KR102277471B1

KR102277471B1 - '혈관내 혈전' 용해제

Info

Publication number: KR102277471B1
Application number: KR1020190131585A
Authority: KR
Inventors: 홍성출; 김현진; 엠디 메헤디 하산
Original assignee: 주식회사 지니스
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2021-07-14
Also published as: KR20210047690A; EP4050105A4; JP2022551936A; WO2021080262A1; US20220362355A1; MX2022004698A; EP4050105A1; CN114585735A; CA3155130A1; BR112022007123A2; JP7427084B2

Abstract

본 발명은 '혈관내 혈전' 용해제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 '혈관내 혈전'에 대한 혈전인지 도메인(thrombo-recognition domain)과 혈전용해 도메인(thrombolytic domain)으로 구성되어, '혈관내 혈전'을 용해하는 기능의 폴리펩티드, 유전자 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전용해 도메인 및 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전인지 도메인으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드는 심각한 출혈 부작용이 없이 포유동물의 혈액 내 혈전을 용해시켜 혈전증에 대한 예방 및 치료 효능을 가지므로, 혈전증 및 관련 질환의 예방 또는 치료제로 널리 이용될 수 있다.

Description

'혈관내 혈전' 용해제 {Thrombolytic agents for Intravascular clots}

본 발명은 '혈관내 혈전' 용해제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 '혈관내 혈전'에 대한 혈전인지 도메인(thrombo-recognition domain)과 혈전용해 도메인(thrombolytic domain)으로 구성되어, '혈관내 혈전'을 용해하는 기능의 폴리펩티드, 유전자 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

혈관 조직에 상처가 나면 혈액이 혈관 밖으로 나오게 되므로, 출혈을 막기 위한 blood clot이 혈관의 상처 주변 혈관조직에 형성되어진다. 상처 부위에 한정되어 출혈을 막는 조직 혈전은 정상적인 상처 치유 과정이고, 사람을 포함한 동물의 생존에 필수적인 과정이다. 이와 달리, 혈액이 흐르는 혈관 내에 비정상적으로 혈액응고 덩어리가 있는 경우를 '혈관내 혈전(Intravascular thrombus)'이라 한다. 혈관내 혈전은 제거되지 않으면 혈액의 흐름을 막아 혈전증(thrombosis)을 일으키게 된다. 혈액의 흐름이 막히면 저산소증(hypoxia)으로 조직괴사(necrosis)를 일으키는 뇌졸중, 폐경색, 심근경색 같은 치명적인 혈전증(thrombosis) 질환을 일으키게 된다. 따라서 혈전증이 발생하면 즉각적인 치료가 절실하다.

혈전증은 매우 심각한 질병이고 발병 빈도도 높아, 다양한 치료제가 개발되어 왔다. 혈전용해제(Thrombolytics)는 혈전을 용해하는 직접적인 치료제로, tissue-type plasminogen activator(tPA)(US4766075, US5185259, US5587159, US5869314, US6274335), urokinase(US4259447, US4851345, US5055295, US6759042), streptokinase(US3855065, US5011686, US7105327)가 대표적이다. 이들 혈전용해제 즉 tPA(alteplase, reteplase), urokinase, streptokinase들은 모두 체내 plasminogen을 절단하여 plasmin으로 활성화시키고, 활성화된 plasmin은 혈전을 분해하여 혈전증 치료 효과를 가진다. 그러나, 활성화된 plasmin은 손상된 혈관의 출혈을 막기 위한 혈전도 분해시켜, 상처 부위로부터 심각한 출혈을 유발한다. 이는 plasmin이, '혈관내 혈전'에 대한 특이성을 가지지 못하는, 비특이적 혈전용해제이기 때문이다. plasmin의 심각한 출혈 부작용 때문에, plasmin을 생성하는 혈전용해제들 즉 tPA, urokinase 그리고 streptokinase들은 모두 매우 제한적으로 일부 경우에만 사용되고 있다.

혈전용해제의 치명적 부작용 때문에, 실제 병원에서는 혈전증 환자에게 혈전용해제 대신 heparin, warfarin, davigatran 등과 같은 항응고제(anticoagulant)나 aspirin 등과 같은 항혈소판제(Antiplatelets)를 사용한다. 항응고제와 항혈소판제는 이미 생성된 혈전을 분해시키는 것이 아니라 혈관 내에서 추가적인 혈전이 형성되지 못하도록 한다. 즉 항응고제와 항혈소판제는 혈전분해능이 없어 치명적인 출혈은 적으나, 혈전증 치료에는 큰 효과가 없다. 또한 항응고제와 항혈소판제는 혈전 형성을 방해하므로 상처 치유를 방해하여, 출혈 부작용 또한 심각하다.

따라서 혈전증을 치료하기 위해서는 '혈관내 혈전'만을 정확하게 인지하여 분해하고, 정상적인 상처 치유를 방해하지 않아 출혈 부작용을 최소화하는, '혈관내 혈전'에 특이성을 가지는 용해제의 개발이 절실히 필요하다.

