CN104114573B - 高mast2亲和力多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有胞质域的多肽，所述胞质域末端为MAST‑2结合域，所述MAST‑2结合域长11‑13个残基，其头两个残基为S和W，而最后4个残基为Q、T、R和L，所述多肽展现对人MAST2蛋白PDZ结构域的高亲和力。本发明还涉及多核苷酸、包含其的载体、慢病毒粒子、细胞以及组合物。本发明还涉及所述多肽、多核苷酸、载体、慢病毒粒子、细胞和组合物在治疗和/或预防改变中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的疾病、病患或病症中的用途。本发明还涉及用于确定分子的神经生存和/或神经保护活性的细胞基因分子标签。

Description

高MAST2亲和力多肽及其应用
发明领域
本发明涉及含有胞质域的多肽，所述胞质域末端为MAST-2结合域，所述MAST-2结合域的头两个残基为S和W，而最后4个残基为Q、T、R和L，所述多肽展现对人MAST2蛋白PDZ结构域的高亲和力。本发明还涉及包含其的多核苷酸、载体、慢病毒粒子、细胞以及组合物。本发明还涉及所述多肽、多核苷酸、载体、慢病毒粒子、细胞和组合物在治疗和/或预防改变中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的疾病、病患或病症中的应用。本发明还涉及用于确定分子的神经生存和/或神经保护活性的细胞基因的分子标签。
发明背景
在神经系统发育期间，为了以合适的方式支配它们的靶标，神经元在相当长的距离上延伸轴突。这包括刺激细胞中能刺激生长锥活性的特定信号转导通路。
虽然发育中的神经系统，尤其是发育中的中枢神经系统，是高度可塑的，但成熟的神经系统，尤其是成熟的脑，具有较有限的修复潜能。因此，为了改善神经退行性疾病、病患或病症如神经系统的急性损伤或慢性神经退行性病患的结果，神经突-轴突增生和针对退化的保护是需要考虑的重要因素。能从此类神经元细胞诱导神经突增生的产品，将带来针对此类疾病、病患或病症的非常有效的治疗和/或预防和/或减轻方案。
在神经元发育过程的另一方面，不分化为成熟的神经元结构的神经元前体细胞的增殖引起神经系统瘤。能从此类前体细胞诱导神经突增生的产品，将带来针对此类肿瘤的治疗和/或预防和/或减轻方案。
已有描述狂犬病毒株的致病性与其诱导细胞凋亡的能力呈负相关(WO03/048198；Ugolini1995；Sarmento et al.2005；Ugolini2008；Jackson et al.2008)。因此，狂犬病毒株毒力越强，细胞凋亡越少。该发现表明烈性狂犬病毒株如CVS病毒株不诱导神经元细胞凋亡，并解释了为何烈性狂犬病毒株能够在出现疾病病症和症状前在CNS中如此广泛地增殖。
最近，Préhaud et al.(2010)报导了狂犬病毒G蛋白胞质域的C端区涉及G蛋白与人微管相关的丝氨酸苏氨酸激酶2——MAST2蛋白的PDZ结构域的结合。该C端区具有称为PDZ-BS(PDZ结合位点)的4个氨基酸的基序，其在烈性狂犬病病毒株中具有序列QTRL，而在减毒株中具有序列ETRL。因此，已表明烈性狂犬病毒株的G蛋白能以高亲和力与MAST-1和MAST-2结合，而不能结合PTPN4、DLG2和MPDZ。相反，已表明减毒狂犬病毒株的G蛋白能与MAST-1、MAST-2、PTPN4、DLG2和MPDZ结合。有关烈性和减毒狂犬病毒株G蛋白结合方式的该差异似乎与这些病毒株毒力的差异有关(图2)。
因此，如申请WO2010/116258中所阐述，狂犬病毒G蛋白491(H/L)和521(Q/E)位置处的氨基酸残基的性质对神经元生存和神经突增生的影响具有重要作用。烈性狂犬病毒株的491位置处显示H残基和521位置处显示Q残基的G蛋白，为非细胞凋亡性的，并有利于神经突增生。相反，减毒狂犬病毒株的491位置处显示L残基和521位置处显示E残基的G蛋白为细胞凋亡性的，并且不促进神经突增生。
基于这些结果，本领域需要确定和设计具有促进神经突增生和神经生存的改善的性能的方式。本发明提供了用于神经元再生和防护的方式，其源于狂犬病毒株的G蛋白，并显示出乎意料的性能。本发明还涉及用于筛选适合神经元再生和防护分子的方式。
附图说明
图1.狂犬病毒(RABV)蛋白G在细胞中的加工：翻译后，蛋白G为I型跨膜糖蛋白，在内质网(ER)处合成，然后通过分泌途径处理以到达高尔基体，在高尔基体中其被在其胞外结构域上糖基化。随后，该蛋白被递送至细胞质膜，在质膜中其通过其跨膜结构域被锚定。G蛋白的胞质域总是与细胞质接触。
图2.(A)本发明多肽(Neurovita多肽)通过与其细胞伴侣——人MAST2蛋白(微管相关的丝氨酸-苏氨酸激酶2)相互作用而产生作用的方式的图示；(B)PI3K/Akt信号通路参与神经元生理机能的图示。
图3.RABV介导的神经保护期间刺激的激酶的识别：有丝分裂后的人神经元NT2-N中的激酶组(Kinome)图谱。(A)覆盖整个人激酶组的肽微阵列载片。(B)得到的以重组rRABV(RABV-CVSHQ)感染45h的NT2-N细胞的激酶组图谱的图示。圆点表示NT2-N细胞中在rRABV神经生存性感染后激活的激酶。
图4.(A)G蛋白(第一条线)和Neurovita1多肽(第二条线)的图示；SP：信号肽，EC：胞外结构域，TM：跨膜结构域，Cyto：胞质域，PDZ-BS：PDZ结合位点，还显示了每个结构域的氨基酸残基(aa)的数目，(B)感染后48h(p.i.)通过蛋白质印迹法测得的，Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS通过慢病毒载体在NS细胞或人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中的表达(1.Neurovita1；2.Neurovita1ΔPDZ-BS；3.阴性对照)，(C)通过免疫荧光法在48h p.i.测得的，Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS通过慢病毒载体在NS细胞的表达。在(B)和(C)中，采用RABV Cyto-G特异性的抗体进行检测。
图5.Neurovita1以PDZ-BS依赖性方式在NS和SH-SY5Y中引发神经突增生。(A)慢病毒载体感染(30h,p.i.)后SH-SY-5Y人神经母细胞瘤细胞中的神经突增生检测。细胞以dbc-AMP(10μM)处理。(B)慢病毒载体感染(72h p.i.)后NS细胞中的神经突增生检测。细胞以NGF(200ng/ml)处理，(*:p<0.05，学生检验)。
图6.(A)Neurovita1介导的神经保护的遗传分子标签的确定；基因表达基于人神经发生和神经干细胞PCR以及PI3K-Akt信号通路检测，在具有表达Neurovita1的慢病毒载体(24h p.i.)的NT2-N细胞中测得；(B)采用聚焦于该通路的基因表达图谱(qRT-PCR)获得的Neurovita1遗传分子标签的图示。基因簇代表Neurovita1感染后被调节、但在未感染培养物或感染了Neurovita1ΔPDZ-BS的培养物中未被调节的基因(圆点为Neurovita1特异性基因；方块为关联基因)。
图7.基于人神经发生和神经干细胞PCR以及PI3K-Akt信号通路检测确定的，缺少MAST2的Neurovita1的分子标签；通过表达Neurovita1的慢病毒载体感染NT2-N细胞后(24hp.i.)的遗传分子标签，其中通过在以慢病毒载体Neurovita1感染前48h用Sh RNA MAST2特异性重组慢病毒感染，MAST2表达被敲除。
图8.慢病毒载体Neurovita1利于NT2-N轴突的创伤愈合。(A)刮伤检测的展示，(B)创伤6天后的再生的阐示，(C)慢病毒载体Neurovita1或Neurovita1ΔPDZ-BS感染后轴突再生的比较。
图9.Neurovita1介导的轴突再生的分子标签；聚焦于通路的基因表达图谱于创伤后2天在NT2-N细胞培养物确立。(A)PI3K/Akt信号通路中涉及的基因(人PI3K-AKT信号转导PCR检测)。(B)细胞增殖、粘附、分化、生长因子和突触功能中涉及的基因(人神经发生和神经干细胞PCR检测)。(C)Neurovita1介导的轴突再生中涉及的基因的簇图示(圆点为neurovita特异性基因；方块为关联基因)。
图10.结构/功能分析。(A)Neurovita1序列的序列和三维组织。(B)本发明多肽(Neurovita多肽)对MAST2-PDZ的亲和力与其神经生存性能间的关联。
图11.(A)本发明多肽的图示；SP：信号肽，EC：胞外结构域，TM：跨膜结构域，Cyto：胞质域。还显示了每个结构域的氨基酸残基(aa)的数目，(B)本发明的2个具体多肽(Neurovita2和Neurovita3)的蛋白序列，以及与Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS多肽序列的比较，(C)通过蛋白质印迹(48h p.i.)、使用RABV Cyto-G特异性抗体测得的，Neurovita1、Neurovita1ΔPDZ-BS和Neurovita2通过慢病毒载体(lentivector)在NS细胞中的表达(1:Neurovita2；2:Neurovita1ΔPDZ-BS；3:Neurovita1,和4:阴性对照)。
图12.慢病毒载体感染(72h p.i.)后在NS细胞中进行的神经突增生检测。细胞以NGF(200ng/ml)处理(N.I.未处理的细胞)。
图13.Neurovitas诱导NS细胞中的神经突枝。(A)以Neurovita2(上图)或Neurovita1(下图)感染的代表性NS细胞的枝状结构的示意性重绘，(B)通过针对以Neurovita1(黑色方框)和Neurovita2(黑色圆圈)慢病毒载体感染72h的NS培养物的Sholl分析测得的神经突树的复杂性。
图14.Neurovita2的遗传分子标签的确定。(A)通过慢病毒载体在NT2-N细胞(24hp.i.)中确定的POU4F1、DRD2、FOS和BTK的下调。(B)采用聚焦通路的基因表达图谱(qRT-PCR)获得的Neurovita2遗传分子标签的图示。基因簇表示Neurovita2感染后被调节，但在未感染培养物或感染了Neurovita1ΔPDZ-BS的培养物中未被调节的基因(圆点为neurovita特异性基因；方块为关联基因)。
图15.Neurovita慢病毒载体感染后，NT2-N细胞中(A)rRABV在24h(p.i.)和(B)慢病毒载体在48h(p.i.)的转录。转录通过RT-QPCR测得。
图16.先天免疫基因的激活。(A)以rRABV CVS HQ和rRABV CVSHΔ4感染后(N.I.:未感染的)或(B)以Neurovita1、Neurovita1ΔPDZ-BS和Neurovita2慢病毒载体(neg:阴性对照)感染后，(A)一组代表性免疫基因(NT2-N细胞中的)的转录。
图17.创伤后NT2-N细胞中的轴突再生。(A)NT2-N细胞中酪氨酸羟化酶(TH)——一种多巴胺能神经元标志物的表达，(B)NT2-N培养物中的TH mRNA转录，以18S作为标准，(C)在针对MAST-2的SHRNA(si MAST2)存在或不存在下，以Neurovita1进行慢病毒载体感染后的轴突再生；N.I.:未感染的，结果表示为再生的刮伤神经元的百分比，(D)以Neurovita1或Neurovita2慢病毒载体感染后的轴突再生；N.I.:未感染的。
图18.在KCl不存在(圆圈)或存在(方块)下(A)以阴性对照进行慢病毒感染后27h，或(B)在KCl存在下以Neurovita2慢病毒载体感染(星形)后，通过针对NS培养物的Sholl分析测得的神经突树的复杂性。
图19.(A)在LiCl不存在或存在下于未感染的(N.I.)NS细胞中，和(B)在LiCl处理的NS细胞、未感染的(N.I.)或者以Neurovita1(NV1)、Neurovita1ΔPDZ-BS(NV1Δ)或Neurovita2(NV2)慢病毒载体感染后的细胞中进行的神经突增生检测。
图20.由G全长、NV1和NV1cyto引发的神经突增生的比较。(A)RABV G全长、Neurovita1和胞质形式的Neurovita1(NV1cyto)的图示；SP：信号肽，EC：胞外结构域，TM：跨膜结构域，Cyto：胞质域，PDZ-BS：PDZ结合位点，还显示了每个结构域的若干氨基酸残基(aa)的数目，(B)以Neurovita1、Neurovita1ΔPDZ-BS、RABV G全长、RABV G全长ΔPDZ-BS、Neurovita1-cyto和Neurovita1-cytoΔPDZ-BS感染后(N.I.:未感染的)NS中的神经突增生检测。
图21.NS细胞中来自双顺反子慢病毒载体的Neurovita分子的表达。(A)pLenti7.3Neurovita双顺反子慢病毒载体的图示，(B)Neurovita1ΔPDZ-BS(NV1Δ)、Neurovita1(NV1)、Neurovita2(NV2)或Neurovita3(NV3)的mRNA相对倍数增加，以18S作为标准，(C)通过流式细胞术测得的以表达NV1Δ-、NV1-、NV2-或NV3的慢病毒载体感染NS细胞后的GFP表达；结果表示为培养物中表达GFP的细胞的百分比；Neg为未感染的细胞，(D)通过蛋白质印迹测得的NS细胞中NV1Δ、NV1、NV2或NV3的表达，(E)在相应的溶解产物中以微管蛋白的表达作为内在蛋白载荷对照。
图22.NS培养物中由NV3引发的神经突增生。(A)未感染的(左图)或以Neurovita3感染的(右图)代表性NS细胞的枝状结构的示意性重绘；(B)以NV1Δ、NV1、NV2或NV3慢病毒载体感染后NS细胞中的神经突增生检测；(C)学生t检验(p<0.05)。
图23.NS培养物中由NV3引发的树状分枝(arborisation)。(A)通过针对未感染的相对感染了Neurovita1的、感染了Neurovita1相对感染了Neurovita3的，或感染了Neurovita2相对感染了Neurovita3的NS细胞的Sholl分析测得的神经突树的复杂性；(B)双因素ANOVA(p<0.05)。
图24.NV3胞质(NV3cyto)慢病毒载体的构建。(A)Neurovita3和胞质形式的Neurovita3(NV3cyto)的图示；SP：信号肽，EC：胞外结构域，TM：跨膜结构域，Cyto：胞质域，PDZ-BS：PDZ结合位点。还显示了每个结构域的氨基酸残基(aa)的数目；(B)表达NV3或NV3-cyto的pLenti7.3Neurovita双顺反子慢病毒载体的图示；(C)NV3和NV3cyto的相对增加倍数，以18S作为标准；(D)通过细胞荧光测定法测得的以表达NV3或NV3cyto的慢病毒载体感染后的GFP表达；结果表示为培养物中GFP阳性细胞的百分比；neg为未感染的细胞。
图25.NV3-cyto诱导的神经突增生与NV1和NV3的那些的比较。(A)感染了NV1、NV3或NV3-cyto的代表性NS细胞的枝状结构的示意性重绘；(B)以NV1、NV2、NV3或NV3-cyto慢病毒载体感染后NS细胞中的神经突增生检测；(C)学生t检验(p<0.05)。
图26.NV3-cyto诱导的神经突树与NV1和NV3的那些的比较。(A)通过针对感染了NV1相对感染了NV3cyto的，或感染了NV3相对感染了NV3cyto的NS培养物的Sholl分析测得的神经突树的复杂性；(B)双因素ANOVA(p<0.05)。
图27.在培养E16小鼠胎儿皮质神经元中通过NV1和NV1Δ诱导的神经突生成。3天体外(A)未感染的或通过NV1(B)或NV1Δ(C)慢病毒载体感染3天，βIII微管蛋白(神经元形式)染色的E16小鼠皮质神经元的代表性图；(D)以NV1或NV1Δ慢病毒载体感染后皮质神经元中的神经突增生检测。
图28.在通过脑内途径以NV1或NV1Δ慢病毒载体感染的新生小鼠中进行的毒性检测。(A)确定的未注射小鼠或注射了NV1或NV1Δ慢病毒载体的小鼠的体重；(B)慢病毒感染3个月后脑中NV1或NV1Δ转录物的表达，以18S作为标准。
图29.被以NV1或NV1Δ慢病毒载体注射至脑中的小鼠的表型。(A)NV1，注射(pi)后第4天；(B)注射了NV1的小鼠(pi)，第20天；(C)注射了NV1Δ的小鼠(pi)，第4天；(D)注射了NV1Δ的小鼠(pi)，第20天；箭头表示未注射的(N.I.)小鼠(切除了尾巴)。
图30.以NV1慢病毒载体通过脑内途径注射的小鼠的脑(纹状体)的免疫染色。(A)采用GFP荧光(绿色)、Map2染色(红色)和GFAP染色(紫色)进行的纹状体的免疫染色。(B)采用GFP荧光(绿色)、Map2染色(红色)和GFAP染色(紫色)进行的树状轴突树的免疫染色。
图31.以NV1Δ慢病毒载体注射至脑中的小鼠的纹状体免疫染色；GFP荧光(绿色)、Map2染色(红色)和GFAP染色(紫色)。
发明详述
在本申请中，发明人出乎意料地表明序列包含残基SW和残基QTRL、具有针对人MAST2蛋白PDZ结构域的高亲和力的多肽，对增加神经突增生和神经生存性能具有特别有趣的效果。因此，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDZ结构域形成的复合物的解离常数(KD)越低，本发明多肽的神经生存性能越高。
本发明涉及本文所定义的多肽，其展现针对人MAST2蛋白PDZ结构域的高亲和力(SEQ ID NO:6为全长人MAST2蛋白，而SEQ ID NO:7为其PDZ结构域)。
换言之，如本文所定义的本发明的多肽以这样的方式设计，其与人MAST2蛋白PDZ结构域形成的复合物的解离常数(KD)非常低，且因此其对人MAST2蛋白PDZ结构域的亲和力非常高(亲和力与KD成反比)。
因此，在第一个实施方案中，本发明的多肽展现针对人MAST2蛋白PDZ结构域的结合亲和力，其大于针对包含SWESHKSGGQTRL序列(SEQ ID NO:1)的狂犬病毒G蛋白MAST2蛋白的PDZ结构域的结合亲和力。
在具体的实施方案中，本发明多肽相比具有由SWESHKSGGQTRL组成的MAST-2结合域的多肽的亲和力的增加(例如，KD比)范围为2.5-20，且特别是5-20、5-15或5-10。
在具体的实施方案中，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDZ结构域形成的复合物的解离常数(KD)小于1μM、小于0.8μM、小于0.5μM、小于0.4μM或小于0.3μM。在优选的实施方案中，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数小于0.2μM，优选小于0.15μM，更优选小于0.1μM。
在具体的实施方案中，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域(MAST2-PDZ)形成的复合物的解离常数(KD)通过等温滴定量热法(ITC)测定。
作为ITC的具体实施方案，确定了多肽浓度范围为250μM-350μM(优选在含有50mMTris-HCl、150mM NaCl,pH7.5的缓冲液中进行)，且MAST2-PDZ结构域的初始浓度为30μM的，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域(MAST2-PDZ)形成的复合物的解离常数。
