ITMI20082229A1 - Nuovi recettori gpcr chimerici, loro usi per lo screening di fitofarmaci, e metodi di screening relativi - Google Patents
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Description
Titolo: “Nuovi recettori GPCR chimerici, loro usi per lo screening di fitofarmaci, e metodi di screening relativi”
La presente invenzione concerne la costruzione di nuovi recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) chimerici e loro usi per lo screening di fitofarmaci. In particolare, la presente invenzione si riferisce anche ai metodi di screening di fitofarmaci che impiegano tali recettori GPCR chimerici. L’invenzione si riferisce ulteriormente a metodi per la costruzione di recettori GPCR chimerici in grado di localizzarsi in membrana, a partire da recettori GPCR privi di tale capacità.
I nematodi parassiti delle piante provocano ogni anno enormi danni all’economia agricola di tutto il mondo. Tra i parassiti più diffusi ci sono gli endoparassiti che includono Heterodera e Globodera (nematodi cisticoli) e Meloidogyne (galligeni). Le specie appartenenti al genere Meloidogyne rivestono grande importanza in quanto infettano piante di notevole interesse economico, quali il grano, il mais, la patata, il pomodoro e le leguminose.
Per contrastare la diffusione di questi nematodi si è fatto ricorso in passato a metodi tradizionali come la rotazione delle colture o la ricerca di piante naturalmente resistenti, ai quali si è affiancato l’uso massivo di nematocidi.
La maggior parte dei nematocidi in commercio sono estremamente tossici e sono stati ristretti o banditi dall’Environmental Protection Agency: tra questi troviamo il bromuro di metilene che riduce l’ozono nell’atmosfera, l’aldicarb (Temik) tossina responsabile della contaminazione delle falde acquifere, e l’1,3-dicloropropene sostanza che ha effetti cancerogeni sull’uomo.
È necessario sviluppare una nuova generazione di agrofarmaci, molto più selettiva, che permetta il controllo dei nematodi dannosi, ma che nel contempo abbia un effetto nullo sugli organismi benefici del terreno e sull’ambiente.
Di fondamentale importanza per lo sviluppo di una nuova generazione di agrofarmaci è la scelta del target molecolare.
I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) comprendono un vasto gruppo di proteine, strutturalmente e funzionalmente simili tra di loro, che svolgono funzioni di vitale importanza in tutti gli organismi eucarioti.
Essi sono costituiti da una singola catena polipeptidica che attraversa la membrana sette volte con l’estremità aminoterminale extracellulare e quella carbossiterminale intracellulare. In seguito al legame con ligandi extracellulari (peptidi, piccole molecole, ioni, luce e composti aromatici) il recettore viene attivato innescando una risposta nella cellula che si traduce nella produzione di secondi messaggeri (cAMP, Ca<2+>, cGMP, IP3).
Nell’uomo sono stati identificati circa 800 recettori ed è stato dimostrato il loro coinvolgimento in molteplici funzioni: dalla percezione visiva e olfattiva alla risposta immunitaria (1).
Dato il loro elevato numero e l’importanza delle funzioni che essi svolgono, i GPCR rappresentano uno dei principali interessi per l’industria farmaceutica: essi costituiscono potenziali bersagli per nuovi farmaci ed attualmente più del 50% dei farmaci presenti sul mercato agiscono sui GPCR (2).
Il numero di recettori GPCR risulta essere molto elevato anche nel genoma dei nematodi: sono stati identificati circa 1300 geni codificanti per GPCR nel nematode modello Caenorhabditis elegans ed è stato dimostrato che sono coinvolti in funzioni di vitale importanza come la riproduzione, nutrizione e movimento (3).
Analogamente ai recettori umani, i recettori dei nematodi parassiti delle piante possono essere utilizzati come bersaglio di nuovi agrofarmaci.
Le convenzionali tecnologie utilizzate dalle industrie farmaceutiche per l’identificazione di molecole in grado di modulare l’attività dei GPCR prevedono l’espressione dei recettori umani in sistemi cellulari eterologhi e la messa a punto di saggi di attività biologica.
Quando il recettore viene espresso in un sistema cellulare, in seguito all’attivazione da parte di agonisti o inibizione da agonisti inversi, esso è in grado di modulare un segnale intracellulare misurabile. Questo sistema di espressione del recettore permette di analizzare collezioni di migliaia di molecole, naturali o di sintesi, e trovare quelle che sono in grado di modulare l’attività del recettore. Queste molecole una volta identificate rappresentano potenziali farmaci che, in seguito ad ottimizzazione, possono essere testati direttamente su animali e sull’uomo in studi di tipo clinico.
La stessa tecnologia può quindi essere applicata per la ricerca di potenziali fitofarmaci i quali, inibendo o iperattivando la funzione dei GPCR di nematodi parassiti, ne alterano le funzioni vitali.
Tuttavia, l’impiego di recettori GPCR come target biologici presenta un limite. Molti recettori GPCR, quando espressi in sistemi eterologhi, presentano difficoltà di localizzazione in membrana plasmatica, dovute alla struttura e alle caratteristiche del recettore stesso. Queste difficoltà rendono impossibile l’utilizzo del recettore per lo screening di molecole ad attività farmacologica, poiché la localizzazione dei GPCR in membrana plasmatica è un requisito fondamentale per il corretto funzionamento del recettore. Se il recettore non è esposto in membrana, ma si presenta in forma internalizzata nel citoplasma, non è in grado di interagire con le molecole, agonisti o agonisti inversi, con cui vengono trattate le cellule allo scopo di trovare tra queste potenziali modulatori dell’attività recettoriale.
Questo problema può essere risolto con tecniche che prevedono delle modifiche alla sequenza del recettore stesso, espressione di altre proteine o trattamenti chimici delle cellule: questo per garantire il corretto trasporto e la localizzazione in membrana dei recettori. Alcuni autori sono riusciti ad incrementare l’espressione in membrana di recettori GPCR olfattivi sostituendo la regione aminoterminale con quella del recettore umano della rodopsina (5), co-esprimendoli con il recettore β-adrenergico (6), oppure trattando le cellule con droghe che bloccano la proteolisi (7). Tuttavia questi sistemi risultano poco applicabili per lo screening di potenziali modulatori della attività dei recettori GPCR di nematodi parassiti. Sia la co-espressione di un GPCR con il recettore β-adrenergico, sia la modifica della porzione aminoterminale possono facilmente alterare l’interazione tra il recettore in esame e potenziali modulatori, che usualmente interagiscono con i tratti transmembrana o extracellulari della proteina. Il trattamento con droghe risulta poi troppo invasivo, e potrebbe con facilità compromettere la risposta delle cellule ai composti in analisi.
Sulla base di quanto sopra esposto appare evidente l’esigenza di disporre di nuovi metodi di screening e relativi target biologici che consentano di selezionare in modo selettivo fitofarmaci specifici contro i nematodi e che, di conseguenza, abbiano un minore impatto ambientale.
La Richiedente ha ora trovato che i recettori GPCR possono rappresentare dei convenienti target specifici per il controllo dei nematodi parassiti delle piante. Uno dei principali vantaggi associati alla scelta dei nematocidi è infatti la specificità e la selettività dei potenziali agrofarmaci. Molti di questi GPCR hanno un grado di identità molto basso con i recettori appartenenti ad altri organismi: tra i recettori dell’uomo e quelli dei nematodi esiste una percentuale di identità di solo 30%. Anche tra le varie specie di nematodi il grado di identità, seppur alto, non è mai completo: tra i recettori del nematode non parassita C.elegans e quelli del nematode parassita Meloidogyne incognita il grado di identità è di circa il 50-60%. Inoltre, gli amminoacidi conservati risiedono quasi tutti nei domini transmembrana del recettore, e questo garantisce la possibilità di trovare molecole che agendo sui domini extracellulari, meno conservati, siano in grado di agire specificatamente sui recettori degli organismi dannosi.
Tutto questo garantirebbe quindi che una molecola che agisca specificamente su un GPCR di M.incognita non interferisca con la vitalità degli altri organismi benefici del terreno, e non sia affatto dannosa per l’uomo e altri mammiferi.
Oltre la scelta dei GPCR e la costruzione di recettori GPCR chimerici che consentono la localizzazione dei GPCR nella membrana plasmatica, requisito fondamentale per il corretto funzionamento del recettore (dato che molti recettori GPCR quando espressi in sistemi eterologhi presentano difficoltà di localizzazione in membrana), esiste un altro aspetto innovativo della presente invenzione. La modifica dei recettori adottata non altera la funzionalità dei recettori. La modifica apportata, inoltre, non altera l’interazione con potenziali modulatori poiché riguarda una porzione del recettore normalmente non coinvolto nell’interazione con i ligandi.
La Richiedente ha ora individuato un metodo di screening di fitofarmaci specifici per i nematodi parassiti delle piante comprendente le seguenti fasi: a) trasformazione di una linea cellulare eterologa con uno o più recettori GPCR dei nematodi parassiti delle piante wild-type o chimerici: detti recettori GPCR chimerici essendo caratterizzati dal fatto di avere il dominio carbossiterminale sostituito con quello dei recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana;
b) mettere a contatto il composto da saggiare con detta linea cellulare;
c) misurazione del segnale intracellulare attivato dall'espressione o dalla stimolazione con un agonista noto del recettore GPCR wild-type o chimerico.
Per recettori GPCR wild type (wt) si intendono recettori GPCR che hanno una sequenza non modificata geneticamente, cioè possiedono la sequenza della proteina nativa, così come si trova nell'organismo di origine. Essa viene prima identificata in un determinato organismo, poi clonata in un opportuno vettore di espressione e trasfettata in un sistema cellulare eterologo. Il recettore così espresso avrà una sequenza identica a quella della proteina endogena che viene prodotta dall’organismo di origine. Un recettore GPCR chimerico è invece una proteina nata dalla fusione di due o più proteine, e più spesso anche di porzioni di proteine. Queste porzioni possono appartenere a proteine diverse provenienti dallo spesso organismo, o da proteine di differenti organismi. Per produrre una proteina chimerica, le sequenze geniche corrispondenti alle porzioni di proteine che si intendono fondere vengono unite insieme, in una unica sequenza genica. Questa sequenza viene clonata prima in un vettore di espressione e poi trasfettata in un sistema cellulare eterologo. La proteina così espressa sarà completamente nuova, in quanto risultante dalla fusione di più proteine differenti o parti di esse. La sequenza proteica del nuovo recettore chimerico sarà così diversa da tutte le altre sequenze di recettori che sono espressi in modo nativo dagli organismi viventi.
Ai sensi della presente invenzione per recettori GPCR wild-type dei nematodi parassiti delle piante si intendono quei GPCR che una volta trasfettati nella linea cellulare eterologa non hanno la capacità (o hanno una ridotta capacità) di localizzarsi sulla membrana plasmatica, requisito fondamentale per consentire lo screening di molecole con essi interagenti e pertanto necessitano di essere resi chimerici. Per recettori GPCR chimerici dei nematodi parassiti delle piante si intendono quei GPCR che derivano dalla fusione di un recettore GPCR che non ha la capacità di localizzarsi sulla membrana plasmatica (i.e. i recettori SerR1-like e DopR1-like di M.incognita), o che presenta una scarsa localizzazione in membrana (i.e. il recettore NprR1-like di M.incognita), con il dominio carbossiterminale di un recettore GPCR di nematodi non parassiti delle piante.
Per nematodi non parassiti delle piante si intendono le specie di nematodi a vita libera quali, ad esempio, Caenorhabditis elegans, C. briggsae, C. japonica, C. brenneri, C. remanei, Zeldia puntata. Le linee cellulari eterologhe usate per l’espressione di recettori GPCR possono essere linee cellulari di mammifero scelte tra: cellule CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary K-1), cellule HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293), cellule COS-7, fibrobasti NIH-T3. Le linee di insetto sono: Sf-9 e Sf-21 (Spodoptera frugiperda 9 e 21), S2 (Schneider 2 di Drosophila). Altri sistemi cellulari per esprimere recettori sono rappresentati da: cellule batteriche di E.coli, cellule di lievito e oociti dell’anfibio Xenopus laevis.