본 발명자들은 혈관 조직에서 정상적으로 일어나는 혈액응고 과정과 상처 치유를 방해하지 않고, 혈전증을 일으키는 '혈관 내 혈전'만을 정확하게 분해시키는 '혈관내 혈전' 용해제가 가장 이상적인 혈전증 치료제라는 사실을 인지한 후, '혈관내 혈전' 용해제 개발을 위해 예의 노력하였다. 따라서 본 발명의 목적은, 혈전증을 일으키는 '혈관내 혈전'만을 정확하게 용해시킴으로써 전신출혈과 같은 심각한 출혈 부작용이 전혀 없는, 혁신적 개념의 '혈관내 혈전' 용해제를 혈전증 치료제로 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전용해 도메인 및 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전인지 도메인으로 구성되는 것을 특징으로 '혈관내 혈전'을 인지하여 '혈관내 혈전'이 용해되도록 하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 혈전용해 도메인을 코딩하는, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전용해 도메인 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 혈전인지 도메인을 코딩하는, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전인지 도메인 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈전증 및 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드는 심각한 출혈 부작용이 없이 포유동물의 혈액 내 혈전을 용해시켜 혈전증에 대한 예방 및 치료 효능을 가지므로, 혈전증 및 관련 질환의 예방 또는 치료제로 널리 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실험예 1에 따라 ex vivo 혈전에 혈전용해효소 SK 또는 HtrA1를 처리한 후 혈전용해능을 확인한 결과이다 (a; 혈전이 용해되어 있는 이미지(HA1) 및 용해되지 않은 혈전 덩어리 이미지(SK) b; 처리전의 %로 나타낸 혈전 덩어리 용해도, c; 혈전의 분해물인 FDP(fibrin degradation products), d; 혈전의 분해물인 D-dimer의 양, (Ctrl: 대조군, SK: 스트렙토키나아제, HA1; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA1)).
도 2는 본 발명의 실험예 1에 따라 ex vivo 혈전에 혈전용해효소 SK 또는 HtrA2를 처리한 후 혈전용해능을 확인한 결과이다 (a; 혈전이 용해되어 있는 이미지(HA2) 및 용해되지 않은 혈전 덩어리 이미지(SK), b; 처리전의 %로 나타낸 혈전 덩어리 용해도, c; 혈전의 분해물인 FDP(fibrin degradation products), d; 혈전의 분해물인 D-dimer의 양, (Ctrl: 대조군, SK: 스트렙토키나아제, HA2; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA2)).
도 3은 본 발명의 실험예 2에 따라 '혈관내 혈전' 용해 폴리펩티드 HtrA1의 플라스미노겐 활성능을 확인한 결과이다 (a; 플라스미노겐의 활성화로 생성된 플라스민이 분해한 기질의 형광 강도 측정치, b; 플라스미노겐의 활성화로 생성된 플라스민 밴드를 확인한 SDS-PAGE 이미지 (Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, UK; 우로키나아제, HA1; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA1)).
도 4는 본 발명의 실험예 2에 따라 '혈관내 혈전' 용해 폴리펩티드 HtrA2의 플라스미노겐 활성능을 확인한 결과이다 (a; 플라스미노겐의 활성화로 생성된 플라스민이 분해한 기질의 형광 강도 측정치, b; 플라스미노겐의 활성화로 생성된 플라스민 밴드를 확인한 SDS-PAGE 이미지 (Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, UK; 우로키나아제, HA2; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA2)).
도 5는 본 발명의 실험예 3에 따라, 본 발명의 혈관내 혈전 용해 폴리펩티드가 혈전특이성을 가지는지 평가하기 위하여, 상처 치유 과정에서 나타나는 fibrinolysis components들에 대한 활성 여부를 확인한 결과이다 (a; 피브리노겐에 각 혈전용해효소들을 처리한 후 피브리노겐이 피브린으로 분해되는지 여부를 SDS-PAGE로 확인한 이미지, b; cellular fibronectin에 각 혈전용해효소들을 처리한 후 fibronectin의 분해 여부를 immuno-blot으로 확인한 이미지, c; plasma fibronectin에 각 혈전용해효소들을 처리한 후 fibronectin의 분해 여부를 immuno-blot으로 확인한 이미지 (Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, UK; 우로키나아제, HA1; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA1)).
도 6은 본 발명의 실시예 1에 따라 동물 모델을 이용하여 꼬리 혈전증 마우스에서 본 발명의 '혈관내 혈전' 용해 폴리펩티드의 혈전증에 대한 치료 효능을 확인한 혈전증 꼬리 이미지 결과이다 (Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, UK; 우로키나아제, tPA; tissue plasminogen activator, HA1; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA1, HA2; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA2).
도 7은 본 발명의 실시예 1에 따라 동물 모델을 이용하여 꼬리 혈전증 마우스에서 본 발명의 '혈관내 혈전' 용해 폴리펩티드의 혈전증에 대한 치료 효능을 확인한 혈전증 꼬리 조직의 H & E 염색 이미지 결과이다 (Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, UK; 우로키나아제, tPA; tissue plasminogen activator, HA1; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA1, HA2; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA2).
도 8은 본 발명의 실시예 3에 따라 창상 동물 모델을 이용하여 본 발명의 '혈관내 혈전' 용해 폴리펩티드의 상처 치유에 미치는 영향을 확인한 출혈 이미지 결과이다 (Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, UK; 우로키나아제, tPA; tissue plasminogen activator, HA1; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA1, HA2; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA2).
도 9는 본 발명의 실시예 3에 따라 창상 동물 모델을 이용하여 본 발명의 '혈관내 혈전' 용해 폴리펩티드 HtrA1의 상처 치유에 미치는 영향을 확인한 출혈 시험 결과이다. a; 출혈 시간 측정치, b; 출혈량 측정치, c; 출혈액의 헤모글로빈 함량 측정치, d; 상처 치유 및 혈액 응고까지 걸린 시간 측정치(Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, UK; 우로키나아제, HA1; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA1).
도 10은 본 발명의 실시예 3에 따라 창상 동물 모델을 이용하여 본 발명의 '혈관내 혈전' 용해 폴리펩티드 HtrA2의 상처 치유에 미치는 영향을 확인한 출혈 시험 결과이다. a; 출혈 시간 측정치, b; 출혈량 측정치, c; 출혈액의 헤모글로빈 함량 측정치, d; 상처 치유 및 혈액 응고까지 걸린 시간 측정치 (Ctrl: 대조군, PL: 플라스민, SK: 스트렙토키나아제, tPA; tissue plasminogen activator, HA2; 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 HtrA2).

