CN107001483A - 适合于神经元再生疗法的纳米抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于将分子穿越血脑屏障递送至脑细胞的领域。本发明涉及新型的基于多肽的载体，其允许将效应肽穿越血脑屏障有效递送至神经元细胞，以及涉及用于产生和测试这样的载体的方法，其包括用于测试这样的分子穿越血脑屏障的能力和/或分子对于血脑屏障的毒性和/或已穿越的分子靶向人脑细胞(例如，神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞)的能力的模型。

Description

适合于神经元再生疗法的纳米抗体
本发明属于将分子穿越血脑屏障递送至脑细胞的领域。本发明涉及新型的基于多肽的载体，其允许将效应肽穿越血脑屏障有效递送至神经元细胞，以及涉及用于产生和测试这样的载体的方法，其包括用于测试这样的分子穿越血脑屏障的能力和/或分子对于血脑屏障的毒性和/或已穿越的分子靶向人脑细胞(例如，神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞)的能力的模型。
发明背景
在对于疾病例如神经变性疾病和脑创伤的治疗开发的背景下，向着脑的药物接近和可用性仍然是未满足的需要。实际上，脑通过称为血脑屏障(BBB)的结构而与全身血流相隔离。BBB主要由与下列邻近细胞动态地相互作用的大脑内皮细胞组成：星形胶质细胞、周细胞、血管周围小胶质细胞和神经元。BBB的三个主要功能为创建和维持关于神经元功能的离子内环境稳定，给中枢神经系统(CNS)提供营养物，和保护其免于毒性损伤或某些感染因子。治疗性物质至脑的递送不得不克服BBB，并将其转变为进入门。尽管进行了努力以克服连接或流出屏障或者避开BBB，但是大多数新开发出的神经药物由于差的CNS药物代谢动力学而失败了。
在穿越血脑屏障(BBB)递送分子的背景下，描述了一类衍生自骆驼科动物的“仅有重链的抗体(heavy chain-only antibodies，HcAbs)”的高度可溶的载体。这些抗体的可变重链结构域(VHH)显示出与由轻链和重链异二聚体组成的常规抗体构建物类似的抗原特异性和亲和力，并且展示出大略15kDa的较小的大小。VHH也被称为“VHH片段”，以反映它是抗体的一部分。在特定的背景下，VHH显示出穿越BBB。虽然暂时还未确定给予穿越BBB的渗透性的VHH的特殊结构特征，但一个重要的参数似乎是等电点(pI)：可渗透的VHH被认为通常是碱性的(尤其是具有高于8.5的pI)。另外，大小被认为是VHH渗透性和转运能力的重要因素，并且特别地，其低分子量单体结构被认为对于这些能力做出了贡献。考虑到，靶向特异性细胞表面抗原可以诱导胞吞作用并改善此类VHH穿越BBB的渗透性。还考虑使用对于脑抗原来说特异的VHH作为载料以将货物分子穿越BBB靶向脑中的特定位点(Li等人,2012；WO2010/004432 A1；US 8,460,888 B2)。然而，此类载料-货物构建体可能具有降低的效率或减小的应用范围，特别是由于其与脑抗原的结合，这可能导致大多数货物分子被隔绝而远离其作用位点。
发明简述
发明人令人惊讶地鉴定出一种碱性VHH，其不识别任何脑特异性抗原并且可用作载料以将肽(所谓的货物肽)转运穿越血脑屏障。已穿越了BBB的货物分子(典型地，对于脑组分具有特定活性的肽)可以保持其生物学活性并能够到达其活性的位点。
因此，本发明提供了一种新型多肽，其包含骆驼科动物重链抗体的VHH或者或由骆驼科动物重链抗体的VHH组成，所述VHH具有SEQ ID NO:3的序列。本发明进一步提供了包含具有SEQ ID NO:3的序列变体的VHH或者由具有SEQ ID NO:3的序列变体的VHH组成的多肽，这样的变体如下所描述。本发明进一步提供了包含具有SEQ ID NO:3的序列或其序列变体(如下所描述的)的一部分的VHH或者由具有SEQ ID NO:3的序列或其序列变体(如下所描述的)的一部分的VHH构成的多肽。本发明的VHH和/或包含VHH的多肽是可渗透穿越BBB的，并且不识别任何脑抗原，特别是任何人脑抗原，和/或不与任何人脑蛋白质特异性地结合。在特别的实施方案中，本发明的VHH和/或包含VHH的多肽具有碱性pI。
如下面所描述的，本发明还提供了由嵌合(或融合)多肽组成的含VHH的多肽，所述嵌合(或融合)多肽包含具有另外的融合的肽/多肽的在本文中所定义的VHH或者由具有另外的融合的肽/多肽的在本文中所定义的VHH组成，所述另外的融合的肽/多肽包括靶向神经元细胞的肽，用作标签和/或间隔子的肽，和/或对于脑细胞具有预计的且有利的生物学效应的效应肽。
还提供了编码这样的VHH或含VHH的多肽的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含此类载体、多核苷酸、VHH或含VHH的多肽的细胞；和包含此类细胞、载体、多核苷酸、VHH或含VHH的多肽的药物组合物。还提供了用于产生这样的VHH或含VHH的多肽或者多核苷酸的方法，包括用于测试多肽或任何其他分子是否是可渗透穿越BBB的方法和装置。还提供了本发明的VHH或多肽的用途，包括治疗性用途。
特别地，发明人发现，此类VHH或含VHH的多肽的靶向可以通过靶向神经元细胞的肽而得到改善，所述靶向神经元细胞的肽例如与VHH序列相融合，优选地在N-末端处。此类肽优选地衍生自狂犬病病毒G蛋白(RVG)的序列，尤其是在本文中所公开的新型狂犬病病毒衍生肽(Rabies Derived Peptides，RDP)之一。此类肽是自身可渗透穿越BBB的，并且已考虑了它们用于将货物分子转运穿越BBB的用途(Fu等人,2012)。然而，与本发明的VHH或含VHH的多肽不同，它们未显示出允许效应肽例如neurovita肽(本文中所描述的)的稳定化(增加半寿期)。因此，在特别的实施方案中，将VHH与靶向神经元细胞的肽相融合，所述靶向神经元细胞的肽特别是RDP，其优选地具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:32的序列。
VHH通常展示出可以形成分子内二硫键的2个半胱氨酸氨基酸残基(下文中，半胱氨酸)。它们不包含奇数的可以形成分子间二硫键的半胱氨酸，并且一般而言不具有形成同二聚体的能力。已考虑产生VHH的融合蛋白质，或者相反地产生多聚VHH。然而，在现有技术中仅报道了牵涉VHH蛋白(或VHH衍生蛋白)的C-末端区域的二聚化策略，并且报道了二硫键形成导致明显降低的生产产量和VHH可溶性(Simmons等人,2006)。另外，由于小的VHH大小据信在其通过BBB的渗透性中发挥重要的作用，因此在其中使用VHH作为跨BBB载体的设置中，未考虑二聚化和/或多聚化。发明人已令人惊讶地发现并在本文中报道，对本发明的VHH或含VHH的多肽进行设计从而它具有二聚化能力可以是有利的。特别地，可以包括形成二硫键的半胱氨酸，尤其是在所述VHH或含VHH的多肽的N-末端区域中，例如在上面提及的靶向神经元细胞的肽的序列中。这不导致下降的在用于其生产的细菌中的表达，而导致增强的该构建体的活性。形成二硫键的VHH或含VHH的多肽容易地在细菌的周质中表达为二聚体，并且构建体的回收是容易的。也可能的是，二聚体的形成增加了本发明的VHH或含VHH的多肽的半寿期。因此，在特别的实施方案中，本发明的VHH或含VHH的多肽具有二聚化(尤其是，同二聚化)能力，优选地通过二硫键的形成和/或通过在本发明的VHH或含VHH的多肽的N-末端区域中的结构域。在优选的实施方案中，形成二硫键的半胱氨酸被包含在融合于含VHH的多肽的N-末端位置处的靶向神经元细胞的肽的序列中。此外，在特别的实施方案中，本发明的VHH或含VHH的多肽在细菌中在周质中表达并被回收，并且任选地从所述细菌的周质中纯化，优选地以同二聚体的形式。
本发明的VHH或含VHH的多肽通常用于在其中想要对脑细胞发挥生物学效应而不需要在脑中直接施用产物的应用之中使用。生物学效应(例如，增加的存活、增殖、神经突增生)有时可以通过已知的肽来获得，但是这些肽可能自身不具有渗透穿越BBB和/或靶向其作用位点(例如，特定的细胞、细胞区室、蛋白质或蛋白质复合体……)的能力。当结合至在本文中所描述的VHH或含VHH的多肽时，所述肽可以能够保持其活性，同时是可渗透穿越BBB的和/或被靶向特定的作用位点。因此，本发明提供了在本文中所定义的VHH或含VHH的多肽，其结合至对于脑细胞具有生物学活性的效应肽，特别是与所述肽相融合。
一个包含MAST-2结合结构域的特殊的多肽家族，Neurovita家族，已被描述为具有神经存活和神经保护效应和/或促进神经突增生(WO 2010/116258 A1，WO 2013/068430A2)。虽然已考虑将此类Neurovita肽用于治疗性应用，但是它们自身不能有效地渗透穿越BBB，这妨碍了它们在其中必须靶向CNS的应用之中的使用。已公开了使用基于表达载体(例如，离体转导到个体细胞中的)的递送系统以在脑中表达肽，但是这具有许多缺点，包括与表达载体的使用相关的安全性考虑，以及药物代谢动力学考虑，因为在该递送类型的情况下从施用到实际有效表达的时间以天来表示，这对于许多应用(例如，在损伤或中风后神经元的修复/恢复)来说太过缓慢，而周级别的载体半寿期可能太过长了。特别地，已公开了基于慢病毒载体的递送，并且虽然容易地检测到mRNA，但是所述肽的短的半寿期导致几乎无法检测的蛋白质水平。还已公开了基于细胞穿透系统(例如，用于neurovita肽的衍生自HIV-1的TAT肽)的递送系统。然而，所述融合肽的低的效率和/或短的半寿期需要使用高剂量的肽，这具有潜在的毒性效应(Préhaud等人,2010)。
发明人已令人惊讶地发现，Neurovita肽当在本发明的VHH或含VHH的多肽的C-末端处进行融合时可以保持其生物学活性，并且被有效地递送穿越BBB，例如当被静脉内注射时；并且此类融合物促进神经突增生和/或神经存活和/或神经保护，并允许在损害后神经元细胞的修复/恢复。因此，本发明提供了在C-末端处与在本文中所描述的VHH或含VHH的多肽相融合的Neurovita肽，由此提供了对于神经元具有特定活性的本发明的含VHH的多肽。在特别的实施方案中，所述Neurovita肽具有SEQ ID NO:7的序列。
结合至本发明的VHH或含VHH的多肽(或包括在其中)的货物肽的穿越BBB的有效递送允许设想将这样的构建体用于疗法，尤其是牵涉CNS的疾病(例如神经变性疾病)，或与脑细胞损伤相关的状况(例如脑中风或损伤)，或这样的疾病或状况的演进的疗法。此类用途可以涉及适合于体内施用(尤其是静脉内注射)的组合物，其包含本发明的VHH或含VHH的多肽和任选地其他药学上可接受的组分。因此，本发明提供了此类组合物。本发明还提供了使用本发明的VHH、含VHH的多肽和/或组合物的治疗方法。本发明还提供了本发明的这样的VHH、含VHH的多肽和/或组合物，其用于用作药物或在制造药物中使用，所述药物尤其是用于在神经变性疾病或与脑细胞损伤相关的状况的疗法中使用的药物。在特别的实施方案中，所述疗法包括本发明的VHH、含VHH的多肽和/或组合物的静脉内注射。
在本文中描述了用于产生本发明的VHH或含VHH的多肽、编码这些多肽的多核苷酸的方法，并且其是本发明的一部分。所述VHH属于本发明的产物的基本组成成分。所述VHH的主要特征是其穿越BBB的渗透性，或者穿越BBB的能力，优选地在含VHH的多肽的背景下。在优选的实施方案中，本发明的VHH不识别任何脑抗原，特别是任何人脑抗原，和/或所述VHH、含VHH的多肽和/或含VHH的多肽的VHH不与任何脑蛋白质(特别是任何人脑蛋白质)特异性地结合。详细描述了用于制备携带所述特征的VHH的方法。在特殊的实施方案中，所选择的VHH或含VHH的多肽具有碱性pI。在特殊的实施方案中，所选择的VHH和/或优选地含VHH的多肽有效地渗透穿越BBB(或能够穿越BBB)，尤其是在BBB的体外模型中有效地渗透穿越模拟BBB的内皮细胞层。在特殊的实施方案中，本发明的VHH或含VHH的多肽可以形成同二聚体。在用于产生本发明的VHH或含VHH的多肽的方法的特殊的实施方案中，所述VHH或含VHH的多肽在细胞中，优选地在细菌细胞中进行表达。在所述方法的特殊的实施方案中，在细菌的周质中回收所述VHH或含VHH的多肽。
尽管进行了努力以克服连接或流出屏障或者避开BBB，但是大多数新开发出的神经药物由于差的CNS药物代谢动力学而失败了。因此，在相关且可靠的BBB模型上就其穿透屏障和其与屏障的相互作用对这些分子进行早期筛选是至关重要的。由于在与动物实验相关的立法和伦理问题方面的改变，体外人BBB模型的开发对于基础研究和工业公司具有重大的重要性。用于测试穿越BBB的渗透性的体外模型在开发旨在渗透穿越BBB的物质(尤其是用于在治疗和/或诊断中，尤其是在治疗和/或诊断影响CNS的疾病中使用的物质)中具有极大的重要性。此类模型对于与BBB相关的研究和开发也具有重要性。目前，在此类应用中所使用的体外模型包括其中通过可以例如在滤器上生长的内皮细胞的汇合层(单层或数层)来模拟BBB本身的模型。可以将该滤器放置在细胞培养容器中，如此使得它将细胞培养容器分隔为两个区室，其中阻止大分子从一个区室被动扩散至另一个区室。在此类模型中，可以在所述区室之一中温育物质，并且可以通过在给定时间后测量在另一个区室中所发现的物质的量来测量其渗透性和/或可以通过例如测量构成汇合层的内皮细胞的生存力来测量其对于BBB的效应(Weksler等人,2005；US 8,084,254 B2；WO 2006/056879)。
然而，认识到这样的简单模型不能准确地反映BBB的体内行为。特别地，认识到，除了构成BBB本身的内皮细胞之外，围绕在周围的细胞(特别是在脑中发现的细胞)的效应是重大的。因此，已开发了更为精密复杂的模型，其除了内皮细胞层之外还包括神经元细胞和/或胶质细胞，包括例如星形胶质细胞(Bicker等人,2014；EP 1 964 915 A1)。然而，此类模型通常利用啮齿类/牛细胞，而公认可靠的模型应当由来自人类来源的细胞构成。小胶质细胞是BBB环境的重要组分。然而，现有技术的大多数模型没有此类细胞，特别地由于其炎性效应，其被认为对于模型是易损害的。实际上，激活的小胶质细胞已显示出诱导BBB(特别是内皮细胞)的功能障碍，而其激活可以由于众多刺激而产生并且在体外培养中难以避免(Sumi等人,2010)。此外，尽管由无限增殖化细胞构成的模型已被描述为显示出差的屏障特性(Lippmann等人,2013)，但此类模型将会具有基本上实用的优点。发明人已令人惊讶地发现，在一个区室中由人无限增殖化细胞(其除了内皮细胞的汇合(单)层之外还包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞)构成的如上面所描述的体外脑模型，容易地可用于与BBB相关的体外研究，例如评估物质穿越BBB的渗透性或对于BBB的效应，和已能够事先穿越BBB的分子或微生物靶向脑实质细胞(神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞)或对于脑实质细胞(神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞)的效应。
因此，本发明包括装置，尤其是适合于用作BBB的体外模型的装置，其包括细胞培养容器或由细胞培养容器构成，所述细胞培养容器被一个或多个对于大分子的被动扩散来说不可渗透的人内皮细胞的汇合层分隔为两个区室，并且在至少一个区室(在本文中所定义的“脑区室”)中包含人小胶质细胞。在特别的实施方案中，所述脑区室除了小胶质细胞之外还包含其他细胞，特别是非小胶质人脑细胞；并且小胶质细胞优选地在包含它们的区室(脑区室)中占细胞的1.5％至24％。在特别的实施方案中，所述非小胶质脑细胞为人神经元细胞和/或星形胶质细胞。在优选的实施方案中，所述内皮细胞、所述小胶质细胞和/或所述其他细胞为人细胞，优选地无限增殖化的人细胞。本发明特别地提供了Ntera-2clD/1细胞在制备在脑区室中包含此类细胞作为神经元和/或星形胶质细胞的BBB中的用途。本发明还提供了一种细胞系，SK-N-SHD，其可以在常规细胞培养基中生长并且当接种在NeuroGROTM或类似的培养基中时分化为神经元细胞。特别地，提供该细胞系以用于接种BBB模型的脑区室，并且还提供了包含此类细胞的模型。本发明进一步提供了用于制备此类装置的方法，其包括将会对于所有存在的细胞类型来说相容的最佳培养基。本发明还为此类装置提供了用途，尤其是用作BBB的体外模型。特别的实施方案包括用于测试受试物质穿越BBB的渗透性的方法和/或用于测试受试物质对于BBB的毒性的方法，所述方法包括在本发明的装置中温育所述受试物质。这些方法通常将会包括：在所述装置的一个区室中温育所述受试物质，和在给定的温育时间后，i)测量在另一个区室中受试物质的量，和/或ii)测量细胞(包括内皮细胞和/或“靶细胞”(神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞))的生存力。
附图简述
图1.特定的含VHH的多肽的示意性图示和表达
A.VHH1、VHH2和VHH3的结构。RDP＝靶向神经元细胞的肽(SEQ ID NO:1)；VHH(SEQID NO:3)；StrepTag＝Strep标签(SEQ ID NO:5)；PDZ-BS＝Neurovita肽(SEQ ID NO:7)；Δ-PDZ-BS(在VHH3中)＝没有PDZ-BS并因此无活性的Neurovita肽(SEQ ID NO:9)。连接“S”符号的黑线描绘了在RDP的半胱氨酸残基之间的二硫桥。B.产生本发明的含VHH的多肽并采用抗-strep抗体通过免疫亲和来对其进行纯化，并且以Western印迹来评估其表达。1＝VHH1，2＝VHH2，3＝VHH3。C.在变性(泳道1)和非变性(泳道2)条件下本发明的Neurovita-Neurocargo构建物(VHH1)的PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，其中显示了该多肽的二聚体呈现。在泳道1的左边，指明了大约的分子量。在泳道2的右边，用“M”指明了单体形式，和用“D”指明了二聚体形式。D.通过Western印迹法显示，VHH A12不识别任何脑蛋白质。在人脑提取物(Sg tau4697；泳道1)、小鼠脑提取物(Tg 4510；泳道2)和经纯化的蛋白质GFAP(星形胶质细胞的特异性标志物)(泳道3)上，用VHH A12或H8/E9来进行Western印迹法。E.通过免疫组织化学显示，VHH A12不识别任何脑蛋白质。在tg 4510经石蜡包埋的小鼠脑切片上，通过使用VHH A12或AT8mAb来进行免疫组织化学染色，以1.25×和20×显示。AT8识别在脑组织中存在的NFT。比例尺用粗的黑色条来指明。
图2.含VHH的多肽与乙酰胆碱受体α7亚基(AchRα7)的结合