Secondo una forma preferita di realizzazione del metodo secondo l’invenzione detti recettori GPCR dei nematodi parassiti delle piante (i.e. Meloidogyne, Heterodera e Globodera) sono scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina, recettori della dopamina, recettori di neuropeptidi, recettori della galanina, recettori metabotropici del glutammato e putativi recettori di ammine biogeniche (i.e. tiramina, melatonina). In particolare, quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne incognita, detto recettore GPCR può essere scelto dal gruppo che consiste nelle sequenze amminoacidiche mostrate nella seguente Tabella 1:
IC/135288 Alternativamente, quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne hapla, detto recettore GPCR ha, in una forma preferita di realizzazione, la seguente sequenza amminoacidica:
MDYAPMPISSNITTWFLLAVFIFVIHRNPSFHSQTNYFLASLAISDLLLILVGVPFDVL FLWKSRFITSPFNGFCEITSTFISWFTFNSILTIVSLTWERLVAICYPFSLKPFFHRDA VIWLIIIIWFISFFPSLFIGLQFKLVIQDFCGHTHVNSNGLGSKCDFVGWSGNYGSGEN YTFEVMLFFTFVLPVLFVIYCYIRILRTLNEATFNSFHLNAGSSIVRKHTSSSHTNSTL LNAITEENLPSTSNNSNSNTAGNNSDLNARDSFTRSSLRSQRAHKTVMKMLIMIAALFF VCYLPYHLERLIVKYSAKGCTEPQMCLWLYHGTGLLQYISAALNPIIYNVMSRRFRREF KLLCYRIVKKENVTKTRSDNNNQLKMTPMNRFL (SEQ. ID NO:14).
Ancora secondo una forma alternativa di realizzazione dell’invenzione, quando detto nematode parassita delle piante è Globodera rostochiensis, detto recettore GPCR ha la seguente sequenza amminoacidica:
MLENDLENLDDSSLILHHLGGSFVHAQIVEIEENDYINSNTSVSNTNLNLFSSSSSTSS SSLFSSSSQRSPLLEPNFVDEIWPATSSNSLFYSHPIIAILISILIFLLILITIIGNLG VCAAILLVRKLKAQPANLLLISLALADFCVGLFVMPLAAVYVLEDRWIFGDILCRFWVT ADLTLCTASILNLCAISVDRHLAVTRALRYSALRTRRRICLYICIVWLGALLVSAAPLA LLPFPKIEQYCQVSQNRVYQIYATIIAFWGPSLIMVIVYVKLWSAAKRMHRQDQLVLRW QGVHLPSDGDLEDGLPPTTTTSNATKSLFRNDSIARANARFLFALRMSAQKFGYYDHQN NKTNGGEIINDDENLRIEVRTSASSSGGGGGGSSTLGTLRVPIVLIIMSAFIICWVPFF ILALAKSQHWVNYVPRWLDSLTLWLGYSNSMLNPIIYCKYNREFRVPFGEMLCCRFRTI QDVMRNESYYAKFGSPRISETKIGGSQQRSSGNNYYTKRKRNNTERRAPQNGFLDSSKT KKNYGIKRNSSPSILMESSK (SEQ. ID NO:16).
Secondo una forma particolarmente preferita di realizzazione dell’invenzione detti recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana sono scelti dal gruppo che consiste in C.elegans, C.briggsae, C. japonica, C. brenneri, C. remanei, Zeldia puntata.
Secondo una forma preferita di realizzazione dell’invenzione detto nematode non parassita è C.elegans e i recettori GPCR di C.elegans possono essere scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina SER-1 (Gene Bank: F59C12.2), SER-2 (C02D4.2), SER-3 (K02F2.6), SER-4 (Y22D7AR.13), SER-5 (F16D3.7), SER-6 (Y54G2A.35), SER-7 (C09B7.1); recettori della dopamina DOP-1 (F15A8.5), DOP-2 (K09G1.4), DOP-3 (T14E8.3), DOP-4 (C52B11.3); recettori di neuropeptidi NPR-1 (C39E6.6), NPR-2 (T05A1.1), NPR-3 (C10C6.2); recettori putativi di neuropeptidi NPR1-like (C16D6.2, C25G6.5, F41E7.3); recettori della galanina GAR-1 (C15B12.5), GAR-2 (F47D12.1), GAR-3 (Y40H4A.1); recettori metabotropici del glutammato MGL-1 (ZC506.4), MGL-2 (F45H11.4); o recettori putativi di ammine biogeniche (cloni F01E11.5, C24A8.1, T02E9.3).
Pertanto, secondo forme preferite di realizzazione del metodo secondo l’invenzione il dominio carbossiterminale dei recettori GPCR di C.elegans in grado di localizzarsi in membrana ha una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste nelle sequenze SEQ ID NO:17 - SEQ ID NO:41 mostrate nella seguente Tabella 2, nella quale vengono anche indicati il nome del recettore di C.elegans relativo e il numero di accesso in Gene Bank:
Tabella 2
Ancora preferibilmente il recettore GPCR chimerico della fase a) del metodo dell’invenzione ha una sequenza amminoacidica scelta tra tutte le sequenze SEQ ID NO:42-SEQ ID NO:49, riportate in Fig.7. Di seguito sono riportate le sequenze proteiche di recettori chimerici in cui e' stata sostituita la porzione carbossiterminale: gli amminoacidi sottolineati indicano la sequenza carbossiterminale del recettore GPCR di C.elegans utilizzato per la costruzione della chimera (i.e. C-terminali aventi SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:34 riportate in Tabella 2):
i)MLENDLENLDDSSLILHHLGGSFVHAQIVEIEENDYINSNTSVSNTNLNLFSSSSST SSSSLFSSSSQRSPLLEPNFVDEIWPATSSNSLFYSHPIIAILISILIFLLILITIIGN LGVCAAILLVRKLKAQPANLLLISLALADFCVGLFVMPLAAVYVLEDRWIFGDILCRFW VTADLTLCTASILNLCAISVDRHLAVTRALRYSALRTRRRICLYICIVWLGALLVSAAP LALLPFPKIEQYCQVSQNRVYQIYATIIAFWGPSLIMVIVYVKLWSAAKRMHRQDQLVL RWQGVHLPSDGDLEDGLPPTTTTSNATKSLFRNDSIARANARFLFALRMSAQKFGYYDH QNNKTNGGEIINDDENLRIEVRTSASSSGGGGGGSSTLGTLRVPIVLIIMSAFIICWVP FFILALAKSQHWVNYVPRWLDSLTLWLGYSNSMLNPIIYYCKYNKEFRIPFREMLACRC ATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV
(MiSerR1-Chimera B; SEQ ID NO:43); ii)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSS IILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIF GQFLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLAS GFSLPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTA ISFRLGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYN LLRDYDGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLYCKYNKEFRIPFREMLAC RCATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV
(MiNpR1::CtermCeSer-7; SEQ ID NO:46); iii)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSD LFVAGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRP MRYVRFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDK FRFIEQQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQL KQATSLLILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFS QINVAVNKSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRV GCGGGNGGERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTF LICWLPFFIVNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFYCKYNKEFRIPF REMLACRCATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV
(MiDop1::CtermCeSer-7; SEQ ID NO:47);
iv)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSS IILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIF GQFLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLAS GFSLPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTA ISFRLGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYN LLRDYDGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLLNLQLRAAFIDLMPHWLR RHLNLEGDNSSPLLNHPTMTITNKYGSTATKTVKATYINTSNGQPYVSTSLVGKVQPEA PSFKFNGSGRKKSAMMRILVQKRNAEEEEQLITKESPSPPEIQMDTLCAASIIPRRKSA QPRSTNEKVVLPRKASF
(MiNpR1::Cterm2(C16D6.2); SEQ ID NO:48); v)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSDLF VAGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRPMR YVRFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDKFR FIEQQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQLKQ ATSLLILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFSQI NVAVNKSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRVGC GGGNGGERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTFLI CWLPFFIVNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFNRDFRRAFKKIIV RVFGCCWEEPDLNKSISSRYAAPDNIERRRSCTRSSESAHDNNNDANATRLNLL SNNNEETIPE (MiDop1::Cterm3(F15A8.5); SEQ ID NO:49).
Secondo una forma di realizzazione preferita del metodo secondo l’invenzione, detto segnale intracellulare della fase c) è scelto tra variazione dei livelli di cAMP, Ca<2+>, IP3, cGMP, attività chinasica.
Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo per coadiuvare l’espressione in un sistema cellulare eterologo di recettori GPCR che presentano difficoltà nel localizzarsi correttamente sulla membrana plasmatica cellulare comprendente le seguenti fasi:
a) creazione del gene del recettore GPCR chimerico mediante sostituzione della sequenza corrispondente al dominio carbossiterminale di detto recettore GPCR con quella del recettore GPCR di nematode non parassita di piante in grado di localizzarsi in membrana;
b) trasfezione del plasmide contenente il gene chimerico in sistemi cellulari eterologhi, preferibilmente mediante l'uso della lipofectamina; c) espressione del recettore GPCR chimerico nelle cellule. Il livello di tale espressione può essere verificato mediante saggio ELISA.
In una forma preferita di realizzazione, detti recettori GPCR che presentano difficoltà nel localizzarsi correttamente sulla membrana plasmatica cellulare sono GPCR di nematodi parassiti delle piante (i.e. Meloidogyne, Heterodera e Globodera). Con il termine “difficoltà nel localizzarsi correttamente sulla membrana plasmatica cellulare” si può intendere sia un recettore GPCR che non si localizza affatto sulla membrana plasmatica, sia un recettore che si localizza parzialmente ma non in modo tale da consentire di rilevare una risposta. Preferibilmente, detti recettori GPCR sono scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina, recettori della dopamina, recettori di neuropeptidi, recettori della galanina, recettori metabotropici del glutammato e recettori di ammine biogeniche.
In particolare, quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne incognita, detto recettore GPCR può essere scelto dal gruppo che consiste nelle sequenze amminoacidiche SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, mostrate nella precedente Tabella 1 (ed in Figura 1); quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne hapla, detto recettore GPCR ha preferibilmente la sequenza amminoacidica SEQ. ID NO:14 mostrata in Figura 1; quando detto nematode parassita delle piante è Globodera rostochiensis ha preferibilmente la sequenza amminoacidica SEQ. ID NO:16 mostrata in Figura 1.
Secondo una forma particolarmente preferita di realizzazione dell’invenzione detti recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana sono scelti dal gruppo che consiste in C.elegans, C.briggsae, C. japonica, C. brenneri, C. remanei, Zeldia puntata.
In una forma particolarmente preferita di realizzazione, detti recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana sono di C.elegans. Preferibilmente, detti recettori GPCR di C.elegans sono scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina SER-1 (No. Gene Bank F59C12.2), SER-2 (C02D4.2), SER-3 (K02F2.6), SER-4 (Y22D7AR.13), SER-5 (F16D3.7), SER-6 (Y54G2A.35), SER-7 (C09B7.1); recettori della dopamina DOP-1 (F15A8.5), DOP-2 (K09G1.4), DOP-3 (T14E8.3), DOP-4 (C52B11.3); recettori di neuropeptidi NPR-1 (C39E6.6), NPR-2 (T05A1.1), NPR-3 (C10C6.2); recettori putativi di neuropeptidi NPR1-like (C16D6.2, C25G6.5, F41E7.3); recettori della galanina GAR-1 (C15B12.5), GAR-2 (F47D12.1), GAR-3 (Y40H4A.1); recettori metabotropici del glutammato MGL-1 (ZC506.4), MGL-2 (F45H11.4); o recettori putativi di ammine biogeniche (cloni F01E11.5, C24A8.1, T02E9.3). Ancora preferibilmente, il dominio carbossiterminale dei recettori GPCR di C.elegans in grado di localizzarsi in membrana ha una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste nelle sequenze SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:41 mostrate nella Tabella 2 sopra menzionata.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un recettore GPCR chimerico ottenibile secondo il metodo sopra definito.
