ES2949039T3 - Nanocuerpos adecuados para terapia de regeneración neuronal - Google Patents

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Monique Lafon
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Institut Pasteur de Lille
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Abstract

La invención pertenece al ámbito de la administración de moléculas a las células cerebrales a través de la barrera hematoencefálica. La invención se refiere a un nuevo vehículo basado en polipéptido que permite la administración eficiente de un péptido efector a células neuronales a través de la barrera hematoencefálica y a métodos para la producción y prueba de dicho vehículo, incluido un modelo para probar la capacidad de dicha molécula para cruzar la barrera hematoencefálica y/o la toxicidad de las moléculas en la barrera hematoencefálica y/o la capacidad de las moléculas que han cruzado para dirigirse a células cerebrales humanas (por ejemplo, neuronas, astrocitos y células microgliales). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanocuerpos adecuados para terapia de regeneración neuronal
Sector de la técnica
La presente solicitud pertenece al dominio del suministro de moléculas a las células cerebrales a través de la barrera hematoencefálica. La presente solicitud describe un nuevo transportador basado en polipéptidos que permite el suministro eficiente de un péptido efector, a las células neuronales a través de la barrera hematoencefálica. También se divulgan métodos para la producción y análisis de dicho transportador, incluyendo un modelo para analizar la capacidad de dicha molécula para cruzar la barrera hematoencefálica y/o la toxicidad de las moléculas sobre la barrera hematoencefálica y/o la capacidad de las moléculas que han cruzado para dirigirse a células cerebrales humanas (por ejemplo, neuronas, astrocitos y células de la microglía). La invención se refiere, más en particular, a un polipéptido, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un polinucleótido que codifica el mismo que se define en la reivindicación 6, un vector que contiene dicho polinucleótido como se define en la reivindicación 7, una célula o línea celular que contiene dicho vector como se define en la reivindicación 8, composiciones como se definen en la reivindicación 9, y el uso terapéutico de estos medios en el tratamiento de enfermedades neurológicas, como se define en la reivindicación 10.
Estado de la técnica
En el contexto del desarrollo de tratamientos para enfermedades tales como enfermedades neurodegenerativas y traumatismos cerebrales, el acceso y la disponibilidad de fármacos para el cerebro siguen siendo necesidades insatisfechas. De hecho, el cerebro está aislado del flujo sanguíneo sistémico por una estructura llamada barrera hematoencefálica (BHE). La BHE se compone principalmente de células endoteliales cerebrales que interactúan dinámicamente con las células vecinas: astrocitos, pericitos, microglía perivascular y neuronas. Las tres funciones principales de la BHE son la creación y el mantenimiento de la homeostasis iónica para las funciones neuronales, el suministro de nutrientes al sistema nervioso central (SNC), y la protección contra lesiones tóxicas o algunos agentes infecciosos. El suministro de sustancias terapéuticas al cerebro tiene que superar la BHE y convertirla en una puerta de entrada. A pesar de los esfuerzos para superar las barreras de unión o de eflujo o para eludir la BHE, la mayoría de los neurofármacos creados recientemente fallan debido a la mala farmacocinética del SNC.
En el contexto del suministro de moléculas a través de la barrera hematoencefálica (BHE), se describió un tipo de transportadores altamente solubles derivados de anticuerpos únicamente de cadena pesada de camélidos (HcAb). Los dominios de cadena pesada variable (VHH) de estos anticuerpos muestran una especificidad y afinidad por el antígeno similares a las construcciones de anticuerpos convencionales que consisten en heterodímeros de cadena ligera y pesada, y muestran un tamaño más pequeño de aproximadamente 15 kDa. Un VHH también se denomina "fragmento VHH" para reflejar que es una porción de un anticuerpo. Se ha demostrado que los VHH, en contextos específicos, cruzan la BHE. Aunque por el momento no se determinó ninguna característica estructural específica de VHH para transmitir la permeabilidad a través de la BHE, un parámetro importante parece ser el punto isoeléctrico (μl, por sus siglas en inglés): se cree que los VHH permeables suelen ser básicos (especialmente con un μl superior a 8,5). Además, el tamaño se considera un factor importante de la permeabilidad de VHH y la capacidad de transporte y, en particular, se considera que su estructura monomérica de bajo peso molecular contribuye a estas capacidades. Se contempló que dirigirse a antígenos de superficie celular específicos podría inducir endocitosis y mejorar la permeabilidad de dicho VHH a través de la BHE. También se contempló usar un VHH específico para un antígeno cerebral como vehículo para dirigir una molécula de carga a un sitio específico en el cerebro, a través de la BHE (Li et al., 2012, documentos WO 2010/004432 A1, US 8.460.888 B2). El documento US 8.460.888 B2 describe con precisión un VHH que tiene un punto isoeléctrico de al menos 8,5, que se dirige contra una proteína fibrilar glial ácida (GFAP, por sus siglas en inglés). Tales construcciones de vehículos de carga, sin embargo, puede tener una eficiencia reducida o un alcance de aplicación reducido, en particular debido a su unión al antígeno cerebral, lo que podría dar como resultado el secuestro de la mayoría de la molécula de carga fuera de su sitio de acción.
También se conoce por el documento WO 2009/004495 A2 un VHH, que es capaz de unirse específicamente al llamado péptido beta amiloide 42.
Objeto de la invención
Los presentes inventores han identificado sorprendentemente un VHH básico, que no reconoce ningún antígeno específico de cerebro y es útil como vehículo para transportar un péptido (el llamado péptido de carga) a través de la barrera hematoencefálica. La molécula de carga, normalmente un péptido con actividad específica en un componente cerebral, habiendo cruzado la BHE, podrá conservar su actividad biológica y tener acceso al lugar de su actividad.
Por lo tanto, la invención proporciona un nuevo polipéptido que se encuentra en un VHH de un anticuerpo de cadena pesada de camélido, como se define en la reivindicación 1. Según la invención, dicho VHH tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. También se divulga un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 3 o un polipéptido que comprende o consiste en un VHH que tiene una variante de secuencia de la SEQ ID NO: 3, siendo dicha variante como se describe a continuación. También se divulga un polipéptido que comprende o consiste en un VHH que tiene una porción de la secuencia de SEQ ID NO: 3 o de una variante de secuencia de la misma, como se describe a continuación. El VHH descrito en el presente documento y/o el polipéptido que comprende un VHH de la invención es permeable a través de la BHE y no reconoce ningún antígeno cerebral, en particular ningún antígeno del cerebro humano, y/o no se une específicamente a ninguna proteína del cerebro humano. El VHH descrito en el presente documento y/o el polipéptido que comprende un VHH de la invención tiene un pI básico.
La solicitud también describe, como se describe a continuación, polipéptidos que comprenden VHH que consisten en polipéptidos quiméricos (o de fusión), que comprenden o consisten en un VHH como se define en el presente documento con péptidos/polipéptidos fusionados adicionales, incluyendo péptidos dirigidos a células neuronales, péptidos utilizados como etiquetas y/o espaciadores y/o péptidos efectores que tienen un efecto biológico pretendido y ventajoso sobre las células cerebrales. Sin embargo, la invención se refiere a polipéptidos que tienen las características establecidas en las reivindicaciones 2 a 5.
También se describen polinucleótidos que codifican dichos VHH o polipéptidos que comprenden VHH, vectores que comprenden dichos polinucleótidos, células que contienen dichos vectores, y composiciones farmacéuticas que comprenden dichas células, vectores, polinucleótidos, VHH o polipéptidos que comprenden VHH. Sin embrago, la invención se refiere a un vidrio como se define en la reivindicación 6, un vector como se define en la reivindicación 7 y una célula o línea celular o una composición como se definen en las reivindicaciones 8 y 9. También se divulgan métodos para la producción de dichos VHH o polipéptidos o polinucleótidos que comprenden VHH, incluyendo métodos y dispositivos para analizar si un polipéptido o cualquier otra molécula es permeable a través de la BHE. La invención también se refiere a usos terapéuticos del VHH o de los polipéptidos de la invención, como se define en la reivindicación 10.
En un aspecto particular, los presentes inventores han descubierto que el direccionamiento de dicho VHH o polipéptido que comprende VHH puede mejorarse a través de un péptido dirigido a células neuronales, por ejemplo, fusionado con la secuencia de VHH, preferentemente en el extremo aminoterminal. Dichos péptidos derivan preferentemente de la secuencia de una proteína G del virus de la rabia (RVG, por sus siglas en inglés, especialmente uno de los nuevos péptidos derivados de la rabia (RDP, por sus siglas en inglés) divulgados en el presente documento. Dichos péptidos son permeables a través de la BHE por sí mismos, y se ha contemplado su uso para transportar moléculas de carga a través de la BHE (Fu et al., 2012). Sin embargo, a diferencia del VHH o el polipéptido que comprende VHH al que se hace referencia en el presente documento, no se ha demostrado que permitan la estabilización (aumento de la semivida) de péptidos efectores tales como los péptidos Neurovita descritos en el presente documento. Según la invención, por lo tanto, el VHH se fusiona con un péptido dirigido a células neuronales, en particular un RDP, preferentemente con la secuencia de (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 32). Los VHH suelen mostrar 2 restos de aminoácidos de cisteína (en adelante en el presente documento, cisteínas) que podrían formar enlaces disulfuro intramoleculares. No contienen un número impar de cisteínas que puedan formar enlaces disulfuro intermoleculares y, en general, no tienen capacidad para formar homodímeros. Se ha contemplado generar proteínas de fusión de VHH o producir de otro modo VHH multimérico. Sin embargo, en la técnica anterior, solo se han informado estrategias de dimerización que implican la región carboxiterminal de la proteína VHH (o derivada de VHH) y se ha informado que la formación de enlaces disulfuro da como resultado rendimientos de producción y solubilidad de VHH drásticamente reducidos (Simmons et al., 2006). Además, debido a que se cree que el tamaño pequeño de VHH desempeña un papel importante en su permeabilidad a través de la BHE, en configuraciones donde VHH se utilizan como transportadores trans-BHE, no se ha contemplado la dimerización y/o multimerización. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente, e informan en el presente documento, que puede ser ventajoso diseñar el VHH o el polipéptido que comprende VHH descrito en el presente documento de modo que tenga capacidad de dimerización. En particular, pueden incluirse cisteínas formadoras de enlaces disulfuro, especialmente en la región aminoterminal del VHH o del polipéptido que comprende VHH, por ejemplo, en la secuencia del péptido dirigido a células neuronales mencionado anteriormente. Esto no da como resultado una expresión disminuida en las bacterias utilizadas para su producción y da como resultado una actividad potenciada de la construcción. VHH o los polipéptidos que comprenden VHH que forman enlaces disulfuro se expresan fácilmente como dímeros en el periplasma de bacterias y la recuperación de la construcción es sencilla. También es posible que la formación de dímeros aumente la semivida del VHH divulgado en el presente documento o del polipéptido que comprende VHH de la invención. En realizaciones particulares, por lo tanto, el VHH divulgado en el presente documento o el polipéptido que comprende VHH de la invención tiene, tal como se define en la reivindicación 2, dimerización, especialmente la capacidad de homodimerización, preferentemente a través de la formación de enlaces disulfuro y/o a través de dominios en la región aminoterminal del VHH o del polipéptido que comprende VHH de la invención. En realizaciones preferidas, las cisteínas que forman enlaces disulfuro están comprendidas en la secuencia del péptido dirigido a células neuronales fusionado en la posición aminoterminal del polipéptido que comprende VHH. Aparte, en realizaciones particulares, el VHH divulgado en el presente documento o el polipéptido que comprende VHH de la invención se expresa en bacterias en el periplasma y se recupera, y opcionalmente se purifica, del periplasma de dichas bacterias, preferentemente en forma de homodímeros.
El VHH o el polipéptido que comprende VHH descrito en el presente documento suele usarse en aplicaciones en las que se desea ejercer un efecto biológico sobre las células cerebrales sin requerir la administración directa de un producto en el cerebro. El efecto biológico (por ejemplo, aumento de la supervivencia, proliferación, crecimiento de neuritas) a veces se puede obtener a través de péptidos conocidos, pero es posible que estos péptidos no tengan la capacidad de penetrar a través de la BHE y/o de dirigirse a su sitio de acción (por ejemplo, células específicas, compartimentos celulares, proteínas o complejos de proteínas, ...) por sí solos. Cuando se une a VHH o a polipéptidos que comprenden VHH descritos en el presente documento, el péptido puede ser capaz de conservar su actividad, siendo permeable a través de la BHE y/o dirigirse a un sitio de acción específico. Por lo tanto, la solicitud describe un VHH, y la invención se refiere a un polipéptido que comprende VHH como se define en el presente documento, unido a un péptido efector con actividad biológica sobre las células cerebrales, particularmente fusionado con dicho péptido.