作为ITC的具体实施方案，按如下确定由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数：在含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl,pH7.5的缓冲液中，以250μM-350μM的初始浓度范围制备本发明多肽。ITC(等温滴定量热法)测量的进行使用来自Microcal(Northampton,MA)的Microcal VP ITC200等温滴定热量计，通过在298K注射按上述制备的本发明多肽来滴定MAST2-PDZ(以30μM的初始浓度)(具体多肽的每次滴定包括以6分钟间隔进行的25-45次连续输注5-7μL的整份)。将原始数据针对多肽的稀释热进行标准化和校正。平衡解离常数的确定使用Origin7.0软件(OriginLab)进行，经非线性曲线将校正数据拟合为具有一组点的模型。
本发明多肽针对人PTPN4蛋白PDZ结构域的亲和力较低，即由本发明多肽与人PTPN4蛋白PDZ结构域形成的复合物的解离常数(KD)较高，具体而言大于500μM(例如通过ITC测得的，尤其是在相同的病症中，且具有关于上述MAST2-PDZ的相同的浓度)。已表明KD(针对人PTPN4蛋白PDZ结构域的)的该较高值达到了本发明的最后4个残基为Q、T、R和L多肽的值。
因此，本文通过以下结构特征描述了多肽，其针对人MAST2蛋白PDA结构域具有高亲和力，和/或以这样的方式设计，其与人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数(Kd)在上述范围内。
因此，本发明涉及多肽，其为至多350个氨基酸残基长，包含或由胞质域组成。表述“胞质域”是指末端为本文定义的MAST-2结合域的蛋白结构域，并且其暴露于细胞胞质中，优选所述多肽具有结构或序列以允许其被锚定在细胞膜中的情形。根据本发明，所述多肽可包含或不包含允许本发明多肽被锚定在膜中的结构或序列。当所述多肽不具有允许锚定在膜中的结构或序列时，例如当所述多肽由本文定义的胞质域组成时，本发明多肽为胞质性的。
在具体的实施方案中，在人MAST2蛋白PDA结构域与不具有允许其被锚定在膜中的结构或序列的本发明多肽，尤其是由本文定义的胞质域组成的多肽间形成的复合物的解离常数(KD)小于1μM、小于0.5μM、小于0.4μM或小于0.3μM，优选小于0.2μM、小于0.15μM，且更优选小于0.1μM。
在具体的实施方案中，本发明涉及多肽，其为至多350个氨基酸残基长，包含(1)信号肽、(2)用于将所述多肽锚定在网状膜和/或高尔基体膜中的结构域(也称为锚定结构域)，和(3)当所述多肽被锚定在膜中时暴露于胞质中的结构域(也称为胞质域)。这些结构域在结构上以这样的方式组织，所述信号肽N端朝向锚定结构域，所述锚定结构域自身的N端朝向胞质域。根据该实施方案，本发明多肽从N端至C端包含(1)信号肽、(2)锚定结构域和(3)胞质域。
本发明多肽的胞质域末端为MAST-2结合域，所述结合域为11-13个氨基酸残基长。通过“末端为”，其指MAST-2结合域的11-13个连续残基为胞质域的最末C端残基，且在具体的实施方案中，为本发明多肽的最末C端残基。
本发明多肽的MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11-13个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L(这4个最末氨基酸残基表示所谓的PDZ-BS)。根据以下组中的一个定义MAST-2结合域，应当了解，不管是哪一个组，MAST-2结合域的头两个氨基酸残基均为S和W，且MAST-2结合域的最后4个氨基酸残基为Q、T、R和L。
(A)在第一组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4X5QTRL组成，其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一个为任意氨基酸残基(SEQ ID NO:19)。
在具体的实施方案中，X1为E或A，更优选E，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEX2X3X4X5QTRL(SEQ ID NO:20)或SWAX2X3X4X5QTRL(SEQ ID NO:21)组成，其中X2、X3、X4和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在另一个实施方案中，X2为S、E或V，更优选V，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1VX3X4X5QTRL(SEQ ID NO:22)、SWX1EX3X4X5QTRL(SEQ ID NO:23)或SWX1SX3X4X5QTRL(SEQID NO:24)组成，其中X1、X3、X4和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X3为H、A或Y，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2HX4X5QTRL(SEQ IDNO:25)、SWX1X2AX4X5QTRL(SEQ ID NO:26)或SWX1X2YX4X5QTRL(SEQ ID NO:27)组成，其中X1、X2、X4和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X4为G或T，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头两个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3GX5QTRL(SEQ IDNO:28)或SWX1X2X3TX5QTRL(SEQ ID NO:29)组成，其中X1、X2、X3和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X5为G或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4GQTRL(SEQ IDNO:30)或SWX1X2X3X4QQTRL(SEQ ID NO:31)组成，其中X1、X2、X3和X4中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E且X2为S、E或V，更优选V，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11哥残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEVX3X4X5QTRL(SEQ ID NO:32)、SWESX3X4X5QTRL(SEQ ID NO:33)或SWEEX3X4X5QTRL(SEQ IDNO:34)组成，其中X3、X4和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E且X3为H、A或Y，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEX2HX4X5QTRL(SEQ ID NO:35)、SWEX2AX4X5QTRL(SEQ ID NO:36)或SWEX2YX4X5QTRL(SEQ ID NO:37)组成，其中X2、X4和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E且X4为G或T，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEX2X3GX5QTRL(SEQ ID NO:38)或SWEX2X3TX5QTRL(SEQ ID NO:39)组成，其中X2、X3和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E且X5为G或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEX2X3X4GQTRL(SEQ ID NO:40)和SWEX2X3X4QQTRL(SEQ ID NO:41)组成，其中X2、X3和X4中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E，X2为V，且X3为H、A或Y，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEVHX4X5QTRL(SEQ ID NO:42)、SWEVAX4X5QTRL(SEQ ID NO:43)或SWEVYX4X5QTRL(SEQ IDNO:44)组成，其中X4和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E，X2为V，且X4为G或T，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEVX3GX5QTRL(SEQ ID NO:45)或SWEVX3TX5QTRL(SEQ ID NO:46)组成，其中X3和X5中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E，X2为V且X5为G或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEVX3X4GQTRL(SEQ ID NO:47)或SWEVX3X4QQTRL(SEQ ID NO:48)组成，其中X3和X4中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E，X2为V，X3为H、A或Y且X4为G或T，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEVHGX5QTRL(SEQ ID NO:49)、SWEVHTX5QTRL(SEQ ID NO:50)、SWEVAGX5QTRL(SEQ IDNO:51)、SWEVATX5QTRL(SEQ ID NO:52)、SWEVYGX5QTRL(SEQ ID NO:53)或SWEVYTX5QTRL(SEQID NO:54)组成，其中X5为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X1为E，X2为V，X3为H、A或Y，且X5为G或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEVHX4GQTRL(SEQ ID NO:55)、SWEVHX4QQTRL(SEQ ID NO:56)、SWEVAX4GQTRL(SEQID NO:57)、SWEVAX4QQTRL(SEQ ID NO:58)、SWEVYX4GQTRL(SEQ ID NO:59)或SWEVYX4QQTRL(SEQ ID NO:60)组成，其中X4为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4X5QTRL组成，其中X1为E或A，X2为S、E或V，X3为H、A或Y，X4为G或T且X5为G或Q(SEQ ID NO:61)。在该实施方案中，MAST-2结合域由S-W-E/A-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L组成。
在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4X5QTRL组成，其中X1为E，X2为S、E或V，X3为H、A或Y，X4为G或T且X5为G或Q(SEQ ID NO:62)。在该实施方案中，MAST-2结合域由S-W-E-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L组成。
在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4X5QTRL组成，其中X1为E，X2为V，X3为H、A或Y，X4为G或T且X5为G或Q(SEQ ID NO:63)。在该实施方案中，MAST-2结合域由S-W-E-V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L组成。在更具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEVHGGQTRL(SEQ ID NO:64)、SWEVHGQQTRL(SEQ ID NO:65)、SWEVHTGQTRL(SEQ ID NO:66)、SWEVHTQQTRL(SEQ ID NO:67)、SWEVAGGQTRL(SEQ ID NO:68)、SWEVAGQQTRL(SEQ IDNO:69)、SWEVATGQTRL(SEQ ID NO:70)、SWEVATQQTRL(SEQ ID NO:71)、SWEVYGGQTRL(SEQ IDNO:72)、SWEVYGQQTRL(SEQ ID NO:73)、SWEVYTGQTRL(SEQ ID NO:74)或SWEVYTQQTRL(SEQID NO:75)组成。
满足该组中描述的定义中的一个的多肽是优选地，尤其是当由该组的多肽与人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数小于0.3μM时，优选小于0.25μM，优选小于0.2μM，优选小于0.15μM，更优选小于0.1μM，所述解离常数通过以上定义的方法测得。在更优选的实施方案中，满足该组中描述的定义中的一个的多肽具有由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数，其小于0.09μM、小于0.08μM、小于0.07μM、小于0.06μM或小于0.05μM，所述解离常数通过以上定义的方法测得。
(B)在第二组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选自：SWX1KSGGQTRL(SEQ ID NO:76)、SWX1SSGGQTRL(SEQ ID NO:77)、SWX1SHGGQTRL(SEQ ID NO:78)、SWX1SHKGQTRL(SEQ ID NO:79)、SWX1SHKSQTRL(SEQ ID NO:80)、SWX1HSGGQTRL(SEQ ID NO:86)、SWX1HKGGQTRL(SEQ IDNO:87)、SWX1HKSGQTRL(SEQ ID NO:88)、SWX1SKGGQTRL(SEQ ID NO:89)、SWX1SKSGQTRL(SEQID NO:90)、SWX1SHSGQTRL(SEQ ID NO:91)、SWX1SHKGQTRL(SEQ ID NO:92)和SWX1SKGGQTRL(SEQ ID NO:93)，其中X1为任意氨基酸，优选E或A，更优选E。因此，在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选自：SWEKSGGQTRL(SEQ ID NO:81)、SWESSGGQTRL(SEQ ID NO:82)、SWESHGGQTRL(SEQ ID NO:83)、SWESHKGQTRL(SEQ ID NO:84)、SWESHKSQTRL(SEQ IDNO:85)、SWEHSGGQTRL(SEQ ID NO:94)、SWEHKGGQTRL(SEQ ID NO:95)、SWEHKSGQTRL(SEQ IDNO:96)、SWESKGGQTRL(SEQ ID NO:97)、SWESKSGQTRL(SEQ ID NO:98)、SWESHSGQTRL(SEQ IDNO:99)、SWESHKGQTRL(SEQ ID NO:100)和SWESKGGQTRL(SEQ ID NO:101)。在具体的实施方案中，胞质域的MAST-2结合域为SWESHGGQTRL(SEQ ID NO:83)。
该第二组的MAST-2结合域可通过从SWESHKSGGQTRL序列(SEQ ID NO:1)缺失两个连续或不连续的氨基酸残基获得。
(C)在第三组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4X5X6QTRL组成，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6中的每个为任意氨基酸残基(SEQ ID NO:112)。
在具体的实施方案中，X1为E、A、V或S，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWEX2X3X4X5X6QTRL(SEQID NO:113)、SWAX2X3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:114)、SWVX2X3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:115)或SWSX2X3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:116)组成，其中X2、X3、X4、X5和X6中的每个为任意氨基酸残基。
在具体的实施方案中，X2为S、V、H、A或Y，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1SX3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:117)、SWX1VX3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:118)、SWX1HX3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:119)、SWX1AX3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:120)或SWX1YX3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO:121)组成，其中X1、X3、X4、X5和X6中的每个为任意氨基酸。
在具体的实施方案中，X3为H、A、Y、K或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2HX4X5X6QTRL(SEQ ID NO:122)、SWX1X2AX4X5X6QTRL(SEQ ID NO:123)、SWX1X2YX4X5X6QTRL(SEQ ID NO:124)、SWX1X2KX4X5X6QTRL(SEQ ID NO:125)或SWX1X2QX4X5X6QTRL(SEQ ID NO:126)组成，其中X1、X2、X4、X5和X6中的每个为任意氨基酸。
在具体的实施方案中，X4为K、A、Q、S或H，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3KX5X6QTRL(SEQ ID NO:127)、SWX1X2X3AX5X6QTRL(SEQ ID NO:128)、SWX1X2X3QX5X6QTRL(SEQ ID NO:129)、SWX1X2X3SX5X6QTRL(SEQ ID NO:130)或SWX1X2X3HX5X6QTRL(SEQ ID NO:131)组成，其中X1、X2、X3、X5和X6中的每个为任意氨基酸。