Forma ulteriore oggetto dell’invenzione un recettore GPCR chimerico caratterizzato dal fatto di comprendere la sequenza amminoacidica di un recettore GPCR di nematode parassita delle piante (i.e. Meloidogyne, Heterodera e Globodera) che presenta difficoltà nel localizzarsi correttamente sulla membrana plasmatica cellulare, in cui il dominio carbossiterminale di detta sequenza è sostituito con quello di un recettore GPCR di nematodi non parassiti (i.e. C.elegans, C.briggsae, C. japonica, C. brenneri, C. remanei, Zeldia puntata) in grado di localizzarsi in membrana.
Preferibilmente la sequenza amminoacidica di detto recettore GPCR di nematode parassita delle piante è scelta dal gruppo che consiste nelle sequenze amminoacidiche riportate nella Tabella 3 seguente, in relazione alla specie di nematode parassita (Meloidogyne incognita, Meloidogyne hapla, Globodera rostochiensis):
Tabella 3
In una forma particolarmente preferita di realizzazione, detti recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana sono di C.elegans. Secondo una forma preferita di realizzazione il dominio carbossiterminale dei recettori GPCR di C.elegans in grado di localizzarsi in membrana ha una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste nelle sequenze SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:41 mostrate nella precedente Tabella 2.
In una forma particolarmente preferita di realizzazione dell’invenzione detto recettore GPCR chimerico può avere una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste in: i)MLENDLENLDDSSLILHHLGGSFVHAQIVEIEENDYINSNTSVSNTNLNLFSSSSST SSSSLFSSSSQRSPLLEPNFVDEIWPATSSNSLFYSHPIIAILISILIFLLILITIIGN LGVCAAILLVRKLKAQPANLLLISLALADFCVGLFVMPLAAVYVLEDRWIFGDILCRFW VTADLTLCTASILNLCAISVDRHLAVTRALRYSALRTRRRICLYICIVWLGALLVSAAP LALLPFPKIEQYCQVSQNRVYQIYATIIAFWGPSLIMVIVYVKLWSAAKRMHRQDQLVL RWQGVHLPSDGDLEDGLPPTTTTSNATKSLFRNDSIARANARFLFALRMSAQKFGYYDH QNNKTNGGEIINDDENLRIEVRTSASSSGGGGGGSSTLGTLRVPIVLIIMSAFIICWVP FFILALAKSQHWVNYVPRWLDSLTLWLGYSNSMLNPIIYYCKYNKEFRIPFREMLACRC ATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO:43); ii)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSS IILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIF GQFLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLAS GFSLPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTA ISFRLGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYN LLRDYDGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLYCKYNKEFRIPFREMLAC RCATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO: 46); iii)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSD LFVAGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRP MRYVRFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDK FRFIEQQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQL KQATSLLILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFS QINVAVNKSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRV GCGGGNGGERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTF LICWLPFFIVNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFYCKYNKEFRIPF REMLACRCATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV
(SEQ ID NO:47); iv)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSS IILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIF GQFLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLAS GFSLPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTA ISFRLGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYN LLRDYDGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLLNLQLRAAFIDLMPHWLR RHLNLEGDNSSPLLNHPTMTITNKYGSTATKTVKATYINTSNGQPYVSTSLVGKVQPEA PSFKFNGSGRKKSAMMRILVQKRNAEEEEQLITKESPSPPEIQMDTLCAASIIPRRKSA QPRSTNEKVVLPRKASF (SEQ ID NO:48); v)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSDLF VAGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRPMR YVRFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDKFR FIEQQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQLKQ ATSLLILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFSQI NVAVNKSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRVGC GGGNGGERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTFLI CWLPFFIVNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFNRDFRRAFKKIIV RVFGCCWEEPDLNKSISSRYAAPDNIERRRSCTRSSESAHDNNNDANATRLNLL SNNNEETIPE (SEQ ID NO:49);
in cui gli amminoacidi sottolineati indicano la porzione carbossiterminale del recettore GPCR di C.elegans utilizzato per la costruzione della chimera (i.e. C-terminali aventi SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:34 riportate in Tabella 2).
L’invenzione si riferisce ulteriormente all’uso dei recettori GPCR chimerici di nematodi parassiti delle piante (i.e. Meloidogyne, Heterodera e Globodera) ottenibili mediante il metodo secondo l’invenzione, come target di potenziali fitofarmaci specifici per detti nematodi.
Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per un recettore GPCR chimerico ottenibile mediante il metodo secondo l’invenzione. Preferibilmente, le sequenze nucleotidiche codificano per un recettore GPCR chimerico avente una delle sequenze SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:46-SEQ ID NO:49 sopra menzionate. Ancora preferibilmente, dette sequenze nucleotidiche sono le sequenze SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:54-SEQ ID NO:57, mostrate nella Figura 7.
Infine, l’invenzione ha come oggetto una linea cellulare eterologa (i.e. cellule CHO, cellule HEK 293, cellule COS-7, fibrobasti NIH-T3, Sf-9 e Sf-21 (Spodoptera frugiperda 9 e 21), S2 (Schneider 2 di Drosophila; cellule batteriche di E.coli, cellule di lievito e oociti dell’anfibio Xenopus laevis) trasformata con un vettore di espressione come quello sopra descritto. Tale linea cellulare può essere vantaggiosamente impiegata in un metodo di screening di fitofarmaci specifici per i nematodi parassiti delle piante (i.e. Meloidogyne, Heterodera e Globodera).
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui: la Figura 1 mostra le sequenze nucleotidiche e proteiche dei recettori GPCR clonati: MiSerR1-like (SEQ ID NO:1-2); MiDopR1-like (SEQ ID NO:3-4); MiRho1-like (SEQ ID NO:5-6); MiRho2-like (SEQ ID NO:7-8), MiRho3-like (SEQ ID NO:9-10); MiRho4-like di M. incognita (SEQ ID NO:11-12); MhRho1 di Meloidogyne hapla (SEQ ID NO:13-14) e GrSer1 di Globodera rostochiensis (SEQ ID NO:15-16);
la Figura 2 mostra l’analisi del numero di vermi C.elegans diventati adulti prodotti da linee non transgeniche “wild type” (WT) e quelle iper-esprimenti il recettore MiSerR1-like di M. incognita e CeSer-4 di C.elegans: nei vermi transgenici, i recettori MiSerR1-like e CeSer-4 sono stati espressi sotto il controllo del promotore egl-15 (Pegl-15), attivato specificamente nei muscoli della vulva del verme; a differenza del controllo WT, entrambe le linee esprimenti i recettori mostrano un comportamento analogo di alterazione della riproduzione, misurata come numero di individui nella progenie;
la Figura 3 mostra l’analisi di espressione dei recettori GPCR 24 ore dopo la trasfezione; cellule CHO (15,000/pozzetto in piastre da 96 pozzetti) sono state trasfettate con 100, 50 e 25 ng di DNA plasmidico contenente ciascuno un gene dei GPCR indicati; l’espressione è stata analizzata con saggio ELISA utilizzando un anticorpo specifico contro l’epitopo HA fuso all'aminoterminale del recettore espresso: a differenza del recettore CeSer-7 di C. elegans, gli altri 3 GPCR di M.incognita mostrano una espressione in membrana scarsa (MiNpR1-like) o nulla (MiSerR1-like e MiDopR1-like);
la Figura 4 mostra la rappresentazione schematica delle proteine chimeriche costruite sostituendo porzioni del recettore MiSerR1-like di Meloidogyne incognita con porzioni omologhe del recettore CeSer-7 di C. elegans; in grigio scuro sono rappresentati i tratti non modificati di M.incognita, mentre in grigio chiaro quelli modificati con il recettore di C.elegans. ChA = chimera A, sostituzione del tratto ammino-terminale; ChB = chimera B, sostituzione del tratto carbossi-terminale; ChC = chimera C, sostituzione della porzione intermedia, comprendente tutti e sette i tratti transmembrana, i tre “loop extracellulari” e i tre “loop intracellulari”; ChD = Chimera D, sostituzione del tratto carbossiterminale e del terzo “loop intracellulare”;
la Figura 5 mostra l’analisi di espressione dei recettori GPCR 24 ore dopo la trasfezione; cellule CHO (15,000/pozzetto in piastre da 96) sono state trasfettate con 50 ng di DNA plasmidico contenente ciascuno un gene dei GPCR: CeSer-7 di C.elegans, MiSerR1-like di M.incognita, e quelli dei costrutti chimerici ChA, ChB, ChC e ChD; l’espressione dei recettori è stata analizzata con saggio ELISA, utilizzando un anticorpo specifico contro l’epitopo HA fuso all’aminoterminale dei recettori espressi; a differenza del recettore MiSerR1-like, le quattro proteine chimeriche mostrano tutte una espressione in membrana significativa;
la Figura 6 mostra l’analisi dell’espressione e di localizzazione cellulare dei recettori CeSer-7, MiSerR1-like e MiSerR1-ChB. Questi recettori sono stati fusi alla proteina fluorescente GFP ed espressi in modo transiente in cellule di mammifero CHO per visualizzarne la localizzazione nella cellula. A differenza del recettore di C.elegans CeSer-7 che si localizza totalmente in membrana (pannello A), MiSerR1-like di M.incognita è prevalentemente localizzato nel citoplasma (pannello B). La proteina chimerica MiSerR1-ChimeraB, costituita dal recettore MiSerR1-like di M.incognita in cui è stato sostituito il tratto carbossiterminale con quello del recettore CeSer-7 di C.elegans, mostra invece una prevalente localizzazione in membrana (pannello C);
la Figura 7 mostra le sequenze nucleotidiche e proteiche di tutte le chimere del recettore MiSer1-like [Chimera A (SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:42), Chimera B (SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:43), Chimera C (SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:44) e Chimera D(SEQ ID NO:53; SEQ ID NO:45)], quelle dei recettori chimerici MiNpR1::CtermCeSer-7 (SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:46) e MiDop1::CtermCeSer-7 (SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:47), e quelle di MiNpR1-ChB(Cterm2) (SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:48) e MiDopR1-ChB(Cterm3) (SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:49);
la Figura 8 mostra l’analisi di espressione dei recettori GPCR 24 ore dopo la trasfezione; cellule CHO (15,000/pozzetto in piastre da 96 pozzetti) sono state trasfettate con 100 e 50 ng di DNA plasmidico contenente ciascuno un gene dei GPCR indicati; l’espressione dei recettori è stata analizzata con saggio ELISA, utilizzando un anticorpo specifico contro l’epitopo HA fuso all’aminoterminale dei recettori espressi; per entrambi i recettori chimerici (MiNpR1-ChB e MiDopR1-ChB) il livello di espressione è significativamente maggiore rispetto alla forma di recettore non modificata (MiNpR1-like e MiDopR1-like);
la Figura 9 mostra i risultati del CRE (cAMP Response Element) assay condotto sui recettori MiSerR1-like e MiSerR1-ChimeraB; 25 ng di DNA plasmidico contenente i geni dei GPCR indicati è stato trasfettato in cellule CHO insieme a 125 ng di plasmide contenente il gene della luciferasi a monte del promotore CRE indotto da aumenti di cAMP intracellulare; in seguito all’espressione dei recettori o stimolazione da parte dell’attivatore forskolina (forsk), il livello di cAMP varia e queste vaziazioni sono misurabili come espressione della proteina reporter luciferasi; a differenza di MiSerR1-like che non produce alcun effetto sul cAMP (perché il recettore non si esprime in membrana), la proteina chimerica MiSerR1-ChB si comporta analogamente al recettore CeSer-4 di C.elegans, determinando cioè riduzioni del livello di cAMP intracellulare, e in maniera opposta a CeSer-7;
la Figura 10 mostra i risultati del CRE (cAMP Response Element) assay condotto sui recettori MiNpR1-ChB e MiDopR1-ChB; 25 ng di DNA plasmidico contenente i geni dei GPCR indicati sono stati trasfettati in cellule CHO insieme a 125 ng di plasmide contenente il gene della luciferasi a monte del promotore CRE indotto da aumenti di cAMP intracellulare; in seguito all’espressione dei recettori, induzione da parte di agonisti specifici (dopamina) o stimolazione da parte dell’attivatore forskolina (forsk), il livello di cAMP varia e queste vaziazioni sono misurabili come espressione della proteina reporter luciferasi; a differenza di MiDopR1-like e MiNpR1-like, che non producono alcun effetto sul cAMP, le proteine chimeriche MiDopR1-ChB e MiNpR1-ChB determinano, rispettivamente, aumenti di cAMP in seguito a stimolazione con lo specifico agonista dopamina o una sua riduzione;
la Figura 11 mostra i risultati del saggio ELISA e CRE (cAMP Response Element) assay, condotti sui recettori chimerici MiNpR1-ChB(Cterm2) e MiDopR1-ChB(Cterm3): nel saggio ELISA cellule CHO (15,000/pozzetto in piastre da 96 pozzetti) sono state trasfettate con 100 e 50 ng di DNA plasmidico contenente ciascuno un gene dei GPCR indicati e il livello di espressione dei recettori è stata misurata utilizzando un anticorpo specifico contro l’epitopo HA fuso all’aminoterminale dei recettori espressi; nel saggio CRE 25 ng di DNA plasmidico contenente i geni dei GPCR indicati sono stati trasfettati in cellule CHO insieme a 125 ng di plasmide contenente il gene della luciferasi a monte del promotore CRE indotto da aumenti di cAMP intracellulare; in seguito all’espressione dei recettori, induzione da parte di agonisti specifici (dopamina) o stimolazione da parte dell’attivatore forskolina (forsk), il livello di cAMP varia e queste vaziazioni sono misurabili come espressione della proteina reporter luciferasi; entrambi i recettori chimerici MiNpR1-ChB(Cterm2) e MiDopR1-ChB(Cterm3) mostrano livelli di espressione in ELISA e di attivazione superiori a quelli dei corrispondenti recettori non modificati (MiNpR1-like e MiDopR1-like).