Una familia específica de polipéptidos, que comprende un dominio de unión a MAST-2, la familia Neurovita, se ha descrito que tiene un efecto de neurosupervivencia y neuroprotector y/o de promover el crecimiento de neuritas (documentos WO 2010/116258 A1, WO 2013/068430 A2). Aunque se ha contemplado el uso de dichos péptidos Neurovita para aplicaciones terapéuticas, no pueden penetrar a través de la BHE de manera eficiente por sí mismos, lo que dificulta su uso en aplicaciones donde se deba dirigir al SNC. Se ha divulgado el uso de un sistema de suministro basado en vectores de expresión (por ejemplo, transducidos ex-vivo en las células de un individuo) para expresar los péptidos en el cerebro, pero esto tiene numerosos inconvenientes, incluyendo consideraciones de seguridad relacionadas con el uso de vectores de expresión, así como consideraciones farmacocinéticas, ya que el tiempo desde la administración hasta la expresión eficiente con este tipo de suministro se expresa en días, que es demasiado lento para muchas aplicaciones (como reparación/recuperación de neuronas después de una lesión o accidente cerebrovascular), mientras que la semivida del vector, del orden de semanas, puede ser demasiado largo. El suministro basado en vectores lentivirales, en particular, se ha divulgado y aunque el ARNm se detecta fácilmente, la semivida corta del péptido da lugar a niveles de proteína apenas detectables. También se han divulgado sistemas de suministro basados en sistemas de penetración celular tales como el péptido TAT derivado de VIH-1 para péptidos Neurovita. Sin embargo, la baja eficiencia y/o la semivida corta del péptido de fusión requerían el uso de altas dosis de péptido, con efectos tóxicos potenciales (Préhaud et al., 2010).
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los péptidos de Neurovita pueden conservar su actividad biológica cuando se fusionan en el extremo carboxiterminal de un VHH descrito en el presente documento o de un polipéptido de la que comprende VHH de la invención, y se suministran de manera eficiente a través de la BHE, por ejemplo, cuando se inyectan por vía intravenosa, y que dichas fusiones promueven el crecimiento de neuritas y/o la neurosupervivencia y/o la neuroprotección y permiten la reparación/recuperación de las células neuronales después de una lesión. Por lo tanto, la presente solicitud describe péptidos Neurovita, fusionados en el extremo C con un VHH o un polipéptido que comprende VHH como se describe en el presente documento, proporcionando así un polipéptido que comprende VHH que tiene actividad específica sobre las neuronas. En realizaciones particulares de la invención, el péptido Neurovita tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 7.
El suministro eficiente a través de la BHE de un péptido de carga, unido a (o incluido en) un VHH o un polipéptido que comprende VHH permite prever el uso de dicha construcción para terapia, especialmente de enfermedades que afectan al SNC, tales como enfermedades neurodegenerativas, o de afecciones asociadas al daño de las células cerebrales tales como accidente cerebrovascular o lesión cerebral, o de la evolución de dicha enfermedad o afección. Dichos usos pueden implicar composiciones adecuadas para administración in vivo, especialmente para inyección intravenosa, que comprenden un VHH divulgado en el presente documento o un polipéptido que comprende VHH de la invención y, opcionalmente, otros constituyentes farmacéuticamente aceptables. Por lo tanto, la invención proporciona dichas composiciones. También se divulgan métodos terapéuticos que utilizan el VHH, los polipéptidos que comprenden VHH, y/o la composición de la divulgación o invención. La invención también proporciona dichos polipéptidos que comprenden VHH y/o composiciones de la invención para su uso como medicamento, especialmente un medicamento para su uso en terapia de enfermedades neurodegenerativas o afecciones asociadas a daño de células cerebrales. En realizaciones particulares, la terapia comprende la inyección intravenosa de los polipéptidos que comprenden VHH y/o composiciones de la invención.
Los métodos para producir un VHH o polipéptidos que comprenden VHH se divulgan en el presente documento, y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos se describen en el presente documento. El VHH se encuentra entre los elementos esenciales de los productos de la invención. La característica principal de dicho VHH es su permeabilidad a través de la BHE, o capacidad de cruzar la BHE, en el contexto de un polipéptido que comprende VHH. En realizaciones preferidas, el VHH no reconoce ningún antígeno cerebral, en particular ningún antígeno cerebral humano, y/o el VHH, el polipéptido que comprende VHH y/o el VHH del polipéptido que comprende VHH se une o no se une específicamente a ninguna proteína cerebral, particularmente ninguna proteína cerebral humana. Los métodos para preparar VHH que portan dicha característica se describen en detalle. Según la invención, el polipéptido que comprende VHH seleccionado tiene un pI básico. Según la invención, el polipéptido que comprende VHH seleccionado penetra eficientemente a través de (o es capaz de cruzar) la BHE, penetra de manera especialmente eficiente a través de la capa de células endoteliales imitando la BHE en un modelo de BHE in vitro. En realizaciones específicas, el VHH o el polipéptido que comprende VHH descritos en el presente documento pueden formar homodímeros. En realizaciones específicas de los métodos para producir un VHH o un polipéptido que comprende VHH, dicho VHH o polipéptido que comprende VHH se expresa en células, preferentemente en células bacterianas. En realizaciones específicas de dichos métodos, dicho VHH o polipéptido que comprende VHH se recupera en el periplasma de bacterias. A pesar de los esfuerzos para superar las barreras de unión o de eflujo o para eludir la BHE, la mayoría de los neurofármacos creados recientemente fallan debido a la mala farmacocinética del SNC. Por lo tanto, la detección temprana de estas moléculas en un modelo de BHE pertinente y fiable para determinar su penetración y su interacción con la barrera es crucial. Debido a cambios en la legislación y cuestiones éticas relacionadas con la experimentación con animales, la creación de un modelo de BHE humana in vitro es de gran interés para la investigación básica y las empresas industriales. Los modelos in vitro para analizar la permeabilidad a través de la BHE presentan un gran interés en el desarrollo de sustancias destinadas a penetrar a través de la BHE, especialmente sustancias para su uso en terapia y/o diagnóstico, especialmente de enfermedades que afectan al SNC. Dichos modelos también presentan interés para la investigación y el desarrollo relacionados con la BHE. En la actualidad, los modelos in vitro utilizados en dichas aplicaciones incluyen modelos en los que la propia BHE se imita mediante una capa (monocapa o varias capas) confluente de células endoteliales, que se puede cultivar, por ejemplo, en un filtro. El filtro se puede colocar en un recipiente de cultivo celular, de tal manera que separa el contenedor de cultivo celular en dos compartimentos, impidiendo la difusión pasiva de macromoléculas de un compartimento a otro. En dichos modelos, una sustancia puede incubarse en uno de los compartimentos, y su permeabilidad puede medirse midiendo la cantidad de sustancia que se encuentra en el otro compartimento después de un tiempo determinado y/o su efecto sobre la BHE puede medirse midiendo, es decir, la viabilidad de las células que constituyen la capa confluente (Weksler et al., 2005, documentos US 8.084.254 B2, WO 2006/056879).
Sin embargo, se reconoce que estos modelos simples no pueden reflejar con precisión el comportamiento in vivo de la BHE. En particular, se reconoce que, además de las células endoteliales que constituyen la propia BHE, el efecto de las células del entorno, particularmente de las células que se encuentran en el cerebro, es significativo. Por lo tanto, se han desarrollado modelos más sofisticados, que comprenden, además de la una o más capas de células endoteliales, células neuronales y/o células gliales, incluyendo, por ejemplo, astrocitos (Bicker et al., 2014, documento EP 1964 915 A1). Sin embargo, estos modelos suelen hacer uso de células de roedores/bóvidos, mientras que se reconoce que un modelo fiable debe consistir en células de origen humano. Las células microgliales constituyen componentes importantes del entorno de la BHE. Sin embargo, la mayoría de los modelos del estado de la técnica carecen de dichas células, en particular por su efecto inflamatorio, que se cree que es perjudicial para el modelo. De hecho, se ha demostrado que las células microgliales activadas inducen la disfunción de la BHE (en particular, de las células endoteliales), mientras que su activación puede ser el resultado de numerosos estímulos y es difícil de evitar en cultivos in vitro (Sumi et al., 2010). Así mismo, mientras que se ha descrito que los modelos que consisten en células inmortalizadas muestran malas propiedades de barrera (Lippmann et al., 2013), dichos modelos tendrían, ventajas esencialmente prácticas. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que un modelo de cerebro in vitro como se describe anteriormente que consiste en células humanas inmortalizadas que comprende, además de la una o más capas confluentes de células endoteliales, neuronas, astrocitos y células microgliales en un compartimento, es fácilmente utilizable para estudios in vitro relacionados con la BHE, tal como la evaluación de la permeabilidad a través de o el efecto sobre la BHE de una sustancia, y el direccionamiento y el efecto sobre las células del parénquima cerebral (neuronas, astrocitos, microglía) de moléculas o microorganismos que hayan podido atravesar previamente la BHE.
Por lo tanto, también se divulgan dispositivos, especialmente dispositivos adecuados para su uso como modelos in vitro de la BHE, que comprenden o consisten en un recipiente de cultivo celular, separado en dos compartimentos por una o más capas confluentes de células endoteliales humanas impermeables a la difusión pasiva de macromoléculas, y que comprenden células microgliales humanas en al menos un compartimento (el "compartimento cerebral" como se define en el presente documento). En un aspecto particular, el compartimento cerebral comprende otras células, en particular células cerebrales humanas no microgliales, además de las células microgliales, y las células microgliales representan preferentemente del 1,5 % al 24 % de las células en el compartimento que las contiene (el compartimento cerebral). En un aspecto particular, las células cerebrales no microgliales son células neuronales y/o astrocitos humanos. En otros aspectos, las células endoteliales, las células microgliales y/o las demás células son células humanas, preferentemente células humanas inmortalizadas. En el presente documento se divulga el uso de células Ntera-2clD/1 en la fabricación de una BHE y las BHE que comprenden dichas células, como neuronas y/o astrocitos en el compartimento cerebral. También se divulga en el presente documento una línea celular, SK-N-SHD, que puede crecer en un medio de cultivo celular convencional y se diferencia en células neuronales cuando se siembra en NeuroGRO™ o medios similares. Esta línea celular se divulga en particular para sembrar el compartimento cerebral de un modelo de BHE, y también se divulgan modelos que comprenden dichas células. También se divulgan métodos para la preparación de dichos dispositivos, incluyendo medios de cultivo óptimos que serían compatibles para todos los tipos de células que están presentes. También se divulgan usos para dichos dispositivos, especialmente como un modelo de la BHE in vitro. Los aspectos particulares incluyen métodos para analizar la permeabilidad de una sustancia de prueba a través de la BHE y/o métodos para analizar la toxicidad de una sustancia de prueba en la BHE, incluyendo dichos métodos la incubación de dicha sustancia de prueba en los dispositivos divulgados en el presente documento. Estos métodos generalmente incluirán la incubación de dichas sustancias de prueba en un compartimento de dicho dispositivo y, después de un tiempo de incubación dado, i) medir la cantidad de sustancia de prueba en el otro compartimento y/o ii) medir la viabilidad de las células, incluidas las células endoteliales y/o las "células diana" (neuronas, astrocitos, microglía).
Descripción de las figuras
Figura 1. Representación esquemática y expresión de polipéptidos que comprenden VHH específicos
A. Estructura de VHH1, VHH2 y VHH3. RDP = péptido dirigido a células neuronales (SEQ ID NO: 1); VHH (SEQ ID NO: 3); StrepTag = etiqueta de estrep. (SEQ ID NO: 5); PDZ-BS = péptido Neurovita (SEQ ID NO: 7); delta-PDZ-BS (en VHH3) = péptido Neurovita desprovisto de PDZ-BS y por tanto inactivo (SEQ ID NO: 9). La línea negra que conecta los símbolos "S" representa un puente disulfuro entre los restos de cisteína del RDP. B. Los polipéptidos que comprenden VHH se produjeron y purificaron por inmunoafinidad con un anticuerpo antiestrep y se evaluó su expresión en transferencia Western. 1=VHH1, 2=VHH2, 3=VHH3. C. Análisis PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) de la construcción Neurovita-Neurocargo (VHH1) en condiciones desnaturalizantes (carril 1) y no desnaturalizantes (carril 2), mostrando la presentación dimérica del polipéptido. A la izquierda del carril 1, se indican los pesos moleculares aproximados. A la derecha del carril 2, la forma monomérica se indica con "M" y la forma dimérica con "D". D. El VHH A12 demostró por transferencia Western que no reconocía ninguna proteína cerebral. La transferencia Western se realizó con VHH A12 o H8/E9 en extracto de cerebro humano (Sg tau 4697; carril 1), un extracto de cerebro de ratón (Tg 4510; carril 2) y en una proteína purificada, GFAP, un marcador específico de astrocitos (carril 3). E. La inmunohistoquímica demostró que el VHH A12 no reconoce ninguna proteína cerebral. La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando mAb contra VHH A12 o AT8 en secciones de cerebro de ratón embebidas en parafina tg 4510, se muestra a 1,25x y 20x. AT8 reconoció NFT presentes en tejidos cerebrales. La escala está indicada por la barra negra gruesa.