在竞争物存在下，在于4℃下30分钟之后，通过FACS来评估含VHH的多肽与表达AchRα7的HEK293细胞的结合。A.狂犬病病毒(RABV)竞争。水平轴：Cy5强度(对数标度)。垂直轴：细胞计数。“C”曲线为对照曲线。在RABV不存在下(“-”，顶行)，VHH1容易地结合细胞，而VHH2(没有靶向神经元细胞的肽)结合与对照不可区别(该图实际上不允许区别VHH2和对照的曲线)。黑色箭头显示了峰的移位。在RABV存在下(“+”，底行)，观察到VHH1结合的54％的下降。B.α-银环蛇毒素竞争。轴和箭头如在图版A中那样。α-银环蛇毒素的存在(“+”曲线)不改变VHH2的结合，而它使VHH1的结合减少58％。C.VHH1、VHH2、VHH3的结合的比较。在狂犬病病毒(RABV)不存在(-)或存在(+)下测试了含VHH的多肽的结合，以相对单位(RU)表示。“**”表示在Student’s t-检验中<0.004的p值。
图3.含VHH的多肽对于神经突增生的刺激
A.如在实施例部分中所描述的那样，在本发明的含VHH的多肽VHH1、VHH2、VHH3(左图版)或者于细菌中表达的VHH1的周质(P)或细胞质(C)级分(右图版)存在下，对于对照细胞(Ct)或细胞进行神经突增生测定法。在细胞质中作为单体产生VHH1。垂直轴：以μm表示的平均神经突长度/神经元。在每种情况下，ANOVA检验显示出<0.0001的p值。B.相应于图版A中的实验的显微术图像(在72小时的温育时)。在细胞质级分中的VHH1(单体的)刺激神经突增生，但比在周质级分中的VHH1(同二聚体的)少且不触发大的生长锥扩展。
图4.含VHH的多肽结合神经元并进入神经元
A.在于4℃下30分钟之后，通过FACS来评估含VHH的多肽与分化的NS细胞的结合和向分化的NS细胞中的进入。水平轴：Alexa488强度(对数标度)。垂直轴：细胞计数。“C”曲线为对照曲线，“1”曲线为VHH1曲线。VHH1容易地结合细胞，而VHH2和VHH3结合与对照几乎不可区别(该图实际上几乎不允许区别VHH2、VHH3和对照的曲线)。B.在用VHH1处理了72小时的NS细胞中VHH1的免疫荧光。方框显示了神经元生长锥。VHH1使神经元生长锥扩展。C.在对照(Ct)和经VHH1处理的(48小时，VHH1)分化的NS细胞中肌动蛋白的免疫荧光。箭头显示了在原始彩色图像中清楚可见的相应于肌动蛋白的强烈染色。VHH1刺激生长锥活动性。
图5.由含VHH的多肽触发在致伤后的轴突再生
A.进行刮擦测定法，其中在使细胞致伤之前，在没有(Ct)或具有含VHH的多肽(VHH1、VHH2或VHH3)的情况下，将NT2-N预温育4小时。在72小时的温育后(即在致伤后68小时)读取该测定法。垂直轴：处于再生的神经元的平均百分比。(***)或(****)表示在Student’s t-检验中<0.0001的p值。B.类似的实验和符号如在图版A中那样，但在添加含VHH的多肽之前1小时进行致伤和在致伤后72小时(即在71小时的多肽温育后)进行读取。C.在刮擦后3天显示出再生(顶行)或者显示出再生缺乏和细胞破坏(底行)的典型图像。
图6.人微型脑(Minibrain)-BBB的体外模型
A.体外模型的示意性图示，其显示为细胞培养孔的横截面。左图版：现有技术的模型，其在脑区室中没有细胞；右图版：本发明的模型。Br：脑区室；Bl：注射区室，相应于BBB的“血液”侧。E：内皮细胞；A：星形胶质细胞；N：神经元；M：小胶质细胞。B.微型脑细胞的表型，在包含内皮细胞的孔的添加之后24小时。在成为本发明的模型的一部分的细胞中，测量了几种基因的mRNA表达，在NT2-N细胞中：1＝酪氨酸羟化酶(TH)(神经元细胞的标志物)，或者在NT2-N、NT2-A和CHME细胞中：2＝神经丝蛋白H(NEFH)(神经元细胞的标志物)，3＝胶质细胞原纤维星形胶质细胞蛋白(GFAP)，4＝水通道蛋白4(AQP4)，和5＝糖原磷酸化酶B(PYGB)(星形胶质细胞的标志物)；6＝CD200受体(CD200R)(小胶质细胞的标志物)。垂直轴：相比于对照而言的mRNA表达的％。
图7.在微型脑-BBB模型中内皮细胞的Q-PCR表征
在将它们添加至包含脑细胞的细胞培养容器之后24小时，在成为本发明的模型的一部分的内皮细胞中测量几种基因的mRNA表达，所述模型用1.5％(左图版)或24％(右图版)的小胶质细胞来制备。垂直轴：相比于对照而言的mRNA表达的％。A.流出转运蛋白：1＝ABCB1蛋白，2＝ABCG2蛋白，3＝多药耐性相关蛋白(ABCC1)，4＝ABCC2蛋白，5＝ABCC4蛋白，6＝ABCC5蛋白。B.受体：1＝低密度脂蛋白受体(LDLR)，2＝低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，3＝胰岛素受体(INSR)，4＝瘦蛋白受体(LEPR)，5＝基底细胞粘附分子(LU)，6＝CD71抗原(TFRC)，7＝高度糖基化终产物受体(AGER)。C.转运蛋白：1＝视黄酸刺激基因6蛋白(STRA6)，2＝葡萄糖转运蛋白类型1(SLC2A1)，3＝大中性氨基酸转运蛋白1(SLC7A5)，4＝溶质载体家族1蛋白(SLC1A1)，5＝溶质载体家族38成员5蛋白(SLC38A5)，6＝单羧化物转运蛋白1(SLC16A1)。STRA6是高度表达的，并且LU在所有条件下过表达。
图8.含VHH的多肽靶向微型脑-BBB模型的神经元
用1.5％小胶质细胞，通过使用本发明的装置来进行用于测定VHH-E9或本发明的含VHH的多肽穿越BBB的能力的荧光显微术测定法，其中将所述VHH-E9或含VHH的多肽温育3小时或24小时。VHH-E9以前已显示出在体内穿越BBB(Li等人,2012)。Ct＝对照，即仅二抗。A.显示了在3小时或24小时后在脑区室中VHH-E9(其是缀合有A488的)的存在情况的荧光图像。B.显示了在3小时或24小时的温育后在脑区室中VHH-E9(缀合有A488)或者本发明的含VHH的多肽VHH1、VHH2、VHH3(使用抗-strep标签抗体)的存在情况的荧光图像。VHH-E9以及本发明的含VHH的多肽VHH1、VHH2和VHH3穿越本发明的BBB体外模型。C.显示了在穿越BBB后本发明的含VHH的多肽(VHH1或VHH2)靶向脑区室的神经元的荧光图像。如在B中那样在24小时温育后获得的并且具有神经丝200kDa(Nf)(其为神经元的标志物)的同时染色的图像。左图像：VHH染色(绿色通道)；右图像：Nf染色(红色通道)。白色的星表示用含VHH的多肽染色的神经元(即在两个通道中都检测到染色)，而白色的点表示具有VHH2染色而无Nf染色的细胞。在VHH1图像中不存在此类细胞。D.在C中所描述的实验中，对于VHH1和VHH2测量了神经元靶向的效率。垂直轴：在就相应的含VHH的多肽进行染色的细胞之中Nf经染色的细胞(神经元细胞)的百分比。(***)表示在Student’s t-检验中<0.0002的p值。VHH1在穿越BBB后靶向神经元。
图9.VHH A12与现有技术的VHH的序列比对
将在本文中所公开的含VHH的肽(VHH A12)的VHH部分的序列与从公共数据库(EMBL:uniprotkb，uniprotkb_swissprot，uniprotkb_swissprotsv，uniprotkb_trembl，epop，jpop，kpop，uspop，nrpl1，nrpl2，uniparc)中可得的关于VHH的序列进行比对。在该比对中包括了所有具有高于419的比对得分的VHH。CDR区的残基以粗体和双下划线显现。如可以看出的，本发明的VHH的示例性特征包括，在CDR2的位置5-6处的GF序列，其中大多数VHH具有GG，而其他的具有GR；在CDR1的位置2-3处的DV序列，其中位置2最经常地为F(R、V和L都呈现一次)，和位置3最经常地为S，有时为G或R；并且在CDR3中和在构架区中发现了类似地独特的特征。
图10.用各种比例的小胶质细胞来进行的本发明的装置的测试
A.显示了在接种那天(第0天)和两天后(第2天)脑区室的细胞的显微术图像，当用1.5％小胶质细胞(左)或15％小胶质细胞(右)接种在本文中所描述的BBB模型时。在用15％小胶质细胞接种的BBB中，在接种后两天，此类细胞看起来构成了细胞的80％。B.用1.5％或15％小胶质细胞接种的BBB模型的限制性细胞旁渗透性。对于在内皮细胞接种后各个时间点处用15％小胶质细胞接种的BBB模型(左)和对于没有用小胶质细胞或者用1.5％或15％小胶质细胞接种的模型(在小胶质细胞接种后2天)(右)，显示了通过跨内皮电阻(TEER，左)和通过内皮渗透性系数(Pe，右)而测量的渗透性。如所观察到的，在本文中所公开的BBB中，甚至以高比例的小胶质细胞的存在对于屏障的渗透性不具有任何有害的影响。
图11.“微-微型脑(Mini-minibrain)”
通过在脑区室中使用SK-N-SHD细胞系作为神经元细胞的来源来产生“微-微型脑”装置，即在本文中所公开的BBB模型。A.该装置的示意性图示，和脑区室的荧光显微术图像，其显示了强的B3微管蛋白标记。B.在neurocargo-neurovita不存在(对照)或存在下所测量的微-微型脑的渗透性系数(Pe)，其证明了渗透性不被在本文中所公开的含VHH的多肽所改变。荧光显微术确认，在这些条件下，neurocargo-neurovita被转运穿越BBB并且被靶向脑区室的细胞。
发明详述
涉及本发明的特征的一般性定义以及其实施方案的公开
肽或多肽
肽或多肽是由通过肽键相连接的氨基酸残基组成的大分子。术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，虽然肽通常是指较短的序列(典型地，少于50，或少于30，或少于20个氨基酸残基)，而多肽通常是指较长的序列(典型地，多于20、30或50个氨基酸残基)。术语“蛋白质”在本文中与术语“多肽”可互换使用。氨基酸残基可以选自20种天然存在的氨基酸，和/或非天然存在的氨基酸，它们是技术人员已知的。氨基酸残基可以被修饰，要么通过天然存在的修饰要么通过非天然存在的修饰。天然存在的修饰包括磷酸化，尤其是丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基的磷酸化；糖基化，包括N-联和O-联糖基化；泛素化，尤其是赖氨酸残基的泛素化；SUMO化；或者其他通过泛素样蛋白进行的修饰，等等。
在特别的实施方案中，本发明的多肽是非天然存在的，即它们不是在自然界中发现的和/或不是天然产物，并且显著不同于天然产物。这样的差异可以源自所述多肽的氨基酸序列。作为例子，由至少两种在不同物种(尤其是来自不同科的物种(例如骆驼科动物和病毒))中发现的多肽的融合物组成或者包含这样的融合物的多肽，通常将会具有在天然存在的多肽中未发现的序列。作为另一个例子，所述多肽可以在其序列的保守氨基酸残基中具有至少一个突变，即在给定位置处的氨基酸可以是在天然存在的多肽中在该位置处未发现的氨基酸。所述差异也可以源自非天然存在的氨基酸的存在。所述差异也可以源自在至少一个氨基酸残基中的修饰，其是非天然存在的修饰。所述差异也可以源自未被发现附加至天然存在的多肽的分子部分的添加。所述差异也可以源自多肽的呈现状态，即多肽被产生、呈现或使用时所处的宏观形式。特别地，本发明的多肽可以处于适合于方便操作的形式，例如在试管或其他人工容器中，尤其是当没有生物膜将所述多肽与管中的其他组分相分隔开时，即当直接的分子接触可以在所述多肽与在该多肽之前或之后添加到容器中的其他分子和大分子之间无延迟地发生时。
融合蛋白/融合多肽是以其通常含义在本文中使用的术语，所述通常含义为包含至少两个通过肽键相连接的肽或者由至少两个通过肽键相连接的肽组成的多肽。实际上，这样的融合物是单一多肽，其所具有的序列相应于串接的包含在该融合物中的肽的序列。当在本文中描述融合蛋白/多肽时，并且除非明确排除或在技术上不相关(如在它所出现的特定上下文中由技术人员所意识到的)，所述融合物可以包含间隔肽(在本文中所描述的)或任何数目的在明确描述的肽之间插入的间隔子或其他肽。正如通常将会从上下文中清楚的，“包含多肽A和多肽B的融合多肽”在本文中是指“多肽A和多肽B以及任选地其他多肽(包括间隔肽)的融合多肽”，和“由多肽A和多肽B组成的融合多肽”在本文中是指“多肽A和多肽B以及任选的间隔肽的融合多肽”。当在本文中叙述到“将多肽A与多肽B相融合”时，除非明确说明，这并不意味着这两个多肽必需相互直接地或通过间隔肽相融合，即所述肽可以被任何数目的肽分隔开并且可以以任何顺序。当在本文中叙述到“将多肽A在C-末端处与多肽B相融合”时，除非明确说明，这并不意味着这两个多肽相互直接地或通过间隔肽相融合，即A和B可以被任何数目的肽和残基分隔开，只要A更接近该融合多肽的C-末端。类似地，“在N-末端处与多肽B相融合的多肽”更接近该融合多肽的N-末端，但可以被任何数目的肽和残基与多肽B相分隔开。
因此，在第一个方面，本发明涉及具有这样序列的多肽，所述序列包含具有SEQ IDNO:3的序列或者其变体或部分(下面所详细说明的)的骆驼科动物重链抗体的VHH，或者由具有SEQ ID NO:3的序列或者其变体或部分(下面所详细说明的)的骆驼科动物重链抗体的VHH组成，其中所述VHH是可渗透穿越血脑屏障的并且不识别任何脑抗原和/或不与任何脑蛋白质特异性地结合(尤其是通过抗体/抗原相互作用)。
如在下面将会更详细地揭示的，本发明包括包含有在本文中所定义的VHH的多肽，其具有另外的与VHH相融合并添加所希望的特征的任选的肽。此类多肽在整个文献中被描述为本发明的含VHH的多肽。然而，为清楚起见，有时省略了对于本发明的VHH或本发明的含VHH的多肽的提及，其中事实上，技术人员将会意识到VHH和含VHH的多肽都可以被涉及。因此，除非在技术上或在逻辑上不相关，当提到“本发明的VHH”时，也涉及“本发明的含VHH的多肽”，反之亦然，即一个短语可以被另一个替代。术语“本发明的多肽”有时也用于称呼“本发明的VHH”和“本发明的含VHH的多肽”这两者。
特别地，关于本发明的VHH的特征描述在大多数情况下也可以适用于含VHH的多肽，包括适用于包含在本文中所定义的具有SEQ ID NO:3的VHH的序列变体或部分或者由在本文中所定义的具有SEQ ID NO:3的VHH的序列变体或部分组成的多肽，所述变体或部分也包括在本发明之内。更特别地，本发明的含VHH的多肽有利地具有碱性pI，和/或是可渗透穿越BBB的；和/或不识别任何脑抗原和/或不与任何人脑蛋白质特异性地结合，和/或不通过抗体/抗原相互作用与任何脑抗原结合和/或不通过VHH部分与任何脑抗原结合。
VHH
VHH是来自骆驼科动物的仅有重链的抗体(HcAb)的可变结构域，或者衍生自这样的VHH并且具有与原始VHH实质上相同的特性(特别是在抗原识别能力方面(包括当不具有抗原识别能力时))的分子。骆驼科(Camelidea)的所有物种都具有仅有重链的抗体。在一个优选的实施方案中，本发明的VHH获得自羊驼(Lama pacos)。
本发明的VHH优选地具有SEQ ID NO:3的序列。所述VHH也可以具有与所述序列具有至少70％或至少80％同一性，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，和更加优选地至少99％同一性的变体序列。如果本发明的VHH仅包含SEQ ID NO:3的序列的一部分，那么同一性水平对所述部分的序列来进行计算。所述部分的长度为SEQ ID NO:3的长度的至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％，和更加优选地至少95％。在优选的实施方案中，所述部分的长度为至少60个氨基酸，至少80个氨基酸，优选地至少100个氨基酸，更优选地至少110个氨基酸，和更加优选地至少115个氨基酸。在特别的实施方案中，本发明的VHH至少包含具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的三个CDR区。在特别的实施方案中，所述VHH包含具有序列IDVINNMA(SEQ ID NO:47)的CDR1、具有序列TITSGFSTNY(SEQ ID NO:48)的CDR2和具有序列KVHLIRLGAARAYDY(SEQ ID NO:49)的CDR3。然而，技术员人将会意识到，可能优选的是，在CDR中引入突变，例如为了去免疫，如果待施用所述VHH。因此，也考虑了保持了所述VHH的特征的有限突变。在一个特别的实施方案中，所述VHH的CDR在其氨基酸序列中具有有限的置换，优选地局限于在每个CDR中两个残基和更加优选地局限于一个残基。在一个特别的实施方案中，本发明的VHH与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性(或更高，如上面所详细说明的)，并且包含具有与SEQ ID NO:47的序列有着不多于2个错配，优选地不多于一个错配的序列的CDR1，和优选地具有SEQ ID NO:47的序列的CDR1；具有与SEQ ID NO:48的序列有着不多于2个错配，优选地不多于一个错配的序列的CDR2，和优选地具有SEQ ID NO:48的序列的CDR2；和具有与SEQ ID NO:49的序列有着不多于2个错配，优选地不多于一个错配的序列的CDR3，和优选地具有SEQ ID NO:49的序列的CDR3。上面所意指的错配优选地为氨基酸置换，特别是对于CDR1和CDR2，但可以是单个氨基酸的缺失或插入。上面所意指的错配优选地为氨基酸的保守置换，即将一个氨基酸置换为另一个将会被技术人员认为具有类似特征的氨基酸。这样的VHH的如上面所定义的部分也构成特别的实施方案。在一个特别的实施方案中，本发明的VHH包含有在图9的序列比对中所描绘的构架序列(所述构架序列相应于未加下划线的氨基酸)。特别地，本发明的VHH可以包含具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的构架区，或者与这些构架区的序列具有至少80％同一性和优选地至少90％同一性的构架区。
作为具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的变体或具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的部分的VHH共享该具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的基本特征，关于抗原识别(特别地，不识别任何脑抗原)、脑蛋白质的结合(特别地，不与任何人脑蛋白质特异性地结合)、穿越BBB的渗透性或穿越BBB的能力(特别地，是可渗透穿越BBB的或是能够穿越BBB的，如在本文中所定义的)和/或pI(特别地，具有碱性pI，如在本文中所定义的)；并且涉及本发明的VHH或含VHH的多肽的实施方案适用于作为具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的变体或具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的部分的VHH。关于这些特征的测试是技术人员容易地可取得的，并且特别地此类测试公开在本文中，特别是在实施例部分中。为了避免疑惑，虽然它们在严格意义上不可以是来自骆驼科动物或从骆驼科动物可获得的抗体的HcAb的VHH片段，但是VHH(包括序列变体)的序列变体和部分包括在本文中所使用的术语VHH之中，除非在技术上或在逻辑上不相关。在一些实施方案中，尤其是当它具有作为来自SEQ ID NO:3的变体的序列时，本发明的VHH不是天然存在的VHH并且优选地不是天然存在的蛋白质。