ESEMPIO 1: Espressione in cellule di mammifero CHO di tre recettori GPCR del nematode parassita M.incognita.
La validità dell’invenzione qui proposta viene di seguito esemplificata, con finalità illustrative e non limitative, attraverso l’espressione in un sistema cellulare eterologo (cellule di mammifero CHO) di tre recettori GPCR del nematode parassita M.incognita.
Vengono forniti due esempi di applicazione della tecnologia oggetto del presente brevetto: 1) nel primo la modifica apportata ai due recettori ne permette l’espressione in membrana, 2) nell’altro la modifica apportata aumenta l’espressione del terzo recettore che, nella forma non modificata (wild-type), si esprime a livelli molto bassi in membrana plasmatica.
Nella parte sperimentale di seguito riportata sono descritte, a scopo esemplificativo e non limitativo, le modifiche apportate ai tre recettori, con le relative nuove sequenze nucleotidiche e proteiche. Sono inoltre riportati i saggi ELISA per la verifica dell’espressione in membrana dei recettori modificati, e l’osservazione al microscopio a fluorescenza della localizzazione di questi recettori, grazie alla fusione con la proteina fluorescente GFP. MATERIALI E METODI
Clonaggio dei recettori di M.incognita
Per clonare i recettori da M.incognita, M.hapla e G.rostochiensis la banca dati delle sequenze espresse di queste specie (disponibile al sito: http://www.nematode.net/BLAST/Cluster.BLAST/index.php) è stata interrogata con varie sequenze peptidiche degli omologhi recettori di C.elegans.
I cloni identificati sono stati:
AW 735607 per MiSerR1-like e GrSerR1-like;
AW 571066 per MiDopR1-like;
BQ 548106 per MiRho1-like;
AW 735557 per MiRho2-like;
AW 829676 per MiRho3-like;
CD749350 per MiRho4-like;
CN 572214 per MhRho1-like.
A partire dalle sequenze dei cloni identificati sono stati disegnati oligonucleotidi specifici che sono stati utilizzati per amplificare gli interi recettori utilizzando la metodica del 5’ e 3’ Race. Gli oligonucleotidi utilizzati per l’amplificazione sono i seguenti:
Per MiSerR1-like:
MiserR F1: GATTTGGAAAATTTGGACGAT (SEQ ID NO:58) MiserR F2: GGAGGGTCTTTTGTCCATGCA (SEQ ID NO:59) MiserR F3: TCTCATCCAATAATTGCAATT (SEQ ID NO:60) MiserR R1: ACGTAATGCTGAATATCGAAG (SEQ ID NO:61) MiserR R2: CAAATTTAAAATTGAAGCAGT (SEQ ID NO:62) MiserR R3: AGCCAAAGCAAGTGATATAAG (SEQ ID NO:63)
Per MiDopR1-like:
MidopR F1: ACTCTTGGTGTTATTATGGGC (SEQ ID NO:64) MidopR F2: TGGCTAGGTTATGCCAATTCT (SEQ ID NO:65) MidopR F3: CGAGACTTTCGACGTGCCTTT (SEQ ID NO:66) MidopR R1: AAAGGCACGTCGAAAGTCTCG (SEQ ID NO:67) MidopR R2: AGAATTGGCATAACCTAGCCA (SEQ ID NO:68) MidopR R3: GCCCATAATAACACCAAGAGT (SEQ ID NO:69)
Per MiRho1-like:
MILYMN F1: CCAACAACAACAACTCGTTAATT (SEQ ID NO:70) MILYMN F2: CCCCCAACATTTTCTCCTTCT (SEQ ID NO:71) MILYMN F3: GATAGAAAAATGAGAAAATCTCCA (SEQ ID NO:72) MILYMN R1: TTGGAATACAACCAAATAAGG (SEQ ID NO:73) MILYMN R2: GTGAACAATAGCAACATATCT (SEQ ID NO:74) MILYMN R3: ATCTGCTATTGCCAAATTTAACAA (SEQ ID NO:75) MIGAL F4: GTCGAGTTTTGTGGTTTAAA (SEQ ID NO:76)
MIGAL F5: AGAAGGAGTGTTGTTAAAATGTTG (SEQ ID NO:77) MIGAL F6: CCTTTTCTCTACACACTTTTCGCT (SEQ ID NO:78) Per MiRho2-like:
MIOPIOD F1: GGAATTCTCGTGTGTGTTTCA (SEQ ID NO:79) MIOPIODF2: GCTCTAAAATTGCTAACGCCT (SEQ ID NO:80) MIOPIODF3: GTCTGGTATTGTATTCCTTTG (SEQ ID NO:81) MIOPIODR1: CAAAGGAATACAATACCAGAC (SEQ ID NO:82) MIOPIODR2: CCCTCTAAAGCACGCCGA (SEQ ID NO:83) MIOPIODR3: TGAAACACACACGAGAATTCC (SEQ ID NO:84) MIOPIODF0: ATGTATGCACTCATTCTACAC (SEQ ID NO:85) Per MiRho3-like:
MIRHO F1: GTTGCCTATTGTTATATAATG (SEQ ID NO:86) MIRHO F2: GCTGTTTCTTATATGTATTTG (SEQ ID NO:87) MIRHO R1: AATATAAAACAATGCTGGAAC (SEQ ID NO:88) MIRHO R2: TGCACGTCTAGGAGAATTCCA (SEQ ID NO:89) MIRHO R3: CAAATACATATAAGAAACAGC (SEQ ID NO:90) Per MiRho4-like:
MIFRZ F1: TCTGGATTTGGATATCTGGAT (SEQ ID NO:91) MIFRZ F2: AATATACCTCATTTGACAAGA (SEQ ID NO:92) MIFRZ F3: AATTGTTGGTGGTTAATACTTGGT (SEQ ID NO:93) MIFRZ R1: AGTTAATTCAGAAGCGTCTACCAA (SEQ ID NO:94) MIFRZ R2: ACCAAGTATTAACCACCAACAATT (SEQ ID NO:95) MIFRZ R3: ATCCAGATATCCAAATCCAGA (SEQ ID NO:96) MIFRZ F4: GTAGACGCTTCTGAATTAACT (SEQ ID NO:97) Per MhRho1-like:
MHXF87 R0: TTACAAAAATCTATTCATTGG (SEQ ID NO:98) MHXF87 R1: GTAAATTATTGGATTTAAAGC (SEQ ID NO:99) MHXF87 R2: ACTGTATTTAACAATTAAACG (SEQ ID NO:100) MHXF87 R3: CTTGTGAGCTCTTTGACTGCG (SEQ ID NO:101) Per GrSer1-like:
GRSER F1: ATGTTAGAAAATGATTTGGAA (SEQ ID NO:102) GRSER R1: TTATTTTGATGATTCCATCAA (SEQ ID NO:103) I recettori amplificati sono stati clonati nel vettore PCR2.1 (Invitrogen) e sequenziati con gli opportuni oligonucleotidi.
Generazione vettori di espressione
I cDNA codificanti per i diversi GPCR sono stati amplificati a partire da opportuni stampi utilizzando oligonucleotidi specifici, che contengono al 5’ una sequenza per opportuni enzimi di restrizione (riportata in grassetto) utilizzata per l’introduzione dell’amplificato nel vettore di espressione.
Le sequenze degli oligonucleotidi utilizzati sono le seguenti:
MiserR Forward: ACCAAGCTTTTAGAAAATGATTTGGAAAA (SEQ ID NO:104)
MiserR Reverse: GACGAATTCTTATTTTGATGATTCCATCA (SEQ ID NO:105)
MiDopR Forward: ACCAAGCTTTTGCCCTGGTGGCTACCTCT (SEQ ID NO:106)
MiDopR Reverse: CGGGGTACCTTAAAAACATAAAAATCTCA (SEQ ID NO:107)
MiNprR Forward: CGGACTAGTGAAGCATCTACAATGGAATT (SEQ ID NO:108)
MiNprR Reverse: AGTTTAGCGGCCGCTCATATCCTCTCATCTGTAT (SEQ ID NO:109)
CeSer-7 Forward: ACTGGTACCGCCCGTGCAGTCAACATATC (SEQ ID NO:110)
CeSer-7 Reverse: CTAGAATTCCTAGACGTCACTTGCTTCGTGAC (SEQ ID NO:111)
CeSer-4 Forward: CGGGGTACCATCGACGAGACGCTTCTCAATC (SEQ ID NO:112)
CeSer-4 Reverse: CCGGAATTCTCAATAATCGTGAATAAGGCAC (SEQ ID NO:113)
Per la costruzione dei recettori chimerici è stato seguito un protocollo di “overlapping PCR” che consiste in due reazioni consecutive di amplificazione: nella prima i frammenti da fondere vengono amplificati utilizzando oligonucleotidi che al 5’ contengono una sequenza extra (sottolineata) complementare all’altro frammento; nella seconda reazione i frammenti ottenuti nella prima amplificazione vengono mescolati e fusi grazie all’amplificazione con i due oligo al 5’ e al 3’ più esterni corrispondenti all’intera sequenza da ottenere.
Le sequenze degli oligonucleotidi utilizzati per le amplificazioni sono le seguenti:
Prime amplificazioni MiSerR1-ChimeraA:
CeSer-7 Forward: ACTGGTACCGCCCGTGCAGTCAACATATC (SEQ ID NO:110)
CeSer-7 Nterm fus Reverse: GATTAAAATTGCAATAGCTTTT CCAGTCGT (SEQ ID NO:114)
MiSer 1TR fus Forward: ACGACTGGAAAAGCTATTGCAATTTTAATC (SEQ ID NO:115)
MiSerR Reverse: GACGAATTCTTATTTTGATGATTCCATCA (SEQ ID NO:105).