Figura 2. Unión de polipéptidos que comprenden VHH a la subunidad alfa 7 del receptor de acetilcolina (AchR alfa7)
La unión de polipéptidos que comprenden VHH a células HEK293 que expresan AchR alfa 7 se evaluó mediante FACS después de 30 minutos a 4 °C, en presencia de competidores. A. Competencia del virus de la rabia (RABV). Eje horizontal: Intensidad de Cy5 (escala logarítmica). Eje vertical: recuentos celulares. La curva "C" es la curva de control. En ausencia de RABV ("-", fila superior), VHH1 se une fácilmente a las células, mientras que la unión de VHH2 (sin péptido dirigido a células neuronales) no se distingue del control (el gráfico en realidad no permite distinguir las curvas de VHH2 y el control). Las flechas negras muestran el cambio del pico. En presencia de RABV ("+", fila inferior), se observa una disminución del 54 % en la unión de VHH1. B. Competencia alfa-bungarotoxina. Eje y flechas como en el panel A. La presencia de alfa-bungarotoxina (curva "+") no modifica la unión de VHH2, mientras que reduce la unión de VHH1 en un 58 %. C. Comparación de unión de VHH1, VHH2, VHH3. La unión de los polipéptidos que comprenden VHH se probó en ausencia (-) o presencia (+) del virus de la rabia (RABV), expresada en unidades relativas (UR). "**" indica un valor de p ≤0,004 en la prueba t de Student.
Figura 3. Estimulación del crecimiento de neuritas por polipéptidos que comprenden VHH
A. Los ensayos de crecimiento de neuritas para células de control (Ct) o células en presencia de polipéptidos que comprenden VHH VHH1, VHH2 y VHH3 (panel izquierdo) o las fracciones periplásmicas (P) o citoplasmáticas (C) de VHH1 expresadas en bacterias (panel derecho) se realizaron como se describe en la sección de ejemplos. VHH1 se produce en el citoplasma como monómero. Eje vertical: longitud media de neuritas por neurona en μm. Una prueba de ANOVA mostró un valor de p ≤0,0001 en todos los casos. B. Imágenes de microscopía correspondientes a experimentos en el grupo A (a las 72 h de incubación). VHH1 en la fracción citoplasmática (monomérica) estimula el crecimiento de neuritas pero menos que VHH1 en la fracción periplásmica (homodimérica) y no desencadena una gran expansión del cono de crecimiento.
Figura 4. Unión de polipéptido que comprenden VHH y entrada en las neuronas
A. La unión y entrada de polipéptidos que comprenden VHH a células NS diferenciadas se evaluó mediante FACS después de 30 min a 4 °C. Eje horizontal: Intensidad de Alexa 488 (escala logarítmica). Eje vertical: recuentos celulares. La curva "C" es la curva de control, la curva "1" es la curva de VHH1. VHH1 se une fácilmente a las células, mientras que la unión de VHH2 y VHH3 apenas se distingue del control (el gráfico en realidad apenas permite distinguir las curvas de VHH2, VHH3 y el control). B. Inmunofluorescencia de VHH1 en células NS tratadas durante 72 h con VHH1. Los recuadros muestran el cono de crecimiento neuronal. VHH1 expande el cono de crecimiento neuronal C. Inmunofluorescencia de actina en control (Ct) y tratadas con VHH1 (48 h, VHH1) de células NS diferenciadas. Las puntas de flecha muestran una tinción intensa correspondiente a la actina claramente visible en las imágenes en color originales. VHH1 estimula la motilidad del cono de crecimiento.
Figura 5. Desencadenamiento de la regeneración del axón después de la herida mediante polipéptidos que comprenden VHH
A. Se realizó un ensayo de raspado en el que se incubaron previamente NT2-N sin (Ct) o con un polipéptido que comprende VHH (VHH1, VHH2 o VHH3) durante 4 horas antes de dañar las células. El ensayo se leyó después de 72 h de incubación (es decir, 68 h después de la herida). Eje vertical: porcentaje medio de neuronas en regeneración. (***) o (****) indica un valor de p ≤ 0,0001 en la prueba t de Student B. Experimento y símbolos similares a los del grupo A, pero la herida se realizó 1 h antes de la adición del polipéptido que comprende VHH y la lectura 72 h después de la herida (es decir, después de 71 h de incubación del polipéptido). C. Imágenes típicas que muestran regeneración (fila superior) o falta de regeneración y destrucción celular (fila inferior) 3 días después del raspado.
Figura 6. Modelo in vitro del Minibrain-BHE humano
A. Representación esquemática de modelos in vitro, se muestra como una sección transversal de un pocillo de cultivo celular. Panel izquierdo, modelos de la técnica anterior, desprovistos de células en el compartimento cerebral; panel derecho: modelo de la divulgación. Br: compartimento cerebral; Bl: compartimento de inyección, correspondiente al lado "sangre" de la BHE; E: células endoteliales; A: astrocitos; N: neuronas; M: células de la microglía. B. Fenotipo de células minibrain, 24 h después de la adición del pocillo que contiene las células endoteliales. Se midió la expresión de ARNm de varios genes en células que forman parte del modelo de la divulgación, en células NT2-N: 1 = tirosina hidroxilasa (TH), un marcador de células neuronales, o en NT2-N, NT2-A y células CHME: 2 = proteína H del neurofilamento (NEFH), un marcador de células neuronales; 3 = proteína astrocítica fibrilar glial (GFAP), 4 = acuaporina 4 (AQP4) y 5 = glucógeno fosforilasa B (PYGB), marcadores de astrocitos; 6 = receptor de CD 200 (CD200R), un marcador de células microgliales. Eje vertical: % de expresión de ARNm en comparación con el control.
Figura 7. Caracterización por O-PCR de células endoteliales en el modelo Minibrain-BHE
Se midió la expresión de ARNm de varios genes en células endoteliales que forman parte del modelo de la divulgación, 24 h después de que se añadieran al recipiente de cultivo celular que contenía las células cerebrales, preparando dicho modelo con un 1,5 % (paneles de la izquierda) o un 24 % (paneles de la derecha) de células microgliales. Eje vertical: % de expresión de ARNm en comparación con el control. A. Transportadores de eflujo: 1 = proteína ABCB1, 2 = proteína ABCG2, 3 = proteína asociada a multirresistencia a fármacos (ABCC1), 4 = proteína ABCC2, 5 = proteína ABCC4, 6 = proteína ABCC5. B. Receptores: 1 = receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR), 2 = proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (l RP1), 3 = receptor de insulina (INSR), 4 = receptor de leptina (LEPR), 5 = molécula de adhesión de células basales (LU), 6= antígeno CD71 (TFRC), 7 = receptor de producto final de glicosilación avanzada (AGER). C. Transportadores: 1 = estimulado por la proteína del gen 6 del ácido retinoico (STRA6), 2 = transportador de glucosa de tipo 1 (SLC2A1), 3 = transportador 1 de aminoácidos neutros grandes (SLC7A5), 4 = proteína de la familia 1 transportadora de soluto (SLC1A1), 5 = proteína del miembro 5 de la familia 38 transportadora de solutos (SLC38A5), 6 = proteína 1 de transporte de monocarboxilato (SLC16A1). STRA6 está altamente expresado y LU está sobreexpresado en todas las condiciones.
Figura 8. Direccionamiento de polipéptidos que comprenden VHH a neuronas del modelo Minibrain-BHE Se realizaron ensayos de microscopía de fluorescencia para determinar la capacidad de VHH-E9 o de polipéptidos que comprenden VHH para cruzar la BHE utilizando el dispositivo de la divulgación con 1,5 % de células microgliales, incubando dicho VHH-E9 o polipéptido que comprende VHH durante 3 horas o 24 horas. Se ha demostrado previamente que VHH-E9 cruza la BHE in vivo (Li et al., 2012). Ct = control, es decir, solamente anticuerpo secundario. A. Imágenes de fluorescencia que muestran la presencia de VHH-E9 (que está conjugado con A488) en el compartimento cerebral después de 3 h o 24 h. B. Fluorescencia que muestra la presencia de VHH-E9 (conjugado con A488) o de los polipéptidos que comprenden VHH, VHH1, VHH2, VHH3 (usando un anticuerpo contra la etiqueta de estrep.) en el compartimento cerebral después de 3 h o 24 h de incubación. VHH-E9 y los polipéptidos que comprenden VHH, v HH1, VHH2 y VHH3 cruzan el modelo de BHE in vitro de la divulgación. C. Imágenes de fluorescencia que muestran el direccionamiento de polipéptidos que comprenden VHH (VHH1 o VHH2) a las neuronas del compartimento cerebral después de cruzar la BHE. Imágenes obtenidas como en B, tras 24 h de incubación, y con tinción simultánea de neurofilamento (Nf) de 200 kDa, que es un marcador de neuronas. Imágenes de la izquierda: tinción de VHH (canal verde); imágenes de la derecha: tinción de Nf (canal rojo). Las estrellas blancas indican neuronas teñidas con el polipéptido que comprende VHH (es decir, se detecta tinción en ambos canales), mientras que los puntos blancos indican células con tinción de VHH2 y sin tinción de Nf. No aparecen dichas células en las imágenes de VHH1. D. En el experimento descrito en C, se midió la eficacia del direccionamiento neuronal para VHH1 y VHH2. Eje vertical: porcentaje de células con Nf teñido (células neuronales) entre las células teñidas para el correspondiente polipéptido que comprende VHH. (***) indica un valor de p ≤ 0,0002 en la prueba t de Student. VHH1 se dirige a las neuronas después de cruzar la BHE. Figura 9. Alineación de secuencias del VHH A12 con los VHH del estado de la técnica
La secuencia del resto de VHH de los péptidos que contienen VHH divulgados en el presente documento (VHH A12) se alineó con las secuencias disponibles en las bases de datos públicas para VHH (EMBL: uniprotkb, uniprotkb_swissprot, uniprotkb_swissprotsv, uniprotkb_trembl, epop, jpop, kpop, uspop, nrμl1, nrμl2, uniparc). Todos los VHH con una puntuación de alineación superior a 419 se incluyen en la alineación. Los restos de las regiones CDR están en negrita y con doble subrayado. Como puede observarse, las características ilustrativas del VHH utilizado en la invención incluyen una secuencia GF en las posiciones 5-6 de la CDR2, donde la mayoría de los VHH tienen GG y otros tienen GR; una secuencia DV en las posiciones 2-3 de la CDR1, donde la posición 2 suele ser F (R, V y L se representan todos una vez) y la posición 3 suele ser S, a veces G o R; y se encuentran las características exclusivas similares en CDR3 y en las regiones marco.
Figura 10. Prueba del dispositivo de la divulgación con varias proporciones de células microgliales
A. Imágenes de microscopía que muestran las células del compartimento cerebral el día de la siembra (día 0) y dos días después (día 2), cuando el modelo de BHE descrito en el presente documento se siembra con 1,5 % de células microgliales (izquierda) o 15 % de células microgliales (derecha). En la BHE que se siembra con un 15 % de células microgliales, dichas células parecen constituir el 80 % de las células dos días después de la siembra.
B. Permeabilidad paracelular restrictiva del modelo de BHE sembrada con 1,5 % o 15 % de células microgliales. Permeabilidad, medida por la resistencia eléctrica transendotelial (TEER, por sus siglas en inglés, izquierda) y por el coeficiente de permeabilidad endotelial (Pe , derecha) para el modelo de BHE sembrada con 15 % de células microgliales en varios momentos después de la siembra de células endoteliales (izquierda) y para el modelo que se siembra sin células microgliales o con 1,5 % o 15 % de células microgliales 2 días después de la siembra de células microgliales (derecha). Como se observa, en la BHE divulgada en el presente documento, la presencia de células microgliales incluso en relación alta no tiene ningún efecto perjudicial sobre la permeabilidad de la barrera. Figura 11. "Mini-minibrain"
El dispositivo "mini-minibrain", es decir, el modelo de BHE divulgado en el presente documento se produjo utilizando la línea celular SK-N-SHD como fuente de células neuronales en el compartimento cerebral. A. representación esquemática del dispositivo e imagen de microscopía de fluorescencia del compartimento cerebral, que muestra un marcaje de tubulina B3 potente. B. Coeficiente de permeabilidad (Pe) del mini-minibrain medido en ausencia (control) o presencia de neurocargo-Neurovita, demostrando que la permeabilidad no está alterada por el polipéptido que comprende VHH divulgado en el presente documento. La microscopía de fluorescencia confirmó que en estas condiciones, neurocargo-Neurovita se transporta a través de la BHE y se dirige a las células del compartimento cerebral.
Descripción detallada de la invención
Definiciones generales que se refieren a las características de la invención y divulgación de realizaciones de la misma
Péptido o polipéptido
Un péptido o polipéptido es una macromolécula que consiste en restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Los términos péptido y polipéptido se usan indistintamente en el presente documento, aunque el péptido generalmente designa secuencias más cortas (normalmente menos de 50 o menos de 30 o menos de 20 restos de aminoácidos) mientras que los polipéptidos generalmente designan secuencias más largas (normalmente más de 20, 30 o 50 restos de aminoácidos). El término proteína se usa indistintamente en el presente documento con el término polipéptido. Los restos de aminoácidos se pueden seleccionar entre los 20 aminoácidos naturales y/o entre los aminoácidos no naturales, que son conocidos por el experto en la materia. Los restos de aminoácidos también pueden modificarse, ya sea por modificaciones naturales o por modificaciones que no son naturales. Las modificaciones naturales comprenden fosforilación, especialmente de restos de serina, treonina y/o tirosina, glucosilación, incluyendo sitios de glucosilación ligada a N y glucosilación ligada a O, ubiquitinación, especialmente de restos de lisina, SUMOilación u otra modificación por proteínas similares a ubiquitina, etc.