本发明的VHH或含VHH的多肽是可渗透穿越BBB的。可渗透穿越BBB的物质(例如，蛋白质)，特别是本发明的VHH，可以被定义为这样的物质，其当施用在由BBB所保护的脑的部分之外时，可以在合理的时间量之后以显著的量在脑中被发现。在以与“是可渗透穿越BBB的”相同的含义在本文中进行使用的其他术语中，所述物质“具有穿越BBB的能力”或“能够穿越BBB”，其中术语“渗透性”在本文中以“穿越BBB的能力”的含义进行使用。一般而言，当在体内进行测试时，通过静脉内注射来进行施用，尤其是在动物(尤其是非人哺乳动物，特别是小鼠或啮齿类)的颈动脉中。
在体内测试穿越BBB的渗透性存在有多重困难。因此，可渗透穿越BBB的物质，特别是本发明的VHH或含VHH的多肽，可以备选地通过参考体外BBB模型来定义。特别地，在包含两个被模拟BBB的细胞汇合层分隔开的细胞培养区室的体外BBB模型的情况下，可渗透穿越BBB的物质可以被定义为这样的物质，其当施加至一个区室和/或在一个区室中温育经过合理的时间量时，在另一个区室中以显著的量被发现。
在上面的定义中，可以考虑高于0.01％或0.1％，优选地高于0.5％、1％或1.5％，和更加优选地高于2.5％、5％或10％的最初施加的和/或施用的物质的量，例如，显著的量。尤其是对于物质是否是可渗透的体内测定，可以证明对已经通过BBB的物质的量进行定量是困难的或不可能的。因为，特别是在体内，BBB非常有效地阻止大多数分子(具有足够大小的)穿透入脑中，因而技术人员将会意识到，用大多数常规的细胞和/或分子检测方法，在脑(或模拟脑的区室)中检测到任何量的此类物质可以认为是显著的并且是渗透性的征兆。还将会意识到的是，痕量(例如，仅通过高度灵敏的技术例如质谱法可检测的量)的已穿越BBB的物质，尤其是如果通过使用体外模型而检测到的，通常将会不被认为是显著的。
鉴于通常观察到的可渗透蛋白质穿越BBB的穿透的动力学，技术人员将会意识到，在该背景下合理的时间量通常为几十分钟至几小时的数量级。因此，在施用和就所述物质在脑(或模拟脑的区室)中的存在情况进行的测试之间的时间量可以例如从10分钟至12小时变动。用于体内测试的典型时间优选地从30分钟至12小时变动，优选地为30分钟、1小时、90分钟、2小时、4小时、8小时或12小时。用于体外测试的典型时间优选地从10分钟至4小时变动，优选地为10分钟、30分钟、45分钟、1小时、90分钟、2小时、3小时或4小时。还考虑了更长的时间，但是当使用延长的温育时间时，诸如物质的半寿期的因素可以明显地影响结果，因为所述物质可能在对它进行测试之前被降解并因此可能仍然是未检测到的，尽管它有效地穿越了BBB。
在特别的实施方案中，当用在Weksler等人,2005、US 8,084,254 B2或WO 2006/056879中所描述的体外模型和/或用在Bicker等人,2014或EP 1964915 A1中所描述的体外模型和/或用在本文中所描述的新的体外BBB模型进行测试时，在4小时的温育后在“脑”区室中发现了多于0.1％的最初所温育的本发明的VHH或含VHH的多肽。在优选的实施方案中，在4小时的温育后发现了多于0.5％，优选地多于1％。在进一步的优选的实施方案中，在1小时的温育后发现了多于0.5％，优选地多于1％。在更进一步的优选的实施方案中，在1小时的温育后发现了多于1.5％，优选地多于2.5％。在特别的实施方案中，当使用在“脑”区室中包含脑细胞(特别是神经元细胞)的这些模型中的任何一个进行测试时，在10pg的施加在另一个区室中的VHH或含VHH的多肽的3小时的温育之后，在免疫荧光实验中，在所述脑细胞(特别是神经元细胞)中容易地检测到本发明的VHH或含VHH的多肽。
完整的构建体(即完整的本发明的含VHH的多肽，其包括“货物”效应肽，如果有的话)的穿越BBB的渗透性通常在应用中是有利的特征。然而，由于完整的构建体的断片(例如，不包括效应肽的VHH或含VHH的多肽)的渗透性与完整的构建体的渗透性有关，因此备选地或另外地，可以对于完整的构建体或其断片，尤其是不包括效应肽的VHH或含VHH的多肽，来评估(测量和/或计算)渗透性。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述多肽，特别是VHH或含VHH的多肽，是碱性的。
在特别的实施方案中，本发明的多肽是碱性的。当其等电点(pI)高于7，更优选地等于或高于8，和更加优选地等于或高于8.5或者等于或高于9时，蛋白质(特别是VHH)被称为是碱性的。蛋白质的pI被定义为蛋白质不携带净电荷(即负电荷抵消了正电荷)时所处的pH。用于测定蛋白质的pI的方法(要么通过实验测定，要么通过基于蛋白质序列的理论计算)是技术人员已知的。特别地，pI可以通过使用等电聚集以实验方式来进行测量。备选地或另外地，pI可以通过使用计算机程序例如从欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatics Institute,Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UK)可得的EMBOSS iep软件和/或从瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics,Quartier Sorge-Batiment Genopode,1015Lausanne,Switzerland)可得的来自Expasy软件的Compute PI工具来进行计算。由于完整的构建体(即完整的本发明的含VHH的多肽，其包括“货物”效应肽，如果有的话)的pI以及其断片(例如，不包括效应肽的VHH或含VHH的多肽)的pI与完整的构建体穿越BBB的渗透性有关，因此备选地或另外地，可以对于完整的构建体或其断片，尤其是不包括效应肽的VHH或含VHH的多肽，来评估(测量和/或计算)pI。
在特别的实施方案中，本发明的VHH(其可能不包括形成本发明的含VHH的多肽的其他肽)具有等于或高于8，更优选地等于或高于8.5，和更加优选地等于或高于9的pI。在特别的实施方案中，本发明的含VHH的多肽(其优选地包括货物肽)具有等于或高于8，更优选地等于或高于8.5，和更加优选地等于或高于9的pI。
具有高的pI的肽很可能非特异性地相结合细胞，从而阻止其靶向特定细胞。在一个特别的实施方案中，本发明的VHH(其可能不包括形成本发明的含VHH的多肽的其他肽)具有等于或低于11，更优选地等于或低于10.5，和更加优选地等于或低于10的pI。在特别的实施方案中，本发明的含VHH的多肽(其优选地包括货物肽)具有等于或低于12，更优选地等于或低于11，和更加优选地等于或低于10.5的pI。对于本发明的VHH(其可能不包括形成本发明的含VHH的多肽的其他肽)的pI的优选范围为8.5-11，8.5-10、9-10和9-10.5。对于本发明的含VHH的多肽的pI的优选范围为8.5-12、8.5-11、9-11、9-10.5、9.5-10.5和10-10.5。
发明人在本文中提供了从羊驼获得的VHH。该VHH具有SEQ ID NO:3的序列，并且由具有SEQ ID NO:4的序列的多核苷酸所编码。发明人显示，该VHH不识别任何脑抗原，具有碱性pI(pI>9)，是可渗透穿越BBB的，至少以在实施例部分中所详细说明的含VHH的多肽(特别是VHH1、VHH2、VHH3)的形式。
在一个特别的实施方案中，本发明的多肽靶向神经元细胞，特别地，所述多肽为融合多肽，其中VHH与靶向神经元细胞的分子相融合。
本发明的VHH可以与靶向神经元细胞的肽相融合。一些肽具有将本发明的多肽靶向特定细胞类型的能力，即包含它们的多肽优选地与特定细胞相联合和/或转运至特定细胞和/或结合至特定细胞。特别地，此类靶向神经元的肽是本领域中已知的。此类肽可以来源于狂犬病病毒G蛋白。具有SEQ ID NO:1的序列的此类肽在本发明的范围之内以对它们进行举例说明。这些序列的变体也作为靶向神经元细胞的肽而包括在本发明之内，只要它们展示出相同的靶向特性并且通过影响10％或更少的氨基酸残基的点突变(例如，通过氨基酸残基的保守置换)而衍生自上面的序列。其他合适的衍生自狂犬病病毒G蛋白的靶向神经元细胞的肽包括具有选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的序列的肽。
在特别的实施方案中，本发明的VHH或含VHH的多肽在穿越内皮细胞层后被靶向神经元细胞，特别是靶向在本发明的装置中的神经元细胞。所述靶向可以通过所述多肽在神经元细胞的表面和/或内部的存在(要么唯独地，要么以相对于在溶液中的其他细胞类型和/或多肽(未与细胞结合的)而言更高的量)来反映。
要注意的是，在本领域中，如在下面所讨论的，通常要避免在包含VHH的嵌合构建物中引入半胱氨酸以便保持被认为对于其活性来说所需要的VHH的单体呈现。然而，需要在衍生自狂犬病病毒G蛋白的靶向神经元细胞的肽中的半胱氨酸以维持其生物学活性(Lentz等人,1987)。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的含VHH的融合多肽包含含有半胱氨酸残基的肽(特别是这样的靶向神经元细胞的肽)，特别是在N-末端处与VHH部分相融合的这样的肽，和特别地这样的半胱氨酸残基被发现位于在N-末端处离VHH部分的第一个(N-末端的)残基5至25个，优选地10至20个，和最优选地16个残基。
根据一个特别的实施方案，本发明的多肽具有二聚化能力，特别是同二聚化能力，和优选地其中同二聚化产生自二硫桥。
本发明的VHH或含VHH的多肽可以具有二聚化能力。因此，本发明包括作为二聚体构建体的VHH或含VHH的多肽。从骆驼科本身获得的VHH通常不能形成二聚体，特别是同二聚体，这被认为是其特征之一和用于发挥生物学功能的所需要的特征。因此，设计VHH或含VHH的多肽的技术人员通常将会设计它以保持其单体结构。然而，在目前所公开的含VHH的多肽的情况下，发明人已令人惊讶地发现，生物学活性在单体和二聚体形式(呈现)之间有差异，并且后者是更好的。
允许二聚体形成的方法是技术人员已知的。特别地，此类方法包括添加二聚化结构域，尤其是已知二聚体蛋白质的同二聚化结构域。备选地(或另外地)，在VHH的序列中半胱氨酸残基的存在(例如，通过在该序列中的另一个氨基酸的突变)或者在本发明的多肽中在与所述VHH相结合的一个或多个肽中半胱氨酸的存在可以使得本发明的VHH或含VHH的多肽能够形成二聚体，尤其是同二聚体。技术人员将会意识到，所述半胱氨酸必须包含在该序列的这样的区域中，从而它们易被另一个多肽接近以进行结合，当所述多肽处于其折叠构象时。在特别的实施方案中，本发明的VHH或含VHH的多肽作为二聚体(特别是同二聚体)来提供。在特别的实施方案中，本发明的VHH或含VHH的多肽包含一个或多个可以形成分子间二硫键的半胱氨酸残基。在特别的实施方案中，形成二聚体(尤其是形成同二聚体)的半胱氨酸位于所述VHH或含VHH的多肽的N-末端处，和特别地它/它们位于相对于所述VHH而言处于N-末端的肽中，和特别地位于在N-末端处与所述VHH相融合的靶向神经元的肽(例如，在本文中所公开的RDP)中。
根据一个特别的实施方案，本发明的多肽为含VHH的多肽，并因此为包含任何在本文中所定义的VHH的融合多肽，其可能与在本文中所公开的分子相融合并且另外地包含融合的效应多肽。
本发明的含VHH的多肽可以包含neurovita肽。本发明的VHH或含VHH的多肽(其特别地包含在本文中所描述的靶向神经元细胞的肽和/或标签)被设计用作运载体以用于将neurovita肽(在本文中也称为货物或效应分子或肽)转运穿越血脑屏障(和可能地将所述货物肽靶向给定的细胞、细胞区室……)。
优选的与作为运载体起作用的本发明的含VHH的多肽的连接是通过产生包含VHH或含VHH的多肽运载体和效应肽的融合多肽来进行的。因此，除非通过上下文排除或在技术上不相关，术语“含VHH的多肽”包括，并且本发明包括，包含本发明的VHH和neurovita肽的融合多肽。在优选的实施方案中，所述货物肽具有少于40个，少于30个，和优选地少于20个氨基酸。技术人员还将会意识到，所述货物肽的pI可能影响包含运载体和货物的融合多肽的pI。如在本文别处所陈述的，所得的本发明的含VHH的多肽优选地是碱性的。
根据本发明，衍生自狂犬病病毒G蛋白的肽(其对于神经元的存活和/或保护和/或活动性具有效应，和/或其促进神经突增生)是货物分子。它们已经公开在WO 2013/068430中。在所述出版物中，这些肽被公开为肽的胞质结构域，所述胞质结构域由处于MAST2-结合结构域上游的胞质结构域和MAST-2结合结构域组成。在本文中所使用的术语“Neurovita肽”是指示这样的胞质肽，其包含MAST2-结合结构域和其上游序列(即，N-末端的，其中MAST2-结合结构域在C-末端处与所述上游序列相融合)或者由MAST2-结合结构域和其上游序列组成。在特别的实施方案中，Neurovita是衍生自狂犬病病毒G蛋白的胞质结构域的具有30至55个氨基酸的肽，其包含所述G蛋白的MAST2-结合结构域，并且对于神经元的存活、保护和/或运动性具有效应，和/或促进神经突增生。用于实施本发明的这样的肽的例子为具有SEQ ID NO:7的序列的肽。此类肽优选地在C-末端处与本发明的VHH相融合，优选地与任何成为含VHH的多肽的一部分的其他肽相融合，从而使得MAST2-结合结构域处于本发明的含VHH的多肽的C-末端处。在特别的实施方案中，本发明的含VHH的多肽包含融合多肽，其包含VHH和Neurovita肽，所述Neurovita肽优选地在C-末端处与所述VHH相融合，更优选地在本发明的多肽的C-末端处。
Neurovita肽，特别是具有SEQ ID NO:7的序列的优选的Neurovita肽，具有碱性pI。特别地，Neurovita的pI可以为12或更高。技术人员将会意识到，具有这样的碱性pI的肽很可能非特异性地结合细胞，并因此将不会考虑使用这样的肽，特别地如果它想要被靶向特定细胞。然而，发明人已发现，当在与VHH(其是较不碱性的，特别地具有在9.5至10的范围内的pI，和特别地具有pI＝9.86)的融合物中使用时，没有观察到含VHH的多肽(其具有在10-10.5的范围内的pI，和特别地具有pI＝10.36)的非特异性结合，并且所述多肽是特异性地靶向的。在特别的实施方案中，Neurovita肽具有12或更高的pI。在特别的实施方案中，包含Neurovita肽的含VHH的多肽具有12或更低，优选地11或更低，更优选地10.5或更低的pI，和特别地在8.5在11的范围内，优选地在9至10.5的范围内，和最优选地在10-10.5的范围内的pI。特别地，包含Neurovita肽的含VHH的多肽具有10.36的pI。
Neurovita肽可以携带任何的在WO 2013/068430A1的第12-22页中所公开的MAST2-结合结构域，并且在那里所公开的每一个组构成了从其中选择特别实施方案的Neurovita肽的MAST2-结合结构域的组。类似地，在本发明的特别的实施方案中，Neurovita肽的MAST2-结合结构域可以选自在WO 2013/068430的第12-22页中的特别实施方案中所定义的Neurovita肽的MAST2-结合结构域。在优选的实施方案中，含VHH的多肽包含具有SEQID NO:7的序列的Neurovita肽。在一个优选的实施方案中包括了在WO 2013/068430的第15、16、18、20和21页中独个地公开的Neurovita肽的MAST2-结合结构域中的每一个。特别地，本发明的Neurovita多肽的MAST-2结合结构域由这样的序列组成，所述序列的大小为11至13个残基，所述序列的头两个残基为S和W，并且所述序列的最后四个残基为Q、T、R和L(这4个最后的氨基酸残基代表所谓的PDZ-BS)。
MAST-2结合结构域按照下列组之一来进行定义，其中已知无论什么组，MAST-2结合结构域的头两个氨基酸残基为S和W，并且MAST-2结合结构域的最后四个氨基酸残基为Q、T、R和L：(A)在第一组中，MAST-2结合结构域由这样的序列组成，所述序列的大小为11个残基，所述序列的头两个残基为S和W，并且所述序列的最后四个残基为Q、T、R和L，该序列由SWX1X2X3X4X5QTRL组成，其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一个为任意氨基酸残基(SEQ ID NO:21)；(B)在第二组中，MAST-2结合结构域由这样的序列组成，所述序列的大小为11个残基，所述序列的头两个残基为S和W，并且所述序列的最后四个残基为Q、T、R和L，该序列可以通过从SWESHKSGGQTRL序列(SEQ ID NO:19)中缺失两个连续或不连续的氨基酸残基来获得；(C)在第三组中，MAST-2结合结构域由这样的序列组成，所述序列的大小为12个残基，所述序列的头两个残基为S和W，并且所述序列的最后四个残基为Q、T、R和L，该序列由SWX1X2X3X4X5X6QTRL组成，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6中的每一个为任意氨基酸残基(SEQID NO:22)；(D)在第四组中，MAST-2结合结构域由这样的序列组成，所述序列的大小为12个残基，所述序列的头两个残基为S和W，并且所述序列的最后四个残基为Q、T、R和L，该序列可以通过从SWESHKSGGQTRL序列(SEQ ID NO:19)中缺失一个氨基酸残基来获得；和(E)在第五组中，MAST-2结合结构域由这样的序列组成，所述序列的大小为13个残基，所述序列的头两个残基为S和W，并且所述序列的最后四个残基为Q、T、R和L，该序列由SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL组成，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的每一个为任意氨基酸残基(SEQ ID NO:23)。
在本发明的neurovita肽中处于MAST2-结合结构域上游的结合结构域的序列可以为任何的在WO 2013/068430的第22至24页中所公开的在所述应用中用于等价目的的序列。特别地，这样的序列可以包含20至40个氨基酸残基，优选地25至45个残基，和特别地31个残基。在特别的实施方案中，处于MAST-2结合结构域上游的胞质结构域的序列为狂犬病病毒G蛋白的胞质结构域的片段，特别是来自减毒的狂犬病病毒毒株的G蛋白的胞质结构域的片段或来自有毒力的狂犬病病毒毒株的G蛋白的胞质结构域的片段；更特别地，处于MAST-2结合结构域上游的胞质结构域的序列由下述序列组成：RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:17)或其变体，如在上面引用的出版物中所描述的，特别是RRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID NO:18)。
