA/suPAR複合体、又はscuPA/n(SuPAR)複合体は共有結合で架橋され、解離できない。本発明の架橋した及び/又は複合体組成物の酵素活性は、以下に詳説する未修飾の天然の組成物に匹敵する。
本発明の別の態様において、様々な割合で、scuPA又はtcuPAに対してsuPARを過剰とすることにより、その結果形成する複合体の安定性及び/又は活性が増加することが分かった。これらの同一の複合体は不安定で、従来の方法によっては検出できなかった。J.Biol.Chem.2000,275:24304-24312を参照されたい。従って、本発明においてscuPA又はtcuPAに対してモル過剰のsuPARを使用して調製された複合体を化学的に架橋し及び/又は共有結合させることにより、等モル濃度及び/又は天然の非架橋酵素に比べて高い分子量及び大きい活性及び有効性を有する新規な複合体が開発される。
本発明の好ましい態様は１分子のscuPA及び１分子のsuPARから成る架橋した及び/又はscuPA/suPARの単一化学化合物複合体を含み、天然の非架橋型より高い線維素溶解活性を示す。
本発明の更に好ましい態様は、scuPA又はtcuPA１分子と、２分子以上のsuPARとから調製されかつ、天然の非架橋型よりも大きい線維素溶解活性を示す架橋した単一化合物複合体、又はtcuPA/suPARを含む。
血栓症の臨床上の治療は、カテーテルを用いた静脈内、又は局所的な血栓溶解剤の投与から構成される。ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子は、通常組換えウロキナーゼ、又は一本鎖型scuPAと同様に投与され、よって二本鎖ウロキナーゼtcuPAを形成する。t-PA及びscu-PAは、in vitro及び動物モデル試験においてフィブリン特異性であること、すなわち全身性プラスミノゲンは主に影響されることなく、フィブリン結合プラスミノゲンを選択的に活性化することが分かった。
しかし、scu-PAによる血栓溶解治療は重大な欠点を有する。該プラスミノゲン活性化因子の治療上の投与量は、投与量による血漿フィブリノゲン濃度の低下で証明されるように、フィブリン特異性、全身線維素溶解活性の喪失に大きく影響することが分かった。その結果、scuPAによる血栓溶解治療はしばしば出血により複雑化する。scuPA活性が増大すればscuPAの投与量を下げ、結果的に副作用も減らせるのでscu-PAの線維素溶解活性の改善のためいくつかの試みがなされた。
ここで記載されている研究は、化学的に架橋した、共有結合のscuPA/suPAR複合体の使用によりscuPAの活性を増大させる改良された方法を示し、scuPAの活性を増大させ、それに従いscuPAの投与量及び副作用を下げることが分かった。
本発明は、また、本発明の架橋した、共有結合のscuPA/suPAR複合体の存在下、t-PA及びscuPAの組み合わせ投与方法の血栓溶解活性を増加させることによる、改良された血栓溶解治療方法を提案する。この相乗効果は、２種のプラスミノゲン活性化因子の異なる作用機構に基づく。例えばt-PAはフィブリンに強く結合しフィブリン血塊に結合したプラスミノゲンと複合体を形成する。scuPAは、血漿中のフィブリン血塊とは有意には結合しない。フィブリン結合プラスミノゲンに対するその選択性は、フィブリンに結合したときにプラスミノゲン中に配座変化が生じこれによってscuPAによる作用に対しいっそう敏感になる。換言すれば、t-PA及びscuPAは、フィブリン血塊に結合した異なる種類のプラスミノゲンを活性化するようにみえる。
従って、本発明はscuPAの投与量を減らし、その結果、副作用の可能性を低下しながら、血栓溶解活性の改善を達成するための、t-PA、scuPA、及び架橋した共有結合のscuPA/suPARの組合わせを提供する。
scuPA/suPARと、tcu-PA、scuPA、IgG、ストレプトキナーゼ、アシル化されたプラスミノゲン-ストレプトキナーゼ活性化因子複合体、これらの混合物、及び他のプラスミノゲン活性化因子を含む他の血栓溶解剤との組み合わせもまた本発明の範囲内である。
非架橋のscuPA/suPAR複合体の線維素溶解活性は、血漿血塊を用いた場合のtcuPAの活性に比べて大きかった。本発明は、tcuPAより大きな線維素溶解活性をも有する、架橋した共有結合のscuPA/suPAR複合体を提供する。
本発明は、効果的な量のIgGと組み合わせて架橋した、共有結合のscuPA/suPAR複合体を含む医薬組成物も提供する。
臨床試験により、急性心筋梗塞の併用血栓溶解治療において、再閉塞が梗塞関連動脈の残した傷害よりむしろ全身的止血因子により多く決定されることが示された。急性心筋梗塞患者に対して、組織及びウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を併用して投与すると低い合併症率での有意な有効性が示された。前記併用血栓溶解活性は、かなり低量の投与量を使用し、その結果経費と副作用を低減しながら、単独療法におけると同程度の血管造影の明白性を示す。scuPAの相補的な効果は、tPAと、ストレプトキナーゼ、又は tPAと、アニソイル化されたプラスミノゲン-ストレプトキナーゼ活性化因子複合体の組み合わせとは逆に特に有望である。急性心筋梗塞患者へのtPAのボーラスの連続投与、及びプロウロキナーゼの注入により、低い再閉塞率で、心臓血管を迅速かつ効率的に再疎通する。The Gusto Angiographic Investigations N.Eng.J.Med 1993,329:1615:1622、Cannon CP et al.J Am Coll Cardiol.1994,24:1602-1610、Zarich Sw et al.J Am Coll Cardiol 1995,26:374-379を参照されたい。