En realizaciones particulares, los polipéptidos de la invención no se producen de forma natural, es decir, no se encuentran en la naturaleza y/o no son productos de la naturaleza y son significativamente diferentes de los productos de la naturaleza. Dicha diferencia puede surgir de la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido. Como ejemplo, un polipéptido que consiste en o que comprende una fusión de al menos dos polipéptidos que se encuentran en diferentes especies, especialmente especies de diferentes familias (por ejemplo, un camélido y un virus) normalmente tendrán una secuencia que no se encuentra en los polipéptidos naturales. Como otro ejemplo, el polipéptido puede tener al menos una mutación en un resto de aminoácido conservado de su secuencia, es decir, el aminoácido en una posición dada puede ser uno que no se encuentre en esta posición en polipéptidos naturales. La diferencia también puede surgir de la presencia de aminoácidos no naturales. La diferencia también puede surgir de una modificación en al menos un resto de aminoácido que es una modificación que no se produce de forma natural. La diferencia también puede surgir de la adición de restos moleculares que no se encuentran adjuntos a los polipéptidos naturales. La diferencia también puede surgir de la presentación del polipéptido, es decir, el formato macroscópico en el que se produce, presenta o utiliza el polipéptido. En particular, el polipéptido de la invención puede estar en un formato adecuado para una manipulación conveniente, por ejemplo, en un tubo de ensayo u otro recipiente artificial, especialmente cuando ninguna membrana biológica separa el polipéptido de otros componentes en el tubo, es decir, se puede producir contacto molecular directo sin demora entre el polipéptido y otras moléculas y macromoléculas añadidas en el recipiente antes o después del polipéptido.
Proteínas de fusión/polipéptidos de fusión son términos utilizados en el presente documento en su significado habitual de un polipéptido que comprende o consiste en al menos dos péptidos unidos por un enlace peptídico. En la práctica, dicha fusión es un único polipéptido con una secuencia correspondiente a las secuencias concatenadas de los péptidos comprendidos en la fusión. Cuando se describe una proteína/polipéptido de fusión en el presente documento, y excepto cuando se excluya explícitamente o sea técnicamente irrelevante (según lo apreciado por el experto en el contexto específico donde aparece), la fusión puede comprender un péptido espaciador (como se describe en el presente documento) o cualquier número de espaciadores u otros péptidos intercalados entre los péptidos descritos explícitamente. Como suele quedar claro por el contexto, "un polipéptido de fusión que comprende polipéptido A y polipéptido B" designa en el presente documento "un polipéptido de fusión de polipéptido A y polipéptido B y, opcionalmente, otros polipéptidos (incluidos los péptidos espaciadores)" y "un polipéptido de fusión que consiste en polipéptido A y polipéptido B" designa en el presente documento "un polipéptido de fusión del polipéptido A y el polipéptido B y un péptido espaciador opcional". Cuando se establece en el presente documento que "un polipéptido A está fusionado con un polipéptido B", no está implícito, a menos que se indique explícitamente, que ambos polipéptidos estén necesariamente fusionados directamente entre sí o a través de un péptido espaciador, es decir, los péptidos pueden estar separados por cualquier número de péptidos y pueden estar en cualquier orden. Cuando se establece en el presente documento que "un polipéptido A está fusionado en el extremo C con un polipéptido B", no está implícito, a menos que se indique explícitamente, que ambos polipéptidos estén fusionados directamente entre sí o a través de un péptido espaciador, es decir, A y B pueden estar separados por cualquier número de péptidos y restos, siempre que A esté más cerca del extremo carboxiterminal del polipéptido de fusión. De forma similar, "un polipéptido fusionado en el extremo aminoterminal con el polipéptido B" está más cerca del extremo aminoterminal del polipéptido de fusión, pero puede estar separado por cualquier número de péptidos y restos del polipéptido B.
La presente solicitud describe un polipéptido que tiene una secuencia que comprende o consiste en un VHH de un anticuerpo de cadena pesada de camélido con la secuencia de la SEQ Id NO: 3, o una variante o una porción de la misma como se indica a continuación, en donde el VHH es permeable a través de la barrera hematoencefálica y no reconoce ningún antígeno cerebral y/o no se une específicamente, especialmente a través de la interacción anticuerpo/antígeno, a ninguna proteína cerebral.
Como se expondrá con más detalle a continuación, la invención se refiere a polipéptidos que comprenden un VHH como se define en la reivindicación 1, que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3, con péptidos adicionales fusionados con el VHH y que añaden características deseadas, según las características establecidas en las reivindicaciones 1 a 5. Dichos polipéptidos se describen a lo largo del documento como polipéptido que comprende VHH de la invención.
En particular, la descripción de las características con respecto a VHH como se describe en el presente documento también puede aplicarse, en la mayoría de los casos, al polipéptido que comprende VHH, incluyendo a un polipéptido que comprende o consiste en una variante de secuencia o porción del VHH con la SEQ ID NO: 3 como se define en el presente documento, cuya variante o porción también están incluidas en la divulgación. De manera más específica, un polipéptido que comprende VHH de la invención ventajosamente tiene un pI básico y/o es permeable a través de la BHE; y/o no reconoce ningún antígeno cerebral y/o no se une específicamente a ninguna proteína cerebral humana, y/o no se une a través de la interacción anticuerpo/antígeno a ningún antígeno cerebral y/o no se une a ningún antígeno cerebral a través del resto VHH.
VHH
Un VHH es el dominio variable de un anticuerpo únicamente de cadena pesada de un camélido (HcAb) o una molécula derivada de dicho VHH y que tiene sustancialmente las mismas propiedades que el VHH original, en particular con respecto a la capacidad de reconocimiento de antígenos (incluso cuando no tiene capacidad de reconocimiento de antígenos). Todas las especies de la familia Camelidea tienen anticuerpos únicamente de cadena pesada. En una realización preferida, el VHH utilizado en el presente documento se obtiene de una alpaca (Lama pacos).
El VHH utilizado en la invención tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. El VHH divulgado en el presente documento también puede tener una secuencia variante con al menos un 70 % o al menos un 80 % de identidad, preferentemente al menos un 90 % de identidad, más preferentemente al menos un 95 % de identidad e incluso más preferentemente al menos un 99 % de identidad con dicha secuencia. Si el VHH comprende únicamente una parte de la secuencia de la SEQ ID NO: 3, el nivel de identidad se calcula sobre la secuencia de dicha porción. La longitud de dicha porción podrá ser de al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 % e incluso preferentemente al menos un 95 % de la longitud de la SEQ ID NO: 3. En consecuencia, la longitud de dicha porción puede ser de al menos 60 aminoácidos, al menos 80 aminoácidos, preferentemente al menos 100 aminoácidos, más preferentemente al menos 110 aminoácidos e incluso más preferentemente al menos 115 aminoácidos. El VHH utilizado en la invención comprende las tres regiones CDR del VHH con la secuencia de la SEQ ID NO: 3. El VHH comprende una CDR1 con la secuencia IDVINNMA (SEQ ID NO: 47), una CDR2 con la secuencia TITSGFSTNY (SEQ ID NO: 48) y una CDR3 con la secuencia KVHLIRlGa ARAYDY (s Eq ID NO: 49). También se divulga que es posible introducir mutaciones en las CDR, por ejemplo, para desinmunización si se va a administrar el VHH. Por lo tanto, se pueden considerar mutaciones limitadas, que conservan las características del VHH, dentro de la presente divulgación. En consecuencia, las CDR del VHH como se divulga en el presente documento pueden tener sustituciones limitadas en su secuencia de aminoácidos, preferentemente limitadas a dos restos en cada CDR e incluso más preferentemente a un resto. Como se divulga en el presente documento, el VHH puede tener al menos un 70 % de identidad (o más, como se detalla anteriormente) con la SEQ ID NO: 3 y comprende una CDR1 con una secuencia que no tiene más de 2 emparejamientos erróneos, preferentemente no más de un emparejamiento erróneo, con la secuencia de la SEQ ID NO: 47, y preferentemente una CDR1 con la secuencia de la s Eq ID NO: 47; una CDR2 con una secuencia que no tiene más de 2 emparejamientos erróneos, preferentemente no más de un emparejamiento erróneo, con la secuencia de la SEQ ID NO: 48, y preferentemente una CDR2 con la secuencia de la SEQ ID NO: 48; y una CDR3 con una secuencia que no tiene más de 2 emparejamientos erróneos, preferentemente no más de un emparejamiento erróneo, con la secuencia de la SEQ ID NO: 49, y preferentemente una CDR3 con la secuencia de la SEQ ID NO: 49. Un emparejamiento erróneo en el sentido anterior es preferentemente una sustitución de aminoácidos, en particular, para CDR1 y CDR2, pero puede ser una eliminación o inserción de un solo aminoácido. Un emparejamiento erróneo en el sentido anterior es preferentemente una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, una sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que el experto en la materia se daría cuenta de que tiene características similares. Las porciones, tal como se define anteriormente, de dicho un VHH también constituyen aspectos divulgados en el presente documento. En una realización particular, el VHH comprende secuencias marco como se representa en las alineaciones de secuencias de la figura 9 (las secuencias marco corresponden a los aminoácidos no subrayados). El VHH descrito en el presente documento puede comprender las regiones marco del VHH con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, o con al menos un 80 % de identidad y preferentemente al menos un 90 % de identidad con la secuencia de estas regiones marco.
El VHH de la divulgación que es una variante del VHH con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una porción del mismo comparte las características esenciales del último VHH con respecto al reconocimiento de antígenos (y en particular no reconoce ningún antígeno cerebral), unión de proteínas cerebrales (y en particular no se une específicamente a ninguna proteína cerebral humana), permeabilidad a través de o capacidad para cruzar la BHE (y en particular es permeable a través de o es capaz de cruzar la BHE, como se define en el presente documento) y/o el pI (y en particular tiene un pI básico como se define en el presente documento) y las realizaciones relacionadas con el VHH divulgado en el presente documento o los polipéptidos que comprenden VHH se aplican a un VHH que es una variante del VHH con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una porción del mismo. Las pruebas para estas características son fácilmente accesibles para los expertos y, en particular, dichas pruebas se divulgan en el presente documento, en particular, en la sección de ejemplos. Para disipar cualquier duda, aunque puede que no sean fragmentos de VHH stricto sensu de un HcAb de un anticuerpo de camélidos, o se puedan obtener de camélidos, la variante de secuencia y la porción de VHH (incluida una variante de secuencia) se incluyen en el término VHH como se usa en el presente documento, excepto cuando sea irrelevante técnica o lógicamente. En algunas realizaciones, especialmente cuando tiene una secuencia que es una variante de la SEQ ID NO: 3, el VHH no es un VHH natural y preferentemente no es una proteína natural.
Un VHH de la divulgación o un polipéptido que comprende VHH de la invención es permeable a través de la BHE. Una sustancia (por ejemplo, una proteína) y, en particular, un VHH que es permeable a través de la BHE se puede definir como aquella que, cuando se administra fuera de la parte del cerebro que está protegida por la BHE, se puede encontrar en el cerebro en cantidades significativas después de un tiempo razonable. En otros términos, que se utilizan en el presente documento con el mismo significado que "es permeable a través de la BHE", la sustancia "tiene la capacidad de cruzar la BHE", o "puede cruzar la BHE", el término permeabilidad se usa en el presente documento con el significado de "capacidad para cruzar la BHE". Generalmente, cuando se analiza in vivo, la administración se realiza mediante inyección intravenosa, especialmente en la carótida de un animal, especialmente un mamífero no humano, en particular un ratón o roedor.
El análisis de la permeabilidad a través de la BHE in vivo presenta múltiples dificultades. Una sustancia, y en particular un VHH divulgado en el presente documento o un polipéptido que comprende VHH de la invención, que es permeable a través de la BHE, por lo tanto, se puede definir como alternativa por referencia a un modelo de BHE in vitro. En particular, en el caso de modelos de BHE in vitro que comprenden dos compartimentos de cultivo celular separados por una capa confluente de células que imitan la BHE, una sustancia que es permeable a través de la BHE puede definirse como aquella que, cuando se aplica a y/o se incuba en un compartimento durante un tiempo razonable, se encuentra en cantidad significativa en el otro compartimento.
En las definiciones anteriores, cantidades superiores al 0,01 % o al 0,1 %, preferentemente superiores al 0,5 %, 1 % 0 1,5 % e incluso más preferentemente superiores al 2,5 %, 5 % o 10 % de la sustancia inicialmente aplicada y/o administrada, pueden considerarse, por ejemplo, cantidades significativas. Especialmente para una determinación in vivo de si una sustancia es permeable, puede resultar difícil o imposible cuantificar la cantidad de sustancia que ha pasado la BHE. Debido a que, en particular in vivo, la BHE previene de manera muy eficiente la penetración en el cerebro de la mayoría de las moléculas (de tamaño suficiente), el experto apreciará que, con la mayoría de los métodos convencionales de detección celular y/o molecular, la detección de cualquier cantidad de dicha sustancia en el cerebro (o en el compartimento que imita al cerebro) puede considerarse significativa y es un signo de permeabilidad. T ambién se apreciará que las cantidades insignificantes (por ejemplo, cantidades detectables solo por técnicas altamente sensibles como la espectrometría de masas) de la sustancia que han cruzado la BHE, especialmente si se detecta usando un modelo in vitro, por lo general no se considerarán significativas.