本发明的neurovita多肽的特别例子选自由下列各项组成的组：
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL
(Neurovita 1)(SEQ ID NO:20)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGGQTRL(Neurovita 2)(SEQ ID NO:24)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(Neurovita 3)(SEQ ID NO:7)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVATQQTRL(SEQ ID NO:25)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVYTGQTRL(SEQ ID NO:26)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTGQTRL(SEQ ID NO:27)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTQQTRL(SEQ ID NO:28)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVAGGQTRL(SEQ ID NO:29)；
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWAEAQHTQQTRL(SEQ ID NO:30)；和
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHASGGQTRL(SEQ ID NO:31)。
在特别的实施方案中，也可以通过缺失其PDZ-BS序列(MAST2-结合结构域的最后四个氨基酸残基)来使本发明的含VHH的多肽的neurovita肽无活性。这样的neurovita肽要么具有降低的生物学活性要么没有生物学活性，并且可以例如用作用于测试在本发明的含VHH的多肽中的neurovita肽的特定效应的参照物。一个特别的失活的neurovita肽为具有下述序列的NVΔ-PDZ-BS：RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQ(SEQ ID NO:9)。
在一个特别的实施方案中，本发明的多肽另外还包含标签肽，和/或另外还包含肽间隔子(其特别地插在VHH和效应多肽之间)，和/或另外还包含亲和肽。
本发明的VHH或含VHH的多肽可以包含另外的肽，例如标签或间隔子。技术人员将会意识到，除了在本文中所描述的靶向肽和/或效应肽之外，在含VHH的多肽中包括具有特定功能的肽可以是有利的。这些包括例如间隔肽、标签肽和亲和肽(和具有间隔肽和标签肽两者的特征的肽)。本发明的含VHH的多肽可以包含一种或多种这样的肽。这样的肽是技术人员熟知的，并且在本文中仅提供了简短描述。技术人员将会意识到，应当对在所述融合蛋白中的肽及其位置进行选择，从而就本发明而言所述融合多肽的基本特征未显著地改变。特别地，pI应当优选地保持碱性，尽可能地所述另外的肽不应当改变所得的多肽的大小范围，并且所述肽的添加不应当导致所得的含VHH的多肽的聚集或隔绝(例如，通过与特定细胞组分相结合)。
间隔肽由几个插入在融合蛋白中的两个所定义的肽或多肽之间的氨基酸组成，通常为了允许每个肽/多肽独立于另一个地或相对独立地进行折叠，即为了允许每个肽/多肽采取与当它不与另一肽/多肽相融合时的其构象类似的构象。间隔肽可以由单个氨基酸组成，或者由具有2、3、4或5个氨基酸，或6至10个氨基酸，或11至20个氨基酸的序列段组成。
标签肽通常用于促进融合多肽的纯化和/或检测。在一些情况下，所标签肽是自身可检测的(例如，荧光标签例如GFP)，而在其他情况下，所述标签肽是可检测的，因为它特异性地结合可检测分子(而所述可检测分子可以是直接可检测的，例如发荧光的，或者它可以通过可检测分子与它的特异性地结合而是可检测的，即可能需要分子支架用于检测)。如果用于纯化和/或间接检测，这样的肽通常被设计成(或被发现)具有高的对于容易地可得的分子的亲和力。这样的肽常常衍生自与其中意欲使用所述多肽的物种不相关的物种，以避免任何交叉反应，尤其是在检测期间。可以就其可检测性和/或就在纯化过程中的固定化和/或回收的容易性来选择结合标签肽的分子。普通的标签肽包括HA-标签(来自人流感血凝素的短肽)、Flag-标签、His-标签(包含至少6个组氨酸残基)和Strep-标签(包含八个氨基酸并且容易地被商购可得的Strep-tactin和抗体结合)。在特别的实施方案中，本发明的含VHH的多肽包含具有SEQ ID NO:5的序列的Strep-标签，其特别地在C-末端处与VHH相融合，特别地插入在VHH和效应肽之间。
在一个特别的实施方案中，本发明因此涉及这样的含VHH的多肽，其包含下列序列的融合物：RDP序列，例如SEQ ID NO:1；VHH序列，例如SEQ ID NO:3；标签序列，例如SEQ IDNO:5；和Neurovita序列，例如SEQ ID NO:7。
在一个特别的实施方案中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:45的序列。
应当注意，尽管肽的融合物具有一些优点，特别地在产生的容易性方面，但是标签肽的功能也可以通过将非肽部分连接至多肽来获得，并且在本文中考虑了使用此类部分并且本发明包括与此类部分相结合的多肽。因此，术语“标签”包括标签肽以及具有类似功能的非肽部分。技术人员将会意识到，特别地在多肽的背景下，术语“标签”应当被解释为“标签肽”，而在它在技术上相关的背景下，提及“标签肽”必须理解为包含非肽标签。
用于制备本发明的VHH和含VHH的多肽的方法公开在本文中并且是本发明的一部分。在特别的实施方案中，用于产生本发明的VHH的方法包括下列步骤：
A–获得VHH，其特别地具有SEQ ID NO:3的序列或者其序列变体或其部分(如在本文中所定义的)，或者编码这样的VHH的多核苷酸；
B–设计或选择一种多肽或一亚组多肽(其由具有碱性pI的所述VHH组成或者包含具有碱性pI的所述VHH)，和任选地设计或获得编码所述多肽的[一亚组]多核苷酸，和/或选择不识别任何脑抗原或不结合任何脑蛋白质(特别是人脑抗原和蛋白质)的VHH；
C–设计或选择一种多肽或一亚组多肽(其由可渗透穿越BBB的所述VHH组成或者包含可渗透穿越BBB的所述VHH)，和任选地设计或获得编码所述多肽的[一亚组]多核苷酸。
备选地，步骤B和C可以以不同的顺序来进行。
A–获得VHH，其具有SEQ ID NO:3的序列或者其序列变体或其部分(如在本文中所定义的)，或者编码这样的VHH的多核苷酸，这可以按照技术人员已知的方法来实现。在特别的实施方案中，获得这样的VHH包括下列步骤：
-获得具有SEQ ID NO:4的序列的cDNA，任选地获得片段，特别是包含所述cDNA的部分(尤其是包含具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的CDR区的部分)的PCR片段，使用所述cDNA作为模板，任选地在所述片段中引入突变，例如通过在PCR引物中引入所希望的突变；
-将所述片段(特别是PCR片段)克隆到载体中，特别地克隆到适合于在细菌中的表达的质粒中，任选地将所述片段以符合读框的方式与编码肽(例如，在本文中所描述的靶向神经元细胞的肽、效应肽和/或标签肽/间隔肽)的核酸序列融合在一起；
-在确定的细胞中表达所编码的多肽，尤其是融合多肽。
随后的选择步骤可以以任一顺序来进行。为了使成本最小化和使成功率最大化，技术人员将会意识到，更高通量的选择步骤通常应当在更低通量的步骤之前进行(因为该亚组将会倾向于在每个选择步骤之后包括更少的可能克隆)，和关于较不常见的特征的选择步骤应当在对于更普遍的特征的选择步骤之前进行(因为在就罕见特征而选择出的克隆中比用相反方式更可能发现普遍特征)。还将会显然的是，应当首先选择更普遍的特征，或更容易选择的特征，其增加发现较不普遍的特征(或较不容易选择的特征)的可能性。因此，对于技术人员来说将会显然的是，对于pI进行的选择通常应当在对于通过血脑屏障的渗透性进行的选择之前来进行。
还必须重申，在相关且未明确排除的情况下，在所描述的方法中，可以将本发明的含VHH的多肽替代本发明的VHH。特别地，下面的选择步骤可以在含VHH的多肽而非VHH上进行。在制备这样的多肽的过程中，所述选择步骤也可以在VHH上和在含VHH的多肽上进行。在一个特别的实施方案中，选择具有碱性pI的一亚组VHH，然后制备一亚组的在本文中所描述的含VHH的多肽，所述含VHH的多肽中的每一个包含所选择的VHH之一，其优选地具有相同的另外的肽和/或修饰，和只有在那时才进行选择可渗透穿越BBB的含VHH的多肽的步骤。技术人员将会意识到，选择不识别脑抗原的VHH的步骤通常将会用单独的VHH(即不与另一个肽相融合)来进行，并且通常将不会需要在修饰(包括其他肽的融合)之后进行重复，因为所述修饰通常不可能对于在含VHH的肽中的VHH产生识别脑抗原的能力。相反地，技术人员将会意识到，尽管包括选择可渗透穿越BBB的单独的VHH的步骤可能是有利的，但是进一步修饰VHH以产生含VHH的多肽很可能改变渗透性，从而使得在单独的VHH上进行选择看起来是任选的，而该步骤将会有利地在含VHH的多肽上进行(或再次进行)。
B–选择或设计由具有碱性pI的所述VHH组成或包含具有碱性pI的所述VHH的多肽可以通过从所述VHH或含VHH的多肽的序列计算pI，或通过体外实验例如等电点聚集来进行。技术人员可以容易地得出用于测试在体外在细菌中产生的多肽的pI的方法。但是，优选的方法基于多肽的序列。pI可以按照技术人员已知的算法例如从欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute,Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB101SD,UK)可得的EMBOSS iep软件和/或从瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute ofBioinformatics,Quartier Sorge-Batiment Genopode,1015Lausanne,Switzerland)可得的来自Expasy软件的Compute PI工具来进行计算。
选择不识别任何脑抗原(特别是任何人脑抗原)或不特异性地结合任何脑蛋白质(特别是任何人脑蛋白质)的VHH可以通过使用技术人员已知的方法来进行。如技术人员将会意识到的，不识别任何人脑抗原或不结合任何人脑蛋白质的抗原可以理解为识别这样的抗原或结合这样的蛋白质的那种，所述抗原或蛋白质仅仅或主要在脑中(相比于其他来源的人细胞而言)发现。特别地，识别在人脑外面的抗原的VHH可以符合该定义。对于技术人员来说还将会显然的是，这样的识别和/或结合的不存在可以理解为为显著的识别和/或结合(即技术人员将会认为其是在生物化学上相关的识别或结合)的不存在。特别地，所述显著的识别和/或结合可以是关于来自非脑来源的抗原或蛋白质，该术语可以被阐述为人脑抗原/蛋白质的特异性识别/结合或者对于与人脑抗原/蛋白质的特异性识别/结合。在特别的实施方案中，本发明的VHH在使用全人脑提取物(Sg tau 4697)、小鼠脑提取物(Tg 4510)和/或GFAP的Western印迹测定法中不产生特异的染色，特别地在允许脑抗原特异性VHH产生染色的条件下，特别地使用在本文中所公开的Western印迹法程序，和特别地使用与Strep标签相融合的VHH。在特别的实施方案中，在脑抗原特异性抗体产生显著的染色的条件下，特别是在本文中所公开的条件下，本发明的VHH在使用Tg 4510小鼠脑组织的免疫组织化学测定法中不产生特异的染色。在特别的实施方案中，如上所述，通过Western印迹法或通过免疫组织化学，本发明的VHH不产生特异的染色。
C–选择或设计由可渗透穿越BBB的所述VHH组成或包含可渗透穿越BBB的所述VHH 的多肽通常将会最初通过体外实验来进行。实际上，没有多肽的已知序列特征或其他直接可取得的参数允许预测穿越BBB的渗透性，而直接的体内测试在伦理学和成本方面将可能会显得不合理。允许测试本发明的VHH或含VHH的多肽的渗透性的方法包括在上面在本发明的VHH的描述中所提及的方法。特别地，这些方法包括在本申请中所公开的测试穿越BBB的渗透性的新方法，其利用由发明人所开发的和也在本文中所公开的新型装置。在下面更详细地公开的该测试方法包括在本发明中，通过本身作为“本发明的测试方法”和作为在制备本发明的多肽的方法的特别实施方案中的步骤。在选择本发明的VHH或含VHH的多肽中，技术人员将会找到指导来使用在本申请中的方法。特别地，使用本发明的装置的方法的特定技术特征(包括实验条件)公开在下面的实施例部分中并且构成用于制备本发明的VHH或含VHH的多肽的方法的优选实施方案。在使用现有技术的方法(其特别地基于具有与本发明的装置类似的呈现的现有技术的装置)中，技术人员将会意识到类似的实验条件很可能是成功的，并且将会利用在本文中的教导来施行选择可渗透穿越BBB的VHH或含VHH的多肽的步骤。
本发明还涉及编码在本文中所公开的多肽和其组分(VHH、肽靶向分子、neurovita、标签、间隔子)的多核苷酸，特别是包含SEQ ID NO:4的序列或所述序列的部分的多核苷酸。
获得编码具有SEQ ID NO:3的序列的VHH的核酸的方法，以及获得编码所述VHH的部分，与所述VHH具有至少80％、90％或95％同一性的VHH，包含所述VHH的融合蛋白(本发明的含VHH的多肽)的核酸的方法，是技术人员已知的。所述编码本发明的VHH或含VHH的多肽的核酸，以及所述获得所述核酸的方法，包括在本发明中。在特别的实施方案中，编码本发明的VHH或含VHH的多肽的核酸包含下列序列或由下列序列组成：
-SEQ ID NO:4的序列，或者另一个编码本发明的VHH的核酸的序列；
-任选地，编码靶向神经元细胞的肽的核酸的序列，优选地SEQ ID NO:2的序列；
-任选地，编码标签肽的核酸的序列，优选地SEQ ID NO:6的序列；
-任选地，编码neurovita肽的核酸的序列，优选地SEQ ID NO:8的序列或在WO2013/068430中(特别地在第32-35页上)公开的编码neurovita肽的核酸中的任一个的序列，或者无活性的neurovita肽的序列，其优选地具有SEQ ID NO:10的序列。
在优选的实施方案中，编码靶向神经元细胞的肽的核酸(如果存在的话)位于编码VHH的核酸的5’处，和/或编码neurovita肽的核酸(如果存在的话)位于编码VHH的核酸的3’处。在优选的实施方案中，编码本发明的VHH或含VHH的多肽的核酸具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16的序列或SEQ ID NO:46的序列。在特别的实施方案中，编码本发明的含VHH的多肽的核酸不包括在自然界中发现的核酸，特别地不包括在骆驼科动物中发现的核酸，特别是由编码从骆驼科动物中获得或可获得的VHH的核酸组成的核酸。在特别的实施方案中，除了编码VHH的核酸的序列之外，编码本发明的VHH或含VHH的多肽的核酸的序列还包含至少两个核苷酸，优选地至少三个核苷酸，和更优选地至少9、18、30、60或120个核苷酸，从而形成在骆驼科动物中和/或在自然界中未发现的序列。在特别的实施方案中，编码本发明的VHH或含VHH的多肽的核酸的序列以符合读框的方式和以紧邻编码VHH的核酸的序列的方式包含终止密码子，从而形成在骆驼科动物中和/或在自然界中未发现的且显著地和/或在功能上不同于这样的骆驼科动物或天然序列的序列，因为它特别地编码相对于天然存在的蛋白质而言经截短的蛋白质。在特别的实施方案中，编码本发明的VHH或含VHH的多肽的核酸的序列在其编码序列中包含在骆驼科动物中未发现的密码子。
本发明还涉及包含编码本发明的VHH或含VHH的多肽的核酸的载体。此类载体是技术人员已知的，并且包括用于在细菌(包括大肠杆菌(E.coli))或其他原核细胞或细胞系或者酵母或其他真核细胞或细胞系(尤其是哺乳动物细胞或细胞系)中表达VHH或含VHH的多肽的表达载体，和还包括克隆载体，其中包括质粒和噬菌粒，其为了基因工程的容易性而进行了设计(进行了优化，例如为了克隆和/或维持核酸，尤其是cDNA、文库，为了产生编码融合蛋白的核酸，……)。本发明的(或用于在产生本发明的多肽的方法中使用的)特别优选的载体为包含指导表达出的蛋白质进入周质空间并在易位过程中被切割掉的信号肽(例如ompA)的质粒，例如从IBA GmbH,Rudolf-Wissell-Str.28,D-37079Goettingen,Germany可得的pASK-IBA2质粒。本发明的载体还包括病毒衍生载体，其中包括慢病毒载体。在特别的实施方案中，包含编码本发明的VHH的核酸的载体不包括编码从骆驼科动物中获得或可获得的VHH的噬菌粒载体。
本发明还涉及这样的细胞和细胞系，其包含本发明的VHH或含VHH的多肽，编码这样的多肽的本发明的核酸，或者含有这样的核酸的本发明的载体。这些细胞可以选自细菌(包括大肠杆菌)或其他原核细胞或细胞系，或者酵母或其他真核细胞或细胞系(尤其是哺乳动物细胞或细胞系)。
本发明还涉及包含任一下列化合物的组合物：本发明的VHH或含VHH的多肽，编码这样的多肽的本发明的核酸，包含这样的核酸的本发明的载体，和/或包含这样的多肽、核酸和/或载体的本发明的细胞或细胞系。包含大量的不同的VHH或编码VHH的序列的组合物可以不携带本发明的技术效果，尤其是当所述VHH的断片不具有本发明的VHH的特征时。因此，在特别的实施方案中，本发明的组合物包含有限数目的不同的VHH或含VHH的多肽，和/或编码有限数目的不同的VHH的核酸，其中有限数目不大于100，优选地不大于20或10，和更加优选地不大于5、4、3、2或1。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物为溶液，其包含本发明的VHH或含VHH的多肽并且包含不多于1、2、3、4或5种不同的VHH和/或含VHH的多肽。在所述组合物中，所提及的化合物与适合于体内施用的生理学上可接受的载料相联合。