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: CeSer-7 Forward e MiSerR Reverse.
Prime amplificazioni MiSerR1-ChimeraB:
MiSerR Forward 2: ACCGGTACCTTAGAAAATGATTTGGAAAA (SEQ ID NO:116)
MiSer TR fus Reverse: GTTGTACTTGCAGTAATAAATTATTGGGTT (SEQ ID NO:117)
CeSer-7 C-term fus Forward: AACCCAATAATTTATTACTGCAA GTACAAC (SEQ ID NO:118)
CeSer-7 Reverse: CTAGAATTCCTAGACGTCACTTGCTTCGTGAC (SEQ ID NO:111).
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: MiSerR Forward 2 e CeSer-7 Reverse.
Prime amplificazioni MiSerR1-ChimeraC:
MiSerR Forward 2: ACCGGTACCTTAGAAAATGATTTGGAAAA (SEQ ID NO:116)
MiSer-7 N-term fus Reverse: GGCAATGGCTAGCAGTATTGGATG AGAATA (SEQ ID NO:119)
CeSer-7 1TR fus Forward: TATTCTCATCCAATACTGCTAGCCA TTGCC (SEQ ID NO:120)
CeSer-7TR fus Reverse: TCGATTATATTTGCAGATCAATGGATTTAA (SEQ ID NO:121)
MiSer-7 C-term fus Forward: TTAAATCCATTGATCTGCAAA TATAATCGA (SEQ ID NO:122)
MiSerR Reverse: GACGAATTCTTATTTTGATGATTCCATCA (SEQ ID NO:105).
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: MiSerR Forward 2 e MiSerR Reverse.
Prime amplificazioni MiSerR1-Chimera D:
MiSerR Forward 2: ACCGGTACCTTAGAAAATGATTTGGAAAA (SEQ ID NO:116)
Mi-CeSer-7 3 int loop Reverse: CCAAATTTTGATGTT ACTCCATAATTTAAC (SEQ ID NO:123)
Mi-CeSer-7 3 int loop Forward: GTTAAATTATGGAGTAACAT CAAAATTTGG (SEQ ID NO:124)
Ce-MiSer-7 3 int loop Reverse: AATTAACACTATTGGCAATG TTTTCCGGGC (SEQ ID NO:125)
Ce-MiSer-7 3 int loop Forward: GCCCGGAAAACATTGCCAATAGT GTTAATT (SEQ ID NO:126)
CeSer-7 Reverse: CTAGAATTCCTAGACGTCACTTGCTTCGTGAC (SEQ ID NO:111).
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: MiSerR Forward 2 e CeSer-7 Reverse.
Prime amplificazioni MiNpR1::CtermCeSer-7
MiNpr F Kpn I: ACTGGTACCGAAGCATCTACAATGGAATT (SEQ ID NO:127).
MiCeNpr ser-7 Cterm fus R: GTTGTACTTGCAGTATAATAAGG CATATAA (SEQ ID NO:128)
MICE NPRSER FUS F: TTATATGCCTTATTATACTGCAAGTACAAC (SEQ ID NO:129)
CE SER-7 R NOT I: ATAAGAATGCGGCCGCCTAGACGTCACTTGCTTCGT (SEQ ID NO:130).
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: MiNprF-KpnI e CE SER-7 R NOT I.
Prime amplificazioni MiDopR1 like::CtermCeSer-7 : MI DOP-1 F KPN I: CGGGGTACCTTGCCCTGGTGGCTACCTCT (SEQ ID NO:131)
MI CE DOPSER FUS R: GTTGTACTTGCAGTAAAATATTCCATAAAT (SEQ ID NO:132)
MI CE DOPSER FUS F: ATTTATGGAATATTTTACTGCAAGTACAAC (SEQ ID NO:133)
CE SER-7 R ECORI: CTAGAATTCCTAGACGTCACTTGCTTCGTGAC (SEQ ID NO:134).
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: MI DOP-1 F KPNI e CESER-7 R ECORI.
Prime amplificazioni MiDopR1like::Cterm2(F15A8.5): MI DOP-1 F Kpn I: CGGGGTACCTTGCCCTGGTGGCTACCTCT (SEQ ID NO:131)
MiCedop1CtermfusReverse:
TCTAAAGTCACGATTAAATATTCCATAAAT (SEQ ID NO:135)
Mi Ce dop1CtermfusF: ATTTATGGAATATTTAATCGTGACTTTAGA (SEQ ID NO:136)
Ce dop-1 R ECO RI: CCGGAATTCCTATTCCGGAATGGTTTCCT(SEQ ID NO:137)
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: MI dop-1 F Kpn I e ce dop-1 R ECO RI.
Prime amplificazioni MiNPR-Cterm3(C16D6.2):
Mi npr F Kpn I: ACTGGTACCGAAGCATCTACAATGGAATT(SEQ ID NO:138)
Mi Ce npr Cterm fusR: CAGTTGGAGGTTGAGTAATAAGGCATATAA (SEQ ID NO:139)
Mi Ce npr CtermfusF:TTATATGCCTTATTACTCAACCTCCAACTG (SEQ ID NO:140)
CE npr R NotI:ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAAAGAAGCCTTCCTTG (SEQ ID NO:141)
Per la seconda reazione di amplificazione e fusione sono stati utilizzati gli oligonucleotidi più esterni: Mi npr F Kpn I e CE npr R Not I.
Lo schema tipico di amplificazione è stato:
- denaturazione: 98°C per 10 secondi;
- annealing: 50°C per 30 secondi;
- estensione: 72°C per 1 minuto e 30 secondi.
I cicli sono stati ripetuti per 35 volte, successivamente è stata effettuata un’estensione finale di 7 minuti a 72°C, seguita dal raffreddamento dei campioni a 4°C. La DNA Polimerasi utilizzata è stata la Phusion High-Fidelity (Finzymes).
I frammenti ottenuti, controllati mediante elettroforesi su gel di agarosio per la concordanza con le dimensioni attese, sono stati digeriti con gli opportuni enzimi di restrizione (New England Biolabs), purificati da gel di agarosio e ligati nei vettori opportuni.
Nel vettore pHM6, che contiene a monte del sito di clonaggio una sequenza codificante per l’epitopo HA, sono stati clonati i cDNA codificanti per i recettori MiSerR1-like (SEQ ID NO:1), MiDopR1-like (SEQ ID NO:3), MiNpR1-like (Q2TGX5_MELIC), CeSer-7 (Gene Bank C09B7.1), CeSer-4 (Gene Bank Y22D7AR.13), MiSerR1-ChimeraA (SEQ ID NO:50), MiSerR1-ChimeraB (SEQ ID NO:51), MiSerR1-ChimeraC (SEQ ID NO:52), MiSerR1-ChimeraD (SEQ ID NO:53), MiNpR1::CtermCeSer-7 (SEQ ID NO:54) e MiDopR1like:CtermCeSer-7 (SEQ ID NO:55), MiNpR1::Cterm2(C16D6.2)(SEQIDNO:56),MiDop1::Cterm3(F15A.
5)(SEQ ID NO:57)(vedere Figure 1 e 7). Nel vettore pGFP, che contiene al suo interno una sequenza codificante per la proteina verde fluorescente, sono stati clonati i cDNA codificanti per i recettori MiSerR1-like (SEQ ID NO:1), CeSer-7, MiSerR1-ChimeraB (SEQ ID NO:51) (vedere Figure 1 e 7), attraverso opportuno subclonaggio.
Il corretto inserimento dei frammenti ed il rispetto delle corrette cornici di lettura sono stati controllati per analisi di sequenza.
Trasfezione
Le cellule di mammifero CHO sono state cresciute a 37°C in presenza di 5% CO2, in un mezzo di coltura DMEM (DMEM F-12, Lonza) supplementato con 10% di siero di feto bovino (FBS).
Tutti i recettori sono stati trasfettati in modo transiente nelle cellule utilizzando il metodo della Lipofectamina 2000 (Invitrogen).
Per la trasfezione le cellule sono state seminate<4>in piastre da 96 pozzetti, 1.5 x 10 cellule per pozzetto, lasciate crescere per 24 ore e successivamente incubate con la miscela di trasfezione contenente la lipofectamina e DNA (in rapporto 5:1) per 5 ore.
La quantità di DNA utilizzata per tutti i recettori è stata da 25 a 100 ng. Le cellule sono state analizzate 24-48 ore dopo la trasfezione.
Saggio ELISA
Questo saggio si basa sul principio dell’immunoriconoscimento specifico: la porzione N-terminale del recettore viene riconosciuta da un anticorpo primario anti-HA riconosciuto, a sua volta, da un anticorpo secondario coniugato con un enzima la cui attività può essere facilmente rilevata mediante una reazione colorimetrica. Il segnale può essere rilevato solo quando i recettori, localizzandosi correttamente in membrana, espongono la loro porzione N-terminale sulla superficie della cellula.
Il protocollo seguito è stato il seguente: le cellule trasfettate in modo transiente con i recettori e ancora attaccate alla superficie dei pozzetti delle piastre 96-pozzetti sono state lavate con tampone (PBS 1x, 0.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) e fissate per 20 minuti in 4% formaldeide.
Dopo due lavaggi con lo stesso tampone, le cellule fissate sono state incubate con una diluizione 1:500 dell’anticorpo primario anti-HA (rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology) in BSA 1% per due ore.
Al termine del periodo di incubazione, le cellule sono state lavate 3 volte per allontanare l’eccesso di anticorpo primario non legato, ed incubate con un anticorpo secondario coniugato con la β-galattosidasi (goat anti-rabbit IgG β-galactosidase) per circa un’ora.
Dopo questa seconda incubazione sono state sottoposte ad nuova serie di lavaggi e incubate con il substrato della β-galattosidasi, il CPRG (Chloro phenol red-β-D-galattopiranoside, Roche Diagnostics GmbH).
La reazione colorimetrica che si è sviluppata in seguito a degradazione del substrato cromogeno è stata rilevata mediante lettura dell’assorbanza dei campioni a 550 nm dopo circa 5 ore con lo strumento Victor3 (PerkinElmer): l’intensità del colore è correlata alla quantità di recettore espresso e correttamente localizzato in membrana plasmatica.
Saggio CRE
Le cellule trasfettate in modo transiente con il vettore reporter (125 ng per pozzetto) e i diversi recettori (25 ng per pozzetto) sono state cresciute per 24 ore dalla trasfezione in un mezzo di coltura contenente 10% di siero.
Il giorno successivo sono state trattate con solo buffer (campioni di controllo) e con 10 microM di forskolina, noto attivatore della via del cAMP, per 3 ore.
Successivamente il mezzo di coltura è stato rimosso, le cellule lavate con tampone (PBS 1x, 0.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) ed incubate per 5 minuti con 10 mg/ml del substrato della luciferasi (Steady-Glo luciferase substrate, Promega) sciolto in un tampone di lisi fornito dalla ditta produttrice insieme al substrato.
La reazione fotometrica che si è sviluppata in seguito a degradazione del substrato da parte della luciferasi è stata rilevata mediante lettura della luminescenza con lo strumento Victor3 (PerkinElmer). RISULTATI
Clonaggio recettori
Sono stati clonati 6 diversi recettori dalla specie Meloidogyne incognita (MiSerR1-like, MiDopR1-like, MiRho1-like, MiRho2-like, MiRho3-like, MiRho4-like), uno dalla specie Meloidogyne hapla (MhRho1-like) e uno dalla specie Globodera rostochiensis (GrSerR1-like). E’ stato quindi effettuato uno studio di questi recettori, sia a livello di sequenza, sia a livello funzionale, allo scopo di dimostrare la validità dei GPCR di nematodi parassiti come target di nematocidi.