Dada la cinética de penetración generalmente observada a través de la BHE de proteínas permeables, el experto en la materia apreciará que una cantidad de tiempo razonable en este contexto es normalmente del orden de magnitud de decenas de minutos a unas pocas horas. Por lo tanto, la cantidad de tiempo entre la administración y el análisis de la presencia de la sustancia en el cerebro (o compartimento que imita el cerebro) puede variar, por ejemplo, de 10 minutos a 12 horas. Los tiempos habituales para el análisis in vivo varían preferentemente de 30 min a 12 horas, preferentemente 30 min, 1 h, 90 min, 2 h, 4 h, 8 h o 12 h. Los tiempos habituales para el análisis in vitro varían preferentemente de 10 min a 4 horas, preferentemente 10 min, 30 min, 45 min, 1 h, 90 min, 2 h, 3 h o 4 h. También se contemplan tiempos más largos, sin embargo, factores tales como la semivida de la sustancia pueden influir en los resultados drásticamente cuando se utilizan tiempos de incubación prolongados, ya que la sustancia puede degradarse antes de que se analice y, por lo tanto, puede pasar desapercibida, aunque cruzara la BHE de manera eficiente.
En realizaciones particulares, cuando se analizan los modelos in vitro descritos en Weksler et al., 2005, documentos US 8.084.254 B2 o WO 2006/056879 y/o con los modelos in vitro descritos en Bicker et al., 2014 o el documento EP 1 964 915 A1 y/o con el nuevo modelo de BHE in vitro descrito en el presente documento, más del 0,1 % del VHH descrito en el presente documento o del polipéptido que comprende VHH de la invención que se incubó inicialmente se encuentra en el compartimento "cerebro" después de 4 horas de incubación. En realizaciones preferidas, más del 0,5 %, preferentemente más del 1 % se encuentra después de 4 horas de incubación. En realizaciones preferidas adicionales, más del 0,5 %, preferentemente más del 1 % se encuentra después de 1 hora de incubación. En otras realizaciones preferidas más, más del 1,5 %, preferentemente más del 2,5 % se encuentra después de 1 hora de incubación. En realizaciones particulares, cuando se analiza usando cualquiera de estos modelos que contienen células cerebrales, en particular células neuronales, en el compartimento "cerebro", el VHH divulgado en el presente documento o el polipéptido que comprende VHH de la invención se detectan fácilmente en experimentos de inmunofluorescencia en dichas células cerebrales, en particular células neuronales, después de 3 horas de incubación de 10 pg del VHH o polipéptido que comprende VHH aplicados en el otro compartimento.
La permeabilidad a través de la BHE de la construcción completa (es decir, el polipéptido completo que comprende VHH de la invención, incluyendo el péptido efector de "carga", si lo hay) suele ser la característica ventajosa en las aplicaciones. Sin embargo, debido a que la permeabilidad de una fracción de toda la construcción, por ejemplo, el VHH o el polipéptido que comprende VHH excluyendo el péptido efector, es relevante para la permeabilidad de la construcción completa, la permeabilidad puede como alternativa, o además, evaluarse (medirse y/o calcularse) para la construcción completa o para una fracción de la misma, especialmente el VHH divulgado en el presente documento y/o el polipéptido que comprende VHH excluyendo el péptido efector.
El polipéptido de la invención, en particular, el polipéptido que comprende VHH de la invención es básico.
Una proteína, particularmente un VHH, se dice que es básica según la presente divulgación cuando su punto isoeléctrico (pI) es superior a 7, o igual o superior a 8. Según la invención, el polipéptido que comprende VHH tiene un pI igual o superior a 8,5 o igual o superior a 9. El pI de una proteína se define como el pH en el que la proteína no tiene carga neta (es decir, las cargas negativas compensan las cargas positivas). Los métodos para determinar el pI de una proteína, ya sea por determinación experimental o por cálculo teórico basado en la secuencia de la proteína, son conocidos por los expertos. En particular, el pI se puede medir experimentalmente usando enfoque isoeléctrico. Como alternativa o además, el pI se puede calcular usando un programa de ordenador como el programa informático EMBOSS iep, disponible en el European Bioinformatics Institute, Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, RU y/o la herramienta Compute PI del programa informático Expasy, disponible en el Swiss Institute of Bioinformatics, Distrito de Sorge - Edificio Genopod, 1015 Lausana, Suiza. Debido a que el pI de la construcción completa (es decir, el polipéptido completo que comprende VHH de la invención, incluido el péptido efector de "carga", si lo hay), así como el pI de una fracción del mismo, por ejemplo, el VHH o el polipéptido que comprende VHH excluyendo el péptido efector, es relevante para la permeabilidad de la construcción completa través de la BHE, el pI puede como alternativa, o además, evaluarse (medirse y/o calcularse) para la construcción completa o para una fracción de la misma, especialmente el VHH y/o el polipéptido que comprende VHH excluyendo el péptido efector.
Según la divulgación, el VHH, posiblemente excluyendo otros péptidos que forman el polipéptido que comprende VHH, tiene un pI igual o superior a 8.
Es probable que un péptido con un pI alto se una a las células de manera no específica, evitando así que se dirija a células específicas. En una realización particular, el VHH divulgado en el presente documento, posiblemente excluyendo otros péptidos que forman el polipéptido que comprende VHH descrito en el presente documento, tiene un pI igual o inferior a 11, más preferentemente igual o inferior a 10,5, e incluso más preferentemente igual o inferior a 10. En realizaciones particulares, el polipéptido que comprende VHH de la invención tiene un pI igual o inferior a 12, más preferentemente igual o inferior a 11, e incluso más preferentemente igual o superior a 10,5. Los intervalos preferidos para el pI del VHH divulgado en el presente documento, posiblemente excluyendo otros péptidos que forman el polipéptido que comprende VHH descrito en el presente documento son 8,5-11, 8,5-10, 9-10 y 9-10,5. Los intervalos preferidos para el pI del polipéptido que comprende VHH de la invención son 8,5-12, 8,5-11, 9-11, 9-10,5, 9,5-10,5 y 10-10,5.
Los presentes inventores proporcionan en el presente documento un VHH obtenido de una alpaca. Este VHH tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y está codificado por un polinucleótido con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. Los presentes inventores demostraron que este VHH no reconoce ningún antígeno cerebral, tiene un pI básico (pI > 9), es permeable a través de la BHE al menos en forma de polipéptidos que comprenden VHH como se detalla en la sección de ejemplos (en particular VHH1, VHH2, VHH3).
El polipéptido de la invención se dirige a las células neuronales. El polipéptido es un polipéptido de fusión en donde el VHH se fusiona con una molécula que se dirige a las células neuronales.
El VHH de la invención se fusiona con un péptido dirigido a células neuronales. Algunos péptidos tienen la capacidad de dirigir un polipéptido de la invención a tipos celulares específicos, es decir, el polipéptido que los comprende se asocia y/o se transporta y/o se une preferentemente a células específicas. En particular, dichos péptidos que se dirigen a las neuronas se conocen en la técnica. Dichos péptidos pueden originarse a partir de una proteína G del virus de la rabia. Dichos péptidos, con la secuencia de la s Eq ID NO: 1 están dentro del alcance de la invención. Las variantes de estas secuencias también están incluidas en la presente divulgación como péptidos dirigidos a células neuronales, siempre que muestren las mismas propiedades de direccionamiento y deriven de las secuencias anteriores mediante una o más mutaciones puntuales que afecten al 10 % o menos de los restos de aminoácidos, por ejemplo, por sustitución conservativa de restos de aminoácidos. Otros péptidos dirigidos a células neuronales adecuados derivados de una proteína G del virus de la rabia incluyen péptidos con una secuencia elegida entre el grupo de la SEQ ID NO: 32, Se Q ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, que se establecen en la reivindicación 1.
El VHH de la divulgación o el polipéptido que comprende VHH de la invención se dirigen a células neuronales, en particular, se dirigen a las células neuronales en el dispositivo como se divulga en el presente documento después de atravesar la capa de células endoteliales. El direccionamiento puede reflejarse por la presencia de dicho polipéptido en la superficie de y/o dentro de las células neuronales, ya sea de forma exclusiva o en mayores cantidades con respecto a otros tipos celulares y/o al polipéptido en solución (no unido a las células). Cabe destacar que, en la técnica, como se analiza a continuación, normalmente se evitaría la introducción de una cisteína en una construcción quimérica que comprende un VHH para conservar la presentación monomérica del VHH, que se considera necesaria para su actividad. Sin embargo, la cisteína en los péptidos dirigidos a células neuronales derivados de una proteína G del virus de la rabia es necesaria para mantener su actividad biológica (Lentz et al., 1987). Por lo tanto, el polipéptido de fusión que comprende VHH descrito en el presente documento comprende un péptido, en particular dicho un péptido dirigido a células neuronales, que comprende un resto de cisteína, en particular, dicho péptido está fusionado en el extremo aminoterminal al resto VHH, y en particular, dicho resto de cisteína se encuentra de 5 a 25, preferentemente de 10 a 20 y lo más preferentemente 16 restos en posición aminoterminal con respecto al primer resto (aminoterminal) de la fracción de VHH. El polipéptido de fusión que comprende VHH de la invención comprende un péptido como se define en la reivindicación 1.
Según una realización particular, el polipéptido de la invención tiene capacidad de dimerización, en particular capacidad de homodimerización y preferentemente en donde la homodimerización es el resultado de uno o más puentes disulfuro, como se define en la reivindicación 2.
El VHH de la divulgación o el polipéptido que comprende VHH de la invención puede tener capacidad de dimerización. Por lo tanto, la divulgación o invención abarca un VHH o un polipéptido que comprende VHH como una construcción dimérica. Un VHH obtenido de Camelidea por sí mismo generalmente no puede formar dímeros, en particular homodímeros, que se cree que es una de sus características y rasgos necesarios para ejercer su función biológica. Por lo tanto, el experto en la materia que diseña un VHH o polipéptidos que comprenden VHH normalmente los diseñaría para conservar su estructura monomérica. Sin embargo, en el caso del polipéptido que comprende VHH actualmente divulgado, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la actividad biológica diterta entre las formas (presentaciones) monoméricas y diméricas y que era preferible esta última.
Los métodos para permitir la formación de dímeros son conocidos por los expertos. En particular, dichos métodos comprenden la adición de dominios de dimerización, especialmente dominios de homodimerización de proteínas diméricas conocidas. Como alternativa (o adicionalmente), la presencia de restos de cisteína en la secuencia del VHH (por ejemplo, por mutación de otro aminoácido en la secuencia) o la presencia de cisteínas en uno o más péptidos unidos a dicho VHH en el polipéptido de la invención puede permitir que el VHH o el polipéptido que comprende VHH de la invención formen dímeros, especialmente homodímeros. El experto en la materia apreciará que dichas cisteínas deben estar comprendidas en una región de la secuencia de manera que sean accesibles para unirse a otro polipéptido cuando el polipéptido está en su conformación plegada. En realizaciones particulares, el VHH de la divulgación o el polipéptido que comprende VHH de la invención se proporcionan como un dímero y, en particular, como un homodímero. En realizaciones particulares, el VHH de la divulgación o el polipéptido que comprende VHH de la invención comprende uno o más restos de cisteína que pueden formar enlaces disulfuro intermoleculares. En realizaciones particulares, la una o más cisteínas que forman dímeros (especialmente forman homodímeros) se encuentran en el extremo aminoterminal del VHH o del polipéptido que comprende VHH, y en particular se encuentran en un péptido aminoterminal para el VHH y en particular en un péptido dirigido a neuronas fusionado en el extremo aminoterminal al VHH, tales como los RDP divulgados en el presente documento.
El polipéptido de la invención es un polipéptido que comprende VHH y, en consecuencia, es un polipéptido de fusión que comprende un VHH definido en la reivindicación 1, fusionado con las moléculas establecidas en la reivindicación 1 y que comprende un polipéptido efector fusionado como se define en la reivindicación 1.
El polipéptido que comprende VHH de la invención comprende un péptido Neurovita. El VHH divulgado en el presente documento o los polipéptidos que comprenden VHH (que comprenden un péptido dirigido a células neuronales y/o una etiqueta como se describe en el presente documento) de la invención se diseñaron para usarse como un vehículo para transportar un péptido Neurovita (también denominado en el presente documento molécula o péptido de carga o efectores) a través de la barrera hematoencefálica (y posiblemente para dirigir el péptido de carga a una célula dada, compartimento celular, ...).
El enlace preferido al polipéptido que comprende VHH de la invención que actúa como vehículo es a través de la generación de un polipéptido de fusión. Por lo tanto, la expresión polipéptido que comprende VHH incluye, excepto cuando esté excluido por el contexto o sea técnicamente irrelevante, y la invención lo abarque, polipéptidos de fusión que comprenden un VHH de la invención y un péptido Neurovita. En algunos aspectos, el péptido de carga tiene menos de 40, menos de 30 y preferentemente menos de 20 aminoácidos. El experto también apreciará que el pI del péptido de carga puede influir en el pI del polipéptido de fusión que comprende el vehículo y la carga. Como se indica en otra parte en el presente documento, el polipéptido que comprende VHH de la invención resultante es preferentemente básico.