혈전을 제거하기 위해 여러 약물들이 개발되어 왔으나 기존 혈전용해제들은 모두 출혈 부작용이 심각하여, 혈전증 및 관련 질환의 효과적인 치료가 어려운 실정이다. 또한 이들 치료법은 혈전증의 사전 예방이 불가능하다.

본 발명자들은 '혈관내 혈전'은 일종의 protein aggregate이라는 점과, aggregated protein을 분해하는 Quality control protein들이 생물의 생존에 필수적이라는 점에 착안하여, misfolded/aggregated protein들을 인지하는 domain 및 misfolded/aggregated protein을 분해하여 제거하는 domain을 가지고 있는 endogenous proteinase가 체내에 존재하고 있고, 이 endogenous proteinase가 혈관 내 혈전을 분해할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

이에 본 발명에서는 misfolded/aggregated protein을 인지하는 도메인, misfolded/aggregated protein을 분해하여 제거하는 도메인, 이들 도메인을 포함하고 있는 Quality control protein들을 탐색하였고, 그 결과, 혈전인지 도메인 및 혈전용해 도메인을 포함하고 있는 폴리펩티드가 '혈관내 혈전'을 특이적으로 인지하고 분해하여 제거함으로써, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드는 심각한 출혈 부작용 없이 혈전증을 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명에서는 혈관내 혈전인지 도메인 및 혈전용해 도메인을 포함하고 있는 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드가 (1) 우수한 혈전용해능이 있고, (2) 기존 혈전용해제와는 달리, plasminogen을 plasmin으로 활성화시키지 않으므로 plasmin 생성에 따른 출혈 위험이 없고, (3) 기존 혈전용해제와는 달리, 상처 치유에 중요한 fibrinogen, c-fibronectin, p-fibronectin을 분해하지 않으므로 상처 치유를 방해하지 않고, (4) in vivo 동물모델에서 혈전증을 효과적으로 치료하고, (5) 기존 혈전용해제와는 달리, in vivo 동물모델에서 혈전색전증의 치료 후 생존율을 100%로 완치시키고, (6) 기존 혈전용해제와는 달리, in vivo 출혈 동물실험에서 혈액 응고 및 상처 치유를 방해하지 않아 출혈 부작용이 없다는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서, 마우스 꼬리 혈전증 모델에서 치료 효능을 확인한 결과, 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 용해하는 폴리펩티드는 기존 혈전용해제들과는 달리 혈전증에 대한 완치 효과를 가짐을 확인하였다.

또 다른 본 발명의 일 실시예인, 폐 혈전색전증 마우스 모델에서는 기존 혈전용해제들 처리군에서는 개체 사망을 확인할 수 있으나, 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 치료군에서는 생존율 100%로, 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드는 치명적인 혈전색전증을 완벽히 치료함을 확인하였다.

또한 마우스 꼬리 출혈 실험에서 상처 치유능을 확인한 결과, 본 발명의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 처리군은 상처 부위의 출혈 시간, 출혈량, 손실된 헤모글로빈 양, 혈액이 응고 시간 등이 무처리 대조군 수준으로 우수하여, 기존 혈전용해제들과는 달리 출혈 부작용이 전혀 없이 완벽한 상처 치유 효과를 가짐을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전용해 도메인 및 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전인지 도메인으로 구성되는 것을 특징으로 하는, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전용해 도메인 및 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전인지 도메인으로 구성되거나, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전용해 도메인 및 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 혈전인지 도메인으로 구성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드는, 바람직하게는 trypsin-like polypeptide인 serine protease의 High Temperature Requirement (Htr) family에 속하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 HtrA1, HtrA2를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 혈전용해 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 유사성(homology)을 가지는 도메인일 수 있으며, 상기 혈전용해 도메인은 GNSGGPL 펩티드 또는 유사 펩티드를 포함하여, serine protease 활성을 부여하는 도메인인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 혈전인지 도메인은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 유사성(homology)을 가지는 도메인일 수 있으며, 상기 혈전인지 도메인은, beta-strand와 alpha-helix의 복수 조합으로 구성되는 위상(topology) 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 혈전인지 도메인은, '혈관내 혈전'을 인지하고 용해 효소의 활성을 조절하는 기능의 PDZ 도메인 또는 PDZ-like 도메인일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 혈전용해 도메인을 코딩하는, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전용해 도메인 유전자에 관한 것이다.

상기 혈전용해 도메인 유전자는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열에 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 유사성(homology)을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또 다른 관점에서 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 혈전인지 도메인을 코딩하는, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전인지 도메인 유전자에 관한 것이다.