I GPCR di M.incognita da noi clonati e scelti come target di nuovi nematocidi sono:
1) un omologo dei recettori della serotonina di C.elegans, che abbiamo chiamato MiSerR1-like;
2) un omologo del recettore della dopamina CeDop-1 di C.elegans, che abbiamo chiamato MiDopR1-like;
3) un omologo di un putativo GPCR di C.elegans (T27D1.3) (appartenente alla famiglia dei Rhodopsinlike GPCR), che abbiamo chiamato MiRho1-like;
4) un omologo di un putativo GPCR di C.elegans (T07D4.1) (appartenente alla famiglia dei Rhodopsinlike GPCR), che abbiamo chiamato MiRho2-like;
5) un omologo di un putativo GPCR di C.elegans (B0563.6) (appartenente alla famiglia dei Rhodopsinlike GPCR), che abbiamo chiamato MiRho3-like;
6) un omologo di un putativo GPCR di C.elegans (F02E8.2) (appartenente alla famiglia dei Rhodopsinlike GPCR), che abbiamo chiamato MiRho4-like.
I GPCR di M.hapla e G.rostochiensis clonati e scelti come target di nuovi nematocidi sono:
1) un omologo di un putativo GPCR di C.elegans (F02E8.2) (appartenente alla famiglia dei Rhodopsinlike GPCR), che abbiamo chiamato MhRho1-like.
2) un omologo dei recettori della serotonina di C.elegans, che abbiamo chiamato GrSerR1-like.
Le sequenze codificanti i GPCR sono state isolate a partire dal cDNA retrotrascritto dall’RNA totale estratto da M.incognita, M.hapla o G.rostochiensis. Per il clonaggio delle sequenze complete, oligonucleotidi specifici, disegnati sulle base delle sequenze espresse (EST) del nematode M.incognita, M.hapla e G.rostochiensis, sono stati utilizzati in esperimenti di 5’ e 3’ RACE. Le sequenze nucleotidiche e proteiche (SEQ ID NO:1-16) dei recettori clonati sono riportate in Figura 1.
Un aspetto particolare della presente invenzione riguarda la possibilità di validare l’importanza dei target scelti grazie a studi nel sistema modello C. elegans. Grazie all’omologia funzionale e di sequenza tra il sistema modello e i nematodi parassiti, è possibile capire quali GPCR del nematode parassita sono di fondamentale importanza per la sua vitalità. Per esempio, i recettori MiSerR1-like di M.incognita e GrSerR1-like di G.rostochiensis da noi identificati e clonati risultano omologhi a CeSer-7 e CeSer-4, due recettori della serotonina di C.elegans, entrambi coinvolti in importanti funzioni biologiche, quali la riproduzione e la contrazione della faringe (4). L’iperespressione del recettore MiSerR1-like nel sistema C.elegans ha prodotto alterazioni nella riproduzione analogamente allo stesso recettore CeSer-4 di C.elegans: questo, oltre ad indicare un’omologia funzionale tra i recettori di questi due organismi, conferma l’importanza di questo recettore quale target di nematocidi (Figura 2).
Espressione in membrana dei recettori clonati
E’ stata ottenuta una buona espressione e localizzazione in membrana dei recettori di nematodi parassiti grazie a modifiche basate sulla sostituzione della regione carbossiterminale. Tutti i recettori di nematodi parassiti saggiati presentavano difficoltà nella localizzazione in membrana.
Attraverso la sostituzione di porzioni di questi recettori con domini omologhi del recettore CeSer-7 (vedere SEQ ID NO:23 - Tabella 2), appartenente alla specie C.elegans che non presenta problemi di localizzazione in membrana, è stato possibile fare esprimere in membrana questi recettori. I migliori risultati sono stati ottenuti sostituendo a questi recettori la porzione carbossiterminale con quella di CeSer-7. In seguito a tale modifica, il recettore si localizza correttamente in membrana, esponendo i suoi domini extracellulari all’interazione con potenziali modulatori, senza il rischio che le modifiche possano alterare la struttura di domini importanti per l’interazione con questi modulatori.
In particolare, lo studio si è concentrato su due di questi recettori MiSerR1-like e MiDopR1-like e su un recettore per un neuropeptide (MiNpR1-like), la cui sequenza era già presente in banca dati (Q2TGX5_MELIC) e risulta essere omologa a quella di un recettore di neuropeptide di C.elegans. Il recettore scelto per gli studi di localizzazione e per la costruzione delle chimere è quello della serotonina di C.elegans (CeSer-7), che si localizza in membrana e funziona correttamente in cellule di mammifero.
I cDNA codificanti per tali recettori sono stati clonati nel vettore di espressione eucariotico pHM6, a valle di una sequenza di un epitopo HA costituita da 9 amminoacidi e riconosciuta da anticorpi specifici commerciali: in questo modo tutti i recettori contengono all’estremità N-terminale la sequenza dell’epitopo HA. Se le cellule contengono in membrana un recettore che porta l’epitopo HA, rispondono positivamente al saggio ELISA che consiste in un immunoriconoscimento dell’epitopo HA da parte di uno specifico anticorpo.
I recettori MiSerR1-like, MiDopR1-like e MiNprR1-like sono stati trasfettati in modo transiente in cellule di mammifero CHO (Chinese Hamster Ovary cells) ed analizzati con un saggio ELISA per verificarne la corretta espressione e localizzazione in membrana. Come mostrato in Figura 3, i recettori MiSerR1-like ed MiDopR1-like non mostrano espressione in membrana, mentre il recettore MiNprR1-like mostra una espressione molto debole; il recettore CeSer-7 mostra un forte segnale.
Utilizzando MiSerR1-like, è stato condotto uno studio per capire quale fosse la porzione del recettore da modificare per avere una corretta espressione e localizzazione in membrana. A tale scopo, sono state costruite diverse proteine chimeriche modificando il recettore MiSerR1-like con porzioni del recettore CeSer-7 di C.elegans, e ne è stata verificata l’espressione e la localizzazione. Le modifiche apportate al recettore MiSerR1-like sono schematizzate nella Figura 4: nella chimera A (SEQ ID NO:42) è stata sostituita la porzione aminoterminale, nella chimera B (SEQ ID NO:43) la porzione carbossiterminale, nella chimera C (SEQ ID NO:44) i sette tratti transmembrana e nella chimera D (SEQ ID NO:45) il terzo tratto intracellulare e la porzione carbossiterminale.
Le sequenze nucleotidiche (SEQ ID NO:50-53) e proteiche (SEQ ID NO:42-45) delle proteine chimeriche sono riportate in Figura 7.
Come si può evidenziare dal risultato del saggio ELISA riportato nella Figura 5, tutte le proteine chimeriche mostrano una significativa espressione in membrana rispetto alla proteina non modificata MiSerR1-like, ed è anche chiaro che per la chimera B e D questo aumento risulta essere più evidente. Dato che la chimeraD non è altro che una chimeraB con un’ulteriore sostituzione del terzo dominio intracellulare, risulta evidente che la sostituzione del solo tratto carbossi-terminale sia sufficiente a garantire la massima espressione in membrana per questa proteina. E’ stata quindi utilizzata la chimera B per i successivi studi di localizzazione con la proteina fluorescente GFP.
Come conferma dei dati ottenuti con i saggi ELISA, i cDNA codificanti per MiSerR1-like, CeSer-7 e per la MiSerR1-Chimera B sono stati clonati in un vettore di espressione eucariotico a monte del gene della GFP, trasfettati in modo transiente in cellule CHO e l’espressione di queste proteine analizzata al microscopio a fluorescenza.
L’osservazione al microscopio a fluorescenza, riportata nella Figura 6, ha evidenziato che nelle cellule trasfettate con il recettore MiSerR1-like (pannello B) la fluorescenza è tutta localizzata nel citoplasma, mentre nelle cellule trasfettate con CeSer-7 e con MiSerR1-ChimeraB (rispettivamente pannello A e C) il segnale fluorescente è anche localizzato in membrana.
Questi risultati permettono di concludere che il tratto carbossiterminale svolge un ruolo determinante nella localizzazione in membrana di questi recettori e affinché il recettore in esame sia localizzato correttamente è sufficiente la sostituzione della sua porzione C-terminale con un altro recettore che non mostra problemi di espressione e localizzazione in membrana. Quest’altro recettore è stato scelto tra quelli appartenenti alla specie C.elegans, purché non presenti problemi di espressione e localizzazione in membrana.
Come conferma della validità di questa invenzione, è stata sostituita anche la porzione carbossiterminale di MiDop1-like con quella di CeSer-7 e misurata l’espressione in membrana.
E’ stato anche verificato se la sostituzione della porzione carbossiterminale del recettore MiNprR1-like con la porzione corrispondente del recettore CeSer-7 sia in grado di migliorarne l’espressione. In particolare, abbiamo voluto verificare se anche per un recettore che mostra bassi livelli di espressione è possibile utilizzare porzioni di un altro recettore per migliorarne l’espressione in membrana.
Le sequenze nucleotidiche e proteiche dei due recettori chimerici che sono stati costruiti e chiamati MiNpR1::CtermCeSer-7 (SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:46) e MiDop1::CtermCeSer-7 (SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:47) è riportata sempre nella Figura 7.
Come si evince dal saggio ELISA riportato nella Figura 8, la proteina chimerica MiNpR1::CtermCeSer-7 si esprime a livelli più alti rispetto al recettore nella sua forma non modificata, e la proteina chimerica MiDop1::CtermCeSer-7 mostra una apprezzabile espressione in membrana. Questi risultati suggeriscono che questo tipo di modificazione può essere applicata a tutti i recettori GPCR di M.incognita, M.hapla e G.rostochiensis, consentendo quindi una loro espressione e corretta localizzazione in membrana.
Questa metodica consente quindi di far esprimere in membrana recettori che usualmente non si esprimono nella loro forma non modificata e di aumentare l’espressione per quelli che mostrano un debole segnale.
Verifica funzionalità recettori chimerici
Per dimostrare che i recettori così modificati fossero funzionalmente attivi, cioè in grado di trasdurre un segnale intracellulare misurabile con una variazione di uno o più secondi messaggeri citoplasmatici, abbiamo condotto una serie di saggi biochimici sulle cellule esprimenti le chimere in oggetto. Uno dei saggi riportati nella parte sperimentale a scopo esemplificativo è quello del CRE (cAMP response element) che misura aumenti intracellulari del secondo messaggero AMP ciclico (cAMP) in seguito alla semplice espressione e/o attivazione dei recettori con agonisti.
Per verificare se MiSerR1-ChimeraB, localizzato in membrana, sia anche funzionalmente attivo, in grado cioè di trasdurre un segnale dall’esterno all’interno della cellula, sono state misurate variazioni del livello di cAMP indotto dall’attivazione del GPCR in analisi. Dati di letteratura dimostrano, infatti, il coinvolgimento di questo secondo messaggero nella via attivata dai recettori della serotonina in C.elegans (8).
A tal proposito è stato adottato un saggio reporter (saggio CRE) che misura l’espressione di un gene reporter, la luciferasi, indotta da variazioni del livello di cAMP: il vettore pCRE utilizzato nel saggio contiene, infatti, la luciferasi sotto il controllo trascrizionale di un promotore con elementi che vengono attivati dal cAMP.
La misurazione dell’attività della luciferasi in cellule trasfettate con pCRE e con i vettori codificanti per CeSer-7, MiSerR1-like e MiSerR1-ChimeraB ha evidenziato che sia la ChimeraB sia CeSer-7, grazie alla loro corretta localizzazione in membrana, mostrano una funzionalità rilevabile come variazione del livello di cAMP intracellulare.
