CN101417126B

CN101417126B - Omi蛋白及其编码基因的一种新用途

Info

Publication number: CN101417126B
Application number: CN2008102393175A
Authority: CN
Inventors: 王光辉; 李斌
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2028-12-10
Also published as: CN101417126A

Abstract

本发明公开了一种OMI蛋白及其编码基因的一种新用途。本发明提供的新用途是OMI蛋白及其编码基因在制备促进A53T α-synuclein突变体蛋白降解的药物中的应用，在制备治疗帕金森病的药物中的应用，在促进溶酶体降解中的应用和在制备促进溶酶体降解的药物中的应用。OMI蛋白是序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质，OMI蛋白的编码基因是序列表的序列3所示的DNA分子。本发明将OMI蛋白及其编码基因与溶酶体的降解活性联系起来，揭示了该蛋白对细胞酸性细胞器-溶酶体的调节功能，和对A53T α-synuclein-EGFP蛋白降解的促进作用，为帕金森病的临床治疗提供了新的思路，具有重大意义。

Description

OMI蛋白及其编码基因的一种新用途

技术领域

本发明涉及OMI蛋白及其编码基因的一种新用途。

背景技术

帕金森病是一种常见的老年神经退行性疾病，其发病率在65岁以上人群中达到1％。帕金森病的主要病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元的丧失，致病机制目前依然不明。由α-synuclein(神经退行性致病蛋白类的突触囊泡核蛋白)作为主要成份在神经元胞浆内形成的路易小体(Lewy body)是帕金森病的病理学特征。现有的治疗帕金森的药物和方法主要包括：乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括L-DOPA肾细胞转移阻断剂的组合物、2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰)-1、3-环己二酮、(2-咪唑啉-2-基氨基)喹噁啉；神经胶质细胞系来源的神经营养因子法；多巴胺能神经元和具有增殖能力的前体细胞法；神经干细胞法和中药法等。

α-synuclein基因是较早发现的与帕金森病相关的致病基因，它编码一个由143个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白广泛分布于中枢神经系统突触前末梢。研究发现，α-synuclein的第53位氨基酸突变A53T与家族性帕金森病相关，A53Tα-synuclein突变蛋白与野生型蛋白相比，在体外易形成寡聚体的缠结，在细胞内其聚集会引起高尔基体等细胞器结构的破坏，从而导致细胞毒性。α-synuclein蛋白主要通过两种方式降解，分别是泛素-蛋白酶体途径和酸性细胞器-溶酶体途径。而α-synuclein突变体很少经过泛素-蛋白酶体途径，主要是通过溶酶体途径降解。因此，探索如何促进α-synuclein突变体在溶酶体途径的降解将对帕金森病的治疗探索提供有利的基础理论和治疗指导。

现有的提高细胞溶酶体降解活性的主要商业化药物有雷帕霉素，海藻糖，这些药物由于广泛地非特异性地提高溶酶体活性，导致正常蛋白和结构的降解，存在细胞毒性高，副作用强的缺点。因此探索一种特异性强且副作用低的提高细胞溶酶体降解突变α-synuclein能力的方法对帕金森病的治疗有重要指导意义。

OMI是一种线粒体蛋白酶，主要存在于线粒体的膜间质中，也在内质网和高尔基体中有分布。OMI在神经退行性疾病和细胞凋亡中行使重要的作用，在帕金森病的病理标志-路易小体中就能检测到OMI蛋白的存在。

发明内容

本发明的目的是提供OMI蛋白及其编码基因的一种新用途。

本发明提供了OMI蛋白的编码基因在制备促进A53T α-synuclein突变体蛋白降解的药物中的应用；所述OMI蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；

所述A53T α-synuclein突变体蛋白是如下(c)或(d)的蛋白质：

(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

本发明还提供了OMI蛋白的编码基因在制备治疗帕金森病的药物中的应用；所述OMI蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