상기 혈전인지 도메인 유전자는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열에 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 유사성(homology)을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈전증 및 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 제제시 통상적으로 이용되는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-1000 ㎍이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 혈전증 및 관련 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 포유동물에 투여시 '혈관내 혈전'을 용해시키고 출혈부작용을 최소화하는 효과가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 혈전증 및 관련 질환은 혈전증(Thrombosis), 색전증(Embolism), 혈전색전증(Thromboembolism), 동맥혈전색전증(Arterial Thromboembolism), 정맥혈전색전증(Venous Thromboembolism, VTE), 심혈관질환(cardiovascular disease), 뇌혈관질환(cerebrovascular disease), 허혈성질환(Ischemic disease) 등 '혈관내 혈전'으로 인한 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 예로는 심부정맥혈전증(Deep Vein Thrombosis, DVT), 폐색전증(Pulmonary Embolism, PE), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 중풍, 뇌출혈, 뇌경색, 심근경색, 심장마비, 협심증(unstable angina)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

[실시예]

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: ex vivo 혈전용해능 평가

'혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드인 HtrA1과 HtrA2는 재조합 단백질로 준비하였다. 이를 위해 혈관내 혈전 도메인과 혈전용해 도메인을 모두 포함하는 HtrA1 아미노산 서열(서열번호 9)의 157-480에 해당되는 cDNA를 forward primer (5'-AATTCATATGCAAGGGCAGGAAGATCCCA-3'; 서열번호 11)와 reverse primer (5'-TATCTCGAGCTATGGGTCAATTTCTTCGGG-3'; 서열번호 12)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR 조건은 initial denaturation 95℃에서 5분 후, 증폭(95℃에서 30초, 63℃에서 1분, 72℃에서 2분) 과정을 34회 반복 후 72℃에서 10분으로 수행하였다. 이를 발현 벡터인 pET28a+ expression vector (Novagen, USA)의 NdeI/XhoI 부위에 서브클로닝하였다. 얻어진 HtrA1 recombinant plasmid를 E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene, USA)에 electroporation시킨 후 배양하면서 IPTG를 첨가하여 HtrA1을 발현시켰다. 재조합 E. coli 배양액을 초음파 처리하여 cell lysate을 만들고, 이를 econo-pac chromatography column(Bio-Rad)에 통과시켜 분리한 후 PD-10 column(Amersham, US)으로 정제함으로써 재조합 단백질 HtrA1를 얻었다. HtrA2의 경우, HtrA2 아미노산 서열(서열번호 10)의 134-458에 해당되는 cDNA를, forward primer (5'-GTCCTCGCCCATATGGCCGTCCCTAGCC-3'; 서열번호 13)와 reverse primer (5'-GGCTCTCGAGTCATTCTGTGACCTCAGGG-3'; 서열번호 14)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR 조건은 initial denaturation 95℃에서 5분 후, 증폭(95℃에서 30초, 65℃에서 45초, 72℃에서 1분) 과정을 34회 반복 후 72℃에서 10분으로 수행하였다. 이를 얻어낸 후, HtrA1과 같은 방법으로 pET28a+ expression vector (Novagen, USA)에 서브클로닝한 후 발현시킴으로써 재조합 단백질 HtrA2를 얻었다.

준비된 재조합 단백질 HtrA1 및 HtrA2을 ex vivo 혈전에 처리하면서 혈전 용해 활성을 확인하였다. 혈소판이 풍부한 혈액을 이용하여 혈전을 형성하고 37℃에서 24 시간 동안 대조군 또는 각 혈전용해효소(2 mg/ml)를 50 mM Tris-HCl과 함께 처리하였다. 각 효소 처리 후 혈전의 무게를 측정하여 처리 전의 %로 나타내었다. 또한 혈전을 구성하는 fibrin polymer의 분해로 생성되는 FDP(fibrin degradation products) 및 D-dimer의 양을 정량하였다.

도 1에서, 기존 혈전용해효소들과 비교시, HtrA1의 혈전용해능(도 1의 a, b)과 피브린 분해능(도 1의 c, d)이 가장 우수하였다. 도 2에서, HtrA2의 경우 역시, 기존 혈전용해효소들보다 우수한 혈전용해능(도 2의 a, b)과 피브린 분해능(도 2의 c, d)을 보였다.

실험예 2: 플라스민 생성능 (혈전용해기전) 평가

현재 혈전용해제 의약품들의 혈전용해 기전은 plasmininogen을 plasmin으로 활성화시켜 플라스민 의존적 혈전용해(plasmin-dependent fibrinolysis)가 일어나는 작용기전이다. 기존 혈전용해효소들과 비교하여 작용기전을 확인하기 위해서, 먼저 플라스미노겐(1.23 μM)과 플라스민 특이적 형광기질 Boc-Glu-Lys-Lys-MCA(100 μM)에 각 혈전용해효소 (0.1 mg/ml)를 첨가한 후 배양하였다. 플라스민에 대한 플라스미노겐의 활성화는 플라스민에 의해 용해된 기질의 형광 강도를 측정함으로써 확인하였다. 실제 플라스미노겐의 활성화로 생성되는 플라스민 밴드는, 각 효소 (0.15 mg/ml)를 플라스미노겐(5.14 μM)으로 처리한 후 SDS-PAGE로 확인하였다.

기존 혈전용해효소와 비교시, HtrA1은 플라스미노겐의 활성화 효능이 전혀 없었고(도 3의 a), 당연히 플라스민 생성도 없었다(도 3의 b). 마찬가지로, HtrA2 역시 플라스미노겐의 활성화 효능이 전혀 없었고(도 4의 a), 그 결과 플라스민 생성도 없었다(도 4의 b).