本発明は、架橋した、共有結合のscuPA/scuPAR及びtPA、scuPA/scuPAR及びストレプトキナーゼ、scuPA/suPAR及びAPSAC、scuPA/suPAR及びtcuPA、又は血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤、scuPA/suPAR及び、E6010、TNK-t-pa、n-PA及び他の組換えDNA技術により得られた新規な血栓溶解誘導体を用いた連結的な血栓溶解治療用の投与計画を提供する。
（投与及び剤形）
scuPA/suPAR複合体は血栓塞栓症疾患の予防及び治療を目的とする、動物への投与のための医薬品製剤へと処方できる。
多くのscuPA/suPAR化合物は、製剤的に相溶性のバッファーを含むタンパクの調製剤として提供できる。
治療上の化合物又は医薬組成物は、静脈注射で、腹腔内で、カテーテルで局所的に、皮下で、筋肉内に、くも膜下腔内に、経口に、直腸に、局所的に、エアロゾルで、投与してもよい。
腸管外投与の適した剤形は、水性の、又は非水性の等張性の滅菌溶液を含み、また酸化防止剤、防腐剤を含有する。前記剤形は、単位投与量や、多糖密封された容器に入っていてもよい。
scuPA/suPAR複合体の注用の患者投与は、約10mg〜約100mgの範囲である。投与量及び間隔は、線維素溶解活性を維持するに十分な活性部分の血清濃度を提供するように個的に調節してよい。薬理学的な組成物に対する種々の送達システムが用いられ、リポソームやエマルジョンが挙げられるがこれに限定されるものでない。医薬組成物はまた、適当な固体、又はゲル相担体、又は武形剤を含んでもよい。そのような担体又は武形剤には例えば炭酸カルシウムや、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールのような高分子が挙げられるがこれに限定されるものでない。
、又は１以上の前述の血栓溶解剤との組み合わせた効果的な量の投与のscuPA/suPAR複合体単独の哺乳類の血栓溶解疾患を治療しうる。哺乳動物における別の血栓症の場合又は他の血栓溶解剤がscuPA/suPAR複合体と共に投与されるとき、前記血栓溶解剤に適当と当業者に知られているプロトコル及び投与量範囲に従い、投与される。
本発明は、本発明の１つの特徴を説明するものとして意図した実施例に開示された態様により発明の範囲が限定されるものでなく、機能的に等価ないかなる方法も本発明の範囲に含まれる。実際、ここで示し、かつ記載された例に加えて、本発明の種々の改良は上記記載から当業者にとって明らかとなるであろう。このような改良は特許請求の範囲の範囲内に入るよう意図されている。
【実施例１】
【０００５】
（実施例）
非架橋天然scuPA/suPARとともに、血清血塊中の複合体の活性を示すために、共有結合scuPA/suPAR複合体の化学合成、及びin vitro研究を以下にさらに詳細に記載した。以下の材料、方法、及び検討は、本発明を支持し、かつ説明するが、いかなる場合にも限定を意図するものでない。
種々の濃度のsuPAR及びそのリガンドscuPAを、リン酸バッファー生理食塩水中4℃で１時間インキュベートした。この調製物を傾けて混合した。スルホスクシンイミジルスボレート(BS3)を最終濃度5mg/mlまでそれぞれの調製物に添加し、前記調製物を室温で更に１時間インキュベートした。
また、本発明はいくつかの他の化学的方法によって例えば、紫外線照射を用い、又はスルホスクシンイミジルスボレートと異なる他の架橋を用い、又は分子生物学的組換えによって、scuPAとsuPARから成るハイブリッド分子合成することによって、架橋したscuPA/suPAR複合体を調製する際用いる別のルーチンの化学的方法を企図しており、それゆえ本発明の範囲に入る。
得られた資料は２種の異なる方法によって分析した。
(i)架橋した複合体の形成を確認するために、DTT(50L)が90 OLのアリコートに添加し、次いで、沸騰水中に４分加熱した。グリセロールを添加した後反応セットをSDS-PAGE MINI-GEL上で評価した。上層ゲルは4.5%AABであり、下層ゲルは10%AABであった。電圧は50ボルトに固定した。操作時間は1:15であった。この実験の結果は図１に示されており、Iの図から安定な架橋scuPA-suPAR複合体が形成されたことが分かる。レーンAはscuPA単独を示す。レーンBはSDS-安定scuPA/suPAR複合体に相当するより高い分子量のバンドが現れているのでscuPA-suPAR複合体を示す。