本发明还提供了OMI蛋白的编码基因在促进溶酶体降解中的应用；所述OMI蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

本发明还提供了OMI蛋白的编码基因在制备促进溶酶体降解的药物中的应用；所述OMI蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

本发明还提供了OMI蛋白在制备促进A53T α-synuclein突变体蛋白降解的药物中的应用；所述OMI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质；

所述A53T α-synuclein突变体蛋白是如下(c)或(d)的蛋白质：

(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明还提供了OMI蛋白在制备治疗帕金森病的药物中的应用；所述OMI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。

本发明还提供了OMI蛋白在促进溶酶体降解中的应用；所述OMI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明还提供了OMI蛋白在制备促进溶酶体降解的药物中的应用；所述OMI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明将OMI蛋白及其编码基因与溶酶体的降解活性联系起来，揭示了该蛋白对细胞酸性细胞器-溶酶体的调节功能和对A53T α-synuclein-EGFP蛋白降解的促进作用。将OMI蛋白的编码基因导入细胞，可以调节细胞内溶酶体的活性，促进A53Tα-synuclein-EGFP蛋白降解。本发明为帕金森病的临床治疗提供了新的思路，具有重大意义。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为哺乳动物真核表达载体pEGFP-N1的结构示意图。

图2为质粒I的酶切鉴定图。

图3为哺乳动物真核表达载体pCDNA3.1-MYC的结构示意图。

图4为质粒II的酶切鉴定图。

图5为质粒III的酶切鉴定图。

图6为稳定表达A53T α-synuclein突变蛋白的细胞系的荧光照片；(a)HeLa细胞系；(b)N2a细胞系。

图7为稳定表达A53T α-synuclein突变蛋白的细胞系的western杂交结果。

图8为在瞬时转染的细胞中，OMI蛋白对A53T α-synuclein突变体蛋白降解的促进作用。

图9为在稳定表达A53T α-synuclein突变体蛋白的细胞中，OMI蛋白对A53Tα-synuclein突变体蛋白降解的促进作用。

图10为降低OMI的表达量对A53T α-synuclein突变体蛋白降解的影响。

图11为氯喹对OMI促进A53T α-synuclein-EGFP降解的抑制作用。

图12为导入OMI蛋白后细胞内溶酶体数量的变化。

图13为导入OMI蛋白后细胞内溶酶体底物水平的变化。

图14为降低OMI的表达量后细胞内溶酶体数量的变化。

图15为沉默HtrA2/OMI的HeLa细胞中，对细胞进行营养缺乏实验后，酸性染料MDC的染色结果。

图16为降低OMI的表达量后细胞内溶酶体底物水平的变化。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的细胞裂解液为RIPA lysis buffer(25mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％NP-40(体积比)、1％Sodium deoxycholate(质量百分比)；pH 7.6)。

实施例1、试验相关质粒和细胞系的获得

一、质粒I(A53T α-synuclein-EGFP突变体质粒)的构建

1、α-synuclein蛋白编码基因的获得

以成人胎脑cDNA文库(clontech公司，Catalog No.638831)为模板，PCR获得全长的α-synuclein蛋白编码基因(野生型)。PCR的引物如下：

上游引物：5-GAAGATCTCCATGGATGTATTCATG-3；

下游引物：5-GCGTCGACAAGGCTTCAGGTTCGTAG-3。

2、A53T α-synuclein突变体蛋白编码基因的获得

使用Takara公司MutanBEST突变试剂盒，以步骤1获得的α-synuclein蛋白编码基因(野生型)为模板进行PCR，获得A53T α-synuclein突变体蛋白编码基因。PCR引物如下：

上游引物：5-GTGGTGCATGGTGTGACAACAGTGGCTGAGAAG-3；

下游引物：5-CTTCTCAGCCACTGTTGTCACACCATGCACCAC-3。

3、质粒I的构建

pEGFP-N1质粒(clonetech公司，Catalog No.6085-1)中的标记为绿色荧光蛋白(EGFP)，结构示意图见图1。该载体能在插入的外源基因表达蛋白的C末端融合表达一个绿色荧光蛋白，从而能够通过荧光显微镜方便其观察及细胞系构建。同时，该载体表达G418抗性蛋白，适合用于细胞系筛选。