실험예 3: 혈전특이성 평가

HtrA1의 혈전특이성을 평가하기 위하여 상처 치유 과정에서 나타나는 fibrinolysis components들에 대한 활성 여부를 확인하였다. 이를 위해 fibrinogen을 thrombin과 반응시켜 얻어진 fibrin clot을 50 mM Tris-HCl 대조군 또는 혈전용해효소(2 mg/ml)와 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. fibrin clot의 용해는 분광 광도계를 사용하여 415 nm 파장에서 측정했다. 피브리노겐에 대한 HtrA1의 활성을 보기 위해서, 피브리노겐 (5μM)을 50 mM Tris-HCl 대조군 또는 각 혈전용해효소(0.15 mg/ml)와 37℃에서 3 시간 동안 배양한 후 피브리노겐의 분해 여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 피브리넥틴에 대한 HtrA1의 활성을 보기 위해서, fibronectin (1.52 μM)을 각 혈전용해효소(0.15 mg/ml)와 함께 37℃에서 3 시간 동안 배양한 후 4-12 % SDS 겔에서 분리하여 anti-cFN 또는 anti-pFN 항체로 면역염색하였다.

표 1에서 보는 바와 같이, HtrA1 및 HtrA2의 경우 무처리 대조군과 비교시 통계적으로 유의한 수준의 흡광도 차이를 보였을 뿐 아니라 기존 혈전용해효소인 streptokinase에 대해서도 통계적으로 유의한 수준의 흡광도 차이를 보였다. fibrin clot에 대한 용해능은 HtrA1이 가장 우수하였으며 다음으로 HtrA2가 우수하였다.

Groups	A415
Control	1.870 ± 0.05
Streptokinase	1.335 ± 0.07a
Urokinase	1.047 ± 0.06a
HtrA1	1.055 ± 0.10a,b
HtrA2	1.002 ± 0.09a,b

a p<0.05 significance difference from control group

b p<0.01 significance difference from Streptokinase group

그럼에도 기존 혈전용해효소들과 달리 HtrA1은 상처 부위 지혈작용에 중요한 fibrinogen을 분해하지 않았고(도 5의 a), 상처 치유에 중요한 cellular fibronectin(도 5의 b)과 plasma fibronectin (도 5의 c)역시 분해하지 않고 보존함을 보여주었다.

마지막으로 상처 치유 과정에 대한 HtrA1의 활성을 보기 위해서, BALB/c 마우스의 꼬리 피부를 외부에서 절개한 상처(~30 mm²)를 만들었다. 절제된 상처 조각을 대조군 50 mM Tris-HCl 또는 각 혈전용해효소(2 mg/ml)와 함께 37℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 상처 치유 여부는 상처 조각이 담긴 액의 관찰 및 550 nm 흡광도를 측정함으로써 판단하였다. 이처럼 실제 동물을 이용한 창상 조직 실험에서, 기존 혈전용해효소 처리시에는 창상 조직의 상처 치유가 되지 않아 출혈로 인한 흡광도 수치를 확인할 수 있지만, HtrA1 또는 HtrA2 처리시에는 대조군과 비슷한 수준으로 흡광도가 낮아, 정상적인 상처 치유가 일어남을 확인할 수 있었다(표 2).

Groups	A550
Control	0.235 ± 0.031
Streptokinase	0.471 ± 0.018a
Urokinase	0.404 ± 0.037a
HtrA1	0.203 ± 0.028a,b
HtrA2	0.247 ± 0.033a,b

a p<0.05 significance difference from control group

b p<0.01 significance difference from Streptokinase group

실시예 1: 혈전증의 치료 효과

본 발명의 성과물에 의한 혈전증 치료 효능을 평가하기 위해 꼬리 혈전증 모델을 이용한 동물실험을 수행하였다. κ-carrageenan 유도 꼬리 혈전증 모델은 15 주령의 암컷 BALB/c 마우스에서 확립되었다. 꼬리 혈전증을 가진 마우스의 각 그룹(n = 8)에 식염수(대조군) 또는 각 혈전용해효소를 복강 내로 주사하고 24 시간 후 혈전증 부위 길이 및 비율을 측정하고, 그 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.

Groups	Dose (mg/kg)	Tail Length (cm)	Thrombosis Length (cm)	Thrombosis Ratio (%)
Control	-	9.21±0.08	9.07±0.11a	98.50±0.80a
Plasmin	40	9.02±0.07	3.37±0.45b	37.39±5.10b
Streptokinase	40	9.10±0.10	5.11±1.22a	56.16±13.4a
Urokinase	40	9.07±0.10	4.27±0.60a	47.08±6.51a
HtrA1 (10mg/kg)	10	9.18±0.16	4.72±1.06	51.33±10.9
HtrA1 (20mg/kg)	20	9.12±0.10	3.41±0.57	37.41±6.43
HtrA1 (40mg/kg)	40	9.17±0.12	1.61±0.49	17.56±5.47

a p<0.001 significance difference from HtrA1 (40mg/kg) group

b p<0.01 significance difference from HtrA1 (40mg/kg) group

표 3에서 보는 바와 같이, 마우스 꼬리 혈전증 모델에서 기존 혈전용해효소들과 비교시 HtrA1 처리군의 경우 꼬리에서 혈전증 꼬리 길이 및 빈도가 현저히 줄어듦을 볼 수 있고, 이러한 혈전 용해 효과가 용량에 비례하여 증가함을 확인하였다. 즉 HtrA1의 경우 기존 혈전용해효소들과 비교시에도 통계적으로 유의한 수준의 혈전증 치료 효과를 가짐을 확인하였다.