在具体的实施方案中，X5为S、H、G或T，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4SX6QTRL(SEQID NO:132)、SWX1X2X3X4HX6QTRL(SEQ ID NO:133)、SWX1X2X3X4GX6QTRL(SEQ ID NO:134)或SWX1X2X3X4TX6QTRL(SEQ ID NO:135)组成，其中X1、X2、X3、X4和X6中的每个为任意氨基酸。
在具体的实施方案中，X6为G、T或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4X5GQTRL(SEQ IDNO:136)、SWX1X2X3X4X5TQTRL(SEQ ID NO:137)或SWX1X2X3X4X5QQTRL(SEQ ID NO:138)组成，其中X1、X2、X3、X4和X5中的每个为任意氨基酸。
在具体的实施方案中，关于如上定义的SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:122至SEQ IDNO:138的多肽，X1为E，并且/或者X2为V，如表1(下一页)中所揭示。
在具体的实施方案中，MAST-2结合域由12个残基组成，其头2个残基为S和W，且其最后4个残基为Q、T、R和L，其由序列SWX1X2X3X4X5X6QTRL组成，其中X1为E、A、V或S，X2为S、V、H、A或Y，X3为H、A、Y、K或Q，X4为K、A、Q、S或H，X5为S、H、G或T，且X6为G、T或Q(SEQ ID NO:191)。在该实施方案中，MAST-2结合域由序列S-W-E/A/V/S-S/V/H/A/Y-H/A/Y/K/Q-K/A/Q/S/H-S/H/G/T-G/T/Q-QTRL组成。
(D)在第四组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选自：SWX1HKSGGQTRL(SEQ ID NO:102)、SWX1SKSGGQTRL(SEQ ID NO:103)、SWX1SHSGGQTRL(SEQ ID NO:104)、SWX1SHKGGQTRL(SEQ IDNO:105)和SWX1SHKSGQTRL(SEQ ID NO:106)，其中X1为任意氨基酸，优选E或A，更优选E。因此，在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选自：SWEHKSGGQTRL(SEQ ID NO:107)、SWESKSGGQTRL(SEQ ID NO:108)、SWESHSGGQTRL(SEQ ID NO:109)、SWESHKGGQTRL(SEQ IDNO:110)和SWESHKSGQTRL(SEQ ID NO:111)。
该第四组的MAST-2结合域可通过从SWESHKSGGQTRL序列(SEQ ID NO:1)缺失1个氨基酸残基获得。
表1
(E)在第五组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为13个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL组成，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的每个为任意氨基酸残基(SEQ ID NO:192)，其中所述MAST-2结合域不由SWESHKSGGQTRL组成。在具体的实施方案中，MAST-2结合域的大小为13个残基，其不为SWESHKSGGQTRL(SEQ ID NO:1)或SWESYKSGGQTRL(SEQ ID NO:16)。
在具体的实施方案中，如果头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，则13个残基的MAST-2结合域与SWESHKSGGQTRL(SEQ ID NO:1)存在至少一个氨基酸残基取代、至少2个取代或至少3个取代的差异；在更具体的实施方案中，13个残基的MAST-2结合域与SWESHKSGGQTRL存在至少一个取代差异，其不为SWESYKSGGQTRL(SEQ ID NO:16)。
在具体的实施方案中，MAST-2结合域由13个残基组成，且与SWESHKSGGQTRL存在位于SW和QTRL之间的1个残基取代的差异；在具体的实施方案中，该差异不是组氨酸残基(H)与酪氨酸残基(Y)的取代。
在SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL的具体的实施方案中，X1为E或A，且X2、X3、X4、X5、X6和X7中的每个为任意氨基酸残基(SEQ ID NO:193)。
在SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL的具体的实施方案中，X2选自极性中性残基、带负电荷的残基或疏水性残基(SEQ ID NO:194)，且优选为S、V或E(SEQ ID NO:195)，其中X1、X3、X4、X5、X6和X7为任意氨基酸残基。
在SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL的具体的实施方案中，X3选自带正电荷的残基、非极性残基，具有小体积的和极性的芳香族残基(SEQ ID NO:196)，且优选为H、A或Y(SEQ ID NO:197)，其中X1、X2、X4、X5、X6和X7为任意氨基酸残基。
在SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL的具体的实施方案中，X4选自非极性残基，具有小体积的极性中性残基和带正电荷的残基(SEQ ID NO:198)，且优选为K、A或Q(SEQ ID NO:199)，其中X1、X2、X3、X5、X6和X7为任意氨基酸残基。
在SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL的具体的实施方案中，X5选自极性中性残基和带正电荷的残基(SEQ ID NO:200)，且优选为S或H(SEQ ID NO:201)，其中X1、X2、X3、X4、X6和X7为任意氨基酸残基。
在SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL的具体的实施方案中，X6选自非极性残基，具有小体积的，优选柔性的和极性中性的残基(SEQ ID NO:202)，且优选为G或T(SEQ ID NO:203)，其中X1、X2、X3、X4、X5和X7为任意氨基酸残基。
在SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL的具体的实施方案中，X7选自非极性残基，具有小体积的，优选柔性的和极性中性的残基(SEQ ID NO:204)，且优选为G或Q(SEQ ID NO:205)，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6为任意氨基酸残基。
对应于极性中性残基、带正电荷的残基、带负电荷的残基、疏水性残基、非极性残基，具有小体积的和极性的芳香族残基的氨基酸残基与常规文献一致，且在以下列表中进行了确认。
在更具体的实施方案中，所述MAST-2结合域由序列SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL组成，其中X1为E或A，并且/或者X2为S、V或E，并且/或者X3为H、A或Y，并且/或者X4为K、A或Q，并且/或者X5为S或H，并且/或者X6为G或T，并且/或者X7为G或Q，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7不一起为E、S、H、K、S、G和G。在具体的实施方案中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7不一起分别为E、S、H、K、S、G和G，也不一起分别为E、S、Y、K、S、G和G。
因此，在优选的实施方案中，如果MAST-2结合域不为SWESHKSGGQTRL(SEQ ID NO:1)，则MAST-2结合域的序列为SEQ ID NO:206中定义的S-W-E/A-S/V/E-H/A/Y-K/A/Q-S/H-G/T-G/Q-QTRL；在更具体的实施方案中，序列S-W-E/A-S/V/E-H/A/Y-K/A/Q-S/H-G/T-G/Q-QTRL的MAST-2结合域不为SWESHKSGGQTRL(SEQ ID NO:1)或是SWESYKSGGQTRL(SEQ ID NO:16)。在另一优选的实施方案中，MAST-2结合域的序列为SEQ ID NO:207中定义的S-W-E/A-V/E-H/A-A/Q-S/H-G/T-G/Q-QTRL。优选的MAST-2结合域由序列SWAEAQHTQQTRL(SEQ ID NO:208)或SWEVHASGGQTRL(SEQ ID NO:209)组成。
在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11或12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其选自以上详细描述的组(A)、(B)、(C)和(D)。
在另一实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其选自以上详细描述的组(A)和(B)。
在另一实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其选自以上详细描述的组(C)和(D)。
在另一实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为13个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其选自以上详细描述的组(E)。
在具体的实施方案中，本发明多肽MAST-2结合域上游的胞质域的序列为：
-多肽，其含有20-40个氨基酸残基，以便整个胞质域(MAST-2结合域上游的和MAST-2结合域的胞质域的序列)的大小为31-53个残基，优选为31-52个或31-51个残基。在具体的实施方案中，MAST-2结合域上游的胞质域的序列由25-45个残基组成。在另一实施方案中，MAST-2结合域上游的胞质域的序列为31个残基，以便整个胞质域为42-44个残基，优选42个残基、43个残基或44个残基长。可以选择任何胞质域，只要该胞质域允许MAST-2结合域与人MAST2蛋白PDA结构域结合。G蛋白胞质域的具体实例可参见Schnell MJ et al.(1998)和Owens RJ et al(1993)。可通过以上针对KD计算详细描述的方法检测MAST-2结合域与人MAST2蛋白PDA结构域的结合，并因此可检测本发明多肽针对人MAST2蛋白PDA结构域的亲和力；或
-MAST-2结合域上游的胞质域的序列为狂犬病毒G蛋白胞质域的片段，具体而言为来自减毒狂犬病毒株的G蛋白胞质域的片段，或来自烈性狂犬病毒株的G蛋白胞质域的片段；在具体的实施方案中，MAST-2结合域上游的胞质域的序列由以下序列RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:2)，或与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％或至少90％同一性的变体组成，所述变体保留有允许本发明多肽的MAST-2结合域与人MAST2蛋白PDA结构域结合的能力。在两个序列中最短的，即在SEQ ID NO:2和所述变体中最短的中计算同一性百分比。与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％或至少90％同一性的变体定义为具有一个或多个添加和/或一个或多个缺失和/或一个或多个取代的变体。SEQ IDNO:2变体的实例为由序列RRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:5)组成的多肽。在具体的实施方案中，变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的同一性，且通过在SEQ ID NO:2中进行1、2或3个取代获得，优选通过文献中定义的保守取代，或根据以下列表获得：
-非极性(即疏水性)氨基酸残基组：第一个亚组包括丙氨酸(A)、甘氨酸(G)和脯氨酸(P)，而第二个亚组包括亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)；
-极性中性(不带电荷的)氨基酸残基组：第一个亚组包括丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)，而第二个亚组包括天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；
-带正电荷的(即碱性)残基组，包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)；
-带负电荷的(即酸性)残基组，包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；和
-芳香族残基组，包括苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
在具体的实施方案中，当多肽由胞质域组成时，所述多肽的大小为31-53个残基，优选为31-52个或31-51个残基，或42-44个残基，优选42个残基、43个残基或44个残基。
在具体的实施方案中，并且不论MAST-2结合域上游的胞质域的序列和MAST-2结合域的序列如何，本发明多肽的锚定结构域(其可以任选地如此，或与信号肽一起为此)为：
-肽，其大小为18-26个氨基酸，其将多肽锚定(或已表明能锚定)在细胞(特别是神经元细胞，更特别是人神经元细胞)的内质网膜和/或高尔基体膜中(图1)。锚定结构域的具体实例可参见Schroth-Diez B et al.(2000)。在具体的实施方案中，锚定结构域的大小为20-24个氨基酸残基。在具体的实施方案中，锚定结构域的大小为22个氨基酸残基。可以选择任何锚定结构域，只要其能将本发明多肽锚定在细胞(特别是神经元细胞，更特别是人神经元细胞)的内质网膜和/或高尔基体膜中。在具体的实施方案中，锚定结构域为跨膜结构域，即，能与脂质双分子层相互作用，并且特别是能将包含其的多肽锚定在脂质双分子层中，特别是锚定在细胞膜中的任何结构域。跨膜结构域为富含疏水残基(A、G、P、L I和/或V)且在膜中稳定的结构域，并且以一个或数个疏水性α-螺旋组织。在具体的实施方案中，用于本文描述的多肽的跨膜结构域为已知跨膜蛋白的跨膜结构域(作为片段)。跨膜结构域的具体实例可参见Schroth-Diez B et al.(2000)。可以通过实施以上针对KD计算详细描述的方法检测本发明多肽针对人MAST2蛋白PDA结构域的亲和力，确定本发明多肽的正确锚定；或
-狂犬病毒G蛋白的跨膜结构域，特别是来自减毒狂犬病毒株的G蛋白的跨膜结构域，或来自烈性狂犬病毒株的G蛋白胞质域的跨膜结构域；在优选的实施方案中，跨膜结构域包含或由序列YVLLSAGALTALMLIIFLMTCC(SEQ ID NO:4)或与所述SEQ ID NO:4具有至少81％、至少86％、至少90％或至少95％同一性的变体组成，所述变体保留有将多肽锚定在细胞内质网膜和/或高尔基体膜中的能力；在两个序列中最短的，即SEQ ID NO:4和所述跨膜结构域变体中最短的中计算同一性百分比。与SEQ ID NO:4具有至少81％、至少86％、至少90％或至少95％同一性的变体定义为具有一个或多个添加和/或一个或多个缺失和/或一个或多个取代的变体。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO:4具有至少90％或至少95％同一性的变体分别通过在SEQ ID NO:4中进行1或2个取代获得，优选通过文献中定义的保守取代，或根据上述列表获得。
无论本文定义的锚定结构域(优选跨膜结构域)的序列如何：
-所述锚定结构域的N末端直接或间接地与本文定义的信号肽的C末端相连；且
-所述锚定结构域的C末端直接或间接地，优选直接地与本文定义的胞质域的第一个N端氨基酸残基相连。
在具体的实施方案中，并且无论MAST-2结合域上游的胞质域的序列、MAST-2结合域的序列和锚定结构域的序列如何，本发明多肽的信号肽(其可以任选地如此，或与锚定结构域一起为此)为：
-肽，其大小为3-60个残基，其将多肽靶向(或已表明能靶向)内质网中，并且任选地通过分泌途径进行(图1)；在具体的实施方案中，信号肽的大小为10-40个，优选15-30个，更优选15-25个氨基酸残基。在具体的实施方案中，信号肽的大小为19个氨基酸残基。可以选择任何信号肽，只要其将本发明多肽靶向内质网中，并且任选地通过分泌途径进行。在具体的实施方案中，用于本文描述的多肽的信号肽为已知蛋白如CD4和CD8蛋白、血凝素(HA)或细胞因子受体(例如IL1R1、EGFR1、HER2、HER3或HER4)的信号肽。可通过实施以上针对KD计算详细描述的方法检测本发明多肽针对人MAST2蛋白PDA结构域的亲和力，确定本发明多肽的正确靶向；或
-狂犬病毒G蛋白的信号肽，特别是来自减毒狂犬病毒株的G蛋白的信号肽，或来自烈性狂犬病毒株的G蛋白胞质域的信号肽；在优选的实施方案中，狂犬病毒G蛋白的信号肽对应于G蛋白的头19个氨基酸残基。在具体的实施方案中，所述信号肽包含或由序列MVPQALLFVPLLVFPLCFG(SEQ ID NO:3)或与所述SEQ ID NO:3具有至少68％、至少73％、至少89％或至少94％同一性的变体组成，所述变体保留有将多肽靶向内质网并且任选通过分泌途径进行的能力；在两个序列中最短的，即SEQ ID NO:3和所述信号肽变体中最短的中计算同一性百分比。与SEQ ID NO:3具有至少68％、至少73％,、至少89％或至少94％同一性的变体定义为具有一个或多个添加和/或一个或多个缺失和/或一个或多个取代的变体。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO:3具有至少89％或至少94％同一性的变体分别通过在SEQ IDNO:3中进行1或2个取代获得，优选通过文献中定义的保守取代，或根据上述列表获得。
无论本文所定义的信号肽的序列如何，所述信号肽(当存在时)为本发明多肽的最N端元件。
通过“直接连接”，其指结构域的最末C端残基由结合至下一个结构域的第一个N端残基的肽连接。
相反，通过“间接连接”，其指结构域的最末C端残基由结合至肽接头的第一个N端残基的肽连接，所述接头的最末C端残基与下一个结构域的第一个N端残基连接。在具体的实施方案中，并且无论MAST-2结合域上游的胞质域的序列、MAST-2结合域的序列、信号肽的序列和锚定结构域的序列如何，本发明多肽在信号肽和锚定结构域(两者均如本文所定义)间任选地包含肽接头，其由1-4个氨基酸，优选狂犬病毒G蛋白胞外结构域C末端的1-4个氨基酸，优选狂犬病毒G蛋白胞外结构域的最后2个C端残基，例如氨基酸残基GK组成。
因此，本发明具体的多肽从N末端至C末端包含或由以下结构组成：
(1)如SEQ ID NO:3中定义的信号肽，或与所述SEQ ID NO:3具有至少68％同一性的变体，所述变体保留有将多肽靶向内质网中并且任选通过分泌途径进行的能力；