Péptidos derivados de la proteína G de un virus de la rabia, que tienen un efecto sobre la supervivencia y/o protección y/o motilidad de las neuronas y/o que promueven el crecimiento de neuritas son moléculas de carga según la presente divulgación. Se han divulgado en el documento WO 2013/068430. Estos péptidos se divulgan como dominios citoplasmáticos de péptidos, consistiendo dichos dominios citoplasmáticos en un dominio citoplasmático cadena arriba del dominio de unión a MAST2 y dominios de unión a MAST-2 en dicha publicación. La expresión "péptidos Neurovita", como se usa en el presente documento, designa dicho un péptido citoplasmático, que comprende o consiste en un dominio de unión a MAST2 y una secuencia cadena arriba del mismo (es decir, aminoterminal, estando fusionado el dominio de unión a MAST2en el extremo C con dicha secuencia cadena arriba). En aspectos particulares, un péptido Neurovita es un péptido de 30 a 55 aminoácidos derivado del dominio citoplasmático de una proteína G de un virus de la rabia, que comprende el dominio de unión a MAST2 de dicha proteína G y que tiene un efecto sobre la supervivencia, protección y/o movilidad de las neuronas y/o que promueve el crecimiento de neuritas. Un ejemplo de dicho un péptido para realizar la invención es el péptido con la secuencia de la SEQ ID NO: 7. Dichos péptidos están preferentemente fusionados en el extremo C con el VHH como se divulga en el presente documento, y preferentemente con cualquier otro péptido que forme parte de un polipéptido que comprende VHH, de modo que el dominio de unión a MAST2 está en el extremo carboxiterminal del polipéptido que comprende VHH. En realizaciones particulares, el polipéptido que comprende VHH de la invención comprende polipéptidos de fusión que comprenden VHH y un péptido Neurovita según la definición de la reivindicación 1, preferentemente fusionado en el extremo carboxiterminal al VHH, más preferentemente en el extremo carboxiterminal del polipéptido de la invención. Los péptidos Neurovita, y en particular el péptido Neurovita preferido con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, tiene un pI básico. En particular, el pI del Neurovita puede ser 12 o más. El experto en la materia apreciaría que un péptido con un pI básico de este tipo es probable que se una a las células de manera no específica y, por lo tanto, no consideraría usar dicho péptido en particular si está destinado a dirigirse a células específicas. Los inventores han descubierto, sin embargo, que cuando se usa en fusión con un VHH que es menos básico, en particular con un pI en el intervalo de 9,5 a 10 y particularmente con un pI = 9,86, sin unión no específica del polipéptido que comprende VHH, se observa que tiene un pI en el intervalo de 10-10,5, y particularmente con pI = 10,36, y el polipéptido se dirige de manera específica. En aspectos particulares, el péptido Neurovita tiene un pI de 12 o más. En aspectos particulares, el polipéptido que comprende VHH, que comprende un péptido Neurovita, tiene un pI de 12 o menos, preferentemente de 11 o menos, más preferentemente de 10,5 o menos, y en particular un pI comprendido en el intervalo de 8,5 a 11, preferentemente en el intervalo de 9 a 10,5 y lo más preferentemente en el intervalo de 10-10,5. En particular, el polipéptido que comprende VHH, que comprende un péptido Neurovita, tiene un pI de 10,36.
Los péptidos Neurovita pueden llevar cualquiera de los dominios de unión a MAST2 divulgados en las páginas 12-22 del documento WO 2013/068430 A1, y cada grupo divulgado en el mismo constituye un grupo del que seleccionar el dominio de unión a MAST2 del péptido Neurovita de realizaciones particulares. De forma similar, el dominio de unión a MAST2 de los péptidos Neurovita en realizaciones particulares de la presente invención puede seleccionarse entre el dominio de unión a MAST2 de los péptidos Neurovita definidos en realizaciones particulares en las págs. 12-22 del documento WO 2013/068430. En realizaciones preferidas, el polipéptido que comprende VHH comprende el péptido Neurovita que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 7. El dominio de unión a MAST2 de los péptidos Neurovita divulgados individualmente en las páginas 15, 16, 18, 20 y 21 del documento WO 2013/068430 están incluidos en una realización preferida. En particular, el dominio de unión a MAST-2 del polipéptido Neurovita utilizado en la invención consiste en una secuencia, cuyo tamaño es de 11 a 13 restos, cuyos dos primeros restos son S y W, y cuyos cuatro últimos restos son Q, T, R y L (estos 4 últimos restos de aminoácidos representan los denominados p DZ-BS).
El dominio de unión a MAST-2 se define según uno de los siguientes grupos, sabiendo que, cualquiera que sea el grupo, los dos primeros restos de aminoácidos del dominio de unión a MAST-2 son S y W y los últimos cuatro restos de aminoácidos del dominio de unión a MAST-2 son Q, T, R y L: (A) en un primer grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, cuyo tamaño es de 11 restos, cuyos dos primeros restos son S y W, y cuyos últimos cuatro restos son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5QTRL, en la que cada uno de X1, X2, X3, X4 y X5 es cualquier resto de aminoácido (SEQ ID NO: 21); (B) en un segundo grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, cuyo tamaño es de 11 restos, cuyos dos primeros restos son S y W, y cuyos últimos cuatro restos son Q, T, R y L, que puede obtenerse por eliminación de dos restos de aminoácidos, consecutivos o no, de la secuencia SWESHKSGGq Tr L (SEQ ID NO: 19) (C) En un tercer grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, cuyo tamaño es de 12 restos, cuyos dos primeros restos son S y W, y cuyos últimos cuatro restos son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5X6QTRL, en la que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5 y X6 es cualquier resto de aminoácido (SEQ ID NO: 22); (D) en un cuarto grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, cuyo tamaño es de 12 restos, cuyos dos primeros restos son S y W, y cuyos últimos cuatro restos son Q, T, R y L, que puede obtenerse mediante la eliminación de un resto de aminoácido de la secuencia SWESHKSGGQTRL (SEQ ID NO: 19) y (E) en un quinto grupo, el dominio de unión a MAST-2 consiste en una secuencia, cuyo tamaño es de 13 restos, cuyos dos primeros restos son S y W, y cuyos últimos cuatro restos son Q, T, R y L, que consiste en SWX1X2X3X4X5X6X7QTRL, en la que cada uno de X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7, es cualquier resto de aminoácido (SEQ ID NO: 23).
La secuencia del dominio de unión cadena arriba del dominio de unión a MAST2 en el péptido Neurovita utilizado en la invención puede ser cualquiera de las secuencias divulgadas en las páginas 22 a 24 del documento WO 2013/068430 para el fin equivalente en dicha solicitud. En particular, dicha una secuencia puede contener de 20 a 40 restos de aminoácidos, preferentemente de 25 a 45 restos, y particularmente 31 restos. En realizaciones particulares, la secuencia del dominio citoplasmático cadena arriba del dominio de unión a MAST-2 es un fragmento del dominio citoplasmático de una proteína G del virus de la rabia, en particular un fragmento del dominio citoplasmático de una proteína G de una cepa atenuada del virus de la rabia o un fragmento del dominio citoplasmático de una proteína G de una cepa virulenta del virus de la rabia; más particularmente, la secuencia del dominio citoplasmático cadena arriba del dominio de unión a MAST-2 consiste en la siguiente secuencia RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS (SEQ ID NO: 17) o una variante de la misma como se describe en la publicación citada anteriormente, en particular RRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS (SEQ ID NO: 18).
Los polipéptidos Neurovita utilizados en la invención, citados en la reivindicación 1, se seleccionan del grupo que consiste en:
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL (Neurovita 1) (SEQ ID NO: 20);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGGQTRL (Neurovita 2) (SEQ ID NO: 24);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL (Neurovita 3) (SEQ ID NO: 7);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVATQQTRL (SEQ ID NO: 25);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVYTGQTRL(SEQ ID NO: 26);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTGQTRL (SEQ ID NO: 27);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTQQTRL (SEQ ID NO: 28);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVAGGQTRL (SEQ ID NO: 29);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWAEAQHTQQTRL (SEQ ID NO: 30); y RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHASGGQTRL (SEQ ID NO: 31).
También se divulga en el presente documento que el péptido Neurovita del polipéptido que comprende VHH de la invención también puede volverse inactivo mediante la eliminación de su secuencia PDZ-BS (los últimos cuatro restos de aminoácidos del dominio de unión a MAST2). Dicho un péptido Neurovita tiene actividad biológica reducida o nula y puede usarse por ejemplo, como referencia para analizar el efecto específico de un péptido Neurovita en un polipéptido que comprende VHH de la invención. Un péptido Neurovita inactivado particular es NV delta-PDZ-BS con la secuencia de RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQ SEQ ID NO: 9).
En una realización particular, como se define en las reivindicaciones 3 y 4, el polipéptido de la invención comprende adicionalmente un péptido marcador y/o comprende adicionalmente un espaciador peptídico, en particular insertado entre el VHH y el polipéptido efector, y/o adicionalmente comprende un péptido de afinidad.
El polipéptido que comprende VHH de la invención puede comprender péptidos adicionales tales como etiquetas o espaciadores. El experto en la materia apreciará que la inclusión en el polipéptido que comprende VHH de péptidos con funciones específicas, además del péptido de direccionamiento y/o el péptido efector descrito en el presente documento, puede ser ventajoso. Estos comprenden, por ejemplo, péptidos espaciadores, péptidos de etiquetado y péptidos de afinidad (y péptidos que tienen las características tanto de péptidos espaciadores como de péptidos de etiquetado). El polipéptido que comprende VHH de la invención puede comprender uno o más de dichos péptidos. Dichos péptidos son bien conocidos por los expertos y en el presente documento solo se proporciona una breve descripción. El experto en la materia apreciará que la elección del péptido y de su posición en la proteína de fusión debe realizarse de modo que las características esenciales del polipéptido de fusión con respecto a la invención no se alteren significativamente. En particular, el pI debe permanecer preferentemente básico, siempre que sea posible, el péptido adicional no debe modificar el intervalo de tamaño del polipéptido resultante, y la adición del péptido no debe dar como resultado la agregación o el secuestro (por ejemplo, mediante la unión a un componente celular específico) del polipéptido que comprende VHH resultante.
Un péptido espaciador consiste en unos pocos aminoácidos que se intercalan entre dos péptidos o polipéptidos definidos en una proteína de fusión, generalmente para permitir que cada péptido/polipéptido se pliegue independientemente del otro, o relativamente independientemente, es decir, para permitir que cada péptido/polipéptido adopte una conformación similar a su conformación cuando no está fusionado con el otro péptido/polipéptido. Un péptido espaciador puede consistir en un solo aminoácido, o un tramo de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o de 6 a 10 aminoácidos o de 11 a 20 aminoácidos.
Un péptido de etiquetado, se suele utilizar para facilitar la purificación y/o detección del polipéptido de fusión. En algunos casos, el péptido de etiquetado es detectable por sí mismo (por ejemplo, etiquetas fluorescentes como GFP), mientras que en otros casos el péptido marcador es detectable porque se une específicamente a una molécula detectable (a su vez, la molécula detectable puede ser directamente detectable, por ejemplo, fluorescente, o puede detectarse mediante la unión específica a ella de una molécula detectable, es decir, puede ser necesario un armazón de moléculas para la detección). Si se utiliza para purificación y/o detección indirecta, dicho péptido normalmente se diseña (o se encuentra) para que tenga una gran afinidad por una molécula fácilmente disponible. Dichos péptidos con frecuencia derivan de una especie no relacionada con la especie en la que se pretende utilizar el polipéptido para evitar cualquier reacción cruzada, especialmente durante la detección. La molécula que se une al péptido de etiquetado puede seleccionarse por su detectabilidad y/o por su facilidad de inmovilización y/o recuperación en los procesos de purificación. Los péptidos de marcado comunes incluyen etiqueta HA (un péptido corto de hemaglutinina de gripe humana), etiqueta Flag, etiqueta His (que comprende al menos 6 restos de histidina) y etiqueta estrep (que comprende ocho aminoácidos y que se une fácilmente a Strep-tactin y anticuerpos disponibles en el mercado). En realizaciones particulares, el polipéptido que comprende VHH de la invención comprende una etiqueta estrep. con la secuencia de la SEQ ID NO: 5, en particular fusionada en el extremo carboxiterminal al VHH, particularmente intercalada entre el VHH y el péptido efector.
En una realización particular, por lo tanto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende VHH que comprende la fusión de una secuencia RDP, tal como la SEQ ID NO: 1, una secuencia v Hh , tal como la SEQ ID NO: 3, una secuencia de etiqueta, tal como la SEQ ID NO: 5 y una secuencia de Neurovita, tal como la SEQ ID NO: 7.
En una realización particular, el polipéptido de la invención tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 11 o de la SEQ ID NO: 45.