Groups	Dose (mg/kg)	Tail Length (cm)	Thrombosis Length (cm)	Thrombosis Ratio (%)
Control	-	9.19±0.09	9.03±0.14a	98.25±1.16a
Plasmin	40	9.03±0.06	3.40±0.41b	37.65±4.62b
Streptokinase	40	9.09±0.09	4.97±1.16a	54.66±12.7a
tPA	40	9.06±0.08	3.49±0.53b	38.53±6.06b
HtrA2 (10mg/kg)	10	9.15±0.12	4.55±1.11	49.62±11.5
HtrA2 (20mg/kg)	20	9.11±0.11	4.01±0.83	44.01±9.18
HtrA2 (40mg/kg)	40	9.14±0.08	2.19±0.75	23.93±8.20

a p<0.001 significance difference from HtrA2 (40mg/kg) group

b p<0.01 significance difference from HtrA2 (40mg/kg) group

또한 표 4에서 보는 바와 같이, 마우스 꼬리 혈전증 모델에서 기존 혈전용해효소들과 비교시 HtrA2 처리군의 경우 역시 꼬리에서 혈전증 꼬리 길이 및 빈도가 현저히 줄어듦을 볼 수 있고, 이러한 혈전 용해 효과가 용량에 비례하여 증가함을 확인하였다. HtrA2의 경우 역시 무처리군 뿐 아니라 기존 혈전용해효소들과 비교시에도 통계적으로 유의한 수준의 혈전증 치료 효과를 가짐을 확인하였다.

도 7에서는, 혈전증 꼬리 조직을 H & E 염색하여 관찰한 결과, 위 혈전증 꼬리 결과와 마찬가지로 직접 혈전 덩어리 및 혈전 용해정도를 확인한 결과, HtrA1과 HtrA2 치료군의 경우 혈전 덩어리를 전혀 찾아볼 수 없었으며, 기존 혈전용해효소들과 비교시에도 우수한 혈전증 치료를 보였다.

실시예 2: 폐 혈전색전증의 치료 효과

다음으로 혈전색전증의 예방 및 치료 효능을 평가하기 위해 폐 혈전색전증 모델을 이용한 동물실험을 수행하였다. Adenosine 5'-diphosphate (ADP)에 의해 유도된 폐 혈전색전증 모델은 15 주령의 암컷 C57BL/6 마우스에서 확립되었다. 폐 혈전색전증 마우스의 각 그룹(n = 8)을 12시간 이상 단식시킨 후 식염수(대조군) 또는 혈전용해효소를 40 mg/kg 용량으로 정맥 내 주사하였다. 30분 후, 마우스에게 ADP(150 mg/kg)를 주사하여 폐 혈전색전증을 유도한 후 사망 여부를 확인하고, 그 결과를 표 5 및 표 6에 나타내었다.

Groups	Dose (mg/kg)	Lethal number/total	Protection rate (%)
Control	-	6/6	0
Plasmin	40	3/6	50
Streptokinase	40	4/6	33
Urokinase	40	2/6	67
HtrA1	40	0/6	100

표 5로부터, 폐 혈전색전증 마우스 모델에서 플라스민, 스트렙토키나아제 및 우로키나아제 처리군의 경우 생존율이 각각 50%, 33%, 66%였으나 HtrA1 처리군의 생존율은 100%를 보였으며, 이로부터 본 발명의 HtrA1이 치명적인 폐 혈전색전증에 대한 완벽한 치료 및 예방 효과를 가짐을 알 수 있었다.

Groups	Dose(mg/kg)	Lethal number/total	Protection rate (%)
Control	-	5/5	0
Plasmin	40	2/5	60
Streptokinase	40	4/5	20
tPA	40	3/5	40
HtrA2	40	0/5	100

표 6으로부터, 폐 혈전색전증 마우스 모델에서 플라스민, 스트렙토키나아제 및 tPA 처리군의 경우 생존율이 각각 60%, 20%, 40%였으나 HtrA2 처리군의 생존율은 100%를 보였으며, 이로부터 본 발명의 HtrA2 역시 폐 혈전색전증에 대한 완벽한 치료 및 예방 효과를 가짐을 알 수 있었다.

실시예 3: 체내 출혈 위험 제거 효과

혈전용해단백질 HtrA1의 투여시 창상 치유 과정에서 체내 출혈 위험 여부를 확인하기 위하여 15주 된 C57BL/6 암컷 마우스를 이용하여 꼬리 출혈 검사를 실시했다. 식염수(대조군) 또는 각 혈전용해효소를 40 mg/kg 용량으로 마우스 그룹 (n = 5)에 정맥주사하였다. 30 분간 후, 마취된 마우스로부터 꼬리를 절단하고 출혈이 멈출 때까지 혈액을 모으면서 출혈 시간 및 출혈량을 기록하였고, 모아진 혈액은 헤모글로빈 함량을 측정하였다. 또한 쥐의 짤린 꼬리 정맥에서 혈액이 응고되는데 필요한 시간을 기록하였다.

도 8에서 보는 바와 같이, 마우스 꼬리 출혈 실험에서 다른 혈전용해효소와 비교시 HtrA1와 HtrA2의 출혈이 현저히 적음을 확인하였다. HtrA1 처리군의 경우, 실제로 출혈 시간(도 9의 a), 출혈량(도 9의 b), 손실된 헤모글로빈 양(도 9의 c), 지혈까지 걸린 시간(도 9의 d)을 측정한 결과, 기존의 혈전용해효소들과는 비교할 수 없이 출혈 부작용이 감소하여 대조군과 유사한 수준임을 확인하였다.