(2)任选地，狂犬病毒G蛋白胞外结构域的最后2个C端残基，优选氨基酸残基GK；
(3)如SEQ ID NO:4中定义的锚定结构域，或与所述SEQ ID NO:4具有至少81％同一性的变体，所述变体保留有将多肽锚定在细胞内质网膜和/或高尔基体膜中的能力；和
(4)包含或由以下组成的胞质域：(a)如SEQ ID NO:2中定义的肽，或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的变体，和(b)如SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:209中定义的MAST-2结合域，优选选自SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:191，和SEQID NO:192至SEQ ID NO:209，更优选如SEQ ID NO:64-68、71、74和208-209中所定义的。在具体的实施方案中，如SEQ ID NO:2中所定义的肽或与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的变体位于MAST-2结合域上游(即，其N端)，优选与其直接连接。
本发明多肽的大小为至多350个、至多250个、至多200个或至多150个氨基酸残基。在优选的实施方案中，本发明多肽的大小为至多100个氨基酸残基，并且优选为85-87个氨基酸残基，并且更优选为85、86或87个氨基酸残基。
在本发明的更具体的实施方案中，本发明多肽缺少狂犬病毒G蛋白的胞外结构域，优选缺少除该胞外结构域C末端的最后2个氨基酸外的结构域。更具体而言，本发明多肽不为来自非细胞凋亡株(神经烈性株，如CVS-NIV病毒株)或细胞凋亡株(减毒株)的狂犬病毒株的野生型全长G蛋白。在另一具体的实施方案中，本发明多肽与狂犬病毒株的野生型全长G蛋白，在两个序列中的最短的(即本发明多肽和狂犬病毒株的野生型全长G蛋白中的最短的)中，具有小于75％的同一性,小于60％的同一性或小于50％的同一性。
在具体的实施方案中，本发明多肽由序列MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:17)组成，其与如SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:209中定义的MAST-2结合域直接相连，其优选选自SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:191，和SEQID NO:192至SEQ ID NO:209，更优选如SEQ ID NO:64-68、71、74和208-209中所定义的。在另一实施方案中，本发明多肽由序列MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:18)组成，其直接与SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:209中定义的MAST-2结合域相连，其优选选自SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102至SEQ ID NO:191，和SEQ ID NO:192至SEQ ID NO:209，更优选如SEQ ID NO:64-68、71、74和208-209中所定义的。
本发明多肽不包含或不由序列SEQ ID NO:9(Neurovita1)中定义的序列组成。
此外，NCBI登录号CAI43218指由以下序列组成的G糖蛋白：
MVPQALLFVPLLGFSLCFGKFPIYTIPDELGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSEFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVRTTKESLIIISPSVTDLDPYDKSLHSRVFPGGKCSGITVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRPRTPCDIFTNSRGKRASKGNKTCGFVDERGLYKSLKGACRLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSDETKWCPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLKVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGHVLIPEMQSSLLQQHMELLKSSVIPLMHPLADPSTVFKEGDEAEDFVEVHLPDVYKQISGVDLGLPNWGKYVLMTAGAMIGLVLIFSLMTWCRRANRPESKQRSFGGTGRNVSVTSQSGKVIPSWESYKSGGQTRL(SEQ ID NO:14)。
因此，在具体的实施方案中，本发明多肽不包含或由MVPQALLFVPLLGFSLCFGGKYVLMTAGAMIGLVLIFSLMTWCRRANRPESKQRSFGGTGRNVSVTSQSGKVIPSWESYKSGGQTRL(SEQ ID NO:15)组成。
在另一具体的实施方案中，本发明多肽的MAST-2结合域不为SWESYKSGGQTRL(SEQID NO:16)。
本发明多肽的具体实例选自以下组(MAST-2结合域为黑体)：
(1)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(Neurovita2)(SEQ ID NO:210)；
(2)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(Neurovita3)(SEQ ID NO:211)；
(3)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:212)；
(4)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:213)；
(5)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:214)；
(6)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:215)；
(7)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:216)；
(8)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:217)；和
(9)MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:218)。
本文定义的术语“多肽”包括修饰的多肽，其通过转录后修饰和/或合成化学，例如，通过添加非蛋白的化学基团和/或通过修改多肽的三级结构修饰，例如，通过乙酰化、酰化、羟基化、环化、外消旋化、磷酸化等，如上所述，只要生成的修饰多肽保留有针对人MAST2蛋白PDA结构域的高亲和力。
本发明还涉及主要的MAST-2结合域，其由上述组A-E中定义的11-13个氨基酸残基组成。
本发明还涉及多肽，其从N端至C端包含或由以下结构组成：
(1)任选地，信号肽，优选如SEQ ID NO:3中定义的信号肽，或与所述SEQ ID NO:3具有至少68％同一性的变体，所述变体保留有将多肽靶向内质网并且任选通过分泌途径进行的能力；
(2)任选地，狂犬病毒G蛋白胞外结构域的最后2个C端残基；
(3)锚定结构域，优选如SEQ ID NO:4中定义的锚定结构域，或与所述SEQ ID NO:4具有至少81％同一性的变体，其保留有将多肽锚定在细胞内质网膜和/或高尔基体膜中的能力；和
(4)胞质域，其包含或由以下组成：(a)MAST-2结合域上游的胞质部分，优选如SEQID NO:2中定义的肽，或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的变体，和(b)如以上组A-E中定义的MAST-2结合域。在具体的实施方案中，所述MAST-2结合域如SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:209中所定义，优选选自SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:191，和SEQ ID NO:192至SEQ ID NO:209，更优选如SEQ ID NO:64-68、71、74和208-209中所定义的。
因此，作为具体的实施方案，本发明涉及至多350个氨基酸的多肽，其从N端至C端包含用于将所述多肽锚定在网状膜和/或高尔基体膜中的结构域(即，锚定结构域)，以及当多肽被锚定在膜中时暴露于胞质中的结构域(即，胞质域)，其中所述胞质域末端为MAST-2结合域，如以上组A-E中所定义，其大小为11-13个氨基酸残基。该多肽对应于以上定义的但失去了其信号肽的多肽，一旦以上定义的多肽锚定在膜中后该信号肽即被切割。因此，本发明还涉及从N端至C端包含或由以下结构组成的多肽：
(1)任选地，狂犬病毒G蛋白胞外结构域的最后2个C端残基；
(2)锚定结构域，优选如SEQ ID NO:4中所定义的锚定结构域，或与所述SEQ IDNO:4具有至少81％同一性的变体，其保留有将多肽锚定在细胞内质网膜和/或高尔基体膜中的能力；和
(3)胞质域，其包含或由以下组成：(a)MAST-2结合域上游的胞质部分，优选如SEQID NO:2中定义的肽或与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的变体，和(b)如以上组A-E中定义的MAST-2结合域。在具体的实施方案中，所述MAST-2结合域如SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:209中所定义，优选选自SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:191，和SEQ ID NO:192至SEQ ID NO:209，更优选如SEQ ID NO:64-68、71、74和208-209中所定义的。
作为具体的实施方案，该多肽由以下序列组成：
-SEQ ID NO:17或18的残基20-74，且直接与以上组A-E中定义的MAST-2结合域相连，如SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:209中定义的那些，优选选自EQ ID NO:19至SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:191，和SEQ ID NO:192至SEQ ID NO:209，更优选如SEQID NO:64-68、71、74和208-209中所定义的；或
-序列SEQ ID NO:210-216中一个的残基20-85，或SEQ ID NO:217或218的残基20-87。
本发明还涉及编码如本文定义的本发明多肽的任何多核苷酸(或核酸)，其与通用的遗传密码一致，适当考虑其简并性。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸为DNA、RNA，其为正链或负链(例如发现于病毒粒子中时)或cDNA(例如表达于病毒粒子转染的细胞中时)。本发明多核苷酸的大小为至多1050个、至多750个、至多600个或至多450个碱基对(bp)。在优选的实施方案中，本发明多核苷酸的大小为至多300bp，且优选为255-261bp，且更优选为255、258或261bp。
这些编码本文描述的本发明多肽的不同结构域的多核苷酸的实例：
-例如，信号肽由位于以下SEQ ID NO:219的核苷酸1-57间的多核苷酸编码；
-例如，胞外结构域的最后2个氨基酸残基由位于以下SEQ ID NO:219的核苷酸58-63间的多核苷酸编码；
-例如，跨膜结构域由位于以下SEQ ID NO:219的核苷酸64-129间的多核苷酸编码；和
-例如，MAST-2结合域上游的胞质部分由位于以下SEQ ID NO:219的核苷酸130-222间的多核苷酸编码。
根据MAST-2结合域的大小，编码MAST-2结合域的多核苷酸位于选自SEQ ID NO:219-225的SEQ ID的核苷酸223-255，或SEQ ID NO:226或227的核苷酸223-261间。
在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸在其N端部分包含编码信号肽的多核苷酸。
具体的多核苷酸由以下序列组成：
(1)编码Neurovita2(如SEQ ID NO:210中所定义)的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACGGGGGTCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:219)；
(2)编码Neurovita3(如SEQ ID NO:211中所定义)的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACGGGCAGCAGACCAGACTGTGA(Neurovita3)(SEQ ID NO:220)；
(3)编码SEQ ID NO:212中定义的多肽的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTAGCCACGCAGCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:221)；
(4)编码SEQ ID NO:213中定义的多肽的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTATACACGGGGCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:222)；
(5)编码SEQ ID NO:214中定义的多肽的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACACGGGGCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:223)；
(6)编码SEQ ID NO:215中定义的多肽的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACACGCAGCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:224)；
(7)编码SEQ ID NO:216中定义的多肽的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTAGCCGGGGGGCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:225)；
(8)编码SEQ ID NO:217中定义的多肽的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGCCGAAGCCCAGCACACGCAGCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:226)；
(9)编码SEQ ID NO:218中定义的多肽的多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAAGTACACGCCTCTGGGGGGCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:227)。
编码本发明多肽的多核苷酸不包含或由SEQ ID NO:8(Neurovita1)中定义的序列组成。
本发明还涉及核酸载体(如质粒)，其包含如本文定义的多核苷酸，即编码本发明多肽的多核苷酸。在具体的实施方案中，载体为表达载体，即除明确提及的元件外，还包含驱动本发明多核苷酸表达所必需的所有元件(表达控制元件)，并且特别是转录调控元件的的载体。“转录调控元件”确定了调控多核苷酸转录所涉及的任何DNA区域，并且包括启动子如CMV或EF1α、增强子或顺式作用调控元件。这些元件，并且特别是启动子，基于待采用核酸载体转染的细胞的性质进行选择。根据所寻求的表达水平或转染细胞确定合适的启动子，属于本领域技术人员知识的一部分。应当注意，当核酸载体含有数个多核苷酸(其中一个为本发明的多核苷酸)时，转录调控元件可能是对所有多核苷酸具有独特性的，或由其中的一些共用，或者相反，每个多核苷酸可能与一个或多个特定的转录调控元件关联。在后一种情形下，所述数个转录调控元件可以为相似的或不同的。
在本发明中，插入本发明核酸载体的表达控制元件优选适于本发明多核苷酸在神经元细胞，特别是人神经元细胞如人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中的表达。这些启动子包括但不限于以下启动子：神经元特异性烯醇化酶(NSE)、突触素-1(SYN)、血小板源性生长因子(PDGF)、酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺β-羟化酶(DBH)(Boulaire et al.；(2009)。
本发明还涉及表达慢病毒来源的载体，特别是质粒，除本发明多核苷酸(即，编码本发明多肽的多核苷酸)外，其还包含所述多核苷酸(表达控制元件)的转录和表达的调控信号、顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)(两者均为慢病毒来源的)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号。当用于反式互补系统(载体/包装系统)时，该载体为转移载体(参见下文)。
在具体的实施方案中，可从慢病毒或逆转录病毒的基因组制备慢病毒来源的表达载体，并且除本发明的多核苷酸或核酸构建物外，其仅包含慢病毒或逆转录病毒基因组序列，所述序列为所述基因组的非编码区，为提供用于DNA或RNA合成和加工的识别信号所必需。因此，慢病毒来源的表达载体可为取代载体，其中位于慢病毒或逆转录病毒基因组的2个长末端重复(LTR)间的所有的病毒编码序列，被用本发明的多核苷酸、所述多核苷酸转录和表达的调控信号(表达控制元件)、顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)(两者均为慢病毒来源的)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号替换。在具体的实施方案中，慢病毒来源的表达载体获自HIV基因组，特别是HIV-1基因组，其中位于2个长末端重复(LTRs)间的所有的病毒编码序列，被用本发明的多核苷酸、所述多核苷酸的转录和表达的调控信号(表达控制元件)、顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)(两者均为慢病毒来源的)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号替换，以给出HIV来源的表达载体，特别是HIV-1来源的表达载体。