Come si può osservare nella Figura 9, infatti, le cellule trasfettate con il recettore CeSer-7 mostrano un aumento dell’attività della luciferasi dovuto ad incrementi del livello di cAMP, le cellule trasfettate con il recettore MiSerR1-like non mostrano nessuna variazione, mentre le cellule trasfettate con MiSerR1-ChimeraB mostrano una diminuzione dell’attività dovuta ad una riduzione dei livelli di cAMP. Tale riduzione è simile a quella che si osserva in cellule trasfettate con un altro membro della famiglia dei recettori della serotonina di C.elegans, CeSer-4, di cui MiSerR1-like sembra essere l’omologo funzionale. Questa riduzione risulta più evidente se le cellule vengono precedentemente trattate con la forskolina, noto attivatore dell’enzima adenilato ciclasi che sintetizza cAMP. Un risultato analogo è stato ottenuto saggiando variazioni dell’attività della luciferasi indotta dall’espressione e attivazione delle chimere MiNpR1::CtermCeSer-7 e MiDop1::CtermCeSer-7.
L’espressione della chimera MiNpR1::CtermCeSer-7 (in figura indicata MiNpR1-ChB) determina anch’essa una riduzione dei livelli di cAMP, mentre la chimera MiDop1::CtermCeSer-7 (indicata come MiDop1-ChB) produce un aumento del cAMP, solo in seguito a stimolazione con il suo agonista specifico dopamina (Figura 10).
Per verificare che anche l’utilizzo di una porzione carbossiterminale differente da Ser-7, ma appartenente ad un altro GPCR di C.elegans, producesse una analoga risposta di espressione in membrana e di attivazione, abbiamo costruito altri recettori chimerici utilizzando i recettori di M.incognita MiNpR1-like e MiDopR1-like e sostituendone il tratto carbossiterminale con quello dei recettori NPR1-like (C16D6.2) e DOP-1 (F15A8.5) di C.elegans. Le chimere risultanti sono state denominate MiNpR1-ChB(Cterm2) (SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:48), in cui al recettore di M.incognita MiNpR1-like è stato sostituito il carbossiterminale con quello di C16D6.2, e MiDopR1-ChB(Cterm3) (SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:49), in cui al recettore di M.incognita MiDopR1-like è stato sostituito il carbossiterminale con quello di F15A8.5.
I risultanti costrutti chimerici sono stati trasfettati in cellule CHO per misurarne il livello di espressione con saggio ELISA e la loro attivazione con saggio CRE (cAMP Response Element assay). Come indica la Figura 11, entrambi i recettori chimerici mostrano un livello di espressione in membrana superiore rispetto ai rispettivi recettori non modificati: nel caso di MiNpR1-ChB(Cterm2) l’espressione aumenta rispetto a quella di MiNpR1-like, mentre per MiDopR1-ChB(Cterm3) è ora apprezzabile dato che la forma non modificata MiDopR1-like non si esprime in membrana. La funzionalità dei due recettori chimerici è stata anche confermata dal successivo saggio CRE (Figura 11). Il costrutto MiNpR1-ChB(Cterm2), una volta espresso, determina una riduzione dei livelli di cAMP intracellulari, mentre il costrutto MiDopR1-ChB(Cterm3) produce aumenti di cAMP solo in seguito a stimolazione con il suo specifico agonista dopamina. I risultati di entrambi i saggi riportati in Figura 11 suggeriscono che anche queste due chimere, a differenza delle forme di recettore non modificate, si esprimono, si localizzano in membrana e sono funzionalmente attive.
Possiamo quindi concludere che analogamente a quanto osservato precedentemente con le chimere MiNpR1::CtermCeSer-7 e MiDop1::CtermCeSer-7, anche l’espressione delle chimere MiNpR1-ChB(Cterm2) e MiDopR1-ChB(Cterm3) produce recettori che si localizzano correttamente in membrana cellulare e che sono funzionalmente attivi, quindi utilizzabili per sistemi di analisi e screening, a differenza dei recettori non ingegnerizzati.
Tutti questi risultati quindi suggeriscono che per tutti i recettori testati le modifiche nella regione carbossiterminale ne permettono la corretta localizzazione in membrana ed il corretto funzionamento, confermando quindi la validità della tecnologia sviluppata.
Inoltre, pensiamo che questa tecnologia che intendiamo proteggere possa essere potenzialmente estesa a tutti quei recettori GPCR che mostrano problemi di localizzazione in membrana, come molti GPCR umani con funzioni di percezione del gusto e dell’olfatto.
BIBLIOGRAFIA
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Claims (32)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo di screening di fitofarmaci specifici per i nematodi parassiti delle piante comprendente le seguenti fasi: a) trasformazione di una linea cellulare eterologa con uno o più recettori GPCR wild-type o chimerici dei nematodi parassiti delle piante, detti recettori GPCR chimerici essendo caratterizzati dal fatto di avere il dominio carbossiterminale sostituito con quello dei recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana; b) mettere a contatto il composto da saggiare con detta linea cellulare; c) misurazione del segnale intracellulare attivato dall'espressione o dalla stimolazione del recettore GPCR wild-type o chimerico con un agonista noto, e misura delle possibili variazioni dell'attività di detto recettore in seguito al trattamento col composto da saggiare.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detti recettori GPCR dei nematodi parassiti delle piante sono scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina, recettori della dopamina, recettori di neuropeptidi, recettori della galanina, recettori metabotropici del glutammato e putativi recettori di ammine biogeniche.
- 3. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui detti nematodi parassiti delle piante sono scelti dal gruppo che consiste in Meloidogyne, Heterodera e Globodera.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3 in cui quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne incognita, detto recettore GPCR è scelto dal gruppo che consiste nelle sequenze amminoacidiche mostrate nella seguente Tabella:
- 5. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne hapla, detto recettore GPCR ha la seguente sequenza amminoacidica: MDYAPMPISSNITTWFLLAVFIFVIHRNPSFHSQTNYFLASLAISDLLLILVGVPFDVL FLWKSRFITSPFNGFCEITSTFISWFTFNSILTIVSLTWERLVAICYPFSLKPFFHRDA VIWLIIIIWFISFFPSLFIGLQFKLVIQDFCGHTHVNSNGLGSKCDFVGWSGNYGSGEN YTFEVMLFFTFVLPVLFVIYCYIRILRTLNEATFNSFHLNAGSSIVRKHTSSSHTNSTL LNAITEENLPSTSNNSNSNTAGNNSDLNARDSFTRSSLRSQRAHKTVMKMLIMIAALFF VCYLPYHLERLIVKYSAKGCTEPQMCLWLYHGTGLLQYISAALNPIIYNVMSRRFRREF KLLCYRIVKKENVTKTRSDNNNQLKMTPMNRFL (SEQ. ID NO:14).
- 6. Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui quando detto nematode parassita delle piante è Globodera rostochiensis, detto recettore GPCR ha la seguente sequenza amminoacidica: MLENDLENLDDSSLILHHLGGSFVHAQIVEIEENDYINSNTSVSNTNLNLFSSSSSTSS SSLFSSSSQRSPLLEPNFVDEIWPATSSNSLFYSHPIIAILISILIFLLILITIIGNLG VCAAILLVRKLKAQPANLLLISLALADFCVGLFVMPLAAVYVLEDRWIFGDILCRFWVT ADLTLCTASILNLCAISVDRHLAVTRALRYSALRTRRRICLYICIVWLGALLVSAAPLA LLPFPKIEQYCQVSQNRVYQIYATIIAFWGPSLIMVIVYVKLWSAAKRMHRQDQLVLRW QGVHLPSDGDLEDGLPPTTTTSNATKSLFRNDSIARANARFLFALRMSAQKFGYYDHQN NKTNGGEIINDDENLRIEVRTSASSSGGGGGGSSTLGTLRVPIVLIIMSAFIICWVPFF ILALAKSQHWVNYVPRWLDSLTLWLGYSNSMLNPIIYCKYNREFRVPFGEMLCCRFRTI QDVMRNESYYAKFGSPRISETKIGGSQQRSSGNNYYTKRKRNNTERRAPQNGFLDSSKT KKNYGIKRNSSPSILMESSK (SEQ. ID NO:16).
- 7. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6, in cui detti recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana sono scelti dal gruppo che consiste in C.elegans, C.briggsae, C. japonica, C. brenneri, C. remanei, Zeldia puntata.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui detti recettori GPCR di C.elegans sono scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina SER-1 (Gene Bank: F59C12.2), SER-2 (C02D4.2), SER-3 (K02F2.6), SER-4 (Y22D7AR.13), SER-5 (F16D3.7), SER-6 (Y54G2A.35), SER-7 (C09B7.1); recettori della dopamina DOP-1 (F15A8.5), DOP-2 (K09G1.4), DOP-3 (T14E8.3), DOP-4 (C52B11.3); recettori di neuropeptidi NPR-1 (C39E6.6), NPR-2 (T05A1.1), NPR-3 (C10C6.2); recettori putativi di neuropeptidi NPR1-like (C16D6.2, C25G6.5, F41E7.3); recettori della galanina GAR-1 (C15B12.5), GAR-2 (F47D12.1), GAR-3 (Y40H4A.1); recettori metabotropici del glutammato MGL-1 (ZC506.4), MGL-2 (F45H11.4); o recettori putativi di ammine biogeniche (F01E11.5, C24A8.1, T02E9.3).
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui il dominio carbossiterminale dei recettori GPCR di C.elegans in grado di localizzarsi in membrana ha una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste nelle sequenze SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:41 mostrate nella seguente Tabella:
- 10. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 4-9, in cui detto recettore GPCR chimerico della fase a) ha una sequenza amminoacidica scelta tra: i)MLENDLENLDDSSLILHHLGGSFVHAQIVEIEENDYINSNTSVSNTNLNLFSSSSSTS SSSLFSSSSQRSPLLEPNFVDEIWPATSSNSLFYSHPIIAILISILIFLLILITIIGNLG VCAAILLVRKLKAQPANLLLISLALADFCVGLFVMPLAAVYVLEDRWIFGDILCRFWVTA DLTLCTASILNLCAISVDRHLAVTRALRYSALRTRRRICLYICIVWLGALLVSAAPLALL PFPKIEQYCQVSQNRVYQIYATIIAFWGPSLIMVIVYVKLWSAAKRMHRQDQLVLRWQGV HLPSDGDLEDGLPPTTTTSNATKSLFRNDSIARANARFLFALRMSAQKFGYYDHQNNKTN GGEIINDDENLRIEVRTSASSSGGGGGGSSTLGTLRVPIVLIIMSAFIICWVPFFILALA KSQHWVNYVPRWLDSLTLWLGYSNSMLNPIIYCKYNKEFRIPFREMLACRCATLQTVMRQ QSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO:43); ii)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSSI ILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIFGQ FLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLASGFS LPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTAISFR LGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYNLLRDY DGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLYCKYNKEFRIPFREMLACRCATLQ TVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO:46); iii)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSDL FVAGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRPMR YVRFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDKFRF IEQQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQLKQAT SLLILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFSQINVA VNKSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRVGCGGGN GGERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTFLICWLPF FIVNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFYCKYNKEFRIPFREMLACRC ATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO:47); iv)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSSI ILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIFGQ FLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLASGFS LPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTAISFR LGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYNLLRDY DGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLAVLNLQLRAAFIDLMPHWLRRHLN LEGDNSSPLLNHPTMTITNKYGSTATKTVKATYINTSNGQPYVSTSLVGKVQPEAPSFKF NGSGRKKSAMMRILVQKRNAEEEEQLITKESPSPPEIQMDTLCAASIIPRRKSAQPRSTN EKVVLPRKASF (SEQ ID NO:48); v)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSDLFV AGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRPMRYV RFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDKFRFIE QQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQLKQATSL LILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFSQINVAVN KSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRVGCGGGNGG ERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTFLICWLPFFI VNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFSIFNRDFRRAFKKIIVRVFG CCWEEPDLNKSISSRYAAPDNIERRRSCTRSSESAHDNNNDANATRLNLLSNNNE ETIPE (SEQ ID NO:49).
- 11. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui detto segnale intracellulare della fase c) è scelto tra variazione dei livelli di cAMP, Ca<2+>, IP3, cGMP, attività chinasiche.