Cabe señalar que, mientras que la fusión de un péptido presenta algunas ventajas en particular en términos de facilidad de producción, las funciones de un péptido de etiquetado también pueden obtenerse uniendo un resto no peptídico a un polipéptido y el uso de dicho resto se contempla en el presente documento y la invención abarca polipéptidos unidos a dichos restos. Por lo tanto, el término "etiquetar" comprende el etiquetado de péptidos así como restos no peptídicos con funciones similares. El experto en la materia apreciará que el término "etiqueta" específicamente en el contexto de un polipéptido debe interpretarse como "péptido de etiquetado", mientras que en contextos en los que es técnicamente relevante, debe entenderse que la referencia a un "péptido de etiquetado" comprende una etiqueta no peptídica.
Los métodos para la preparación de VHH divulgados en el presente documento y polipéptidos que comprenden VHH de la invención o de la divulgación se divulgan en el presente documento. Según un aspecto particular, el método para producir un VHH de la divulgación o utilizado en la invención comprende los pasos de:
A - obtener un VHH, en particular con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de secuencia de la misma o una porción de la misma como se define en el presente documento, o un polinucleótido que codifica dicho VHH;
B - diseñar o seleccionar un polipéptido o un subconjunto de polipéptidos que consiste en o que comprende dicho VHH que tienen un pI básico y, opcionalmente, diseñar u obtener un [subconjunto de] uno o más polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos y/o seleccionar un VHH que no reconoce ningún antígeno cerebral o no se une a ninguna proteína cerebral, en particular antígenos y proteínas cerebrales humanos;
C - diseñar o seleccionar un polipéptido o un subconjunto de polipéptidos que consistan o comprendan dicho VHH que sean permeables a través de la BHE y, opcionalmente, diseñar u obtener un [subconjunto de] uno o más polinucleótidos que codifiquen dicho uno o más polipéptidos.
Los pasos B y C se pueden realizar alternativamente en un orden diferente.
A - La obtención de un VHH, con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de secuencia de la misma o una porción de la misma como se define en el presente documento, o un polinucleótido que codifica dicho VHH se puede lograr según métodos conocidos por los expertos. Según un aspecto particular, la obtención de dicho VHH comprende los pasos de:
- obtener los ADNc con la secuencia de la SEQ ID NO: 4, obteniendo opcionalmente fragmentos, en particular, fragmentos de PCR que comprenden porciones de dichos ADNc, especialmente porciones que comprenden las regiones CDR del VHH con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, usando dichos ADNc como plantillas, introduciendo opcionalmente mutaciones en dichos fragmentos, por ejemplo, introduciendo las mutaciones deseadas en los cebadores de PCR;
- clonar dichos fragmentos, en particular fragmentos de PCR en vectores, en particular en plásmidos adecuados para la expresión en bacterias, fusionando opcionalmente dicho fragmento en marco junto con secuencias de ácidos nucleicos que codifican péptidos, por ejemplo, péptidos dirigidos a células neuronales, péptidos efectores y/o péptidos de etiquetado/espaciadores como se describe en el presente documento;
- expresar el polipéptido codificado, especialmente el polipéptido de fusión en determinadas células.
Los pasos de selección posteriores se pueden realizar en cualquier orden. Con el objetivo de minimizar el costo y maximizar la tasa de éxito, el experto apreciará que los pasos de selección de mayor rendimiento generalmente deben realizarse antes de los pasos de menor rendimiento (ya que el subconjunto tenderá a comprender menos clones posibles después de cada paso de selección), y que los pasos de selección con respecto a la característica menos frecuente debe realizarse antes de los pasos de selección para características más comunes (ya que es más probable encontrar una característica común en un clon seleccionado para una característica rara que al contrario). También parecerá que las características más comunes, o características que son más fáciles de seleccionar, que aumentan la probabilidad de encontrar una característica menos común (o una menos fácil de seleccionar) deben seleccionarse primero. En consecuencia, a los expertos en la materia les parecerá que la selección de pI normalmente debería realizarse antes de la selección de la permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica.
B - La selección o el diseño de un polipéptido que consiste en o que comprende dicho VHH que tiene un PI básico se puede realizar calculando el pI a partir de la secuencia de dicho VHH o polipéptido que comprende VHH, o mediante experimentos in vitro tal como el enfoque isoeléctrico. El experto en la materia puede deducir fácilmente métodos para probar el pI de un polipéptido producido en bacterias in vitro. El método preferido, sin embargo, se basa en la secuencia del polipéptido. El pI se puede calcular según algoritmos conocidos por el experto, como el programa informático EMBOSS iep, disponible en el European Bioinformatics Institute, Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, RU y/o la herramienta Compute PI del programa informático Expasy, disponible en el Swiss Institute of Bioinformatics, Distrito de Sorge - Edificio Genopod, 1015 Lausana, Suiza.
Seleccionar un VHH que no reconozca ningún antígeno cerebral, en particular, ningún antígeno cerebral humano, o que no se una específicamente a ninguna proteína cerebral, en particular cualquier proteína cerebral humana, se puede realizar utilizando métodos conocidos por el experto en la materia. Como apreciará el experto en la materia, un antígeno que no reconoce ningún antígeno cerebral humano, o que no se une a ninguna proteína cerebral humana, puede entenderse como aquel que sí reconoce un antígeno o se une a una proteína que se encuentra únicamente, o en su mayoría, en el cerebro, frente a células humanas de otro origen. En particular, un VHH que reconoce un antígeno fuera del cerebro humano puede corresponder a esta definición. También le parecerá al experto que dicha ausencia de reconocimiento y/o unión puede entenderse como la ausencia de reconocimiento y/o unión significativos, es decir, un reconocimiento o unión que el experto consideraría bioquímicamente relevante. En particular, dicho reconocimiento y/o unión significativos pueden ser con respecto a antígenos o proteínas de origen no cerebral, que puede formularse como un reconocimiento/unión específico de/a un antígeno/proteína del cerebro humano. En realizaciones particulares, el VHH de la divulgación no produce una tinción específica en los ensayos de transferencia Western utilizando extracto de cerebro humano completo (Sg tau 4697), extractos de cerebro de ratón (Tg 4510) y/o GFAP, en particular en condiciones que permiten que los VHH específicos de antígenos cerebrales produzcan tinción, en particular, utilizando los procedimientos de transferencia Western divulgados en el presente documento y, en particular, utilizando el VHH fusionado con una etiqueta de estrep. En realizaciones particulares, el VHH de la divulgación no produce una tinción específica en los ensayos de inmunohistoquímica que utilizan tejido cerebral de ratón Tg 4510, en condiciones en las que un anticuerpo específico de antígeno cerebral produce una tinción significativa, en particular en las condiciones divulgadas en el presente documento. En realizaciones particulares, el VHH de la divulgación no produce una tinción específica por transferencia Western o por inmunohistoquímica como anteriormente.
C - Seleccionar o diseñar un polipéptido que consiste en o que comprende dicho VHH que es permeable a través de la BHE generalmente se realizará inicialmente a través de experimentos in vitro. De hecho, ninguna característica de secuencia conocida u otros parámetros directamente accesibles del polipéptido permiten predecir la permeabilidad a través de la BHE, mientras que los análisis directos in vivo probablemente parecerían poco razonables en términos de ética y coste. Los métodos que permiten analizar la permeabilidad del VHH o del polipéptido que comprende VHH comprenden los métodos mencionados anteriormente en la descripción del VHH. En particular, estos métodos comprenden el método novedoso para analizar la permeabilidad a través de la BHE divulgado en la presente solicitud que hace uso del dispositivo novedoso creado por los presentes inventores y divulgado también en el presente documento. Este método de análisis, divulgado con más detalle a continuación, está incluido en la divulgación, tanto por sí mismo como un "método de análisis de la divulgación" y como un paso en aspectos particulares del método de preparación de un polipéptido de la invención o divulgación.
Al seleccionar un VHH o un polipéptido que comprende VHH, el experto encontrará orientación para usar el método en la presente solicitud. En particular, las características técnicas específicas (incluidas las condiciones experimentales) del método que usa el dispositivo descrito en el presente documento se divulgan en la sección de ejemplos a continuación y constituyen aspectos del método para preparar un VHH o un polipéptido que comprende VHH. En el uso de métodos de la técnica anterior, en particular basados en dispositivos del estado de la técnica con una presentación similar al dispositivo descrito en el presente documento, el experto apreciará que es probable que condiciones experimentales similares tengan éxito y haga uso de las enseñanzas del presente documento para realizar el paso de seleccionar un VHH o un polipéptido que comprende VHH que sea permeable a través de la BHE.
La divulgación también describe un polinucleótido que codifica el polipéptido divulgado en el presente documento y sus componentes (VHH, molécula dirigida a péptidos, Neurovita, etiqueta, espaciador), en particular un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o una porción de dicha secuencia. La invención se refiere a un polinucleotídico como se define en la reivindicación 6.
Los métodos de obtención de ácidos nucleicos que codifican el VHH con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 son conocidos por el experto en la materia así como los métodos para obtener ácidos nucleicos que codifican una porción de dicho VHH, un VHH con al menos un 80 %, 90 %, o 95 % de identidad con dicho VHH, proteínas de fusión que comprenden dicho VHH (polipéptidos que comprenden VHH). En aspectos particulares, los ácidos nucleicos que codifican el VHH de la divulgación o el polipéptido que comprende VHH descrito en el presente documento comprenden o consisten en:
- la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o la secuencia de otro ácido nucleico que codifica un VHH descrito en el presente documento;
- opcionalmente, la secuencia de un ácido nucleico que codifica un péptido dirigido a células neuronales, preferentemente la secuencia de la SEQ ID NO: 2;
- opcionalmente la secuencia de un ácido nucleico que codifica un péptido de etiquetado, preferentemente la secuencia de la SEQ ID NO: 6;
- opcionalmente, la secuencia de un ácido nucleico que codifica un péptido Neurovita, preferentemente la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o la secuencia de cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican péptidos Neurovita divulgados en el documento WO2013/068430, particularmente en las páginas 32-35, o la secuencia de un péptido Neurovita inactivo, preferentemente con la secuencia de la SEQ ID NO: 10.
En aspectos particulares, en este contexto de la divulgación, el ácido nucleico que codifica un péptido dirigido a células neuronales, si está presente, está en 5' del ácido nucleico que codifica el VHH, y/o el ácido nucleico que codifica el péptido Neurovita, si está presente, está en 3' del ácido nucleico que codifica el VHH. En aspectos particulares, en este contexto de la divulgación, el ácido nucleico que codifica el VHH o el polipéptido que comprende VHH de la invención tiene una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o la secuencia de la SEQ ID NO: 46. El polinucleótido de la invención es como se define en la reivindicación 6. En realizaciones particulares, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que comprende VHH de la invención excluyen ácidos nucleicos que se encuentran en la naturaleza, en particular excluyen ácidos nucleicos que se encuentran en camélidos, en particular, ácidos nucleicos que consisten en un ácido nucleico que codifica un VHH obtenido u obtenible de un camélido. En realizaciones particulares, la secuencia del ácido nucleico que codifica un VHH o un polipéptido que comprende VHH de la invención comprende, además de la secuencia de un ácido nucleico que codifica un VHH, al menos dos nucleótidos, preferentemente al menos tres nucleótidos y más preferentemente al menos 9, 18, 30, 60 o 120 nucleótidos, que forman una secuencia que no se encuentra en camélidos y/o de otro modo en la naturaleza. En realizaciones particulares, la secuencia del ácido nucleico que codifica un VHH divulgado en el presente documento o un polipéptido que comprende VHH de la invención comprende, en marco e inmediatamente adyacente a la secuencia de un ácido nucleico que codifica un VHH, un codón de parada que forma una secuencia que no se encuentra en camélidos y/o de otro modo en la naturaleza y es significativo y/o funcionalmente diferente de dicho camélido o secuencia natural, ya que en particular codifica una proteína que está truncada con respecto a proteínas naturales. En realizaciones particulares, la secuencia del ácido nucleico que codifica un VHH divulgado en el presente documento o el polipéptido que comprende VHH de la invención comprende en su secuencia codificante un codón que no se encuentra en camélidos.
La invención también se refiere a vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican el polipéptido que comprende VHH de la invención, como se define en la reivindicación 7. Dichos vectores son conocidos por los expertos e incluyen vectores de expresión para la expresión del VHH o del polipéptido que comprende VHH en bacterias (incluyendo E. coli), u otras células o líneas celulares procariotas o levaduras u otras células o líneas celulares eucariotas, especialmente células o líneas celulares de mamíferos y también incluyen vectores de clonación, incluyendo plásmidos y fagémidos, diseñados para facilitar la ingeniería genética (optimizados, por ejemplo, para la clonación y/o mantenimiento de ácido nucleico, especialmente ADNc, bibliotecas, para la generación de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión, ...). Los vectores particularmente preferidos de la invención (o para su uso en el método de producción del polipéptido de la invención) son plásmidos que comprenden una señal peptídica tal como ompA que dirige la proteína expresada al espacio periplásmico y se escinde durante el proceso de translocación, tal como el plásmido pASK-IBA2 disponible de IBA GmbH, Rudolf-Wissell-Str. 28, D-37079 Gottingen, Alemania. Los vectores de la invención también comprenden vectores derivados de virus, incluidos los vectores lentivirales. En realizaciones particulares, los vectores excluyen los vectores fagémidos que codifican un VHH obtenido u obtenible de un camélido.