本发明还涉及在反式互补系统中形成粒子后的慢病毒载体基因组，即，慢病毒载体粒子中包含的遗传物质，以及慢病毒来源的表达载体与慢病毒载体粒子中包含的遗传物质间的任何核酸中间物，所述慢病毒基因组或核酸中间物包含本发明的多核苷酸、所述多核苷酸的转录和表达的调控信号(表达控制元件)、顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)(两者均为慢病毒来源的)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号。
因此，本发明还包括任何合适的核酸，即DNA或RNA，基于粒子的周期阶段，其为双链或单链的，包括含有DNA瓣片(flap)作为三联体序列形式的DNA或RNA，包括慢病毒来源的、用于与包装质粒和包膜质粒共转染宿主细胞以表达粒子的表达性核酸，或者粒子形成时的RNA基因组，或者包括宿主(其被投送了粒子)的转导细胞中该基因组的各种形式的核酸，包括载体整合前复合物。
因此，本发明的慢病毒来源的表达载体、慢病毒载体基因组或任何核酸中间物包含非慢病毒区的转录和表达的调控信号，如启动子和/或增强子，优选如上所述的适于在神经元细胞，特别是人神经元细胞中表达本发明多核苷酸的启动子。启动子的实例为CMV，也称为CMVie(立早CMV(CMV immediate early))、EF1α启动子、PGK…。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸置于转录和表达的调控信号的控制下。
本发明的慢病毒来源的表达载体、慢病毒载体基因组或任何核酸中间物还包含顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)(两者均为慢病毒来源的)。这两个区域也称为DNA瓣片或DNA三联体。适于本发明的DNA瓣片可获自慢病毒或逆转录病毒样生物体如逆转座子，或可合成(化学合成)制备，或通过扩增来自任何慢病毒基因组的DNA瓣片，如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。DNA瓣片可获自慢病毒，且特别是HIV逆转录病毒，或获自CAEV病毒(山羊关节炎脑炎病毒)、EIAV病毒(马传染性贫血病毒)、VISNA病毒、SIV病毒(猿猴免疫缺陷病毒)或FIV病毒(猫免疫缺陷病毒)。在更优选的实施方案中，DNA瓣片获自HIV逆转录病毒，例如HIV-1或HIV-2病毒，包括这两种类型的任何分离物。优选的DNA瓣片包含或由SEQ ID NO:228-234中定义的序列组成。应当注意，DNA瓣片被用作分离自其天然(慢病毒基因组)核苷酸环境的DNA片段，即，从pol基因天然包含于慢病毒基因组中的环境中分离的片段。因此，在本发明中，所用的DNA瓣片缺失了pol基因非必需的5’和3’部分，且与不同区域的序列重组。
根据具体的实施方案，DNA瓣片具有约90至约140个核苷酸的核苷酸序列。在HIV-1中，DNA瓣片为稳定的99个核苷酸长的正链重叠。当用于本发明的慢病毒载体的基因组载体时，其可作为较长的序列插入，尤其是当其制备为PCR片段时。具体的包含提供DNA瓣片的结构的合适的多核苷酸为178个碱基对聚合酶链式反应(PCR)片段，其包含HIV-1DNA的cPPT和CTS区。
在具体的实施方案中，为了在逆转录期间采用三联体构造，以功能方向将cPTT和CTS区插入至载体或慢病毒基因组中。
在具体的实施方案中，将DNA瓣片插入至本发明多核苷酸的直接上游或控制本发明多核苷酸表达的启动子的直接上游，以使其有利地在载体基因组中具有中心位置或近乎中心位置。
本发明的慢病毒来源的表达载体、慢病毒载体基因组或任何核酸中间物还包含逆转录病毒来源的、用于逆转录、表达和包装的调控信号。此类元件的实例为至少一个(优选2个)长末端重复(LTR)，如LTR5’和LTR3’以及慢病毒基因组包装中涉及的psi序列。在本发明的具体的实施方案中，U3区的启动子和增强子缺失了LTR，优选LTR3’；以表明该修饰能大幅增加插入慢病毒基因组中的转基因的转录(WO01/27304)。
本发明的慢病毒来源的表达载体、慢病毒载体基因组或任何核酸中间物还可任选地包含至少一种下述元件：
-元件，选自剪接供体位点(SD)、剪接受体位点(SA)和/或Rev-效应元件(RRE)；和/或
-数个独特的用于克隆本发明多核苷酸的限制位点；和/或
-复制起始的DNA序列——复制起点(ori)，其序列取决于应当表达慢病毒基因组的细胞的性质。所述ori可为哺乳动物来源的，最优选为人来源的，优选适于在人神经元细胞中进行的复制。当慢病毒基因组未整合至细胞宿主基因组中时，本发明的有利的实施方案是具有插入至本发明的慢病毒基因组或慢病毒来源的表达载体中的ori；因此，ori的存在确保了至少一个慢病毒基因组存在于每个细胞中，即使是在细胞分裂后；和/或
-至少一个支架结合区(SAR)和/或基质结合区(MAR)。确实，这些富含AT的序列允许慢病毒基因组被锚定在细胞染色体基质上，从而调控本发明多核苷酸的转录。
在本发明具体的实施方案中，独立地或与整个说明书中论述的实施方案组合，慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组缺少功能性gag、pol和/或env慢病毒基因。通过“功能性”，其指基因被正确转录和/或正确表达。因此，该实施方案中的本发明的慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组含有gag、pol和env基因中的至少一种，优选所有，其未被转录或被不完全转录；表达“不完全转录”指转录物gag、gag-pro或gag-pro-pol的改变，这些中的一个或这些中的数个未被转录。在具体的实施方案中，慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组缺少gag、pol和/或env慢病毒基因。在具体的实施方案中，慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组还缺少Vif-、Vpr-、Vpu-和Nef-附属基因(针对HIV-1慢病毒载体)的编码序列，或缺少其完整的或功能性的基因。
本发明的慢病毒载体为非复制性的，即，慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组不能形成新的从感染的宿主细胞出芽的粒子。这可通过在慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组中缺失gag、pol或env基因获得，如上段中所述；这还可通过缺失粒子形成所需的其他的病毒编码序列和/或顺式作用遗传元件获得。不形成粒子应当区别于慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组的复制。确实，如上所述，慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组可含有确保复制慢病毒来源的表达载体或慢病毒载体基因组，而不确保形成粒子的复制起点。
本发明还涉及慢病毒载体假型粒子，其包含GAG结构蛋白和病毒核心，所述病毒核心由以下组成：(a)POL蛋白和(b)慢病毒载体基因组，其包含本发明的多核苷酸、所述多核苷酸的表达控制元件、顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)(两者均为慢病毒来源的)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号，其中所述粒子为用VSV病毒的G蛋白或狂犬病毒的G蛋白假型化的粒子。
表述“慢病毒载体假型粒子”包括这样的慢病毒粒子，其包含蛋白和遗传物质，优选包装在这些蛋白中的遗传物质。粒子由病毒包膜蛋白(由env基因编码)以及结构蛋白(由gag基因编码)组成。在粒子内部，病毒核心(或衣壳)由3种酶(由pol基因编码)即逆转录酶、整合酶和蛋白酶以及遗传物质(慢病毒基因组)组成。慢病毒基因组中包含的所述多核苷酸的表达控制元件、顺式作用中心起始区(cPPT)和顺式作用终止区(CTS)(两者均为慢病毒来源的)以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号的特征，如以上关于慢病毒来源的表达载体所定义。确实，慢病毒粒子中包含的慢病毒基因组为慢病毒来源的表达载体中包含的核酸的转录物。
本发明的慢病毒载体的包膜蛋白可为以用于制备慢病毒载体的慢病毒蛋白假型化的蛋白，或可选地具有关于待靶向宿主中的细胞选择的异源包膜蛋白。
在具体的实施方案中，所述慢病毒粒子为用VSV-G蛋白假型化的粒子。VSV-G蛋白起源于血清型Indiana、New Jersey、Piry、Chandipura、Isfahan、Cocal或这些血清型中的至少2种的组合。在具体的实施方案中，起源于VSV的VSV-G蛋白相对于其天然形式进行了修饰，尤其是为了改善假型。
在另一实施方案中，所述慢病毒粒子为用狂犬病毒G蛋白假型化的粒子。在具体的实施方案中，G蛋白起源于减毒株如ERA-NIV(ERA)病毒株。在具体的实施方案中，G蛋白起源于烈性株如CVS-NIV(CVS)病毒株、CVS-Gif-sur-Yvette病毒株(Préhaud et al.1988)、CVS-11病毒株、N2C病毒株或CVS-24病毒株。在具体的实施方案中，G蛋白起源于CVS24B2c病毒株(Morimoto et al.1998；Mentis et al.2006)。用狂犬病毒的G蛋白假型化的、在其慢病毒基因组中包含编码本发明多肽的多核苷酸的慢病毒粒子，为本发明的优选的产品。
狂犬病毒(RABV)的原始ERA和CVS病毒株可从ATCC获得，其保存号分别为vr332和vr959(Prehaud C et al,,2003,和WO2010/116258)。
CVS-NIV病毒株的G蛋白的序列可从登录号AF406694获得，且被定义在SEQ ID NO:12中。CVS-NIV病毒株的G蛋白可从重组大肠杆菌(E.coli)菌株获得，其根据布达佩斯条约的条款以登录号I-2758于2001年11月30日保存于CNCM(巴斯德研究所,25rue du DocteurRoux,75724PARIS Cedex15–法国)。该重组大肠杆菌包含质粒(质粒pRev-TRE-G-CVS；WO03/048198)，其可诱导地表达CVS-NIV病毒株的G蛋白。
ERA-NIV病毒株的G蛋白的序列可从登录号AF406693获得，且被定义在SEQ ID NO:13中。ERA株的G蛋白可从重组大肠杆菌菌株获得，其根据布达佩斯条约的条款以登录号I-2760于2001年11月30日保存在CNCM。该重组大肠杆菌包含质粒(质粒pRev-TRE-G-ERA；WO03/048198)，其可诱导地表达ERA病毒株的G蛋白。
培养含有质粒CNCM I-2758或质粒CNCM I-2760的重组大肠杆菌菌株的合适的条件，包括于37℃在标准的LB-TYM生长培养基上(在氨苄青霉素存在下)孵育所述重组大肠杆菌菌株。
CVS24B2c病毒株的G蛋白的核苷酸和蛋白序列分别如SEQ ID NO:287和SEQ IDNO:288中所述。
在具体的实施方案中，慢病毒载体假型粒子中包含的整合酶蛋白为缺陷型的。整合酶蛋白为pol基因编码的蛋白中的一种。通过“缺陷型的”，其指慢病毒来源的整合酶缺乏将慢病毒基因组整合至宿主细胞基因组中的能力，即，突变的特异性改变了其整合酶活性的整合酶蛋白。因此，蛋白的整合酶能力发生了改变，而GAG、PRO和POL蛋白的正确表达和/或衣壳的形成及因此的载体粒子的形成，以及病毒周期的整合步骤之前或之后的其他步骤如逆转录、细胞核输入保持完整。当相比包含相应的野生型整合酶的慢病毒载体，其应当允许的整合以整合步骤发生了小于1/1000，优选小于1/10000的方式发生改变时，整合酶为所述缺陷型的。
在本发明的具体的实施方案中，缺陷型整合酶的性质产生于1类突变，优选氨基酸取代(1个氨基酸取代)或短的缺失，产生了满足上段的要求的蛋白。突变在pol基因中实现。改变HIV-1并允许得到用于整合的非功能性整合酶(不能整合的整合酶)的突变的实例为以下：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D116I、D116A、N120G、N120I、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199C、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。另一建议的取代为用氨基酸残基AAH取代氨基酸残基RRK(位置262-264)。在具体的实施方案中，优选以下取代：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116I、D116A、N120G、N120I、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199C、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。其他突变公开于Wanisch和(2009)中。特别合适的突变为D64V突变。
无论慢病毒载体基因组中包含的元件、粒子的包膜蛋白的性质和整合酶蛋白的缺陷型特征或非缺陷性特征如何，慢病毒载体假型粒子优选通过反式互补系统(载体/包装系统)获得。因此，受纳细胞(如293T细胞)在体外转染了转移载体，所述载体为如本文定义的慢病毒来源的表达载体，且具有至少一种其他的质粒，其提供编码多肽GAG、POL和包膜蛋白或足以允许形成慢病毒粒子的这些多肽的一部分的反式的gag、pol和env序列。转移载体产生作为转录物的慢病毒基因组，而gag、pol和env分别提供病毒核心的GAG结构蛋白、POL蛋白(优选具有缺陷型整合酶)和假型ENV蛋白(优选来自VSV的G蛋白或来自狂犬病毒的G蛋白)。
例如，受纳细胞被转染了作为本发明的慢病毒来源的表达载体(转移载体)的第一质粒、包含编码包膜蛋白(如VSV-G或狂犬病毒的蛋白G)的基因的第二质粒(包膜表达质粒或假型env质粒)，以及表达GAG和POL蛋白的第三质粒(包装质粒或包装构建物)。
本发明还涉及以本发明载体转染或通过本发明的慢病毒粒子转导的细胞(优选分离的)或细胞培养物。因此，本发明的细胞或细胞培养物包含或表达至少一种本发明的多肽，和/或包含至少一种本发明的多核苷酸，和/或至少一种本发明的载体。
所述细胞可以为真核细胞[或由真核细胞产生的细胞培养物]，优选为哺乳动物细胞，例如人细胞或非人细胞，最优选人细胞。优选地，所述细胞不为人胚胎细胞或人生殖细胞。
在具体的实施方案中，所述细胞为神经元细胞，优选为人神经元细胞。在具体的实施方案中，所述细胞为人有丝分裂前的神经元、未成熟的人神经元，如神经母细胞瘤细胞、Ntera2D1(ATCC CRL-1973)、SK-N-SH(ATCC HTB11)、SH-SY-5Y(ATCC CRL-2266)、U373MG(人星形细胞瘤细胞系；Babault N et al,2011)(Prehaud C.et al,2010,2005和2003；LafonM.et al,2008和2006；Megret F.et al.2007)。
这些为可根据本说明书进行转染或转导的具体的细胞或细胞培养物：
-SH-SY5Y细胞培养物——一种人神经母细胞瘤细胞系，其可从美国典型培养物保藏中心(ATCC；10801University Blvd.；Manassas,Virginia20110-2209；U.S.A.)以保藏号CRL-2266获得。这些细胞为人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH(ATCC,HTB11)的亚克隆，当对其以能透过db-cAMP的细胞处理时，可进行分化。这些分化的细胞已显示出高度可塑性、生长和收缩(retraction)(Loh SHY et al.2008)；
-纯的有丝分裂后的人神经元(NT2-N)，其获自如本领域所述，例如Préhaud etal.2005中描述的胚胎癌细胞系NTera2cl.-D1(ATCCCRL-1973)。在通过全反式维甲酸(ATRA)诱导分化，随后以有丝分裂抑制剂处理及通过胰蛋白酶消化布置的纯化后，Tera细胞N2D1可分化成人神经元(NT2-N)的有丝分裂后的纯培养物(Andrews PW,1998)。NT2-N细胞具有分化的人神经元的所有特异性标记(Guillemain I.2000)。它们之间可建立体外突触接触，并可在共培养中与星形胶质细胞建立功能性接触，还可建立功能性突触。
-大鼠嗜铬细胞瘤细胞(NS细胞,Cellomics USA)，其为PC12细胞的亚克隆，与NGF不同。这些分化的细胞展现强的有组织的神经突网络，并已确定用于高通量筛选。NS细胞延伸神经突，成为电兴奋细胞，变得对外部施加的乙酰胆碱更具响应性，具有增加数目的钙通道，并增加数种神经递质的合成。NGF存在下NS细胞的生长类似于交感神经神经元，且为去甲肾上腺素能神经元的一种模式。
-SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞系(ATCC HTB11)，其为肾上腺素能的未成熟神经元的原型(Von Reitzentstein,2001)。这些细胞可通过以ATRA处理进一步分化(Gaitonde etal.2001；Wainwright et al.2001)。
可选地，所述细胞可为原核细胞[或由原核细胞产生的细胞培养物]，优选为细菌，例如大肠杆菌。
在具体的实施方案中，细胞包含整合在其基因组中的本发明的多核苷酸(表达本发明的多肽)，特别是当细胞或细胞培养物在先前已通过本发明的慢病毒粒子转导时。可选地，由于缺陷型的整合酶，本发明的多核苷酸未整合在细胞的基因组中，即使当其先前以通过本发明的慢病毒粒子转导时。在后一种情形中，本发明的多核苷酸有利地包含有复制起点。
本发明还涉及组合物，其包含本发明多肽、本发明多核苷酸、本发明载体、本发明的慢病毒来源的表达载体、本发明的慢病毒载体假型粒子或本发明细胞，以及任选地药学可接受的媒介物、赋形剂或载体。组合物包含本发明的多肽、多核苷酸、载体、慢病毒来源的表达载体、慢病毒载体假型粒子或细胞作为有效成分，所述组合物适于给予至宿主，优选人宿主。
优选的组合物包含用本发明的狂犬病毒G蛋白假型化的慢病毒载体粒子。确实，用本发明的狂犬病毒G蛋白假型化的慢病毒载体粒子组合了至少两种有利的特征：
(1)通过如上文定义的胞质域的MAST-2结合域的特征，本发明多肽具有针对人MAST2蛋白PDA结构域的高亲和力。因此，相比现有技术多肽，本发明多肽的使用改善了观察到的对神经突增生的诱导和/或刺激和/或神经生存的效应；和
(2)用狂犬病毒G蛋白假型化的粒子允许通过从肌肉(组合物的注射位点)逆运输，特异性靶型神经元细胞，并因此能防止其他细胞类型的不必要的转导。