(ii)scuPA/suPARの結合化学反応が活性に影響しなかったことを確認するために、反応混合物の一部分をBlood,1998,92:2075-2083に詳細に記載されているように、基質として血清血塊を用いて調べた。図２は、架橋した複合体の線維素溶解活性が非架橋種の線維素溶解活性と類似することを示す結果を提示する。従って、scuPA/suPARの共有結合はscuPA/suPAR複合体の安定性を付与し、これが今度は化学的に生成したsuPA/suPAR複合体の線維素溶解活性を変えることなくsuPAを向上する。単一化合物suPA/suPARの共有結合は非可逆的なので、この複合体を使用すると、最適な血栓溶解活性に対する効果容量が低下し、それが今度は高投与量により生じる副作用を軽減する。加えて、減少した架橋複合体の解離は、全体的に単離したscuPAかつ、内因性のウロキナーゼ受容体又は内皮細胞上に存在する他の受容体との相互作用を阻害して、もって、突然変異又は血管作動性効果のような望まない効果を減少させる。
当業者であれば、単なる平凡な実験を用いて、ここで記載されている本発明の特定の態様と等価なものを認識し、かつ確認できるであろう。このような等価物は、特許請求の範囲に含まれるものとして企図されている。
本発明の範囲は、本発明の１特徴を示すものとして企図された実施例に開示された態様により限定されず、機能的に等価ないかなる方法も本発明の範囲内である。実際、ここで示しまた記載されている内容に追加して本発明の種々の改良は、上記から当業者に明らかとなるであろう。このような修正は特許請求の範囲内に含まれることを企図している。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、suPARに結合したscuPAのSDS-PAGE分析の図表であり、安定な架橋した及び/又は共有結合したscuPA-suPAR複合体の形成を示す。レーンAはscuPA単独を示す。レーンBは、scuPA-suPAR複合体を示す。SDS-安定scuPA-suPAR複合体に相当する、より高い分子量のバンドの存在を示す。レーンCは、suPAR単独を示す。
【図２】図２は、架橋した及び/又は共有結合したscuPA-suPAR複合体の線維素溶解活性を示すグラフである。25nMのscuPA（黒抜き四角）、非架橋のscuPA/suPAR複合体、又は架橋したscuPA/suPAR複合体（三角）の放射性標識された血漿血塊を開裂する能力（白抜き四角）が下に示されたように測定された。放出された放射能は、架橋した及び/又は共有結合の複合体が、非架橋のscuPA/suPAR複合体の放射能と比較して、その線維素溶解活性を維持したことを示す。
Claims (25)
- 可溶性のウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(suPAR)と共有結合した一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(scuPA)を含む、架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- 可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体の２単位以上と共有結合した一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子を含む、架橋したウロキナーゼ/受容体複合体。
- 約100kdの分子量を有しかつ生理的及び/又は病理学的な条件で線維素溶解活性を有する、請求項１に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- 100〜300kdの範囲の分子量を有しかつ生理的及び/又は病理学的な条件で線維素溶解活性を有する、請求項２に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- 前記複合体がさらにヒトIgGを含み、その組み合わせが前記線維素溶解活性を有する、請求項１に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- さらにtcuPA又はtcuPA/suPARを含み、その組み合わせが前記線維素溶解活性を有する、請求項１に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- 請求項２に記載のscuPA/suPAR複合体をさらに含み、その組み合わせが前記線維素溶解活性を有する、請求項１に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- さらにtPAを含み、その組み合わせが線維素溶解活性を有する、請求項１に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- tcuPA、tPA、ストレプトキナーゼ、rt-PA、rt-PA誘導体、APSC、組換えscuPA、プロウロキナーゼ、又は血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤を本質的に含む、１種以上のプラスミノゲン活性化因子をさらに含む、請求項１に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- tcuPA、tPA、ストレプトキナーゼ、rt-PA、rt-PA誘導体、APSC、組換えscuPA、プロウロキナーゼ、又は血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤を本質的に含む、１種以上のプラスミノゲン活性化因子をさらに含む、請求項２に記載の架橋したウロキナーゼ/受容体複合体scuPA/suPAR。