限制性内切酶BglII和SalI双酶切步骤2获得的α-synuclein突变体蛋白编码基因，并将酶切产物连接到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的pEGFP-N1载体上，得到质粒I。

4、A53T α-synuclein-EGFP突变体质粒的鉴定

1)酶切鉴定

用限制性内切酶Eco47 III和KpnI对质粒I进行酶切，结果见图2。

2)测序鉴定

将质粒I进行测序，结果表明，插入的外源DNA具有序列表的序列1自5’末端第1至420位核苷酸。A53T α-synuclein突变体蛋白编码基因如序列1所示，A53Tα-synuclein突变体蛋白如序列2所示。

A53T α-synuclein突变体蛋白编码基因与α-synuclein蛋白编码基因(Genbank Accession Number：NM_000345)只存在1个核苷酸(单位点突变)的差别(序列1自5’末端第157位核苷酸)，A53T α-synuclein突变体蛋白与α-synuclein蛋白(Genbank Accession Number：NP_000336)只有自氨基末端第53位氨基酸残基不同。

二、HtrA2/OMI真核表达质粒的构建

1、HtrA2/OMI基因序列的克隆

以成人胎脑cDNA文库(clontech公司，Catalog No.638831)为模板，PCR获得全长的HtrA2/OMI基因cDNA序列。PCR的引物如下：

上游引物：5-AATGGTACCCCACCATGGCTGCGCCGAGGGCGG-3；

下游引物：5-CGCTCGAGTTCTGTGACCTCAGGGGTC-3。

2、HtrA2/OMI真核表达质粒的构建

pCDNA3.1-MYC真核表达载体(购自invitrogen公司，Catalog No.V80020)中的标记为MYC，结构示意图见图3。该载体能在插入的外源基因表达蛋白C末端融合表达一段MYC短肽标签，可用MYC抗体检测外源蛋白的表达。限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切步骤1获得的HtrA2/OMI基因序列，并将酶切产物连接到经限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切的pCDNA3.1-MYC真核表达载体上，得到质粒II。

pKH3-HA真核表达载体(购自www.addgene.com网站，质粒编号12555，网址：http://www.addgene.org/pgvecl？f＝c&cmd＝findpl&identifier＝12555&attag＝n)中的标记为HA。该载体能在插入的外源基因表达蛋白C末端融合表达一段HA短肽标签，可用HA抗体检测其表达。限制性内切酶HindIII和XbaI双酶切质粒II并将酶切产物连接到pKH3-HA相应的多克隆位点，得到质粒III。

3、HtrA2/OMI真核表达质粒的鉴定

1)酶切鉴定

用限制性内切酶KpnI和XhoI对质粒II进行酶切鉴定，结果见图4。

用限制性内切酶HindIII和XbaI对质粒III进行酶切鉴定，结果见图5。

2)测序鉴定

分别将质粒II和质粒III进行测序，结果表明，插入的外源DNA具有序列表的序列3自5’末端第1至1374位所示的核苷酸。序列3所示的核苷酸为Genbank AccessionNumber：NM_013247.4自起始密码子起第1-1377位核苷酸，编码序列表的序列4所示的蛋白质，序列4所示的蛋白质为Genbank Accession Number：NP_037379自氨基端第1-458位氨基酸残基。

三、稳定表达A53T α-synuclein突变体蛋白的细胞系的构建

1、将质粒I接种于含卡那霉素(60ug/ml)的LB培养基中过夜培养后，提取并纯化质粒，通过紫外分光光度计测定浓度。

2、HeLa细胞(ATCC，Catalog No.30-2003)和N2a细胞(ATCC，Catalog CCL-131)分别接种在24孔细胞培养板中，密度约3-5×10⁴/孔，过夜培养，待用。