“药学可接受的载体”是指任何常规形式的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封物质或助剂。“药学可接受的载体”在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并与制剂的其他成分兼容；合适的载体包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、蒸馏水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的湿润剂无菌溶液等、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合物。此类载体允许药物组合物被配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆体、悬浮剂等。用于肠胃外给药的载体包括葡萄糖水溶液、甘露醇、甘露糖、山梨醇、盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、香油、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物等。
“药学可接受的赋形剂”是指用作载体或用于生产本发明多肽的可给药形式的物质。合适的赋形剂包括填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂如玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，可加入崩解剂如交联的聚乙烯吡咯烷酮、糖或藻酸或其盐如海藻酸钠。因此，对于本发明多肽的经口应用，可以采用固体赋形剂，如有需要，在加入合适的助剂后，任选研磨生成的混合物，并加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。用于包覆糖衣丸或片剂的赋形剂的实例为浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加至片剂或糖衣丸包衣中，用于鉴定或定征活性化合物剂量的不同组合。
本发明还涉及用作药物或药品的本发明多肽、本发明多核苷酸、本发明载体、本发明的慢病毒来源的表达载体、本发明的慢病毒载体假型粒子、本发明细胞或本发明组合物(下文中公开为本发明产品)。
关于用作药物，以及以下详细描述的应用和治疗，用本发明的狂犬病毒G蛋白假型化的慢病毒载体粒子或包含用本发明的狂犬病毒G蛋白假型化的慢病毒载体粒子的组合物是优选的。
因此，本发明的产品用于诱导和/或刺激神经突增生，更具体而言用于治疗和/或减轻和/或预防有关神经突生成不足或受损，更具体而言神经突增生不足或受损的疾病、病患或病症。
根据本发明，本发明产品预期用作神经突增生(和/或轴突和/或树突发育)，例如从神经元前体细胞或新生神经元起始的神经元分化，和/或受损神经元的神经元再生(两种效应均通过刺激神经突增生获得)的效应物。在具体的实施方案中，本发明产品被用于诱导和/或刺激神经突生成，更具体而言神经突增生，更具体而言人神经突增生。在另一具体的实施方案中，本发明产品被用于诱导和/或刺激神经突生成，更具体而言从有丝分裂前的神经元、新生神经元、神经元前体细胞以及受损的神经元起始的神经突增生。
本发明产品用作神经再生剂(新的功能性神经元、神经胶质、轴突、髓磷脂和/或突触的生成)和/或神经保护剂(保护神经元免于细胞凋亡或退行)。
本发明产品被用于刺激和/或诱导神经突发芽和/或轴突生长和/或树突树(dendritic tree)延伸。
本发明产品被用于刺激和/或诱导突触产生和/或神经传递。确实，本发明多肽刺激生长锥的活性。此外，其防止生长锥在与生长崩解剂如LPA或氧化压力接触后发生崩解。
本发明产品被用于刺激神经元发育和/或神经元再生和/或轴突生长和/或树突发育和/或树突树延伸和/或神经元可塑性和/或树突发生和/或神经传递。
本发明产品被用于预防和/或抑制和/或阻止引起神经突萎缩和/或生长锥崩解任何类型的神经中毒。
本发明产品被用于在所述神经突和/或锥与神经毒性剂接触后刺激和/或诱导神经突增生和/或生长锥活性。
本发明产品被用于预防和/或抑制和/或阻止生长锥崩解和/或神经突萎缩和/或轴树突触受损或损伤和/或突出完整性破坏和/或神经元连接丧失和/或神经末梢损伤和/或神经传递损伤。
本发明产品被用于诱导和/或刺激神经突增生，其在以下应用中尤其有用：
-在诱导神经元分化中，例如在治疗和/或减轻和/或预防神经系统瘤中，以及
-在再生受损的神经元中，更具体而言受损的神经突中，例如
-在治疗和/或减轻和/或预防神经退行性疾病、病患或病症中、在治疗和/或减轻和/或预防神经元的微生物感染中，或在保护神经元免于神经毒性剂或氧化压力。
因此，本发明涉及本发明产品，其被用于治疗和/或减轻和/或预防有关神经突生成不足或受损，更具体而言神经突增生不足或受损或树突树形成不足的任何疾病、病患或病症。
所述疾病、病患或病症可选地或补充性地定义为有关神经元细胞周期失衡的任何疾病、病患或病症，其中所述神经元细胞周期通过以下失衡：
-有丝分裂前神经元的过量或非需要的存在(更具体而言，神经元分化不足和/或有丝分裂后神经元的过量或非需要地重新进入神经元细胞周期，其为神经系统中发展出瘤时的情形)，或
-过量的或非需要的神经元再生，更具体而言过量的或非需要的神经突再生(其为神经退行性疾病、病患或病症以及神经元的某些微生物感染的情形)。
本发明产品被用于治疗和/或减轻和/或预防改变了中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的疾病、病患或病症，例如作为神经恢复性治疗和/或预防和/或减轻。本文中的表述“中枢神经系统”或“CNS”预期意指脑和(在脊椎动物情形下)脊髓。周围神经系统(PNS)为连接身体与脑和脊髓的巨大的脊椎神经和颅神经网络。PNS可细分为自主神经系统(交感NS和副交感NS)和躯体神经系统。PNS由从刺激受体至CNS运行的感应神经元，和从CNS至肌肉和腺体运行的运动神经元组成。
根据本发明的实施方案，所述疾病、病患或病症为或包括神经系统的微生物感染，如细菌和/或病毒感染，更特别是病毒感染。优选地，所述微生物感染为诱导神经元细胞凋亡的微生物感染如脊髓灰质炎(Blondel et al.,2005)。病毒感染的一个实例为小儿麻痹症病毒感染或西尼罗河病毒感染。
根据本发明的另一实施方案，所述疾病、病患或病症为或包括非病毒性疾病、病患或病症，更优选非细菌性或非病毒性疾病、病患或病症，更优选非微生物性疾病、病患或病症。
根据本发明的实施方案，所述疾病或病患为或包括神经退行性疾病或病患(例如，慢性神经退行性疾病或病患)，如非病毒性脑病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、ALS、亨廷顿病、多发性硬化(MS)或罕见遗传性疾病。优选地，所述神经退行性疾病或病患为非病毒性疾病或病患，更优选为非细菌性和非病毒性疾病或病患，更优选非微生物性病患。
根据本发明的实施方案，所述病症为或包括神经退行性病症，如老化。优选地，所述神经退行性病症为非病毒性病症，更优选为非细菌性和非病毒性病症，更优选为非微生物性病症。
根据本发明的实施方案，所述疾病、病患或病症为或包括神经系统的物理或缺血性损伤，如突然发作、中风、创伤、癫痫。优选地，所述物理或缺血性损伤为非病毒性疾病、病患或病症，更优选非细菌性和非病毒性疾病、病患或病症，更优选非微生物性疾病、病患或病症。
根据本发明的一个实施方案，所述疾病、病患或病症涉及化学神经毒性剂和/或氧化压力的存在。优选地，所述疾病、病患或病症为非病毒性疾病、病患或病症，更优选非细菌性和非病毒性疾病、病患或病症，更优选非微生物性疾病、病患或病症。
根据本发明的一个实施方案，所述疾病为肿瘤，更具体而言为包括神经元瘤的肿瘤。本文中的术语“肿瘤”更特别预期作为恶性肿瘤，更特别是癌症，更特别是肿瘤或白血病，甚至更特别为肿瘤。
本发明包括技术人员可发现其适用的任何给药方式。根据如何配制本发明产品，其可通过肠胃外或肠内(例如，经口)给药，优选通过肠胃外给药，更优选通过肠胃外注射。
本发明还涉及本发明多核苷酸、本发明载体、本发明的慢病毒来源的表达载体、本发明的慢病毒载体假型粒子、本发明的细胞或组合物的应用，其用于制造用于治疗和/或减轻和/或预防如上所述的任何疾病、病患或病症药物或药品。
本发明还涉及治疗有需要的个体，更特别是人的方法，包括将至少本发明多核苷酸、本发明载体、本发明的慢病毒来源的表达载体、本发明的慢病毒载体假型粒子、本发明细胞或本发明组合物给予所述个体或人。该治疗方法与其用于治疗和/或减轻和/或预防如上所述的任何疾病、病患或病症。
本发明产品部位免疫原性试剂或佐剂，或者在至少不用作免疫原性试剂或佐剂，且不在允许本发明多肽用作免疫原性试剂或佐剂的条件下使用。本发明产品在给药后不引起可检测的体液免疫反应。
本发明还涉及确定细胞中给定分子的神经生存和/或神经保护活性的方法，包括：
(a)加入待检测分子，使其与细胞或细胞培养物接触；
(b)测量步骤a)的细胞或细胞培养物中由以下5个细胞基因组成或包含以下5个细胞基因的一组基因的表达：ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1；和
(c)基于未与所述分子接触的相同细胞类型细胞中测得的相同基因的表达，将步骤b)中测量的基因中的每个的表达标准化，
其中所述组基因表达的统计学显著的调节揭示所述分子可能具有神经生存和/或神经保护活性。
在具体的实施方案中，步骤b)还包括测量选自以下12个细胞基因的至少一个其他基因的表达：PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK和FOS。在此情形下，每个其他的基因在步骤c)中基于未与所述分子接触的相同细胞类型细胞中测得的相同的其他基因的表达标准化。
因此，在具体的实施方案中，确定细胞中分子的神经生存和/或神经保护活性的方法包括：
(a)加入待检测分子，使其与细胞或细胞培养物接触；
(b)测量步骤a)的细胞或细胞培养物中由5个细胞基因组成或包含5个细胞基因的一组基因以及任选地选自12个细胞基因的至少一个其他基因的表达，所述5个细胞基因为ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1，所述12个细胞基因为PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK和FOS；和
(c)基于未与所述分子接触的相同细胞类型细胞中测得的相同基因的表达，将步骤b)中测量的基因中的每个的表达标准化，
其中所述组基因表达的统计学显著的调节揭示所述分子可能具有神经生存和/或神经保护活性。
ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B、PAFAH1B1、PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK和FOS基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:236至SEQ ID NO:252中所定义。
该方法(或处理)包括在第一步骤中加入待检测分子，使其与细胞或细胞培养物接触。
通过“加入待检测分子，使其与细胞或细胞培养物接触”，其指分子须能与人MAST2蛋白PDA结构域相互作用，并因而须能在该细胞或细胞培养物的胞质中表达，特别是在表达人MAST-2蛋白的细胞或细胞培养物中。因此，第一步骤由在细胞胞质中表达待检测分子组成。
因此，本领域技术人员已知的任何方法均可用于转染或转化细胞，或使得细胞对分子具有可透过性，特别是根据分子的性质。
作为所述胞质中的表达的示例，无论待检测分子的性质如何，该分子可采用脂质体、通过使所述细胞与含有待检测分子的脂质体接触，或通过电穿孔或通过纳米粒子递送被运输至细胞胞质中。
作为具体的实施方案，并且当分子为蛋白或多肽时，表达可产生于编码该蛋白或多肽的核酸、含有编码该蛋白或多肽的核酸序列的质粒或载体转染该细胞。在该实施方案中，方法的第一步在于以编码该蛋白或多肽核酸、含有编码该蛋白或多肽的核酸序列的任何质粒或载体转染所述细胞。在具体的实施方案中，分子为如本文定义的本发明多肽。在该实施方案中，方法的第一步在于以说明书中定义的多核苷酸或载体转染所述细胞。已知的方法包括基于化学的转染，如磷酸钙、阳离子脂质体(DOTMA和DOPE、Lipofectamine和UptiFectin)、阳离子聚合物(DEAE-葡萄糖)、聚乙烯亚胺、Fugene、LT-1、GeneJuice和JetPEI)，和非化学方法，如电穿孔、声孔法(sono-poration)、光转染、基因电转移或刺穿感染(impalefection)。
可选地，还可通过病毒粒子转导细胞或细胞培养物，其在其病毒基因组包含有编码待检测蛋白或多肽的核酸序列。作为具体的实施方案，如本说明书中定义的粒子可用于转导细胞或细胞培养物。
为了确定分子的神经生存和/或神经保护活性，在神经元细胞，特别是表达MAST-2蛋白的细胞，优选人神经元细胞中实施该方法。在具体的实施方案中，所述细胞为人有丝分裂前神经元、未成熟的人神经元如神经母细胞瘤细胞。优选对如上定义的SH-SY5Y细胞、NT2-N细胞、NS细胞或NS-SK-N-SH细胞实施该方法。
第二个步骤包括测量未与待检测分子接触的细胞或细胞培养物中一组基因的表达，所述基因组由以下5个细胞基因组成或包含以下5个细胞基因ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1。该步骤还可包括测量选自12个细胞基因PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK和FOS的至少一个其他基因，具体为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个基因的表达。
通过“测量”，其指检测，具体为测定细胞基因表达产生的一种产物或几种产物，该产物为核酸形式，具体为RNA、mRNA、cDNA、多肽、蛋白或任何其他的形式。在具体的实施方案中，基因表达的测量包括检测一组核苷酸靶标，每个核苷酸靶标对应于该组中包含的基因的表达产物。
表述“核苷酸靶标”指需测量其表达，优选定量测量的核酸分子。通过“测量的表达”，其指测量基因的表达产物，具体而言转录产物。通过“定量”，其指方法用于确定表达产物，具体为转录产物或核苷酸靶标的量或拷贝数的。其必然与定性测量相反，定性测量的目的仅是确定所述表达产物的存在与否。
核苷酸靶标特别为RNA，且最特别为总RNA。在优选的实施方案中，核苷酸靶标为mRNA或转录物。根据用于测量基因表达水平的方法，mRNA可用于获得cDNA或cRNA，其随后被检测并可能被测量。
表达产物或核苷酸靶标优选从细胞培养物制备，特别是在分离或甚至纯化后。当核苷酸靶标为mRNA时，在检测表达步骤前还可进行其他的步骤，包括或由以下组成：将所述mRNA逆转录为cDNA(互补DNA)。任选地，还可体外转录cDNA以提供cRNA。
在制备步骤中，以及在检测表达前，可以同位素(如放射性同位素)或非同位素(如荧光、有色的、发光的、亲和、酶、磁性、热或化学)标记或标签标记表达产物或核苷酸靶标。
应当注意针对检测基因表达进行的步骤不能改变表达产物或核苷酸靶标的定性或定量表达(拷贝数)，或者不能干扰随后的包括检测所述表达产物或核苷酸靶标的定性或定量表达的步骤。
基因表达谱分析步骤包括确定一组基因的表达。此类组定义为一项测试应当检测的一组基因，且尤其是在相同的时间、对相同的细胞培养物进行的那些。
一组基因由5个细胞基因组成或包含5个细胞基因：ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1。该组基因还可包括至少一个其他的基因，其选自12个细胞基因：PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK和FOS。
此外，除了这些基因，步骤b)还可包括测量其他细胞基因的表达，且特别是测量至少一个细胞基因的表达，其选自PI3K/Akt信号通路中涉及的基因或细胞增殖、细胞粘附、细胞分化、生长因子和突出功能中涉及的基因。
在具体的实施方案中，用于步骤b)的基因包括5-17个基因，具体为(1)刚好为5个细胞基因ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1，或(2)至少5个细胞基因ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1，以及1-12个基因，特别是1-10个或1-5个基因，其选自12个细胞基因PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK和FOS。因此，在具体的实施方案中，该组基因由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个基因组成。
在方法的步骤c)中，步骤b)中测量的所述组的每个基因的表达被标准化，即对于每个基因，将步骤b)中测得的表达与在未与待检测分子接触的相同细胞类型细胞，特别是相同细胞培养物或细胞系中测得的相同基因的表达比较。因此，计算了以下比例：
该比例允许确定每个基因的相对表达，即，是否由于与待检测分子接触，每个基因的表达增加或减少。通过“增加”或“减少”，其指相比未与该分子接触的相同细胞类型细胞，与待检测分子接触的细胞中基因的表达统计上更高或统计上更低。当通过学生t检验计算的p值(p)为<0.05时，认为表达具有统计学差异。
执行如本文所述的方法，当本文定义的组中包含的基因的表达被以统计学显著的方式调节时，分子，且特别是本发明多肽被认为具有神经生存表型(即神经保护，和/或神经发生和/或神经再生和/或分枝和/或神经修复)。
例如，当相比未与所述分子接触的细胞(培养物)(阴性对照)中相同基因的表达，各个ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1基因在统计上表达偏低，特别是低至少1.5时，分子，且特别是本发明多肽被认为具有神经生存表型(即神经保护，和/或神经发生和/或神经再生和/或分枝和/或神经修复)；可通过实施以下点A.5(结果在点B.10中)中详细描述的实验计算偏低表达，其中阴性对照为感染mock的细胞培养物。
本发明还涉及适于实施本文所述的方法的试剂盒，其包含
a.多对引物，其对本文中定义的一组基因特别是由以下5个细胞基因组成或包含以下5个细胞基因的一组基因：ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1，以及任选地选自以下12个细胞基因的至少一个其他的基因：PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK和FOS具有特异性；和
b.任选地通过所述引物扩增这些细胞基因的核苷酸靶标所必需的试剂，以及任选地用于检测扩增产物的试剂。
如本文中所定义，引物由正向多核苷酸和反向多核苷酸组成，当引入合适的条件和试剂时，每个引物具有与其核苷酸靶标匹配并扩增的能力，核苷酸序列通过其核苷酸靶标序列中的互补序列进行设计。
本发明试剂盒中存在的引物对为基因特异性的，即，每对引物扩增所述组中的一个且仅一个基因的核苷酸靶标。因此，不存在一对基因特异性的引物以指数或甚至线性方式扩增另一基因核苷酸靶标，和/或样品中包含的其他核酸。以这种方式，所选的引物序列(其引物对为基因特异性的)在找到的另一基因序列中不能被找到、不与找到的该另一基因的序列互补，和/或不能在本申请叙述的扩增条件下与该另一基因的核苷酸靶标的序列杂交。
在具体的实施方案中，可通过同位素(如放射性同位素)或非同位素(如荧光、生物素、荧光素)方法标记正向和/或反向引物。引物标记导致扩增子(扩增产物)的标记，因为引物被整合到最终的产物中。