本发明还涉及适合于体内施用(特别地适合于静脉内注射或眼部施用)的药物组合物，其包含任一下列化合物：本发明的VHH或含VHH的多肽，编码这样的多肽的本发明的核酸，包含这样的核酸的本发明的载体，和/或包含这样的多肽、核酸和/或载体的本发明的细胞或细胞系，其中所述化合物与药学上可接受的辅助剂和/或溶剂和/或载体相联合。适合于体内施用的组合物可以按照技术人员已知的方法来制备。在特别的实施方案中，本发明的药物组合物为可注射溶液或滴眼液。在特别的实施方案中，本发明的药物组合物包含：作为活性成分的VHH或含VHH的多肽，其中所述VHH优选地具有SEQ ID NO:3的序列；和在C-末端处与所述VHH相融合的neurovita肽，其优选地具有SEQ ID NO:7的序列。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含作为活性成分的含VHH的多肽，该含VHH的多肽包含VHH、Neurovita肽和在N-末端处与所述VHH相融合的靶向神经元细胞的肽，所述靶向神经元细胞的肽优选地具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:32的序列。
本发明还涉及由任一下列化合物组成的试剂(称为“本发明的试剂”)：本发明的VHH或含VHH的多肽，编码这样的多肽的核酸，包含这样的核酸的载体，包含这样的多肽、核酸和/或载体的细胞或细胞系，或者包含所述多肽、核酸、载体和/或细胞或细胞系的药物组合物，其中所述本发明的试剂用于用作药物和/或在制备药物中使用。本发明还包括使用本发明的试剂来治疗有此需要的宿主(尤其是人患者)的方法。在特别的实施方案中，用于本发明的用途的含VHH的多肽包含：VHH，其优选地具有SEQ ID NO:3的序列；和在C-末端处与所述VHH相融合的Neurovita肽，其优选地具有SEQ ID NO:7的序列。在优选的实施方案中，用于本发明的用途的含VHH的多肽包含VHH、Neurovita肽和在N-末端处与所述VHH相融合的靶向神经元细胞的肽，所述靶向神经元细胞的肽优选地具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:32的序列。
在特别的实施方案中，本发明的治疗包括静脉内注射本发明的试剂，和/或所述药物是用于静脉内注射的。在特别的实施方案中，本发明的治疗包括在眼睛中施用所述试剂(眼部施用)，和/或所述药物呈现为滴眼剂。在特别的实施方案中，本发明的试剂用于在人受试者的治疗中使用(或者用于制备用于人受试者的治疗的药物)。在特别的实施方案中，本发明的试剂对于脑细胞具有有利的和/或治疗性的效应。在特别的实施方案中，本发明的试剂用于在治疗CNS或脑疾病或状况中使用，和/或用于制备用于治疗CNS或脑疾病或状况的药物。所考虑的特定疾病包括神经元疾病，特别是神经变性疾病。所考虑的特定状况包括脑中风、损伤、青光眼、创伤或损害，其由外在或内在(对于个体)因素所诱导。在优选的实施方案中，本发明的试剂包含含VHH的多肽，该含VHH的多肽包含下列组分或由下列组分组成：VHH，其优选地具有SEQ ID NO:3的序列；和在C-末端处与所述VHH相融合的Neurovita肽，其优选地具有SEQ ID NO:7的序列；和任选地，在N-末端处与所述VHH相融合的靶向神经元细胞的肽，其优选地具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:32的序列，并且所述试剂用于在治疗神经元疾病(特别是神经变性疾病)或者脑中风、青光眼、创伤、损害或损伤中使用(或者用于制备用于治疗神经元疾病(特别是神经变性疾病)或者脑中风、青光眼、创伤、损害或损伤的药物)。
关于骆驼科动物抗体的产生以及其修饰(特别地为了在治疗性应用中使用)的进一步教导公开在Harmsen和De Haard,2007中。
本发明的装置在呈现形式方面与在现有技术中(例如，在Weksler等人,2005、US8,084,254 B2和WO 2006/056879中)所公开的装置类似，因为它由这样的容器组成或包含这样的容器，所述容器适合于包含一个或多个内皮细胞汇合层(优选地，单层)的细胞培养，所述单层将该细胞培养容器分隔为两个区室。与现有技术的装置相反，本发明的装置为血脑屏障体外模型，其特征在于，所述装置包含人来源的细胞，其在所述区室之一中包括小胶质细胞。包含在所述装置中的细胞优选地均为人细胞。所述装置的细胞中的至少一些，特别是内皮细胞，优选地为无限增殖化细胞。优选地，所述装置的细胞均为人无限增殖化细胞。
在本文中所使用的“人细胞”是指人来源的细胞，即其衍生自最初在人中发现的细胞。在优选的实施方案中，所述细胞不是通过对人的直接取样而获得的。取而代之，将从人中取样出的细胞在允许产生适合于体外研究的细胞(包括以足够的数目和对于此类研究来说足够均质)的条件下进行培养，所述适合于体外研究的细胞共享在人中发现的细胞的大多数特征和特别地其基因组DNA由或基本上由在人基因组DNA中发现的序列组成。因此，“人细胞”可以是指从在人中直接取样出的细胞获得(可能在选择过程之后)的无限增殖化细胞。“人细胞”还可以是指从干细胞(不论是人胚胎干细胞，还是人成体干细胞，包括通过技术人员已知的技术而获得的多能和/或未分化细胞)的培养和/或分化中获得的细胞。在特别的实施方案中，所述装置的细胞的提供不牵涉在人上的体内程序。在特别的实施方案中，所述装置的细胞不是通过破坏人胚胎而获得的。同样地，“脑细胞”是指脑来源的细胞，即其衍生自来自脑组织的样品的细胞并且与在脑中发现的细胞共享基本特征。
用于细胞培养的容器可以例如为细胞培养管、小瓶或烧瓶，或者优选地，用于细胞培养的多孔平板(尤其是12-孔和24-孔平板)的孔。在一个特别的实施方案中，本发明的装置包含用于细胞培养的多孔平板，优选地12-孔或24-孔平板，其中每个孔构成一个容器(其包含被内皮细胞层分隔开的两个区室，其中一个区室包含小胶质细胞)，这样的装置允许同时运行分开的实验。所述容器优选地用在粘附细胞的培养中所使用的常规涂层(优选地，聚-D-赖氨酸-层粘连蛋白)进行包被。
细胞单层可以在对于液体和大分子可渗透的物理基质(例如，适合于细胞培养的滤器)上进行生长。细胞在这样的滤器上的生长允许使细胞层定位，从而它将细胞培养容器分隔为两个区室。由于细胞层旨在模拟BBB，因此所述区室之一相应于脑，而另一个区室相应于全身血流。前者在本文中有时称为“脑区室”，而后者称为“注射区室”。术语“注射区室”是为简单起见而使用的并且不是旨在将所述装置或其用途限制于其中在所述区室中施加受试物质的应用，并且在一些设置中，在脑区室中施加受试物质可以是优选的。
在所述装置中形成分隔层的内皮细胞优选地为人细胞，优选地无限增殖化的人细胞。在特别的实施方案中，形成分隔层的内皮细胞为无限增殖化的人脑内皮细胞。
特别地，此类细胞可以通过在Weksler等人,2005中所描述的人脑微血管内皮细胞的无限增殖化来获得和/或具有与在所述出版物中所公开的hCMEC/D3细胞系类似的特性，或者所述内皮细胞可以来自hCMEC/D3细胞系。备选地，可以使用其他的人的无限增殖化的BBB内皮细胞系，例如hBMEC、TY10和BB19。所述分隔层优选地为单层并且是汇合的，即在所述单层中的细胞之间未留空间。为了制备细胞汇合层，通常应当以比对于汇合所需要的数目少的数目接种细胞并让其进行生长，通常生长数天，直至它们达到汇合。如此地使细胞层定位，从而使得区室之间的分隔对于大分子的被动扩散来说是不可渗透的，和/或使得从一个区室转运至另一个区室的任何分子必须通过该细胞层来做此事。
在本发明的装置中的小胶质细胞存在于脑区室中。所述细胞优选地为人细胞，优选地人无限增殖化细胞。此类细胞可以由下述细胞组成：CHME-5细胞或类似细胞，其通过用SV40的T抗原使人胎儿小胶质细胞无限增殖化来获得(如在例如Peudenier等人,1991中所描述的)。备选地，可以使用原代细胞(例如，从ScienCell 6076Corte Del Cedro,Carlsbad,California-92011,USA商购可得的)。在脑区室中的细胞要么可以与形成分隔层的内皮细胞没有接触，要么可以与所述层相接触地进行培养。根据一个特别的实施方案，在它们的区室中，内皮细胞和小胶质细胞不相接触，并且小胶质细胞与内皮细胞相对地定位。
除了小胶质细胞之外，所述装置的脑区室还可以包含其他细胞类型。所述另外的细胞优选地是人的，优选地人无限增殖化细胞或从人无限增殖化细胞获得的细胞。特别地，其他细胞类型，例如其他脑细胞，特别是神经元或星形胶质细胞或者两者，可以存在于脑区室中。人的神经元和星形胶质细胞可以通过Ntera-2clD/1细胞(其是从ATCC可得的，具有参考号CRL-1973)的分化来获得，如在PaquetDurand等人,2003和Sandhu等人,2003中以及在实施例部分中所描述的。备选地，可以使用原代细胞。
在本文中公开了细胞(SK-N-SH D细胞)的备选的来源，所述细胞特别地是用于产生本发明的装置。这些细胞(从神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH(ATCC HTB-11)中分离出的克隆)获得了神经元细胞的特征，特别是当在EndoGROTM培养基(EndoGROTM-LS#SCME001或EndoGROTM-MV#SCME004,Merck-millipore,France)中进行培养时，而将它们按惯例在常规的细胞培养基例如DMEM Glutamax-I-High Glucose-Na Pyr中进行生长和维持。因此，此类细胞便于生长和维持，并且可以通过将它们转移入合适的分化培养基例如EndoGROTM中而在短时间内分化为神经元细胞，所述分化培养基也可以用作该模型的温育培养基。因此，本发明提供了SK-N-SHD细胞系，其于2015年9月4日以编号CNCM I-5010保藏于CNCM(国家微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture de Microorganismes),InstitutPasteur,Paris,France)。提供这些细胞，特别地用于用作神经元细胞模型，例如以便检定药理学化合物对于所述细胞的效应。更特别地，提供这些细胞用于在制造本发明的装置中使用，特别地用于在脑区室中接种。在本文中所公开的实施方案的任一个中，本发明的装置可以在其脑区室中包含SK-N-SH D细胞。
在现有技术中，通常避免在BBB模型的脑区室中使用小胶质细胞，这特别地是由于其炎性性质和其BBB破坏能力(参见例如，Carvalho da Fonseca等人,2014)。然而，发明人已令人惊讶地显示，本发明的装置可以在脑区室中包含(或接种有)15％或更多和甚至24％或更多的小胶质细胞，而没有其作为BBB的功能的任何显著的损害。特别地，接种有1.5％至24％的小胶质细胞的本发明的BBB模型已显示出是有功能的。具有80％或更多的小胶质细胞的这样的模型也是完全地有功能的。
在脑中，特别地取决于脑的区域，小胶质细胞占细胞的1.5％至24％(Kettenmann和Ransom,2012)，并且本发明的装置已显示在相对于脑区室的总细胞含量而言1.5％或24％的小胶质细胞的情况下是有功能的。优选地，当将细胞接种在脑区室中时进行细胞的定量和混合，因为在该阶段细胞需要进行胰蛋白酶消化以从细胞培养物中回收它们并接种它们。然而，由于预期在从细胞的接种至该装置的实验使用的时间段期间出现少量的细胞分裂或死亡，因而在接种之时建立的比例可能是在该装置中的最终比例的非常接近的近似值或低估值。
在一个特别的实施方案中，小胶质细胞占在所述区室中的细胞的1.5％。在一个特别的实施方案中，小胶质细胞占在所述区室中的细胞的24％。在另一个特别的实施方案中，小胶质细胞占在所述区室中的细胞的15％。在特别的实施方案中，小胶质细胞占在所述区室中的细胞的1.5％至15％，1.5％至24％，5％至20％，或10％至20％。在特别的实施方案中，小胶质细胞占在脑区室中的细胞的1.5％至5％或20％至24％。
技术人员将会意识到，在脑区室中小胶质细胞的比例可以随在所述区室中生长的细胞而变化，特别地由于不同类型的细胞可能具有不同的生长和/或存活率。在特别的实施方案中，本发明的装置在添加细胞之时在脑区室中包含上述比例的小胶质细胞(换言之，本发明的装置的脑区室接种有细胞，所述细胞以上面所公开的相对于总细胞含量的比例包含小胶质细胞)。在特别的实施方案中，当将本发明的装置用于测定法时，在脑区室中小胶质细胞的比例为24％或更多，50％或更多，75％或更多。所述比例可以在测定法开始时进行测定，和/或所述比例可以在测定法结束时进行检定。优选地，所述比例在整个测定法期间停留在下列范围内：10％至100％，15％至100％，24％至100％，50％至100％，70％至100％，或80％至100％。在一个特别的优选实施方案中，所述装置在脑区室中接种有15％比例的小胶质细胞，并且该比例在接种后两天为80％或更高。
一般而言，用于培养、操作和维持对于制备本发明的装置来说所需要的细胞的方法是技术人员容易地知晓的。然而，特别地，由于在现有技术中从未实现过内皮细胞例如hCMEC/D3和小胶质细胞例如CHME的共培养，因此发明人已开发了特殊的培养条件。在特别的实施方案中，本发明的装置的细胞在这样的细胞培养基中或所述细胞培养容器包含这样的细胞培养基，所述细胞培养基包含EBM-2，并补充有胎牛血清、氢化可的松、bFGF、抗坏血酸、化学成分确知的脂质、HEPES和任选地青霉素-链霉素，优选地以并不显著地不同于在实施例部分中所公开的那些的量，特别地没有相差超过50％，优选地没有相差超过25％、10％或更优选地5％。在特别的实施方案中，脑区室或注射区室，或者本发明的装置的两个区室，都包含EndoGROTM-LC或EndoGROTM-MV(Merck-millipore,France)培养基，或任何适合于SK-N-SHD细胞分化为神经元细胞的培养基。在优选的实施方案中，这两个区室都包含相同的培养基。关于细胞培养和操作的另外的指导可以在本文中所引用的出版物中和在实施例部分中找到。在实施例部分中所公开的特定的技术特征和实验条件定义了用于制备装置的方法和/或本发明的装置的优选实施方案。
在一个特别的实施方案中，小胶质细胞(和可能地其他脑细胞)不与内皮细胞单层和/或在其上接种了此类细胞的滤器相接触，或者不紧密接近所述细胞或滤器。
在另一个实施方案中，使小胶质细胞定位在内皮细胞和/或滤器下面，或者紧密接近其。
制备本发明的装置的方法包括在本发明中。所述方法通常将会包括下列步骤：
-获得内皮细胞，优选地人无限增殖化内皮脑细胞；
-将所述内皮细胞接种在适合于细胞培养的滤器上；和然后
-使所述细胞在所述滤器上生长至汇合；
和下列步骤：
-获得小胶质细胞，优选地人无限增殖化小胶质细胞；
-任选地，获得其他脑细胞，尤其是神经元和/或星形胶质细胞，尤其是通过人无限增殖化脑细胞(特别是Ntera-2clD/1和/或SK-N-SHD细胞)的分化而获得的神经元和星形胶质细胞；
-将所述小胶质细胞(任选地与其他脑细胞一起)接种在适合于细胞培养的容器中，和优选地用上面所描述的经补充的EBM-2培养基填充所述容器；
和然后下列步骤：
-将携带内皮细胞汇合层的滤器提供(特别地转运)到其中接种了小胶质细胞的容器中；
-使所述滤器定位，从而它将所述容器分隔为两个区室；
-在该容器中在如此获得的区室之一中提供小胶质细胞，和任选地其他细胞，特别是其他脑细胞。
本发明的装置的用途包括在本发明中。此类用途包括任何这样的方法，在所述方法中模拟人BBB的行为的体外装置(在本文中所使用的“BBB的体外模型”)的可得性可以被认为是有利的。此类用途是技术人员已知的，并且在药物开发领域中是普遍的，尤其是对于旨在在脑疾病或状况的治疗中使用的药物或药物候选物以及旨在在涉及脑的诊断程序中(例如在脑成像程序中)使用的药物或物质。因此，本发明包括本发明的装置作为BBB的体外模型的用途，特别地用于测试已穿越BBB的分子靶向其他脑实质细胞例如小胶质细胞、神经元或星形胶质细胞的能力。特别的实施方案为测试方法，尤其是测试受试物质穿越BBB的渗透性的方法和测试受试物质对于BBB的毒性的方法，其包括将受试物质施加至本发明的装置的细胞培养容器，和/或在该装置的容器中温育所述受试物质并测定所述受试物质是否渗透BBB和/或对于BBB具有毒性效应和/或被靶向脑区室的特定细胞。
如对于技术人员来说将会显然的，受试物质可以为任何物质，尤其是旨在体内使用(尤其是在非人哺乳动物和/或人中)的物质，尤其是被开发用于用作药物或用作诊断试剂的物质。可以施加至所述装置的受试物质的量取决于测试方法的目的。特别地，由于在普通的实验条件下通常仅一部分的可渗透物质将会渗透穿越BBB，因此在所述物质穿越BBB的渗透性的测试方法中，最初所施加的量应当是这样的，从而所述量的一部分(优选地多于0.1％，更优选地多于0.5％、1％、2.5％或5％，和更加优选地多于10％)是通过对于检测该物质来说可得的方法容易地可检测的。另一方面，非常大量的物质可以导致不希望的效应，包括允许物质渗透BBB的细胞转运机制的饱和，或者由于所述物质与细胞或细胞外组分的非特异性或低亲和力结合(其在当使用合理量的所述物质时不具有生物学或生理学重要意义，但在大量存在下是显著的)而引起的效应。
例如，为了测试渗透性，在基于12-孔平板的本发明的装置的孔中所施加的蛋白质的典型量将会等于或高于0.1pg，优选地等于或高于1pg、2pg或5pg，更优选地等于或高于10pg，并且低于10mg、1mg、100μg、10μg或1μg，优选地低于100ng、10ng或1ng。
当测试毒性时，技术人员将会意识到，所施加的受试物质的量通常应当至少反映在所述物质的预计用途中BBB预期将会暴露至的所述物质的最高量。例如，在测试作用于脑的药物中，对于BBB的毒性应当以比预期产生最大治疗效应的量显著更高的量进行测试，以便该测试允许在当其揭示没有毒性时得出结论：治疗有效量的物质对于BBB是没有毒性的。当物质旨在用于实验目的(包括就其渗透性进行测试)时，这依然是正确的：预先用比打算在渗透性测试中使用的最大量更高的量就毒性进行测试将会允许得出结论，渗透性测试的结果不与毒性效应相关，如果毒性测试揭示没有毒性。典型地，在毒性测试中所施加的物质的量为在渗透性测试中所施加或打算施加的物质的最大量的10倍、5倍、2倍或1倍。在特别的实施方案中，本发明的测试方法包括：用于测试受试物质对于BBB的毒性的方法的步骤，和用于测试所述受试物质穿越BBB的渗透性的方法的步骤，其中相对于在渗透性试验中的量而言，在毒性测试中，将至少相同的量，优选地至少2倍或5倍，和更优选地至少10倍的量的所述受试物质施加至本发明的装置。
测试受试物质穿越BBB的渗透性(或受试物质穿越BBB的能力)包括下述步骤：测定在其中最初未施加受试物质的区室(“转越”区室(‘trans’compartment))中，尤其是在包含小胶质细胞的区室或脑区室中，所述受试物质的存在情况。通常在将受试物质施加在一个区室中和测定其在另一个区室中的存在之间允许一个合理的时间量。用于测试的典型时间优选地从10分钟至4小时变动，优选地10分钟、30分钟、45分钟、1小时、90分钟、2小时、3小时或4小时。在优选的实施方案中，所述方法是为了测试所述受试物质从全身血流至脑的渗透性，并因此最初将受试物质施加在注射区室(即不包含小胶质细胞的区室)中并且在脑区室中检测其存在情况。