3、细胞转染

Lipofectamine2000每孔1.5μl，溶解在100μl DMEM(无血清无抗生素)培养基中，充分混合后室温孵育5min；质粒I每孔2μg，溶解在100μl DMEM培养基中，充分混合后室温孵育5min；然后两种溶解混合均匀，室温孵育20-25min。HeLa细胞(或N2a细胞)用DMEM(含血清无抗生素)培养基洗涤2次后加入孵育过的混合物，在37℃，5％CO₂培养条件培养4-6h后，补充培养基成分，使培养基成为DMEM完全培养基(含血清抗生素)，每孔300μl，转染后培养24小时，到细胞增长接近95％密度时按1：4密度传代，继续培养24h。

4、去掉培养液，PBS洗一次，加入G418浓度为400μg/ml的筛选培养基(含有10％(体积比)新生牛血清的DMEM培养基)。

5、换液

根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待克隆逐渐增大后进入步骤6的实验。

6、挑单克隆

制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待克隆出现并逐渐增大后转入到48孔中增殖。

7、单克隆鉴定

细胞大量扩增后，收取部分细胞，用荧光显微镜拍照，照片见图6。用细胞裂解液处理细胞，然后用EGFP抗体(购自santa cruz公司，Catalog No：sc-73556)对细胞裂解液进行western杂交检测，结果见图7。结果表明，在HeLa和N2a两种细胞系中均可稳定表达A53T α-synuclein-EGFP蛋白。

本实施例制备的质粒I、质粒II、质粒III、稳定表达A53T α-synuclein-EGFP蛋白的HeLa细胞系、稳定表达A53T α-synuclein-EGFP蛋白的N2a细胞系用于以下实施例2和实施例3的试验。

实施例2、OMI蛋白促进A53T α-synuclein突变体蛋白降解

以下试验中，HeLa细胞、N2a细胞、稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的HeLa细胞、稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的N2a细胞的细胞密度均为3×104^-4×10⁴个/孔。

1、OMI蛋白在瞬时转染的细胞中促进A53T α-synuclein突变体蛋白降解

在HeLa细胞中，同时转入质粒I和质粒III(质粒I的转染量为1ug/孔；质粒III的转染量为1ug/孔)；同时，在HeLa细胞中，同时转入质粒I和质粒pKH3-HA，作为对照。48h后，用EGFP抗体和HA抗体(购买自santa cruz公司，Catalog No.sc-57592)对细胞裂解液进行western杂交，western杂交中的内参蛋白为GAPDH(该抗体购买自santa cruz公司，Catalog No.sc-47724)。

实验结果见图8。图8中，1：对照；2：转入质粒I和质粒III的HeLa细胞。结果显示，与对照组相比，转入质粒III的细胞中，A53T α-synuclein-EGFP蛋白的表达量明显降低，说明在瞬时转染的细胞中，转入外源HtrA2/OMI基因能提高细胞对神经退行性疾病致病蛋白(A53T α-synuclein)的降解能力。

2、OMI蛋白在稳定表达A53T α-synuclein突变体蛋白的细胞中促进A53Tα-synuclein突变体蛋白降解

在稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的HeLa细胞中，转入质粒III(转染量为1ug/孔)；同时，在稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的HeLa细胞中，转入质粒pKH3-HA(转染量为1ug/孔)，作为对照。48h后，用EGFP抗体和HA抗体对细胞裂解液进行western杂交，western杂交中的内参蛋白为ERK1/2(购买自santa cruz公司，Catalog No.sc-93)，结果见图9-A。图9-A中，1：对照；2：转入质粒III的HeLa细胞。

在稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的N2a细胞中，转入质粒II(转染量为1ug/孔)；同时，在稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的N2a细胞中，转入pCDNA3.1-MYC(转染量为1ug/孔)，作为对照。48h后，用EGFP抗体、MYC抗体(该抗体购买自santa cruz公司，Catalog No.sc-70468)和OMI抗体(购买自santa cruz公司，Catalog No.sc-25606)对细胞裂解液进行western杂交，western杂交中的内参蛋白为ERK1/2，结果见图9-B。图9-B中，1：对照；2：转入质粒II的N2a细胞。

结果显示，与对照组相比，转入外源HtrA2/OMI基因的细胞中，A53Tα-synuclein-EGFP蛋白量明显减少，说明在稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的细胞中，外源HtrA2/OMI基因能提高细胞对神经退行性疾病致病蛋白A53Tα-synuclein-EGFP突变体的降解能力。

3、降低OMI的表达量对A53T α-synuclein突变体蛋白降解的影响

设计针对OMI的SiRNA序列(Si-OMI)如下：

上游引物：5’-GGGGAGUUUGUUGUUGCCAdTdT-3’；

下游引物：5’-UGGCAACAACAAACUCCCCdTdT-3’。

对照SiRNA序列(Si-对照)如下：

上游引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’；

下游引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。

在稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的HeLa细胞中，转染Si-OMI(35pmoles/well)；在稳定表达A53T α-synuclein-EGFP突变体的HeLa细胞中，转染Si-对照(35pmoles/well)，作为对照。24h后，用EGFP抗体和OMI抗体(OMI抗体购买自santa cruz公司，Catalog No.sc-25606)通过western杂交检测A53Tα-synuclein-EGFP的量，western杂交中的内参蛋白为GAPDH。

结果见图10。图10中，1：Si-对照；2：Si-OMI。结果表明：相对于对照组，转染Si-OMI的细胞中，A53T α-synuclein-EGFP的水平有显著的提高。

4、OMI促进A53T α-synuclein-EGFP降解的机理分析

氯喹(CQ)是常用的溶酶体抑制剂，该药物能破坏溶酶体内的酸性环境，从而破坏一切由溶酶体所介导的蛋白质降解。在HeLa细胞中，瞬时转染质粒I和质粒III(质粒I的转染量为1ug/孔；质粒III的转染量为1ug/孔)，24小时后，加入药物氯喹(购买自SIGMA，catalog No.25745)，氯喹的作用浓度为20μM，作用12h后，western杂交检测A53T α-synuclein-EGFP蛋白的量。

用pKH3-HA空载体作为质粒III的对照，pCDNA3.1-MYC空载体作为质粒I的对照，用DMSO作为氯喹的溶剂对照。

结果如图11所示。图11中，按照从上往下的顺序，转染以下质粒或加入相应药物(+代表加入，-代表不加入)1：pKH3-HA质粒；2：质粒III；3：pEGFP质粒；4：质粒I；5：DMSO；6：氯喹。

在不加入药物的情况下，OMI可以显著的降解A53T α-synuclein-EGFP蛋白。然而，加入CQ后，A53T α-synuclein-EGFP的降解被抑制。同时，无论是否加入药物，OMI都对绿色荧光蛋白EGFP的降解没有影响。这充分说明，OMI所针对的A53Tα-synuclein-EGFP的降解是一个溶酶体特异性的过程，而没有泛素蛋白酶体参与。同时也证明OMI特异性地促进A53T α-synuclein突变体降解而不降解EGFP蛋白。这种特异性说明OMI很适合选为一个促进A53T α-synuclein突变体降解的治疗基因，其作用通路也适合被选择为药物靶点，其高特异性意味着更低的副作用。

实施例3、OMI蛋白对溶酶体活性的调节作用

以下试验中，HeLa细胞、N2a细胞的细胞密度均为3×10⁴-4×10⁴个/孔。

1、导入OMI蛋白后细胞内溶酶体数量的变化

细胞的酸性细胞器(主要是溶酶体)的活性可以被酸性染料MDC(monodancylcadaverine)(SIGMA，catalog no.M-4008)的染色强度所显示。在HeLa细胞中，转入质粒III(1ug/孔)，24h后用MDC进行染色；在HeLa细胞中，转入质粒pKH3-HA(1ug/孔)，24h后用MDC进行染色，作为对照。