引物对的设计为本领域熟知，且具体可通过参考Sambrook et al.(MolecularCloning,A laboratory Manual,Third Edition；chapter8and in particularpages8.13to8.16)进行。可使用各种软件来设计引物对，如OligoTM或Primer3。
因此，每个引物对(正向和反向)彼此独立地具有以下特征：
-其大小为10-50bp，优选15-30bp；和
-其具有与基因的核苷酸靶标的序列杂交的能力。
在具体的实施方案中，当引物对被用于对样品进行同时的扩增反应时，不同的引物具有在相同的温度和相同的条件下与其各自的核苷酸靶标杂交的能力。
用于PCR扩增的常规条件为本领域熟知，且具体参见Sambrook et al。PCR扩增的常规条件的实例为dNTP(200mM)、MgCl2(0.5-3mM)和引物(100-200nM)。
在具体的实施方案中，引物的序列与其应当杂交的核苷酸靶标的序列的一条链具有100％的同一性，即，与其应当杂交的核苷酸靶标的序列100％互补。在另一实施方案中，所述同一性或互补性不为100％，但与核苷酸靶标中的其互补序列的相似性至少为80％、至少85％、至少90％或至少95％。在具体的实施方案中，引物序列与核苷酸靶标序列中其配对物相差1、2、3、4或5个变异(缺失、插入和/或取代)，优选相差1、2、3、4或5个核苷酸取代。在具体的实施方案中，所述变异不位于引物3’端的至少5个核苷酸中。
在具体的实施方案中，不为100％相同或互补的引物，保留了与核苷酸靶标序列杂交的能力，类似于与核苷酸靶标序列100％相同或100％互补的引物(在本文所述的杂交条件下)。为了具有特异性，基因特异性引物对的引物中的至少一条(具有至少80％的相似性，如上所述)不能与所述组的另一基因和样品的另一基因的核苷酸靶标中找到的序列杂交。
可用于测量本文列出的细胞基因的表达的引物的实例公开于表2中。
表2
在本申请中，术语“包括(comprising)”与“包括(including)”或“包括(containing)”同义，为开放式的，并且不排除其他的、未叙述的元件、成分或方法步骤，而术语“由…组成”为封闭术语，其排除未明确叙述的任何其他的元件、步骤或成分。
术语“基本上由…组成”为部分开放术语，其不排除其他的、为叙述的元件、步骤或成分，只要这些其他的元件、步骤或成分不实质性地影响本发明的基本和新颖性特性。
因此，术语“包括(comprising)”(或包括“comprise”)包括术语“由…组成”以及术语“基本上由…组成”。因此，术语“包括(comprising)”(或包括“comprise”)在本申请中更具体意指包括术语“由…组成”以及术语“基本上由…组成”。
本文引用的所有参考文献的相关公开中的每个均通过引用明确并入本文。以下实施例通过示例性方式提供，并非通过限制性方式提供。
实施例
A.材料和方法
A.1.等温滴定量热法(ITC)计算
采用VP-ITC VP-ITC200热量计(MicroCal)进行ITC测量。在298K下通过注射多肽(25-45次连续的5-7μL小份，以6分钟间隔)滴定MAST2-PDZ。针对多肽的稀释热，对原始数据进行标准化和校正。采用Origin7.0软件(OriginLab)，对具有一组点的模型进行校正数据的非线性曲线拟合来确定平衡解离常数(KD)。所有样品均在含有50mM Tris-HCl、150mMNaCl，pH7.5的缓冲液中制备。使用初始浓度为30μM的MAST2-PDZ和初始浓度范围为250μM-350μM的肽记录数据。
A.2.细胞培养物
人神经母细胞瘤细胞——SH-SY-5Y和人NT2-N细胞培养物分别描述于PrehaudC.et al(2010)和Prehaud C.et al(2005)，且在上述说明书中有详细描述。按照生产商的说明书(http://www.cellomics.com/content/menu/Neuroscreen-1_Cells/)所描述的在RPMI培养基中培养NS细胞。
A.3.慢病毒制造
从G-[SP-(2aa)-TM-Cyto]WO2010/116258申请中描述的质粒克隆Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS的核苷酸序列。Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS(公开于WO2010/116258中)以及Neurovita2的核苷酸序列通过PCR获得，并通过使用TA克隆试剂盒(K5315-20,Invitrogen,France)克隆至pLenti6.3/V5-中。通过Vitry S.et al(2009)中描述的标准方案，在以编码Neurovita1、Neurovita1ΔPDZ-BS或Neurovita2多肽的载体转染的293T细胞中获得慢病毒。通过使用HIV p24ELISA试剂盒(Perkin Elmer,NEK050)检测HIV粒子量。通过qRT-PCR系统监测重组慢病毒载体对NS、SH-SY-5Y和NT2-N细胞的感染性。
A.4.激酶组谱分析
根据厂商说明书(http://www.pepscan.com/presto/products-services/pepchip/#kinase-profiling)，通过Pepscan presto(Netherlands)基于PepChip激酶检测进行激酶组谱分析。简言之，在收获前对NT2-N细胞感染mock(对照)或感染神经生存rRABVCVS HQ(Prehaud C.et al,2010)45h。rRABVCVS HQ(CVS-NIV病毒株)已于2009年4月1日在保存号I-4140下保存在CNCM。对于每种条件，以一式两份处理10000mm2的NT2-N细胞。在包含抗-蛋白酶的MPER缓冲液(Pierce,Thermofisher,France)中制备细胞溶解产物，并在使用前保持上清液深度冷藏在液氮中。PepChip激酶检测覆盖整个人激酶组(Manning G.Etal,2002)。将数据接受Kolmogorov-Smirnov统计分析，确认前的阈值为p＝0.001。选择了阈值平均比值>1.96SE(高严格性)。点代表Gene Network Central pro(Qiagen,Germany)定义的组织的激酶簇。
A.5.聚焦通路的谱型分析
根据厂商说明书(http://www.sabiosciences.com/RTPCR.php)，通过使用来自QIAGEN(Germany)的以下聚焦通路的谱型分析PCR阵列监测基因表达：人PI3K-AKT信号转导PCR阵列(ref.:PAHS-058)和人神经发生及神经干细胞PCR阵列(ref.:PAHS-404)。简言之，用900ng的p24慢病毒载体感染15.7mm2的NT2-N细胞。通过使用RNEasy纯化试剂盒(QIAGEN,包括DNA酶1处理)分离总RNA，并使其接受cDNA合成(SABioscience,USA)和qPCR(ABIFast7500实时PCR装置)。实验以一式两份实现，并针对每个PCR板检测质量对照。利用QIAGEN网站界面(http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php)分析数据。
根据比较法计算调节倍数。在qPCR数据分析的比较法或ΔΔCt法中，将从两个不同的实验RNA样品获得的Ct值直接标准化为看家基因，然后比较。该方法假定目的基因和看家基因的扩增效率接近100％(意指标准或校准曲线的斜率为-3.32)。首先，计算了每个实验样品的目的基因和看家基因的Ct值间的差异(ΔCt)。然后，计算了实验和对照样品(感染mock的细胞)ΔCt值间的差异(ΔΔCt)。然后，两个样品的目的基因表达间的倍数变化等于2^(-ΔΔCt)。通过方程式2(-ΔΔC(t)计算倍数差异(倍数变化)。对于调节倍数，将小于1(意指该基因被下调)的任何调节倍数(或倍数变化)负逆转，将分数变为整数[例如，对于具有0.31的倍数变化值的基因，给出的倍数调节为-3.2倍，意指该特定基因被下调了3.2倍]。
通过使用Gene Network Central pro(Qiagen,Germany)实现基因聚类。
A.6.神经突增生
在Prehaud C.et al,2010中已广泛地描述了神经突增生检测。以每孔40,000个细胞的密度在24孔板上，将SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞接种(Cell Bind plastic ware,Corning,USA)于非分化培养基[DMEMF12(Invitrogen,U.K.)，含有20％牛胎儿血清+1％Pen:Strep和1％谷氨酰胺]，并在37℃下培养过夜。接种24h后，用分化培养基[Neurobasal培养基(Invitrogen,U.K.)，补充有B27补充物(Invitrogen,U.K.)、1％P/S、1％谷氨酰胺和1mM db-cAMP(dibutyril c-AMP为膜通透性的，Sigma)]替换非分化培养基，并将细胞孵育6h。然后，以30ng的p24慢病毒载体在分化培养基中感染细胞。孵育1h后，以分化培养基将细胞洗涤一次，并于添加分化培养基后，将其在37℃下孵育24h。分化30小时后，用于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的3％多聚甲醛将细胞在室温下(RT)固定20min，然后在室温下以于PBS中的0.1％Triton-X-100处理5mn，并用于PBS中的50％正常山羊血清(NGS)处理1h。神经元特异性抗βIII微管蛋白Ab(Promega,France)和抗-RABV核壳体Ab被分别用于对神经突进程染色，和揭示RABV感染。可选地，还用保护神经突进程的结晶紫对细胞染色。
对NS细胞检测72h，并在时间＝0时(仅处理一次)以200ng/ml的NGF处理。基本上按如上针对SH-SY5Y所述的进行神经突增生(NO)，除了在感染后72h监测NO，和总是将NS细胞培养在其饲喂培养基(Cellomics,USA)中外。
在两种情形下，SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞和NS细胞均使用配有DC300FX照相机的Leica DM5000B UV显微镜(x40或x20物镜)成像，且均使用ImageJ1.38X软件(WayneRasband,NIH,USA,http://rsb.info.nih.gov/ij/)及其插件NeuronJ(Meijering etal.2004；http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/)进行分析。从一式三份实验确定每个神经元的平均神经突长度。
A.7.刮伤检测(轴突再生)
对于刮伤诱导的检测，为了能在胰蛋白酶处理后完全恢复，将以30ngp24慢病毒载体感染的200mm2的NT2-N细胞(n＝8)，接种于涂覆有聚-D-细胞溶解素-层粘连蛋白的cell+(Sarstedt,Germany)12孔塑料器皿中，并培养2天。在刮伤前2h更换培养基。单个伤口以注射针(26GX1/2”,12-4.5)制作。在每个单个细胞上至少制作10个刮伤。损伤后6天用PFA(4％)固定细胞，并用结晶紫溶液染色。使用配有DC300FX照相机的Leica DM5000B显微镜(20倍物镜)对细胞成像，并使用ImageJ1.38X软件(Wayne Rasband,NIH,USA,http://rsb.info.nih.gov/ij/)及其插件NeuronJ进行分析。从8个实验确定再生神经元的平均百分比。
A.8.分枝
根据Sahay A.et al和Lioy DT.et al Nature2011进行了Sholl分析，其为一种测量树状分枝的方式。通过使用ImageJ Sholl分析插件(http://www-biology.ucsd.edu/labs/ghosh/software/)，从8位图像分析了神经突复杂性。图像在用慢病毒载体感染(p.i.)后72h采集。
A.9.MAST2的沉默
使用RNAI联盟(TRC、MIT和Harvard,由Thermoscientific-Abgene出售,RHS4533-NM_015112)开发的一组基于shRNA的特异性慢病毒将MAST2基因表达沉默。按如上所述制备重组慢病毒。用每种慢病毒载体的900ng p24感染15.7mm2的NT2-N细胞。感染后2天使用特异性引物集QT00042574(Qiagen,Germany)，通过qRT-PCR评估沉默效率。然后，将细胞立即用于实验。
A.10.小鼠胎儿皮质神经元中的神经突生成
根据Vitry et al(2009)制备E16swiss小鼠皮质神经元。将104个皮质神经元接种于96孔暗面细胞结合板(#3340,Corning,USA)，并在接种后用10ng p24/孔的慢病毒载体(NV1eGFP或NV1ΔeGFP)感染2小时。感染后12小时更换培养基。感染后3天小心移除培养基，并在室温下用4％PFA将神经元固定20mn。用PBS将板洗涤3次，然后在室温下用0.3％TritonX100将细胞通透化10mn。按照Loh Shy et al.(2008)进行βIII神经元微管蛋白免疫荧光检测。在cellomics(USA)CellInsight读取仪上，通过使用神经元谱型生物应用(neuronalprofiling bioapplication)(n＝10个孔,20个视野/孔,每孔250个神经元)，经高通量筛选监测神经突增生。在GraphPad Prism6(USA)上进行学生t检验。
A.11.使用慢病毒载体NV1eGFP和NV1ΔeGFP进行小鼠实验
按Vitry et al(2003)中所述，将每种慢病毒载体(媒介物为含PBS的1％BSA)的100ng p24或单独的媒介物(1只小鼠)直接注射至10只swiss小鼠(3天大)的组的脑中。在4个月的时段内记录小鼠发育和表型。注射后20天监测体重。注射后4个月，将动物安乐死，并分离脑，用于按Vitry et al(2003)所述进行免疫化学和实时PCR分析。以e-GFP表达监测Neurovita表达。Map2抗原的免疫染色被用于检测树突。GFAP(胶质纤维酸性蛋白)的免疫染色被用于监测胶质化。抗map2抗体来自SIGMA,US(M1406)；抗GFAP抗体来自Dako(Z0334)；抗GFP抗体来自Rockland(600-106-215)。
B.结果
B.1.RABV介导的神经保护期间NT2-N细胞的激酶组谱
在高度严格条件下，以源自用神经生存rRABV CVS HQ感染(45h)的NT2-N细胞的细胞溶解产物孵育PepChip激酶组阵列(覆盖整个人激酶组，即大于518种激酶)，揭示出仅17种激酶被刺激(表3)。所有这些激酶被连接在一起，如图3B中所示。
表3
B.2.以表达Neurovita1的慢病毒载体转导的SH-SY5Y细胞和NS细胞中的神经突增 生
设计了以下构建物：Neurovita1多肽和Neurovita1ΔPDZ-BS多肽(图4A)。其核苷酸和蛋白序列如下：
Neurovita1
-多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAATCACACAAGAGTGGGGGTCAGACCAGACTGTGA(SEQ ID NO:8)。
-多肽：
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL(SEQ ID NO:9)。
Neurovita1ΔPDZ-BS(无PDZ-BS结构域)
-多核苷酸：
ATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGTACCCCTTCTGGTTTTTCCATTGTGTTTTGGGGGGAAGTATGTATTACTGAGTGCAGGGGCCCTGACTGCCTTGATGTTGATAATTTTCCTGATGACATGTTGTAGAAGAGTCAATCGATCAGAACCTACGCAACACAATCTCAGAGGGACAGGGAGGGAGGTGTCAGTCACTCCCCAAAGCGGGAAGATCATATCTTCATGGGAATCACACAAGAGTGGGGGTTGA(SEQ ID NO:10)。
-多肽：
MVPQALLFVPLLVFPLCFGGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGG(SEQ ID NO:11)。
蛋白质印迹实验表明Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS在两种细胞系中均表达(图4B)。此外，图4C证实Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS展现预期的棒状病毒糖蛋白的典型的免疫荧光图谱。
SH-SY5Y细胞中的神经突增生检测表明Neurovita1多肽展现强神经突增生表型，其为PDZ-BS介导的(比较有和无PDZ-BS结构域的多肽，图5A中)。类似地，NS细胞中的神经突增生检测表敏Neurovita1多肽不仅展现PDZ-BS介导的强神经突增生表型，还增加受感染培养物中的神经突网络(图5B)。
B.3.Neurovita1介导的保护的分子标签
以表达Neurovita1的慢病毒载体转染的NT2-N细胞的聚焦通路的基因表达谱(人神经发生和神经干细胞检测及PI3K/Akt信号通路)揭示了如图6A和6B中所示的遗传分子标签。该标签的特征为以下的调节倍数：SHH基因(-1.82)、ROBO1基因(-1.69)、PTN基因(-1.83)、POU4F1基因(-1.50)、PARD6B基因(-1.62)、PAFAH1B1基因(-1.57)、INHBA基因(-1.92)、HEY2基因(-3.49)、HDAC7基因(-1.60)、DRD2基因(-1.64)、S100A6基因(+3.38)、PAX5基因(+1.97)、DRD1基因(+1.59)、BMP2基因(+1.52)和PIK3CG基因(+1.79)。
将该基因表达谱与敲除人MAST2蛋白(沉默了76％的MAST-2)的NT2-N细胞中得到的表达谱进行了比较，而且还用表达Neurovita1的慢病毒载体进行了转染。因此，图7B中确定的基因簇代表在Neurovita1感染中被调节但在敲低MAST2表达的NT2-N细胞中被差异性调节的基因。遗传分子标签的特征为以下的调节倍数：SHH基因(-2.52)、ROBO1基因(+1.00)、PTN(+1.01)、POU4F1基因(+1.21)、PARD6B基因(+1.46)、PAFAH1B1基因(+1.03)、INHBA基因(-1.31)、HEY2基因(-2.27)、HDAC7基因(-1.17)、DRD2基因(-1.15)、S100A6基因(-1.44)、PAX5基因(-1.01)、DRD1基因(+2.31)、BMP2基因(+1.23)和PIK3CG基因(-2.24)。应当注意MAST2表达被沉默时基因ROBO1、PTN、POU4F1、PARD6B、PAFAH1B1、S100A6、PAX5和PIK3CG的逆向调节，其导致得出MAST-2控制Neurovita介导的基因生存模式的结论。
B.4.轴突再生
对NT2-N细胞进行的刮伤检测表明仅感染Neurovita1的NT2-N细胞能在刮伤后再生其轴突。未感染的或感染Neurovita1ΔPDZ-BS的细胞均不能这样做(p<0.0001)(图8)。
B.5.Neurovita1介导的轴突再生的分子标签