测定受试物质的存在情况可以牵涉或不牵涉所述物质在“转越”区室中的量的定量。所述测定可以在“转越”区室上原位地进行，即允许“转越”区室的内容物或所述内容物的一部分保留在所述区室中以用于随后的检测/定量步骤。备选地，所述测定可以在回收所述区室的内容物或所述内容物的样品后进行，所述回收包括下列步骤或由下列步骤组成：吸移和/或抽吸和/或回收在所述区室中的液体培养基，和/或回收在所述培养基中处于悬浮的细胞，和/或从所述区室中回收(尤其是通过胰蛋白酶消化)粘附细胞，并且将所述培养基和/或细胞转移到分开的容器例如试管中，以用于随后的检测/定量步骤。在特别的实施方案中，所述受试物质在“转越”区室中的存在情况的测定包括下述步骤：对于“转越”区室或者对于其内容物或所述内容物的样品施行检测显著量的(但不检测非显著量的)所述受试物质的方法，优选地检测非痕量的(但不检测痕量的)所述受试物质的方法；和确定通过所述方法在“转越”区室中检测到了还是未检测到所述受试物质。在这些实施方案中，所述方法导致这样的结论：如果在“转越”区室中检测到所述受试物质，那么所述受试物质是可渗透穿越BBB的；反之亦然。
允许非痕量的(和/或显著量的)检测和不允许痕量的(和/或非显著量的)检测的方法特别地包括免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、Western印迹法、放射免疫测定法、PCR(在核酸的情况下)，等等。技术人员将会意识到，大多数常规的分子生物学检测方法可以检测以非痕量(和/或以显著量)的受试物质，当通过本领域中的常识进行调整时；而痕量(和/或非显著量)通常将不会检测到。然而，高度灵敏的方法例如质谱法或者(在核酸的情况下)PCR和相关方法(尤其是嵌套式PCR)以及其他已知成功扩增出微小量的核酸的方法可能导致痕量的检测，并且技术人员将会意识到，如果对于所述检测未设置量的下限阈值，那么此类方法可能在当实际上不是如此时导致得出物质是可渗透的这样的结论。这也适用于一些ELISA测定法、放射免疫测定法等，其已就痕量(例如，痕量蛋白质)的检测进行了优化。
在特别的实施方案中，所述受试物质在“转越”区室中的存在情况的测定包括下述步骤：对于“转越”区室或者其内容物或所述内容物的样品施行允许对所述物质的量进行定量的方法。在这样的实施方案中，通常在将受试物质施加至本发明的装置之前可以进行定量(优选地通过使用相同的方法)，以测定最初所施加的受试物质的量，和/或可以进行定量(优选地通过使用相同的方法)，以测定保留在其中最初注射了受试物质的区室之中的受试物质的量。当可以通过数种方法来获得量的准确测量时，不需要使用相同的方法来定量不同的级分。当没有合适的方法对于确定在至少一个所述级分中受试物质的量的准确测量来说是可得的或实用的时，优选地在所有级分中使用相同的方法以便尽可能准确地估计相对量。
在此类实施方案中，渗透穿越BBB的物质的量可以相对地来表示，要么相关于最初注射的物质的量而言，要么相关于已渗透的物质的量而言。如果已测定了这些量中的两个，那么第三个可以容易地计算出来，并且这些比例两者也均容易计算出来，除非可检测物质的总量在温育时间期间发生改变，例如由于降解或扩增。如果仅可以建立估计的值，那么通常优选的是高估最初注射的物质的量并低估渗透的物质的量，因此渗透的物质与最初注射的物质的比例可以表示为“至少x％”。此类实施方案导致这样的结论：受试物质是可渗透穿越BBB的，如果所述物质的最初注射的量的至少0.1％、0.2％或0.5％在合理的时间量之内渗透穿越分隔层，优选地如果所述物质的至少1％、2％或3％渗透，更优选地如果所述物质的至少5％、10％或20％渗透。允许对受试物质进行定量的方法是技术人员已知的，并且包括Western印迹法、放射免疫测定法、定量ELISA、qPCR或半定量PCR(在核酸的情况下)、荧光辅助细胞分选术(FACS)等。
测定在“转越”区室中受试物质的存在情况另外还可以包括测定该物质在所述区室的哪个位点处被发现的步骤，尤其是当将所述物质施加在注射区室中时。“位点”在此以广义进行使用，具有下述含义：任何的特定地点或者地点或环境类型，或者可以描述的功能实体，其中可能地包括物质的生理化学状态，例如“吸附至细胞培养容器的表面(或分子涂层)”、“在培养基中处于溶液中”、“结合至(给定细胞类型的)细胞表面”、“在给定的细胞区室例如溶酶体中”、“在包含给定蛋白质的复合体中”等。在特别的实施方案中，所述方法包括下述的另外步骤：测定所述受试物质是否与给定的细胞类型相联合，尤其是内化到所述细胞类型(尤其是脑区室的细胞类型)中和/或结合至所述细胞类型(尤其是脑区室的细胞类型)的细胞表面。在特别的实施方案中，所述方法包括下述步骤：通过免疫组织化学测定物质是否被靶向给定的细胞类型，即与所述细胞类型相联合并且不或显著更少地与在该区室中的其他细胞相联合。允许测定其中受试物质被发现的位点的方法是技术人员已知的，并且包括基于显微术的方法(特别是免疫组织化学、荧光显微术、共聚焦显微术、电子显微术等)、用于测定与特定细胞区室的联合的方法(其涉及细胞破坏，例如细胞分级分离/或梯度离心，以分开所述区室)、用于测定在多蛋白复合体中蛋白质的存在情况的方法例如免疫沉淀等。
测试受试物质对于BBB的毒性包括测定所述受试物质是否对于构成所述装置的分隔层的内皮细胞具有毒性效应的步骤。在另一个实施方案中，测试受试物质对于BBB的毒性包括测定所述受试物质是否对于存在于所述容器中的其他脑细胞具有毒性效应的步骤。将所述物质施加至注射区室和/或脑区室并测定毒性效应通常在将受试物质温育给定的时间量后进行。在此类方法中典型的温育时间优选地从2小时至7天，更优选地从6小时至4天变动。温育时间优选地等于或长于1小时，更优选地等于或长于2小时或4小时，和更优选地等于或长于6小时或12小时。温育时间优选地等于或短于7天，更优选地等于或短于6天或5天，和更加优选地等于或短于4天、3天或2天。当细胞呈现出相比于未温育的或在相当的实验条件下但在没有施加受试物质(或施加对于BBB不具有毒性效应的对照物质)的情况下进行温育的细胞而言减小的生存力时，可以检测到毒性效应。细胞生存力可以通过使用技术人员已知的方法来测定。检测毒性效应的其他方法也是技术人员已知的，包括检测和/或定量细胞死亡或凋亡的标志物，例如在正在经历细胞死亡或凋亡的细胞中表达且不在活细胞中表达(或以比在活细胞中更大的量表达)的蛋白质和/或基因。
虽然关于用于测试受试物质对于内皮细胞或对于该装置的其他脑细胞的毒性效应的存在的方法给出了详细说明，但类似的方法也适用于测试受试物质对于所述细胞和/或对于该装置的其他细胞(特别是脑区室的细胞)的其他生物学效应。
实施例
实施例1：VHH和含VHH的多肽序列
从VHH免疫文库中选择具有SEQ ID NO:3的序列的VHH(命名VHH A12)。先前已创建了VHH免疫文库，如在1997年由Ghahroudi等人所描述的。已经用从阿尔茨海默病患者中分离的人脑海马提取物对一只羊驼进行了免疫接种。该提取物包含不同的蛋白质。将从循环B淋巴细胞中提取的mRNA进行反转录。为了选择仅编码VHH而不编码常规抗体的cDNA，借助于与FR1和CH2区互补的引物对它们进行了扩增。将VHH序列以与噬菌体外壳蛋白III(pIII)相融合的方式克隆入噬菌粒pHEN1中，并且将该噬菌粒用于转化大肠杆菌TG1细菌。重组VHH的表达用IPTG来进行诱导。在通过噬菌体展示技术进行淘选后，选择出独个克隆，进行培养，并进行测试。当我们选择出了特定的VHH后，我们用NcoI和NotI对于细菌培养物进行了消化步骤，在37℃下3小时。将消化产物加载在琼脂糖凝胶中并在180V下进行电泳45分钟以将插入片段与质粒pHEN1载体分开。我们回收了相应于VHH序列的400bp级分，并且与事先用NcoI和NotI于16℃过夜进行消化的另一个质粒pASK-Iba2进行了连接。对于所述连接，质粒/插入片段之比为1/5。将超感受态XL2细菌(Agilent technologies)首先通过添加β-巯基乙醇进行处理，并在4℃下温育10分钟，每2分钟轻轻涡旋。我们添加1μL的DNA(30ng)并在4℃下温育30分钟。在42℃下进行热脉冲30秒，然后将细菌在冰上温育2分钟。添加500μL的2YT，并将培养物在37℃下在搅拌下温育1小时。将两百个培养物涂布在培养皿上并在37℃下温育过夜。实行相同的操作以控制良好的细菌转化。将预培养物在30℃下在2YT+A中温育过夜。使用1mL的预培养物来接种100mL的2YT+A。当OD550等于0.5时，我们添加10μL的脱水四环素(最终浓度：200ng/mL)并在20℃下摇动过夜。VHH表达在细菌周质中，并且它们在C-末端区域中包含Strep-标签。借助于该标签，我们按照制造商的建议，用亲和层析柱Strep-Tactine Sepharose(Iba)从细菌中纯化出它们。为了控制样品纯度，可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质通过在室温下在搅拌下用考马斯亮蓝着色1小时来揭示。然后，通过相继的水浴来完成脱色。
用针对来自阿尔茨海默病患者的脑提取物(Sg tau 4697)的一个免疫噬菌体展示文库Inti来实现选择。在61个用Sg tau 4697筛选而分离出的克隆中，将2个克隆VHH-A12和VHH-E8在大肠杆菌中进行表达(图1)并进一步进行表征。
NV3-Cyto(NV)序列(SEQ ID NO:7)作为neurovita 3公开在WO2013068430中。已将NV3-Cyto序列插入在neurocargo-neurovita分子的–COOH部分处，其中紧记NV3必须保持其游离羧基末端(包含PDZ-BD)。所述neurovita序列可以特别地由具有下述序列的核酸所编码：
CGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTaCATGGCCAGCAAACCCGCTTA(SEQ ID NO:8)。
备选地，在VHH3(含VHH的多肽)中，将通过缺失PDZ-BS而失活的neurovita肽融合在所述含VHH的多肽的C-末端处。所述失活的neurovita具有SEQ ID NO:9的序列并且可以由具有下述序列的核酸所编码：
CGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTaCATGGCCAG(SEQ ID NO:10)。
已经从经免疫接种的羊驼噬菌体展示中分离出了不识别任何人脑蛋白质的VHHA12。它很好地进行表达并且具有碱性pI(9.78)。该VHH具有下述序列：
EVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVS(SEQ ID NO:3)，并且可以特别地由具有下述序列的核酸所编码：
GAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCC(SEQ ID NO:4)。
为了增加纳米抗体分子仅针对神经元细胞的特异性，我们使用了衍生自CVS-NIV毒株的G蛋白(欧洲专利09290257.6(2009)、PCTIB2010000967(2010)、US 13/263050和US2012100116)的RDP序列(即狂犬病病毒衍生肽)。可以使用两个特别的序列，要么RDP1即YTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKG(SEQ ID NO:1)，其特别地由具有下述序列的核酸所编码：
TATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGG(SEQ ID NO:2)，
要么RDP2即KSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGGG(SEQ ID NO:32)。这两个肽已这样被设计成包含参与识别两种不同的被RABV用作受体的神经元分子的表位(Lafon M.,2005)。在第一组neurocargo-neurovita分子中，仅裁剪了RDP1。可以使用的其他靶向神经元细胞的肽包括具有下述序列的肽：
KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPH(SEQ ID NO:33)，或
YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG(SEQ ID NO:34)。
所述含VHH的多肽包含strep-标签序列GGGSAWSHPQFEKAAA(SEQ ID NO:5)以对分子进行标记，其可以特别地由具有下述序列的核酸所编码：
GGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCA(SEQ ID NO:6)。它还包含具有序列MA的肽(MA肽)，其包含起始物甲硫氨酸(该MA肽特别地由具有序列ATGGCC的核酸所编码)。
已将上面的肽以下面的顺序(从N-末端至C-末端)相融合：MA肽、RDP1、VHH A12、Strep标签、NV。所得的多肽(在本文中称为VHH1)具有下述序列：
MAYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSGGGSAWSHPQFEKAAARRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(SEQ ID NO:11)。所述多肽可以特别地由具有下述序列的核酸所编码：
ATGGCCTATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGGGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCACGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGCAAACCCGCTTATGATAA(SEQ ID NO:12)，其在3’末端处包括两个终止密码子。
作为对照，产生了缺乏NV3-Cyto PDZ-结合结构域(PDZ-BD)(或PDZ-结合序列，PDZ-BS)的相应分子(在本文中称为VHH3)，或缺乏RDP1序列的相应分子(在本文中称为VHH2)。这些多肽相应于下列融合肽，并且具有下列序列：
VHH2：MA肽、VHH A12、Strep标签、NV，
MAEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSGGGSAWSHPQFEKAAARRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(SEQ ID NO:13)，其可以特别地由具有下述序列的核酸所编码：
ATGGCCGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCACGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGCAAACCCGCTTATGATAA(SEQ ID NO:14)，其在3’末端处包括两个终止密码子；VHH3：MA肽、RDP1、VHH A12、Strep标签、缺失了PDZ-BD的NV，
MAYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSGGGSAWSHPQFEKAAARRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQ(SEQ ID NO:15),其可以特别地由具有下述序列的核酸所编码：
ATGGCCTATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGGGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCACGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGTGATAA(SEQ ID NO:16)，其在3’末端处包括两个终止密码子。
也可以使用由以下述顺序的下列多肽的融合物构成的多肽：MA肽、RDP1、VHH A12、NV；所述多肽具有下述序列：
MAYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(SEQ ID NO:45)，并且特别地由具有下述序列的核酸所编码：
ATGGCCTATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGGGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCCGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGCAAACCCGCTTATGATAA(SEQ ID NO:46)，其在3’末端处包括两个终止密码子。
已通过在基因工程中所使用的标准程序产生了所有构建体(如在Préhaud C.等人,2010中简要描述的)。
引人注目地，在本文中所公开的VHH A12的序列显示出一些与现有技术的VHH的差异，甚至在后者显示出相对强的保守性的残基处。
实施例2：neurocargo-neurovita分子的克隆和表达
neurocargo-neurovita基因序列(VHH1：SEQ ID NO:12，VHH2：SEQ ID NO:14，VHH3：SEQ ID NO:16)由Eurofin MWG Operon公司化学合成，并被插入在pASK-IBA2质粒(IBA,BioTAGnology,USA)中，在四环素启动子的控制之下。在该质粒中，ompA信号序列指导表达出的蛋白质进入周质空间并在易位过程中被切割掉。在周质空间中，可以发现正确折叠的形成二硫键的蛋白质。将所述重组质粒用于转化XL1-blue大肠杆菌细菌(Stratagene,USA)。通过PCR来鉴定重组细菌，并制备甘油储备物。表达含VHH的多肽，并将其从细菌周质中纯化，如P.Lafaye(2008)所描述的。备选地，也可以从细胞质中直接提取蛋白质。将周质提取物通过免疫亲和层析进一步进行纯化，其中使用小鼠高亲和力抗strep标签mAb，例如C23.21(P.Lafaye,Institut Pasteur biological collection)。含VHH的多肽的表达通过使用mAb C23.21的Western印迹法来进行监测。
进一步地，为了显示其二聚体呈现，按照制造商的说明书，将经纯化的Neurocargo-neurovita在具有NuPage MES走样缓冲液的NuPageTM凝胶(LifeTechnologies,France)中进行解析，其中要么作为变性样品(NuPageTM LDS+DTT+煮沸)，要么作为天然样品(NuPageTM LDS)。neurocargo-neurovita分子种类通过使用抗strep标签mAb C23.21的Western印迹法来进行鉴定(图1C)。
实施例3：中性VHH A12的表征