结果见图12。图12中，(a)为对照细胞；(b)为转入质粒III的细胞。结果表明：在HtrA2/OMI高表达的细胞中，酸性染料的着色强度更高，点状分布更明显，这提示细胞的溶酶体活性处在高水平。

2、导入OMI蛋白后细胞内溶酶体底物水平的变化

Sequestosome 1/p62(一种胞质蛋白)是公认的溶酶体降解底物。在HeLa细胞中，转入质粒III(1ug/孔)；在HeLa细胞中，转入质粒pKH3-HA(1ug/孔)，24h后裂解细胞，作为对照。用p62抗体(购买自santa cruz公司，catalog No.sc-28359)和HA抗体对细胞裂解液进行western杂交，内参蛋白为GAPDH。

结果见图13。图13中，1：对照；2：转入质粒III的细胞。结果表明：在HtrA2/OMI高表达的细胞中，p62蛋白水平出现明显的降解，提示细胞的溶酶体降解通路被HtrA2/OMI所激活。

3、降低OMI的表达量后细胞内溶酶体数量的变化

设计针对OMI的SiRNA序列(Si-OMI)如下：

上游引物：5’-GGGGAGUUUGUUGUUGCCAdTdT-3’；

下游引物：5’-UGGCAACAACAAACUCCCCdTdT-3’。

对照SiRNA序列(Si-对照)如下：

上游引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’.

下游引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’.

在两组HeLa细胞中，转染Si-OMI(35pmoles/孔)；在另外两组HeLa细胞中，转染Si-对照(35pmoles/孔)，作为对照。转染24小时后，转入HBSS(Invitrogen，Catalog Number，14025092.)缓冲液中培养4小时，作为饥饿刺激(starvation)。

将一组转染Si-OMI的HeLa细胞和一组转染Si-对照的HeLa细胞进行western杂交实验内参蛋白为GAPDH。结果见图14。图14中，1：Si-对照；2：Si-OMI。

将一组转染Si-OMI的HeLa细胞和一组转染Si-对照的HeLa细胞进行MDC染色。结果见图15。图15中，(a)为转染Si-对照的HeLa细胞；(b)为转染Si-OMI的HeLa细胞。

结果表明：转染Si-OMI，成功下调了OMI基因，OMI蛋白的表达量大大降低。当用营养缺乏刺激细胞时，对照细胞的酸性细胞器活性有明显的上升，而OMI低表达细胞则显示溶酶体活性下降。

4、降低OMI的表达量后细胞内溶酶体底物水平的变化

在HeLa细胞中，转染Si-OMI(35pmoles/孔)；在HeLa细胞中，转染Si-对照(35pmoles/孔)。24h后裂解细胞。用p62抗体和OMI抗体对细胞裂解液进行western杂交，内参蛋白为GAPDH。

结果见图16。图16中，1：对照；2：转入SiRNA的细胞的细胞裂解液。结果表明：在转染了针对OMI的SiRNA后，细胞内溶酶体底物p62蛋白的水平出现明显的上升，这显示了OMI是细胞溶酶体降解通路中一个关键的蛋白。

序列表

<110>中国科学技术大学

<120>OMI蛋白及其编码基因的一种新用途

<130>CGGNARY81993

<160>4

<210>1

<211>423

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>140

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

<210>3

<211>1377

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>3

<210>4

<211>458

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>4

Claims

1.OMI蛋白的编码基因在制备促进A53T α-synuclein突变体蛋白降解的药物中的应用；所述OMI蛋白的编码基因是序列表中序列3所示的DNA分子；

所述A53T α-synuclein突变体蛋白是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.OMI蛋白在制备促进A53T α-synuclein突变体蛋白降解的药物中的应用；所述OMI蛋白是由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；