图9表示相比刮伤后未感染的细胞，刮伤后检测的对感染Neurovita1的NT2-N细胞实施的聚焦通路的基因表达谱分析(基于人神经发生和神经干细胞及人PI3K-AKT信号转导PCR阵列)(以上的点B.4.)。遗传分子标签的特征为以下的调节倍数：
图9A：人PI3K-AKT信号转导PCR阵列
EIF2AK2(+1.57)、FASLG(+2.13)、FOXO3(+1.5)、GSK3B(+1.53)、HRAS(+1.54)、IRAK1(+1.51)、MAPK8(+1.53)、MTCP1(+1.76)、PDK1(+2.71)、PIK3CG(+3.78)、RHEB(+1.84)、RPS6KA1(+1.99)、TCL1A(+2.10)、APC(-1.82)、BTK(-1.61)、GRB10(-1.78)、RPS6KB1(-1.68)和TLR4(-1.63)；以及
图9B：人神经发生和神经干细胞阵列
ALK(+2.49)、GDNF(+1.5)、NPTX1(+1.56)、NRG1(+1.52)、PAX5(+1.65)、S100A6(+1.99)、ASCL1(-1.56)、BDNF(-1.78)、BMP15(-2.27)、BMP4(-1.58)、EGF(-2.10)、INHBA(-1.89)、NDP(-1.68)、NEUROD1(-3.92)、NOTCH2(-1.57)、POU3F3(-1.55)和ROBO1(-1.98)。
这些分子标签显示PI3K/Akt信号通路中涉及的基因(图9A)和细胞增殖、粘附和分化、生长因子和突触功能中涉及的基因(图9B)的强的调节，且表明这些基因是高度关联的(图9C)。
B.6.具有优化序列的多肽的设计(解离常数和热力学参数)
从我们的与内源性和病毒配体(蛋白数据库密码子2KQF&2KYL)的复合物中MAST2-PDZ的高分辨率NMR结构中，定征了结构域与多肽间的出乎意料的大表面的相互作用。已表明多肽不仅通过典型C端区的最后4个氨基酸，还与检测的肽的N末端的另一锚定区一起，类似地与PDZ靶标相互作用。即使肽的C端残基主要贡献于与MAST2-PDZ的结合力，指示肽的特定位置和PDZ结构域的原始特征的其他N端相互作用的存在明显加强了相互作用的特异性和亲和力。该大的和原始表明的相互作用是优化肽亲和力和针对MAST2-PDZ的特异性的机会。
我们对MAST2-PDZ/肽复合物(图10)的热力学和结构(在原子水平)的详细描述被用于设计优化的序列。我们提出了多肽对MAST2-PDZ(Neurovita)的亲和力与其神经生存性能之间关联的模型，其中多肽对MAST2-PDZ结构域的亲和力最高时(即，KD最低时)，这些多肽的神经生存性能最高(图10B)。
为了保留肽的N端和C端结合位点驱动的和内源性和病毒配体针对与MAST2-PDZ的相互作用选择的高特异性，末端序列保持不变。为了增加序列对MAST2-PDZ的亲和力，通过设计MAST2-结合域为11-13个氨基酸残基长的多肽修饰了肽的中心区。这些多肽的一般结构描绘在图11A中。
已设计了以下列表中描述的多肽，并进行了对每个MAST2-PDZ/多肽复合物的完成的热力学描述(考虑有助于结合力的柔性和极性接触，估计了焓和熵参数)(表4)：
-多肽，其末端为SEQ ID NO:235中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:9中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:1中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:215中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:67中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:210中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:64中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:218中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:209中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:217中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:208中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:213中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:74中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:211中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:65中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:214中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:66中定义的MAST-2结合域；
-SEQ ID NO:216中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:68中定义的MAST-2合域；和
-SEQ ID NO:212中定义的多肽，其末端为SEQ ID NO:71中定义的MAST-2结合域。
通过MAST2-PDZ的ITC测量解离常数(KD)及热力学参数(ΔH和TΔS)表明本发明的优化多肽针对MAST2-PDZ结构域的亲和力显著增加(表4)。因此，所有检测多肽均具有小于0.5μM的KD，即相比Neurovita1增加至少2.5的亲和力。检测的多肽的KD自0.0629至0.49μM变化，即相比Neurovita1增加的亲和力自2.5至20变化。尤其引起兴趣的多肽是多肽454(Neurovita3)，其MAST2-结合域由SWEVHGQQTRL组成，具有的KD为0.0629μM。
因此，通过修饰Neurovita序列中心柔性接头的序列，考虑到复合物的熵/焓补偿，本发明多肽针对MAST2-PDZ的亲和力得到大幅提高。
例如，相比Neurovita1，Neurovita2多肽(其MAST2-结合域由SWEVHGGQTRL组成)显示针对MAST2-PDZ结构域亲和力的10倍增加(0.12μM相对1.26μM)。Neurovita2胞质域序列与Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS序列的比较描述于图11B中。
感染慢病毒载体(其中克隆有Neurovita2序列)的NS细胞中Neurovita2多肽的表达类似于感染表达Neurovita1和Neurovita1ΔPDZ-BS多肽的慢病毒载体所获得的表达(图11C)。
B.7.感染表达Neurovita2的慢病毒载体的NS细胞中的神经突增生
在感染表达Neurovita2的慢病毒载体的NS细胞中进行的神经突增生检测表明Neurovita2，如同Neurovita1，展现PDZ-BS介导的强神经突增生表型(p<0.0001)(图12)。
B.8.以表达Neurovita2的慢病毒载体转导的NS细胞中的分枝
以表达Neurovita2的慢病毒载体转导的NS细胞中的分枝表明相比neurovita1，NS细胞中Neurovita2介导的神经突增生的特征为较大的神经突树复杂性，所述神经突树为完全功能化的交感神经神经元特定性的。因此，Neurovita2增加了神经突树的强度和复杂性，其为功能和生存特性(图13)。
B.9.Neurovita2介导的神经保护的分子标签
在NT2-N细胞中检测了先前鉴定的4个细胞基因的表达(24h p.i.)。图14显示了下述倍数下调：BTK(-1.64)、FOS(-1.82)、DRD2(-2.35)和POU4F1(-1.53)。
B.10.Neurovita1和Neurovita2分子的遗传分子标签
表5展示了Neurovita1或Neurovita2感染NT2-N细胞获得的倍数调节的概述。
黑色方块指刮伤检测中被调节的基因；白色方块指MAST2沉默时调节逆转的基因；有阴影线的方块指Neurovita2感染中被调节的基因(阈值x<-1.5，或x>+1.5)。
于是，神经生存基因标签的核心为ROBO1、POU4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1，其为Neurovita1和Neurovita2感染中均以相同方式调节的基因，并且其调节在MAST2沉默时逆转。应当注意ROBO1也在刮伤检测中下调。
其他基因被用于更具体地定征Neurovita1(即PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH)或Neurovita2(即DRD2、BTK、FOS)。
这些基因及其功能列出在以下表7中。
表5
表6为Neurovita1遗传分子标签(a)和Neurovita2遗传分子标签(b)的热图图示。
表6
a)
b)
表7
B.11.rRABV和慢病毒载体在NT2-N细胞中的转录
以重组狂犬病毒(rRABV CVS HQ或rRABV CVS HΔ4)或如上所述的慢病毒载体感染NT2-N细胞。rRABV CVS HQ病毒表达末端为SEQ ID NO:1中定义的MAST-2结合域的全长G蛋白；rRABV CVS HΔ4病毒表达末端为由SEQ ID NO:1组成的MAST-2结合域的全长G蛋白，其中Q、T、R和L残基缺失。
对于rRABV感染，总RNA提取24h p.i.，而对于慢病毒载体感染，提取48h。通过RT-QPCR检测了重组病毒(rRABV,慢病毒)的特异性转录。图表明NT2-N细胞可有效地被两种类型的病毒感染。
B.12.细胞中一组典型的免疫基因NT2-N的转录
通过RT-qPCR检测以上收集的培养物中的转录(图15)。
检测了以CVS-HQ病毒株或CVS HΔ4病毒株感染的NT2-N细胞中一组免疫基因的相对诱导倍数。图16A和16B的比较表明免疫基因簇的诱导和神经生存表型是分离的。
此外，检测了以表达Neurovita1、Neurovita1ΔPDZ-BS或Neurovita2的慢病毒载体感染的NT2-N细胞中一组免疫基因的相对诱导倍数。图16B表明没有Neurovita多肽能单独在有丝分裂后的人神经元中引发免疫基因应答。
B.13.轴突再生
图8表明Neurovita1感染的NT2-N细胞能在刮伤后再生其轴突。发明人已分析了MAST-2在再生机制中的作用。
如图17C中所阐示，MAST2表达(NV1/siMAST2)的沉默极大地降低了刮伤后的轴突再生，表明通过慢病毒载体NV1促进有丝分裂后的人多巴胺能神经元(NT2-N)中的轴突再生依赖于MAST2的表达。
图17D表明，如同慢病毒载体Neurovita1(NV1)，慢病毒载体Neurovita2(NV2)促进有丝分裂后的人多巴胺能神经元(NT2-N)中的轴突再生。
B.14.通过Neurovita2防止过度分枝
如图18A中所示，在未感染的NS细胞(黑色方块)中加入KCl刺激过度增生和分枝。该观察结果可通过KCl模拟持续性神经元活性的去极性效应(神经元放点(firing))这一事实得到解释。
相比相同的处理的、但未感染的细胞(星形，图18B)，KCl处理的NS细胞中Neurovita2慢病毒载体的感染降低了NS细胞的增生和分枝。这些结果表明Neurovita2，不仅刺激神经突生成中涉及的通路，还通过控制这些通路和使其避免失控防止过度分枝。有趣的是，Neurovita2的该调节效应也是其无毒性的标志。
B.15.通过Neurovita1和Neurovita2防止LiCl毒性
如图19A中所示，在未感染的NS细胞中加入LiCl抑制神经突生成。
Neurovita1或Neurovita2慢病毒载体，但非Neurovita1ΔPDZ-BS慢病毒载体，展现神经突增生表型，其为LiCl处理的NS细胞中PDZ-BS介导性的(图19B)。这些结果表明Neurovita1和Neurovita2防止LiCl毒性效应。
B.16.以通过慢病毒载体递送的RABV G和来源于Neurovita1的多肽感染的NS细胞 中的神经突增生
检测了6种类型的多肽(图20A)：RABV G完整蛋白、缺失了PDZ-BS结构域的RABV G蛋白、neurovita1多肽、缺失了PDZ-BS结构域的neurovita1多肽、胞质形式的neurovita1多肽和缺失了PDZ-BS结构域的胞质形式的neurovita1多肽。图20表明在神经突增生检测中，neurovita1多肽为优化形式。
B.17.从双顺反子慢病毒载体表达Neurovita多肽
通过双顺反子慢病毒载体在NS细胞中表达了各种Neurovita多肽(NV1、NV1Δ、NV2和NV3)。所有这些Neurovita多肽均得到正确表达(蛋白质印迹)。发现的NV1和NV2mRNA水平近似相同，但发现的NV3mRNA水平较高(图21)。
实验还表明GFP蛋白从该双顺反子慢病毒载体在细胞中得到正确和充分表达。
B.18.以表达Neurovita3的慢病毒载体转导的NS细胞中的神经突增生和分枝
以表达Neurovita3的慢病毒载体转导的NS细胞中的分枝实验表明相比阴性对照，Neurovita3增加神经突树的较大的复杂性(图22A)。如先前的表4中所记录的，Neurovita3具有针对MAST2的亲和力，其为NV1的20倍。
此外，以表达Neurovita3的慢病毒载体转染的NS细胞中的神经突增生检测表明Neurovita3展现强神经突增生表型，比Neurovita1(p<0.00001)和Neurovita2(p<0.0003)(图22B和C)更重要。
NV1、NV2和NV3间交叉(分枝)数目的比较表明相比NV1(p<0.0001)和NV2(p<0.0007)，NV3更有效地增加NS细胞中的神经突树分枝(图23)。
B.19.胞质形式Neurovita3的实验
检测了NS细胞中Neurovita3(NV3)多肽及其胞质形式(NV3cyto)(图24A)的表达、神经突增生和分枝。NV3多肽具有针对MAST2的高亲和力(为NV1的20x)，由ER和高尔基体加工，且具有跨膜结构域(TM)结构域允许其锚定在胞质膜中。NV3cyto多肽相比NV3具有相同的针对MAST-2的亲和力，但为胞质分子。
通过双顺反子慢病毒载体进行的转录分析(图24B)表明NV3cyto得到正确表达，但水平低于NV3(图24C)。GFP从该双顺反子慢病毒载体的表达也是正确的(图24D)。
以表达NV3和NV3cyto的慢病毒载体转导的NS细胞中的分枝实验表明NV3cyto不像NV3一样，增加神经突树复杂性(图25A)。
此外，以表达NV3和NV3cyto的慢病毒载体感染的NS细胞中的神经突增生检测证实NV3cyto增加NS中的神经突增生，但不如NV3一样有效。然而，NV3-cyto与NV1(锚定形式)在增加NS细胞中的神经突增生方面一样好(图25B和25C)。
有趣的是，NV3cyto中SP和TM结构域的缺失(已知缺失可降低Neurovita多肽的神经突增生增加；参见图20B中的NV1cyto)被NV3cyto(和NV3)针对MAST2的高亲和力抵消。
该结论在神经突树分枝实验中得到证实，其中NV3-Cyto与NV1在增加NS细胞中的神经树增生方面一样好(图26A，上图)。
总之，这些实验证明Neurovita多肽如本发明多肽的神经突增生增加和神经突树分枝增加，取决于两种因素：(1)该多肽针对MAST2的亲和力，和(2)该多肽在胞质膜中的锚定。因此，锚定在胞质膜中且具有与Neurovita1(1.26μM)可比的或更高的MAST-2亲和力的多肽，可有效促进神经突增生和神经突树分枝。此外，具有高于Neurovita1且优选与Neurovita3可比的的MAST-2亲和力的胞质多肽，仍然可有效促进神经突增生和神经突树分枝，尽管未锚定在膜中。
B.20.E16小鼠胎儿皮质神经元中的神经突生成
神经突增生实验证明NV1刺激E16小鼠胎儿皮质神经元中的神经突生成(图27)，这与在SH-SY-5Y和NS细胞中得到的结果一致。
B.21.NV1或NV1Δ慢病毒载体对通过脑内途径感染慢病毒载体的新生小鼠无毒性
如图28A中所记录，未感染的小鼠或感染了NV1或NV1Δ慢病毒载体的小鼠间没有体重差异。此外，在注射后第4或20天，在那些不同小鼠间不能检测到明显的表型差异(图29)。
免疫荧光组织化学脑分析表明NV1(eGFP)和NV1Δ(eGFP)表达于纹状体的神经元中(图30和31，图以神经元标记软件Map2标记)。对于NV1(eGFP)和NV1Δ(eGFP)感染，胶质化均非常温和(图30和31，图以GFAP标记)。
另外，NV1感染的神经元展现神经突生成和延长的树状轴突树分化(图30B)，表明NV慢病毒载体允许在体外和体内的神经突生成和神经突树发育。这些体内结果一方面证明了Neurovita多肽如NV1的体能功效，另一方面证明了这些Neurovita多肽对动物发育，且特别是脑发育的安全性。
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Claims (12)

1.多肽，其序列选自SEQ ID NO:210，SEQ ID NO:211，或SEQ ID NO:211的第44至85位氨基酸。
2.编码权利要求1定义的多肽的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其选自SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、或SEQ IDNO:220的第130至258位核苷酸。
4.包含权利要求2或3中定义的多核苷酸的载体。
5.如权利要求4所述的载体，其为表达载体，其中所述多核苷酸处于一个或多个转录调控元件的控制下。
6.如权利要求5所述的载体，其中所述转录调控元件包含CMV启动子。
7.来源于慢病毒的表达载体，其包含权利要求2或3中定义的多核苷酸、所述多核苷酸的表达控制元件、慢病毒来源的顺式作用中心起始区(cPPT)和慢病毒来源的顺式作用终止区(CTS)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号。
8.如权利要求7所述的来源于慢病毒的表达载体，其为质粒。
9.慢病毒载体假型粒子，其包含GAG结构蛋白和病毒核心，所述核心由(a)POL蛋白和(b)慢病毒载体基因组组成，所述粒子包含权利要求2或3中定义的多核苷酸、所述多核苷酸的表达控制元件、慢病毒来源的顺式作用中心起始区(cPPT)和慢病毒来源的顺式作用终止区(CTS)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号，其中所述粒子为用VSV病毒的G蛋白或狂犬病毒的G蛋白假型化的粒子。
10.如权利要求9所述的慢病毒粒子，其中所述POL蛋白的整合酶蛋白为缺陷型的。
11.细胞或细胞培养物，其以权利要求4-8中任一项定义的载体转染，或通过权利要求9或10中定义的慢病毒粒子转导。
12.组合物，其包含权利要求1定义的多肽、权利要求2或3中定义的多核苷酸、权利要求4-8中任一项定义的载体、权利要求9或10中定义的慢病毒粒子，或权利要求11定义的细胞，以及任选地药学可接受的媒介物、赋形剂或载体。
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