VHH A12显示出具有下列特征：碱性pI(即pI>8.5；特别地对于单独的VHH未9.86，和对于VHH1多肽为10.36)；通过Western印迹法，针对人脑提取物(即Sg tau4697)和小鼠脑提取物(即Tg 4510)和GFAP(即胶质细胞原纤维星形胶质细胞蛋白)没有反应性；并且通过免疫组织化学，对于Tg 4510小鼠脑组织没有免疫反应性。
相比于识别脑蛋白质的对照VHH(H8/E9，与VHH E9相同，Perruchini等人)而言的本发明的VHH(A12)的特异性通过Western印迹法在3种不同的抗原上来进行测定：人脑提取物(Sg tau 4697)、小鼠脑提取物(Tg 4510)和经纯化的蛋白质GFAP(星形胶质细胞的特异性标志物)。如在图2中所显示的，用VHH A12未检测到条带。进一步地，从含有NFT的Tg4510小鼠组织(Grueninger等人,2010)中进行VHH免疫组织化学。作为对照，特异性抗-NFT单克隆抗体，AT8，对于在Tg 4510小鼠石蜡切片上的NFT的免疫检测显示出优异的灵敏度和选择性。相反地，用VHH A12未观察到标记(图1)。
对于Western印迹法，首先我们在200V下进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳45分钟。然后，我们在30V下在1小时期间将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜。我们在搅拌下用PBS-2％乳使硝酸纤维素膜饱和1小时。然后，将膜与在PBS-2％乳中以1μg/ml进行稀释的所选择的VHH一起温育1小时，并用PBS Tween洗涤3次5分钟。以1:2500添加识别Strep-标签的第二小鼠mAb C23-21(DI 2012-32高亲和力单克隆抗-Strep-标签抗体C23.21；Girard-blancC.,Krey T.,Vasiliauskaite ieva,Nato F.,Lafaye P.,Dartevelle S.,Rey F.)，并在37℃下温育1小时。然后，在另外的洗涤后，添加用过氧化物酶进行标记的抗小鼠mAb 1小时。在PBS Tween中进行三次5分钟的洗涤。接着，我们按照制造商的说明书用光敏胶片(ThermoScientific,ECL Western Blotting Substrate)进行揭示。
实施例4：神经突增生
神经突增生测定法已经在Préhaud等人,2010中详尽地进行了描述。
Neuroscreen细胞(NS细胞)是pC12亚克隆。如由制造商的说明书所描述的那样(http://www.cellomics.com/content/menu/Neuroscreen-1_Cells/)，使所述细胞在RPMI培养基中进行生长。监测NS细胞72小时，并用200ng/ml的NGF(在时间＝0时，仅一击)和neurocargo-neurovita(10pg，在时间＝6时，仅一击)进行处理。神经突增生(NO)基本上如对于SH-SY5Y所描述的那样来进行，除了在感染后72小时监测NO并且NS细胞总是在其饲养培养基(Cellomics,USA)中进行生长之外。
在一式四份的孔上使用Cell insight(Cellomics,USA)来对NS细胞进行成像。通过使用Neuronal profiling bioapplication(Cellomics,USA)来测定平均神经突长度/神经元。
实施例5：刮擦测定法(轴突再生)
对于刮擦诱导型测定法，在经聚-D-赖氨酸-层粘连蛋白包被的cell+(Sarstedt,Germany)12-孔塑料器皿上接种200mm2的NT2-N细胞(n＝8)，并使其生长两天，以便在胰蛋白酶消化后完全回收。在刮擦之前4小时更换培养基，并添加10pg的neurocargo-neurovita/孔。用注射针头(26GX1/2”，12-4.5)制造独个伤口。在每个独个孔上制造至少10个刮擦。备选地，在刮擦前一小时添加neurocargo-neurovita。在致伤后6天用PFA(4％)固定细胞，并用结晶紫溶液进行染色。使用配备有DC 300FX照相机的Leica DM5000B显微镜(x20物镜)对细胞进行成像，并且使用ImageJ 1.38X软件(Wayne Rasband,NIH,USA,http://rsb.info.nih.gov/ij/)及其插件NeuronJ来进行分析。从8次实验中测定处于再生的神经元的平均百分比。
实施例6：通过流式细胞术来监测的AchR结合和竞争测定法，neurocargo- neurovita进入NS细胞
所遵循的流式细胞术程序已描述在Préhaud等人,2003中。简而言之，使表达α7AchR的HEK 293细胞(Yamauchi等人,2011)和亲本HEK 293细胞在高葡萄糖DMEM(LifeTechnologies,France)+10％FBS中进行生长。将HEK 293细胞或表达AchR的HEK 293细胞接种在6-孔平板上(1.e+06个细胞/孔)。在接种后24小时，将细胞放置在冰上，并且在为了流式细胞术而通过使用染色缓冲液进行加工之前用20pg的neurocargo-neurovita处理30分钟。备选地，对于竞争测定法，将细胞用经U.V.灭活的2.e+07PFU的狂犬病病毒CVS毒株(如在Mégret等人,2005中所描述的)或者用16μMα银环蛇毒素(Sigma,USA)进行处理。为了监测neurocargo-neurovita分子的进入，进行相同的实验，但使用透化缓冲液，其允许检测结合至受体的分子和在细胞质中的分子两者。结合至细胞质膜受体的neurocargo-neurovita分子用上面所描述的抗-strep标签mAb+缀合有Cy5的抗小鼠抗体(Jackson laboratory,USA)来进行检测。
实施例7：神经元细胞(NS)生长锥活动性的测定
用200ng/ml的NGF(在时间＝0时，仅一击)和neurocargo-neurovita(10pg，在时间＝6时，仅一击)使NS细胞进行分化。作为对照，用不表达neurocargo-neurovita的细菌的细菌周质提取物处理细胞。在48小时，将细胞用PFA进行固定，用0.3％triton X100进行透化，并为了免疫荧光进行加工，如已经描述的那样(Préhaud等人,2010)。用Hoescth 33342检测细胞核，用小鼠抗-β3微管蛋白抗体(G7121,Promega,France)和抗小鼠Alexa 488抗体(Jackson laboratory,USA)检测βIII微管蛋白，和用缀合有Alexa 546的鬼笔环肽(A22283,Life Technologies,France)检测F肌动蛋白网。
实施例8：细胞基因表达的实时PCR分析
RT-PCR基因表达分析程序已经在Préhaud等人,2005中详尽地进行了描述。在此由于用于所述测定法的细胞培养塑料器皿，用从200ng至1μg变动的RNA来制备cDNA分子。在该研究中所使用的引物为：TH(HSTH1SG，Qiagen，Germany)，GFAP(F:CTGCTTCTTAACCCCAGTAAGCCA(SEQ ID NO:39)，R:CAGCAGTGCCCTGAAGATTAGCAG(SEQ ID NO:40))，AQP4(F:GGTATAGTCAATTCTTATTTGAAT(SEQ ID NO:35)，R:CTTGAATCTCAATAGGTGCCCTTA(SEQ ID NO:36))，PYGB(F:TCCTGCTGTGTCCTGAGGTGCATT(SEQ ID NO:43)，R:GCCCAGATCCAGCATGCAAGGTGC(SEQ ID NO:44))，NEFH(F:CCCCAGGCGATGGACAATTATGAT(SEQID NO:41)，R:CACTTGGTTTTATTGCACAGAAGC(SEQ ID NO:42))，CD200R(F:TTAACACTTCATGGCCTGTAAGA(SEQ ID NO:37)，R:TGTGCCATTGCTCCAGTATTCTTG(SEQ ID NO:38))，和来自Qiagen,Germany(HSSLC2A1-1，HSSLC7A5，HSSLC1A1-1，HSSLC38A5-1，HSSLC16A1，HSSLCO1C1，HSSLCABCB1-1，HSABCG2-1，HSABCC1-1，HSABCC2-1，HSABCC4-1，HSABCC5-1，HSLDLR-1，HSLRP1-1，HSINSR-1，HSLEPR-1，HSPVLAP-1，HSLU-1，HSTFRC-1，HSAGER1，HSSTRA6-1)。
实施例9：人BBB的体外模型的产生
人脑微血管内皮细胞系(hCMEC/D3)的无限增殖化通过Weksler等人,2005来进行。使hCMEC/D3在补充有胎牛血清(5％，Eurobio,France)、氢化可的松(1.4μM，Sigma,USA)、bFGF(1ng/mL，Sigma,USA)、抗坏血酸(5μg/mL，Sigma,USA)、化学成分确知的脂质(1/100，Life technologies,France)、HEPES(10mM，Life technologies,France)、青霉素-链霉素(Life technologies,France)的EBM-2(Lonza,Switzerland)中进行生长。在经鼠尾胶原I(150μg/mL，R&D systems,U.K.)包被的培养瓶(Corning,USA)上按惯例地培养细胞，并且每周剥落(通过胰蛋白酶消化)两次。在经鼠尾胶原I(150μg/mL，R&D systems,U.K.)和纤连蛋白(10μg/mL，Sigma,USA)包被的聚酯Transwells(直径为12mm，孔径为0.4μm，Corning,USA)上获得经分化的单层。将细胞以25,000个细胞/cm2的密度进行接种并培养5天。在分化的第3天更换培养基。在第5天，将所述体外内皮血脑屏障与接种在该装置的下面区室上的微型脑细胞一起进行培养(即微型脑-BBB)，或者备选地将它们仅留在培养基上(BBB)。因此，微型脑-BBB模型除了内皮细胞外还包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，而BBB模型仅包含内皮细胞。
使CHME小胶质细胞在DMEM-F12(Life Technologies,France)+10％FBS中进行生长(Janabi等人,1995)，使hNT2N/A(神经元-星形胶质细胞)分化并从人畸胎癌细胞NTera/cl2D1中分离，如由Préhaud等人,2005、Lafon等人,2005和Mégret等人,2007所描述的。在DMEM F12(Life Technologies,France)+5％FBS中维持hNT2N/A。通过轻度胰蛋白酶消化来分离CHME和hNT2N/A细胞，并且以从0.015至0.24变动的各种比例进行混合，以便匹配不同脑区域的小胶质细胞与神经元-星形胶质细胞的比例(Kettenmann和Ransom,2012)。将这些共培养细胞(一起称为微型脑细胞)接种在经聚-D-赖氨酸-层粘连蛋白包被的CellBind塑料器皿(Corning,USA)上，在EBM-2完全培养基中(如上面所描述的)。在24小时后，添加包含内皮细胞单层的Transwell，并且在24小时之后该系统就可供使用了。
实施例10：纳米抗体的微型脑-BBB穿越以及neurocargo-neurovita穿越和靶向
接种包含1.5％小胶质细胞的微型脑-BBB装置。在接种后一天，将缀合有Alexa488的抗-GFAP VHH(VHHE9，Li等人,2012)施加至上面小室(10pg的纳米抗体)。在3和24小时后，对在下面小室中的细胞进行PFA固定，用0.3％triton X100进行透化。通过使用cellinsight(Cellomics,USA)随机摄取照片(>500)。监测荧光集中点。
备选地，对于neurocargo-neurovita分子，在用上面所描述的抗-strep标签抗体和缀合有Alexa 488的抗小鼠抗体(Life technologies,France)进行染色后，监测荧光集中点。
为了测定用neurocargo-neurovita分子所靶向的神经元的数目，还将细胞用抗神经丝200KDa抗体(Sigma,USA)和缀合有Alexa 546的抗兔抗体(Life technologies,France)进行染色。
实施例11：用萤光黄来测定限制性细胞旁渗透性
hCMEC/D3细胞的限制性细胞旁渗透性通过其对于非透性荧光标记物萤光黄(LY)(Sigma Aldrich,L0259)的低渗透性来进行评估。简而言之，在滤器上培养6天后，将hCMEC/D3单层转移至12-孔平板，该平板在每孔(离腔区室)中包含1.5mL的转运培养基(HBSS CaMg(Gibco,14025-100)，其补充有10mM的hepes(Life technologies,15630-080)和1mM的丙酮酸钠(Life technologies,11360))。然后，将0.5mL的包含50μM LY的转运培养基添加至腔区室。在37℃，5％CO2，95％湿度下进行温育。在15、25和45分钟后，将插入物转移入预先装有1.5mL的转运培养基的新孔中。在45分钟后，在每个时间点处从所述两个区室中取出等份试样，并使用荧光分光光度计(Tecan Infinite F500)来测定LY的浓度。
以厘米/分钟(cm/min)来计算LY的内皮渗透性系数(Pe)，如由Siflinger-Birnboim等人(1987)所描述的。为了获得不依赖于浓度的转运参数，使用清除原则(clearance principle)。简而言之，将平均清除体积对时间进行作图，并且通过线性回归来估计斜率。按照下述公式，“插入物”的渗透性(PSf，对于仅用胶原包被的插入物)和“插入物+内皮细胞”的渗透性(PSt，对于具有胶原和细胞的插入物)两者都得到了考虑：1/PSe＝1/PSt-1/PSf。
然后，将关于内皮单层的渗透性值除以插入物(Corning,3460)的多孔膜的表面积，从而获得所述分子的内皮渗透性系数(Pe)(以cm.分钟-1表示)。
跨内皮电阻(TEER)的测定
如已经由Weksler等人(2005)所描述的那样，在Endogro-MV培养基(SCME004,Merck Millipore,France)中培养5、6和7天后，测定HCMEC/D3的TEER。
实施例12：SK-N-SH D细胞系
SK-N-SH D细胞系是ATCC HTB-11SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞系的亚克隆。已在分化培养基中作为亚克隆而分离出了它，其可以作为是β3-微管蛋白和肌动蛋白-F阳性细胞的神经元样细胞以100％自然地分化。该细胞系已于2015年9月4日以参考号I-5010保藏于CNCM(Institut Patseur,Paris,France)。
使SK-N-SH D细胞在DMEM Glutamax-I-High Glucose(4.5g/l)-Na Pyr(LifeTechnologies,#31966-021)+10％胎牛血清中按惯例地进行生长。当被转移入Endogro-LS(#SCME 001)或Endogro-MV(#SCME004)培养基(Merck-millipore,France)中时，所述细胞自发地分化。
就在本文中所公开的用途中的适合性，成功地测试了通过在脑区室中使用这些细胞而产生的BBB模型，和要不然与上面所描述的模型类似的且以类似方式产生的BBB模型。
特别地，依照与上面类似的程序产生并测试了包含HCMEC-D3细胞且在脑区室中包含SK-N-SH D细胞的BBB模型。当在该模型中进行温育时，包含Neurovita的本发明的含VHH的多肽不改变渗透性(通过Pe所测量的)。通过荧光显微术显示，包含靶向神经元细胞的肽的含VHH的多肽跨越内皮细胞层并且被靶向在脑区室中的脑细胞。还可以成功地开发出另外的模型，其包含HCMEC D3细胞和在脑区室中包含SK-N-SH D细胞(神经元)、U 373MG MG细胞(ECACC#08061901)(星形胶质细胞，即大胶质细胞)和CHME(小胶质细胞)。
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tatctacaga tgaacagcct gaaacctgag gacacggccg attattactc taaggttcac 300
ttaatacgtc ttggggccgc gcgggcgtat gactactggg gccaggggac ccaggtcacc 360
gtctccggtg gaggctcagc ttggagccac ccgcagttcg aaaaagcggc cgcacgccgg 420
gtaaaccgca gtgaaccgac ccagcacaat ctgcgtggga ctggtcgtga ggtgtccgtt 480
acgccacagt ctggcaaaat cattagctcg tgggaagtac atggccagca aacccgctta 540
tgataa 546
<210> 15
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
Met Ala Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser
1 5 10 15
Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Glu
20 25 30
Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Val Thr Val Ser Gly Ser Ile Asp Val Ile Asn Asn
50 55 60
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Ala Arg Glu Leu Val Ala
65 70 75 80
Thr Ile Thr Ser Gly Phe Ser Thr Asn Tyr Ala Ser Ser Val Lys Gly
85 90 95
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ala Val Tyr Leu Gln
100 105 110
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Ser Lys Val
115 120 125
His Leu Ile Arg Leu Gly Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro
145 150 155 160
Gln Phe Glu Lys Ala Ala Ala Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr
165 170 175
Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln
180 185 190
Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Val His Gly Gln
195 200 205
<210> 16
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
atggcctata cgatttggat gccggaaaat ccacgtctgg gcatgtcgtg cgatatcttt 60
accaacagtc gcggtaaacg cgcgagcaaa ggggaggtgc agctgcaggc gtctggggga 120
ggcttggcgc agcctggggg gtccctgaga ctctccgtaa cagtctctgg aagtatcgat 180
gttattaata acatggcctg gtaccgccag gctccaggga atgcgcgcga gttggtcgcc 240
acaattacta gtggttttag cacaaactat gcaagctccg tgaagggccg attcaccatc 300
tccagagaca acgccaagaa agcggtatat ctacagatga acagcctgaa acctgaggac 360
acggccgatt attactctaa ggttcactta atacgtcttg gggccgcgcg ggcgtatgac 420
tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tccggtggag gctcagcttg gagccacccg 480
cagttcgaaa aagcggccgc acgccgggta aaccgcagtg aaccgaccca gcacaatctg 540
cgtgggactg gtcgtgaggt gtccgttacg ccacagtctg gcaaaatcat tagctcgtgg 600
gaagtacatg gccagtgata a 621
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser
20 25 30
<210> 18
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln Leu Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser
20 25 30
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Gln Thr Arg Leu
1 5 10
<210> 20
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(7)
<223> Xaa可以为任意天然存在的氨基酸
<400> 21
Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Thr Arg Leu
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Xaa可以为任意天然存在的氨基酸
<400> 22
Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Thr Arg Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> Xaa可以为任意天然存在的氨基酸
<400> 23
Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Thr Arg Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Val His Gly Gly Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 25
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Val Ala Thr Gln Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 26
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Val Tyr Thr Gly Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 27
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Val His Thr Gly Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 28
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Val His Thr Gln Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 29
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Val Ala Gly Gly Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 30
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Ala Glu Ala Gln His Thr Gln Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 31
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
1 5 10 15
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
20 25 30
Trp Glu Val His Ala Ser Gly Gly Gln Thr Arg Leu
35 40
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu
1 5 10 15
Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 33
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu
1 5 10 15
Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His
20 25
<210> 34
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 34
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly
20 25
<210> 35
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Thr Cys Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr
1 5 10 15
Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala Thr
20
<210> 36
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Cys Thr Cys Ala Ala Thr Ala Gly Gly
1 5 10 15
Thr Gly Cys Cys Cys Thr Thr Ala
20
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 37
Thr Thr Ala Ala Cys Ala Cys Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Thr Ala Ala Gly Ala
20
<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 38
Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly
1 5 10 15
Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr Gly
20
<210> 39
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala
1 5 10 15
Gly Thr Ala Ala Gly Cys Cys Ala
20
<210> 40
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Gly
20
<210> 41
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala
1 5 10 15
Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr
20
<210> 42
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Gly Cys
1 5 10 15
Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys
20
<210> 43
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Thr
20
<210> 44
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly
1 5 10 15
Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys
20
<210> 45
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
Met Ala Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser
1 5 10 15
Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Glu
20 25 30
Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Val Thr Val Ser Gly Ser Ile Asp Val Ile Asn Asn
50 55 60
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Ala Arg Glu Leu Val Ala
65 70 75 80
Thr Ile Thr Ser Gly Phe Ser Thr Asn Tyr Ala Ser Ser Val Lys Gly
85 90 95
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ala Val Tyr Leu Gln
100 105 110
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Ser Lys Val
115 120 125
His Leu Ile Arg Leu Gly Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr
145 150 155 160
Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln
165 170 175
Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Val His Gly Gln Gln Thr Arg
180 185 190
Leu
<210> 46
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
atggcctata cgatttggat gccggaaaat ccacgtctgg gcatgtcgtg cgatatcttt 60
accaacagtc gcggtaaacg cgcgagcaaa ggggaggtgc agctgcaggc gtctggggga 120
ggcttggcgc agcctggggg gtccctgaga ctctccgtaa cagtctctgg aagtatcgat 180
gttattaata acatggcctg gtaccgccag gctccaggga atgcgcgcga gttggtcgcc 240
acaattacta gtggttttag cacaaactat gcaagctccg tgaagggccg attcaccatc 300
tccagagaca acgccaagaa agcggtatat ctacagatga acagcctgaa acctgaggac 360
acggccgatt attactctaa ggttcactta atacgtcttg gggccgcgcg ggcgtatgac 420
tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc tcccgccggg taaaccgcag tgaaccgacc 480
cagcacaatc tgcgtgggac tggtcgtgag gtgtccgtta cgccacagtc tggcaaaatc 540
attagctcgt gggaagtaca tggccagcaa acccgcttat gataa 585
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
Ile Asp Val Ile Asn Asn Met Ala
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
Thr Ile Thr Ser Gly Phe Ser Thr Asn Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
Lys Val His Leu Ile Arg Leu Gly Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Tyr
1 5 10 15

Claims (18)

1.包含骆驼科动物重链抗体的VHH或者由骆驼科动物重链抗体的VHH组成的多肽，其中所述VHH：
i)具有SEQ ID NO:3的序列；
ii)为i)的VHH的序列变体，其与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性；或
iii)为i)或ii)的VHH的一部分；
并且其中这样的多肽是可渗透穿越血脑屏障的，且具有等于或高于8.5，优选地等于或高于9的等电点。
2.权利要求1的多肽，其中所述部分的序列长度为VHH片段的序列长度的至少90％。
3.权利要求1至2中任一项的多肽，其中所述多肽包含具有SEQ ID NO:3的序列的VHH片段的CDR区。
4.权利要求1至3中任一项的多肽，其为含VHH的多肽，其中所述VHH或其部分以符合读框的方式与另外的肽相融合。
5.权利要求4的多肽，其包含靶向神经元细胞的肽，优选地在所述多肽的NH2-末端处。
6.权利要求5的多肽，其中所述靶向神经元细胞的肽由从由下列各项组成的组中选择的序列组成或者包含从由下列各项组成的组中选择的序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:34。
7.权利要求1至6中任一项的多肽，其具有二聚化能力，特别是同二聚化能力，和优选地其中通过二硫桥来实现同二聚化。
8.权利要求4至7中任一项的多肽，其包含标签肽或亲和肽。
9.权利要求4至8中任一项的多肽，其包含以符合读框的方式融合的效应多肽，特别是对于下列方面具有效应的效应多肽：细胞生存力、细胞周期状态、凋亡、细胞存活、细胞死亡、有丝分裂、细胞分化、细胞的大小或形态、细胞生长、神经突增生、细胞之间的连接、细胞信号传导途径的激活状态、信号转导、细胞运动性、细胞活动性、疾病相关状况、损伤后或损害后的相关状况、诊断相关状况。
10.权利要求9的多肽，其中所述效应多肽由衍生自狂犬病病毒G蛋白的肽构成或者包含衍生自狂犬病病毒G蛋白的肽，所述肽对于神经元的存活和/或保护和/或活动性具有效应，和/或促进神经突增生，特别是具有SEQ ID NO:7的序列的肽。
11.权利要求9至10中任一项的多肽，其中在所述VHH和所述效应多肽之间插入肽间隔子。
12.权利要求1至11中任一项的多肽，其包含VHH序列例如SEQ ID NO:3、靶向神经元细胞的肽例如SEQ ID NO:1、Neurovita序列例如SEQ ID NO:7和任选地标签序列例如SEQ IDNO:5，并且其优选地具有从由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:45组成的组中选择的序列。
13.编码权利要求1至12中任一项的多肽的多核苷酸，特别是包含SEQ ID NO:4的序列、SEQ ID NO:2的序列、SEQ ID NO:8的序列和任选地SEQ ID NO:6的序列的多核苷酸，特别是由选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:46的序列组成的多核苷酸。
14.包含权利要求13的多核苷酸的载体。
15.权利要求14的载体，其适合于在细菌中表达由所述多核苷酸所编码的多肽，其中优选地使得能够在所述细菌的周质中回收由所述多核苷酸所编码的多肽。
16.细胞或细胞系，特别是细菌细胞，其包含权利要求14至15中任一项的载体，和/或权利要求13的多核苷酸。
17.组合物，其包含权利要求1至12中任一项的多肽、权利要求13的多核苷酸、权利要求14或15中任一项的载体、权利要求16的细胞或细胞系，以及与之相联合的适合于体内施用的生理学上可接受的载料。
18.权利要求1至12中任一项的多肽、权利要求13的多核苷酸、权利要求14至15中任一项的载体、权利要求16的细胞或细胞系或者权利要求17的组合物，其用于在神经学疾病的治疗中用作药物，所述神经学疾病尤其为神经变性疾病、脑中风、创伤、损害或损伤。
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