- 12. Metodo per coadiuvare l’espressione in un sistema cellulare eterologo di recettori GPCR che presentano difficoltà nel localizzarsi correttamente sulla membrana plasmatica cellulare comprendente le seguenti fasi : a) creazione del gene del recettore GPCR chimerico mediante sostituzione della sequenza corrispondente al dominio carbossiterminale di detto recettore GPCR con quella di recettore GPCR di nematode non parassita di piante in grado di localizzarsi in membrana; b) trasfezione del plasmide contenente il gene chimerico in sistemi cellulari eterologhi; c) espressione del recettore GPCR chimerico nelle cellule.
- 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, in cui detti recettori GPCR sono scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina, recettori della dopamina, recettori di neuropeptidi, recettori della galanina, recettori del glutammato e recettori di ammine biogeniche.
- 14. Metodo secondo la rivendicazione 13 in cui detti recettori GPCR sono GPCR di nematodi parassiti delle piante.
- 15. Metodo secondo la rivendicazione 13, in cui detti nematodi parassiti delle piante sono scelti dal gruppo che consiste in Meloidogyne, Heterodera e Globodera.
- 16. Metodo secondo la rivendicazione 15 in cui quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne incognita, detto recettore GPCR è scelto dal gruppo che consiste nelle sequenze amminoacidiche mostrate nella seguente Tabella:
- 17. Metodo secondo la rivendicazione 15, in cui quando detto nematode parassita delle piante è Meloidogyne hapla, detto recettore GPCR ha la seguente sequenza amminoacidica: MDYAPMPISSNITTWFLLAVFIFVIHRNPSFHSQTNYFLASLAISDLLLILVGVPFDVL FLWKSRFITSPFNGFCEITSTFISWFTFNSILTIVSLTWERLVAICYPFSLKPFFHRDA VIWLIIIIWFISFFPSLFIGLQFKLVIQDFCGHTHVNSNGLGSKCDFVGWSGNYGSGEN YTFEVMLFFTFVLPVLFVIYCYIRILRTLNEATFNSFHLNAGSSIVRKHTSSSHTNSTL LNAITEENLPSTSNNSNSNTAGNNSDLNARDSFTRSSLRSQRAHKTVMKMLIMIAALFF VCYLPYHLERLIVKYSAKGCTEPQMCLWLYHGTGLLQYISAALNPIIYNVMSRRFRREF KLLCYRIVKKENVTKTRSDNNNQLKMTPMNRFL (SEQ. ID NO:14).
- 18. Metodo secondo la rivendicazione 15, in cui quando detto nematode parassita delle piante è Globodera rostochiensis, detto recettore GPCR ha la seguente sequenza amminoacidica: MLENDLENLDDSSLILHHLGGSFVHAQIVEIEENDYINSNTSVSNTNLNLFSSSSSTSS SSLFSSSSQRSPLLEPNFVDEIWPATSSNSLFYSHPIIAILISILIFLLILITIIGNLG VCAAILLVRKLKAQPANLLLISLALADFCVGLFVMPLAAVYVLEDRWIFGDILCRFWVT ADLTLCTASILNLCAISVDRHLAVTRALRYSALRTRRRICLYICIVWLGALLVSAAPLA LLPFPKIEQYCQVSQNRVYQIYATIIAFWGPSLIMVIVYVKLWSAAKRMHRQDQLVLRW QGVHLPSDGDLEDGLPPTTTTSNATKSLFRNDSIARANARFLFALRMSAQKFGYYDHQN NKTNGGEIINDDENLRIEVRTSASSSGGGGGGSSTLGTLRVPIVLIIMSAFIICWVPFF ILALAKSQHWVNYVPRWLDSLTLWLGYSNSMLNPIIYCKYNREFRVPFGEMLCCRFRTI QDVMRNESYYAKFGSPRISETKIGGSQQRSSGNNYYTKRKRNNTERRAPQNGFLDSSKT KKNYGIKRNSSPSILMESSK (SEQ. ID NO:16).
- 19. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 12-18, in cui detti recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana sono scelti dal gruppo che consiste in C.elegans, C.briggsae, C. japonica, C. brenneri, C. remanei, Zeldia puntata.
- 20. Metodo secondo la rivendicazione 19, in cui detti recettori GPCR di C.elegans sono scelti dal gruppo che consiste in recettori della serotonina SER-1 (Gene Bank F59C12.2), SER-2 (C02D4.2), SER-3 (K02F2.6), SER-4 (Y22D7AR.13), SER-5 (F16D3.7), SER-6 (Y54G2A.35), SER-7 (C09B7.1); recettori della dopamina DOP-1 (F15A8.5), DOP-2 (K09G1.4), DOP-3 (T14E8.3), DOP-4 (C52B11.3); recettori di neuropeptidi NPR-1 (C39E6.6), NPR-2 (T05A1.1), NPR-3 (C10C6.2); recettori putativi di neuropeptidi NPR1-like (C16D6.2, C25G6.5, F41E7.3); recettori della galanina GAR-1 (C15B12.5), GAR-2 (F47D12.1), GAR-3 (Y40H4A.1); recettori metabotropici del glutammato MGL-1 (ZC506.4), MGL-2 (F45H11.4); o recettori putativi di ammine biogeniche (F01E11.5, C24A8.1, T02E9.3).
- 21. Metodo secondo la rivendicazione 20, in cui il dominio carbossiterminale dei recettori GPCR di C.elegans in grado di localizzarsi in membrana ha una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste nelle sequenze SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:41 mostrate nella seguente Tabella:
- 22. Recettore GPCR chimerico ottenibile con il metodo definito secondo ognuna delle rivendicazioni 12-21.
- 23. Recettore GPCR chimerico caratterizzato dal fatto di comprendere la sequenza amminoacidica di un recettore GPCR di nematode parassita delle piante che presenta difficoltà nel localizzarsi correttamente sulla membrana plasmatica cellulare, in cui il dominio carbossiterminale di detta sequenza è sostituito con quello di un recettore GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana.
- 24. Recettore GPCR chimerico secondo la rivendicazione 23, in cui detto nematode parassita delle piante è scelto dal gruppo che consiste in Meloidogyne, Heterodera e Globodera.
- 25. Recettore GPCR chimerico secondo ognuna delle rivendicazioni 23-24, in cui detto recettore GPCR è scelto dal gruppo che consiste nelle seguenti sequenze amminoacidiche:
- 26. Recettore GPCR chimerico secondo ognuna delle rivendicazioni 23-25, in cui detti recettori GPCR di nematodi non parassiti in grado di localizzarsi in membrana sono scelti dal gruppo che consiste in C.elegans, C.briggsae, C. japonica, C. brenneri, C. remanei, Zeldia puntata.
- 27. Recettore GPCR chimerico secondo la rivendicazione 26, in cui il dominio carbossiterminale dei recettori GPCR di C.elegans in grado di localizzarsi in membrana ha una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste nelle sequenze SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:41 mostrate nella seguente Tabella:
- 28. Recettore GPCR chimerico secondo ognuna delle rivendicazioni 25-27, caratterizzato dal fatto di avere una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo che consiste in: i)MLENDLENLDDSSLILHHLGGSFVHAQIVEIEENDYINSNTSVSNTNLNLFSSSSST SSSSLFSSSSQRSPLLEPNFVDEIWPATSSNSLFYSHPIIAILISILIFLLILITIIGN LGVCAAILLVRKLKAQPANLLLISLALADFCVGLFVMPLAAVYVLEDRWIFGDILCRFW VTADLTLCTASILNLCAISVDRHLAVTRALRYSALRTRRRICLYICIVWLGALLVSAAP LALLPFPKIEQYCQVSQNRVYQIYATIIAFWGPSLIMVIVYVKLWSAAKRMHRQDQLVL RWQGVHLPSDGDLEDGLPPTTTTSNATKSLFRNDSIARANARFLFALRMSAQKFGYYDH QNNKTNGGEIINDDENLRIEVRTSASSSGGGGGGSSTLGTLRVPIVLIIMSAFIICWVP FFILALAKSQHWVNYVPRWLDSLTLWLGYSNSMLNPIIYCKYNKEFRIPFREMLACRCA TLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO:43); ii)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSS IILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIF GQFLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLAS GFSLPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTA ISFRLGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYN LLRDYDGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLYCKYNKEFRIPFREMLAC RCATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO: 46); iii)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSD LFVAGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRP MRYVRFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDK FRFIEQQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQL KQATSLLILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFS QINVAVNKSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRV GCGGGNGGERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTF LICWLPFFIVNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFYCKYNKEFRIPF REMLACRCATLQTVMRQQSFTSRYGPPVSRRNDSHEASDV (SEQ ID NO:47); iv)MEASTMELLPPPTILFNVSSAPSVICEDMNAYLWNTRRDLTTCPFVMAVFASLYSS IILLGIIGNSCVIMAIARIKSLQTVPNMFIFSLSCSDILVCFISATITPIAAFKKDWIF GQFLCSFAPFVAGGSLCFSTFTLAAISVDRFLLILFPTRKAFSHTQALFIILVTFLLAS GFSLPMLFMQKLKPVTHYCGRFCFEDWGEMIGIRRIYGTLLLTVQFIIPLALITFCYTA ISFRLGKSVNLRTRKKCEWQMPISAQRNGATKRRQRTNRMFIAMVIAFSVSWIWSVLYN LLRDYDGLPKFVHDQEFFFGILTHCIAMSSTVWNPILYALLAVLNLQLRAAFIDLMPHW LRRHLNLEGDNSSPLLNHPTMTITNKYGSTATKTVKATYINTSNGQPYVSTSLVGKVQP EAPSFKFNGSGRKKSAMMRILVQKRNAEEEEQLITKESPSPPEIQMDTLCAASIIPRRK SAQPRSTNEKVVLPRKASF (SEQ ID NO:48); v)MLPWWLPLLIFVPIFSVLISLAFSGNLLVIAAIFYDRKLRRQPENLFLVSLALSDLF VAGMVMVLAAANDLIGFWPFGAAFCQFWICLDIACSTASILNLCAIALDRFIHISRPMR YVRFVGRRVICCSVCAIWIISTAVGTAQIAFGATNGLEIYSVIFNGDYFGEINETDKFR FIEQQHTLVQCQLQLSPFYAVFSSLLSFFLPATLMLFLYYRLYLYARHHARSIQSQLKQ ATSLLILQLASDRVRQVVVRPSSGFLSPSSIALHYDSRRFSGKSSFDGESLQKAEFSQI NVAVNKSPENHSIDATIQQGTPVLRATLRQLRRTESNNSSSFSFVSRNGLGVNSRRVGC GGGNGGERRKSCSPLPSPTTKRGFKSCGWSNNNNGNGGHRSSDKKARVTLGVIMGTFLI CWLPFFIVNVLRPFWPEIFPPLLFQTVSWLGYANSSVNPVIYGIFSIFNRDFRRAFKK IIVRVFGCCWEEPDLNKSISSRYAAPDNIERRRSCTRSSESAHDNNNDANATRL NLLSNNNEETIPE (SEQ ID NO:49).
- 29. Uso dei recettori GPCR chimerici di nematodi parassiti delle piante come definiti secondo ognuna delle rivendicazioni 22-28, come target di potenziali fitofarmaci specifici per detti nematodi.
- 30. Vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per un recettore GPCR chimerico come definito secondo ognuna delle rivendicazioni 22-28.
- 31. Linea cellulare eterologa trasformata con il vettore di espressione come definito nella rivendicazione 30.
- 32. Uso di una linea cellulare come definita secondo la rivendicazione 31 in un metodo di screening di potenziali fitofarmaci specifici per nematodi parassiti delle piante.
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| WO2001061000A1 (en) * | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | 5ht3 receptors of nematodes, polynucleotide molecules encoding same, and antagonists thereof |
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2008
- 2008-12-16 IT IT002229A patent/ITMI20082229A1/it unknown
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