HtrA2 처리군의 경우 역시 출혈 시간(도 10의 a), 출혈량(도 10의 b), 손실된 헤모글로빈 양(도 10의 c), 지혈까지 걸린 시간(도 10의 d)을 측정한 결과, 기존의 혈전용해효소들과는 비교할 수 없이 출혈 부작용이 감소하여 대조군과 유사한 수준임을 확인하였다. HtrA1과 HtrA2는 상처의 치유과정의 일부인 지혈 과정을 방해하지 않아 출혈 위험이 완벽히 감소시키므로 출혈 부작용을 획기적으로 감소시킨 혈전증 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> JINIS CO., LTD. <120> Thrombolytic agents for Intravascular clots <130> P19135 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of thrombolytic domain of HtrA1 (HtrA1 as1) <400> 1 Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala 1 5 10 15 His Val Val Thr Asn Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly 20 25 30 Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile 35 40 45 Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu 50 55 60 Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly 65 70 75 80 Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr 85 90 95 Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp 100 105 110 Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro 115 120 125 Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val 130 135 140 Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe 145 150 155 160 Leu <210> 2 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of thrombolytic domain of HtrA2 (HtrA2 as1) <400> 2 Ile Leu Asp Arg His Pro Phe Leu Gly Arg Glu Val Pro Ile Ser Asn 1 5 10 15 Gly Ser Gly Phe Val Val Ala Ala Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala 20 25 30 His Val Val Ala Asp Arg Arg Arg Val Arg Val Arg Leu Leu Ser Gly 35 40 45 Asp Thr Tyr Glu Ala Val Val Thr Ala Val Asp Pro Val Ala Asp Ile 50 55 60 Ala Thr Leu Arg Ile Gln Thr Lys Glu Pro Leu Pro Thr Leu Pro Leu 65 70 75 80 Gly Arg Ser Ala Asp Val Arg Gln Gly Glu Phe Val Val Ala Met Gly 85 90 95 Ser Pro Phe Ala Leu Gln Asn Thr Ile Thr Ser Gly Ile Val Ser Ser 100 105 110 Ala Gln Arg Pro Ala Arg Asp Leu Gly Leu Pro Gln Thr Asn Val Glu 115 120 125 Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ala Ile Asp Phe Gly Asn Ser Gly Gly Pro 130 135 140 Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Val Asn Thr Met Lys Val 145 150 155 160 Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Arg Leu Arg Glu Phe 165 170 175 Leu <210> 3 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of thrombus cognitive domain of HtrA1 (HtrA1 as2) <400> 3 Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys 1 5 10 15 Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys 20 25 30 Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala 35 40 45 Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu 50 55 60 Lys Glu Asn Asp Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser 65 70 75 80 Ala Asn Asp Val Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met 85 90 95 Val Val Arg Arg Gly Asn Glu 100 <210> 4 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of thrombus cognitive domain of HtrA2 (HtrA2 as2) <400> 4 Val Met Met Leu Thr Leu Ser Pro Ser Ile Leu Ala Glu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Arg Glu Pro Ser Phe Pro Asp Val Gln His Gly Val Leu Ile His Lys 20 25 30 Val Ile Leu Gly Ser Pro Ala His Arg Ala Gly Leu Arg Pro Gly Asp 35 40 45 Val Ile Leu Ala Ile Gly Glu Gln Met Val Gln Asn Ala Glu Asp Val 50 55 60 Tyr Glu Ala Val Arg Thr Gln Ser Gln Leu Ala Val Gln Ile Arg Arg 65 70 75 80 Gly Arg <210> 5 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of thrombolytic domain of HtrA1 (HtrA1 bs1) <400> 5 gggtctgggt ttattgtgtc ggaagatgga ctgatcgtga caaatgccca cgtggtgacc 60 aacaagcacc gggtcaaagt tgagctgaag aacggtgcca cttacgaagc caaaatcaag 120 gatgtggatg agaaagcaga catcgcactc atcaaaattg accaccaggg caagctgcct 180 gtcctgctgc ttggccgctc ctcagagctg cggccgggag agttcgtggt cgccatcgga 240 agcccgtttt cccttcaaaa cacagtcacc accgggatcg tgagcaccac ccagcgaggc 300 ggcaaagagc tggggctccg caactcagac atggactaca tccagaccga cgccatcatc 360 aactatggaa actcgggagg cccgttagta aacctggacg gtgaagtgat tggaattaac 420 actttgaaag tgacagctgg aatctccttt gcaatcccat ctgataagat taaaaagttc 480 ctc 483 <210> 6 <211> 531 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of thrombolytic domain of HtrA2 (HtrA2 bs1) <400> 6 atcctggacc ggcacccttt cttgggccgc gaggtcccta tctcgaacgg 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tcagcgacgt cattaaaagg gaaagcaccc tgaacatggt ggtccgcagg 300 ggtaatgaa 309 <210> 8 <211> 246 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of thrombus cognitive domain of HtrA2 (HtrA2 bs2) <400> 8 gtgatgatgc tgaccctgag tcccagcatc cttgctgaac tacagcttcg agaaccaagc 60 tttcccgatg ttcagcatgg tgtactcatc cataaagtca tcctgggctc ccctgcacac 120 cgggctggtc tgcggcctgg tgatgtgatt ttggccattg gggagcagat ggtacaaaat 180 gctgaagatg tttatgaagc tgttcgaacc caatcccagt tggcagtgca gatccggcgg 240 ggacga 246 <210> 9 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HtrA1 (HtrA1) <400> 9 Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro 20 25 30 Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro 35 40 45 Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys 50 55 60 Cys Glu Val Cys Gly Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu 65 70 75 80 Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro 85 90 95 Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys 100 105 110 Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn 115 120 125 Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg 130 135 140 Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu 145 150 155 160 Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val 