- 等モルの、又はモル過剰量のsuPARと共有結合した２本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(tcuPA)を含む、架橋したウロキナーゼ/受容体複合体tcuPA/tuPAR。
- １本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(scuPA)及び可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(suPAR)の１以上の単位から架橋した共有結合性のscuPA/suPAR複合体を調製する方法であって、以下の工程、
リン酸塩バッファーの生理食塩水又は適当な他のバッファーにおいて、十分な濃度のscuPA及び種々の濃度のsuPARを提供する工程、
前記scuPA及びsuPARを４℃又は、適当な温度にて混合する工程、
十分な濃度のスルホサクシンイミジルスボレートを工程(b)で得られた混合物に、最終濃度約5mg/mlまで、添加する工程であり、及び/又は他のいずれの架橋剤、
室温において工程(c)で得られた調製物をインキュベートする工程、
を含む前記方法。 - ２本鎖のウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(tcuPA)及び可溶性ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(suPAR)の１以上の単位から架橋した共有結合性のtcuPA/suPAR複合体を調製する方法であり、以下の工程、
a) リン酸塩バッファーの生理食塩水又は適当な他のバッファーにおいて、十分な濃度のtcuPA及び種々の濃度のsuPAR濃度を供給する工程、
b)前記tcuPA及びsuPARを４℃又は、適当な温度にて混合する工程、
c)十分な濃度のスルホサクシンイミジルスボレートを工程(b)で得られた混合物に、最終濃度約5mg/mlまで添加する工程であり、及び又は他のいずれの架橋剤、
室温において工程(c)で得られた調製物をインキュベートする工程、
を含む前記方法。 - 患者において、架橋したscuPA/scuPARを用いる線維素溶解性治療法であって、該患者に血栓溶解投与量の架橋したscuPA/suPAR複合体を１ボーラスで又は持続輸注で投与する工程を含み、その後さらに必要であれば、存在しかつ形成する血栓を溶解する量の架橋したscuPA/suPAR複合体の追加的投与量の１ボーラスを投与する方法。
- scuPA/suPARの追加的投与量を、約200mg/時までの投与量又は200mgまでの単一ボーラスで投与する、請求項１４に記載の線維素溶解性治療法。
- scuPA/suPARの追加的投与量が5〜200mgの単一ボーラスである、請求項１４に記載の線維素溶解性治療法。
- scuPA/suPARの追加的投与量が5〜200mgの単一ボーラスである、請求項１５に記載の線維素溶解性治療法。
- クロットフリーの患者において閉塞を予防する方法であって、該患者に１日〜１０日毎に１回、架橋したscuPA/suPARの量の単一ボーラスを投与する工程を含み、前記架橋したscuPA/suPARはその後、血栓症の発症中に血小板媒介血栓症を阻害する方法。
- 5〜200mgの単一ボーラスを1〜5日毎に１回、前記架橋したscuPA/suPARが静脈内又は皮下投与される請求項１８に記載の方法。
- コンビネーション療法計画における天然のscuPA/suPARの投与をさらに含む、請求項１４に記載の線維素溶解性治療法。
- 5〜200mgの投与量における天然のscuPA/suPARの投与量をさらに含む、請求項１４に記載の線維素溶解性治療法。
- ヒトIgGの効果的な量の投与をさらに含む、請求項２０に記載の線維素溶解性治療法。
- 患者において、架橋したtcuPA/scuPARを用いる線維素溶解性治療法であって、該患者に血栓溶解投与量の架橋したtcuPA/suPAR複合体を単一ボーラスで又は持続輸注で投与する工程を含み、その後さらに必要であれば、存在しかつ形成する血栓を溶解する量の架橋したtcuPA/suPAR複合体の追加的投与量の１ボーラスを投与する方法。
- tcuPA、TcuPA/PAR、tPA、血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤、ストレプトキナーゼ、rt-PA、rt-PA誘導体、APSC、組換えscuPA、又はプロウロキナーゼを本質的に含む、１種以上のプラスミノゲン活性化因子をさらに含む、請求項１４に記載の線維素溶解性治療法。
- tcuPA、tcuPA/PAR、tPA、血小板糖タンパクIIb-IIIa受容体阻害剤、ストレプトキナーゼ、rt-PA、rt-PA誘導体、APSC、組換えscuPA、又はプロウロキナーゼから本質的になる、１種以上のプラスミノゲン活性化因子をさらに含む、請求項２３に記載の線維素溶解性治療法。
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