165 170 175 Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu 180 185 190 Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile 195 200 205 Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn 210 215 220 Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala 225 230 235 240 Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile 245 250 255 Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu 260 265 270 Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu 275 280 285 Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly 290 295 300 Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp 305 310 315 320 Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp 325 330 335 Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser 340 345 350 Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His 355 360 365 Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly 370 375 380 Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp 385 390 395 400 Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu 405 410 415 Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp 420 425 430 Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val 435 440 445 Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg 450 455 460 Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro 465 470 475 480 <210> 10 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of HtrA2 (HtrA2) <400> 10 Met Ala Ala Pro Arg Ala Gly Arg Gly Ala Gly Trp Ser Leu Arg Ala 1 5 10 15 Trp Arg Ala Leu Gly Gly Ile Arg Trp Gly Arg Arg Pro Arg Leu Thr 20 25 30 Pro Asp Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ser Gly Thr Ser Asp Pro Arg Ala 35 40 45 Arg Val Thr Tyr Gly Thr Pro Ser Leu Trp Ala Arg Leu Ser Val Gly 50 55 60 Val Thr Glu Pro Arg Ala Cys Leu Thr Ser Gly Thr Pro Gly Pro Arg 65 70 75 80 Ala Gln Leu Thr Ala Val Thr Pro Asp Thr Arg Thr Arg Glu Ala Ser 85 90 95 Glu Asn Ser Gly Thr Arg Ser Arg Ala Trp Leu Ala Val Ala Leu Gly 100 105 110 Ala Gly Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Trp Gly Gly Gly Arg Gly Pro 115 120 125 Pro Ala Val Leu Ala Ala Val Pro Ser Pro Pro Pro Ala Ser Pro Arg 130 135 140 Ser Gln Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Thr Ala Pro Ala 145 150 155 160 Val Val Tyr Ile Glu Ile Leu Asp Arg His Pro Phe Leu Gly Arg Glu 165 170 175 Val Pro Ile Ser Asn Gly Ser Gly Phe Val Val Ala Ala Asp Gly Leu 180 185 190 Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Ala Asp Arg Arg Arg Val Arg Val 195 200 205 Arg Leu Leu Ser Gly Asp Thr Tyr Glu Ala Val Val Thr Ala Val Asp 210 215 220 Pro Val Ala Asp Ile Ala Thr Leu Arg Ile Gln Thr Lys Glu Pro Leu 225 230 235 240 Pro Thr Leu Pro Leu Gly Arg Ser Ala Asp Val Arg Gln Gly Glu Phe 245 250 255 Val Val Ala Met Gly Ser Pro Phe Ala Leu Gln Asn Thr Ile Thr Ser 260 265 270 Gly Ile Val Ser Ser Ala Gln Arg Pro Ala Arg Asp Leu Gly Leu Pro 275 280 285 Gln Thr Asn Val Glu Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ala Ile Asp Phe Gly 290 295 300 Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Val 305 310 315 320 Asn Thr Met Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp 325 330 335 Arg Leu Arg Glu Phe Leu His Arg Gly Glu Lys Lys Asn Ser Ser Ser 340 345 350 Gly Ile Ser Gly Ser Gln Arg Arg Tyr Ile Gly Val Met Met Leu Thr 355 360 365 Leu Ser Pro Ser Ile Leu Ala Glu Leu Gln Leu Arg Glu Pro Ser Phe 370 375 380 Pro Asp Val Gln His Gly Val Leu Ile His Lys Val Ile Leu Gly Ser 385 390 395 400 Pro Ala His Arg Ala Gly Leu Arg Pro Gly Asp Val Ile Leu Ala Ile 405 410 415 Gly Glu Gln Met Val Gln Asn Ala Glu Asp Val Tyr Glu Ala Val Arg 420 425 430 Thr Gln Ser Gln Leu Ala Val Gln Ile Arg Arg Gly Arg Glu Thr Leu 435 440 445 Thr Leu Tyr Val Thr Pro Glu Val Thr Glu 450 455 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HtrA1 forward primer <400> 11 aattcatatg caagggcagg aagatccca 29 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HtrA1 reverse primer <400> 12 tatctcgagc tatgggtcaa tttcttcggg 30 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HtrA2 forward primer <400> 13 gtcctcgccc atatggccgt ccctagcc 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HtrA2 reverse primer <400> 14 ggctctcgag tcattctgtg acctcaggg 29

Claims

(a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 혈전용해 도메인 및 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 혈전인지 도메인으로 구성되거나, (b) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 혈전용해 도메인 및 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 혈전인지 도메인으로 구성되는 것을 특징으로 하는, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드.
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제1항에 있어서, 상기 혈전용해 도메인은 GNSGGPL 펩티드를 포함하여, serine protease 활성을 부여하는 도메인인 것을 특징으로 하는, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드.
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제1항에 있어서, 상기 혈전인지 도메인은, beta-strand와 alpha-helix의 복수 조합으로 구성되는 위상(topology) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 혈전인지 도메인은, 혈관내 혈전을 인지하고 용해 효소의 활성을 조절하는 기능의 PDZ 도메인 또는 PDZ-like 도메인인 것을 특징으로 하는, '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드.
제1항의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 혈전용해 도메인을 코딩하는, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전용해 도메인 유전자.
삭제
제1항의 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 혈전인지 도메인을 코딩하는, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈전인지 도메인 유전자.
삭제
제1항의 '혈관내 혈전'을 인지하여 혈전을 용해하는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료 또는 예방용 약학적 조성물.