También se divulgan células y líneas celulares que comprenden un polipéptido que comprende VHH como se define en el presente documento. La invención también se refiere a una célula o línea celular que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o un vector de la invención que comprende dicho ácido nucleico, como se define en la reivindicación 8. Estas células pueden seleccionarse en el grupo de bacterias (incluyendo E. coli) u otras células o líneas celulares procariotas o levaduras u otras células o líneas celulares eucariotas, especialmente células o líneas celulares de mamíferos.
La invención también se refiere a composiciones que comprenden cualquiera de los siguientes compuestos: un polipéptido que comprende VHH de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica dicho un polipéptido, un vector de la invención que comprende dicho un ácido nucleico y/o una célula o línea celular de la invención que comprende dicho un polipéptido, ácido nucleico y/o vector, como se define en la reivindicación 9. Las composiciones que comprenden un gran número de VHH diferentes, o secuencias codificantes de VHH, pueden no tener el efecto técnico de la invención, especialmente cuando una fracción de dichos VHH no tiene la característica de los VHH de la invención. Por lo tanto, en realizaciones particulares, la composición de la invención comprende un número limitado de diferentes polipéptidos que comprenden VHH, en donde un número limitado es preferentemente no más de 10 e incluso más preferentemente no más de 5, 4, 3, 2 o 1. Los compuestos citados están asociados con un vehículo fisiológicamente aceptable adecuado para administración in vivo en la composición.
También se divulgan composiciones farmacéuticas, adecuadas para administración in vivo, en particular para inyección intravenosa o administración oftálmica, que comprende cualquiera de los siguientes compuestos: un polipéptido que comprende VHH como se describe en el presente documento, un ácido nucleico que codifica dicho un polipéptido, un vector que comprende dicho un ácido nucleico y/o una célula o línea celular que comprende dicho un polipéptido, ácido nucleico y/o vector, en donde dicho compuesto está en asociación con adyuvantes y/o disolventes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables. Se pueden preparar composiciones aptas para administración in vivo según métodos conocidos por el experto en la materia. En aspectos particulares, la composición farmacéutica es una solución inyectable o una solución de colirio. En aspectos particulares, la composición farmacéutica de la invención comprende como principio activo un polipéptido que comprende VHH, en donde el VHH tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3, y un péptido Neurovita preferentemente con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, fusionado en el extremo carboxiterminal a dicho VHH. En algunos aspectos, la composición farmacéutica de la invención comprende como principio activo un polipéptido que comprende un VHH que comprende un VHH, un péptido Neurovita y un péptido dirigido a células neuronales, preferentemente con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 32, fusionado en el extremo aminoterminal a dicho VHH.
La invención también se relaciona con un agente que consiste en cualquiera de los siguientes compuestos: un polipéptido que comprende VHH de la invención, un ácido nucleico que codifica dicho un polipéptido, un vector que comprende dicho un ácido nucleico, una célula o línea celular que comprende dicho polipéptido, ácido nucleico y/o vector, o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido, ácido nucleico, vector y/o célula o línea celular, en donde dicho agente es para su uso como un medicamento como se define en la reivindicación 10. El agente de la invención es para su uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas, especialmente enfermedades neurodegenerativas, ictus cerebral, traumatismo, lesión o daño. Puede ser para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección del SNC o del cerebro. Las enfermedades específicas contempladas en la presente invención o divulgación incluyen enfermedades neuronales, en particular neurodegenerativas. Las afecciones específicas contempladas en la presente invención o divulgación incluyen accidente cerebrovascular, daño, glaucoma, traumatismo o lesión, inducidos por factores extrínsecos o intrínsecos (al individuo). El agente puede comprender un polipéptido que comprende VHH que comprende o consiste en un VHH, preferentemente con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y un péptido Neurovita, preferentemente con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, fusionado en el extremo carboxiterminal a dicho VHH y, opcionalmente, a un péptido dirigido a células neuronales, preferentemente con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 32, fusionado en el extremo aminoterminal a dicho VHH, y el agente es para su uso en el tratamiento de enfermedades neuronales, en particular enfermedades neurodegenerativas o accidentes cerebrovasculares, glaucoma, traumatismo, lesión o daño. La invención se refiere a los usos terapéuticos definidos en la reivindicación 10.
Se divulgan enseñanzas adicionales con respecto a la producción de anticuerpos de camélidos, y modificaciones de los mismos, en particular para su uso en aplicaciones terapéuticas, en Harmsen y De Haard, 2007.
El dispositivo divulgado en el presente documento es similar en presentación a los dispositivos divulgados en la técnica anterior, por ejemplo, en Weksler et al., 2005, documentos US 8.084.254/B2 y W o 2006/056879, porque consiste en o comprende un recipiente adecuado para el cultivo celular que comprende una o más capas confluentes, preferentemente monocapas, de células endoteliales, separando dichas monocapas el recipiente de cultivo celular en dos compartimentos. A diferencia de los dispositivos de la técnica anterior, el dispositivo divulgado en el presente documento es un modelo de barrera hematoencefálica in vitro caracterizado porque el dispositivo comprende células de origen humano incluyendo, en uno de los compartimentos, células de la microglía. Las células comprendidas en el dispositivo son preferentemente todas células humanas. Al menos algunas de las células del dispositivo, particularmente las células endoteliales, son preferentemente células inmortalizadas. Preferentemente, las células del dispositivo son todas células humanas inmortalizadas.
Como se usa en el presente documento, "células humanas" designa células de origen humano, es decir, derivadas de células encontradas inicialmente en un ser humano. En aspectos preferidos, las células no se obtienen por muestreo directo de un ser humano. En cambio, las células muestreadas de un ser humano se cultivan en condiciones que permiten la producción de células adecuadas para estudios in vitro, incluso en número suficiente y suficientemente homogéneo para dichos estudios, que comparten la mayoría de las características de las células encontradas en un ser humano y en particular de las cuales el ADN genómico consiste o consiste esencialmente en secuencias encontradas en el ADN genómico humano. Por tanto, "células humanas" puede designar células inmortalizadas obtenidas a partir de células muestreadas directamente en un ser humano, posiblemente después de un proceso de selección. "Células humanas" también puede designar células obtenidas del cultivo y/o diferenciación de células madre, ya sean células madre embrionarias humanas, células madre adultas humanas, incluyendo células pluripotentes y/o indiferenciadas obtenidas por técnicas conocidas por el experto en la materia. En aspectos particulares, la provisión de las células del dispositivo no implica procedimientos in vivo en un ser humano. En aspectos particulares, las células de los dispositivos no se obtienen mediante la destrucción de embriones humanos. Análogamente, "células cerebrales" designa células de origen cerebral, es decir, derivadas de células de muestras de tejido cerebral y que comparten características esenciales con las células que se encuentran en el cerebro.
El recipiente para el cultivo celular puede ser, por ejemplo, un tubo de cultivo celular, vial o matraz o, preferentemente, el pocillo de una placa multipocillo para cultivo celular, especialmente placas de 12 y 24 pocillos. En un aspecto particular, el dispositivo divulgado en el presente documento comprende una placa multipocillo, preferentemente una placa de 12 o 24 pocillos, para cultivo celular, constituyendo cada pocillo un recipiente (que consiste en dos compartimentos separados por una capa de células endoteliales, un compartimento que comprende células microgliales), permitiendo dicho un dispositivo ejecutar experimentos separados simultáneamente. El recipiente se recubre preferentemente con recubrimientos convencionales utilizados en el cultivo de células adherentes, preferentemente poli-D-lisina-laminina.
La monocapa de células puede crecer sobre un sustrato físico que sea permeable a líquidos y macromoléculas, tal como un filtro adecuado para el cultivo celular. El cultivo de células en un filtro de este tipo permite colocar la capa de células de manera que separe el recipiente de cultivo celular en dos compartimentos. Debido a que la capa de células está destinada a imitar la BHE, uno de los compartimentos corresponde al cerebro, mientras que el otro compartimento corresponde al flujo sanguíneo general. El primero se denomina a veces en el presente documento "compartimento cerebral", mientras que este último se denomina "compartimento de inyección". La expresión "compartimento de inyección" se utiliza por simplicidad y no pretende limitar el dispositivo o los usos del mismo a aplicaciones en las que se aplica una sustancia de prueba en dicho compartimento, y en algunas configuraciones puede ser preferible aplicar la sustancia de prueba en el compartimento cerebral.
Las células endoteliales que forman la capa de separación en el dispositivo son preferentemente células humanas, preferentemente células humanas inmortalizadas. En aspectos particulares, las células endoteliales que forman la capa de separación son células endoteliales cerebrales humanas inmortalizadas.
En particular, dichas células pueden obtenerse mediante la inmortalización de células endoteliales microvasculares cerebrales humanas como se describe en Weksler et al., 2005, y/o tienen propiedades similares a la línea celular hCMEC/D3 divulgada en dicha publicación, o las células endoteliales pueden ser de la línea celular hCMEC/D3. Como alternativa, se podrían utilizar otras líneas de células endoteliales de la BHE inmortalizadas humanas tales como hBMEC, TY10 y BB19. La una o más capas de separación son preferentemente monocapas y son confluentes, es decir, no queda espacio entre las células en la una o más (mono)capas. Para preparar una capa confluente de células, por lo general, las células deben sembrarse en menor número que el requerido para la confluencia y dejar crecer, por lo general durante varios días, hasta llegar a la confluencia. La capa de células está posicionada de tal forma que la separación entre los compartimentos es impermeable a la difusión pasiva de macromoléculas y/o de manera que cualquier molécula transportada de un compartimento a otro debe hacerlo a través de la capa de células.
Las células microgliales en el dispositivo divulgado en el presente documento están presentes en el compartimento cerebral. Dichas células son preferentemente células humanas, preferentemente células inmortalizadas humanas. Dichas células pueden consistir en células CHME-5 o células similares obtenidas por inmortalización de microglía fetal humana por el antígeno T de SV40 (como se describe, por ejemplo, en Peudenier et al., 1991). Como alternativa, se pueden usar células primarias (por ejemplo, disponibles comercialmente de ScienCell 6076 Corte Del Cedro, Carlsbad, California - 92011, EE. UU.). Las células del compartimento cerebral pueden no tener contacto con las células endoteliales que forman la capa de separación o pueden cultivarse en contacto con dicha capa. Según un aspecto particular, las células endoteliales y las células microgliales no están en contacto y las células microgliales están colocadas frente a las células endoteliales, en su compartimento.
El compartimento cerebral del dispositivo puede comprender otros tipos celulares además de las células microgliales. Las células adicionales son preferentemente humanas, preferentemente células humanas inmortalizadas o células obtenidas a partir de células humanas inmortalizadas. En particular, otros tipos de células tales como otras células cerebrales en particular neuronas o astrocitos o ambos pueden estar presentes en el compartimento cerebral. Las neuronas y los astrocitos humanos pueden obtenerse mediante la diferenciación de células Ntera-2clD/1 (disponibles de ATCC, con la referencia CRL-1973) como se describe en Paquet-Durand et al., 2003, Sandhu et al., 2003 y en la sección de ejemplos. Como alternativa, pueden usarse células primarias.
Una fuente alternativa de células, células SK-N-SH D, en particular para la producción del dispositivo descrito en el presente documento, se divulga en el presente documento. Estas células, un clon aislado de la línea celular de neuroblastoma SK-N-SH (ATCC HTB-11), adquiere las características de las células neuronales, en particular cuando se cultiva en medio EndoGRO™ (EndoGRO™-LS n.° SCME 001 o EndoGRO™-MV n.° SCME004; Merck-millipore, Francia), mientras que se cultivan y mantienen de forma habitual en un medio de cultivo celular convencional tal como DMEM Glutamax-I-High Glucose-Na Pyr. Por lo tanto, estas células son fáciles de cultivar y mantener y pueden diferenciarse en poco tiempo en células neuronales transfiriéndolas al medio de diferenciación apropiado, tal como EndoGRO™, cuyo medio de diferenciación también puede utilizarse como medio de incubación del modelo. En consecuencia, se divulga en el presente documento la línea celular SK-N-SHD, depositada en la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Instituto Pasteur, París, Francia) el 4 de septiembre de 2015, bajo el número CNCM I-5010. Estas células se proporcionan en particular para su uso como modelos de células neuronales, por ejemplo, para someter a ensayo el efecto de compuestos farmacológicos sobre dichas células. Más particularmente, estas células se proporcionan para su uso en la fabricación de un dispositivo descrito en el presente documento, particularmente para sembrar en el compartimento cerebral. El dispositivo de la presente divulgación puede comprender, en su compartimento cerebral, células SK-N-SH D.
En la técnica, generalmente se evita el uso de células microgliales en el compartimento cerebral de un modelo de BHE, en particular debido a su naturaleza inflamatoria y su capacidad de alteración de la BHE (ver, por ejemplo, Carvalho da Fonseca et al., 2014). Sin embargo, los inventores han demostrado sorprendentemente que un dispositivo como el descrito en el presente documento puede comprender (o estar sembrado con) un 15 % o más e incluso un 24 % o más de células microgliales en el compartimento cerebral, sin ningún deterioro significativo de sus funciones como BHE. En particular, se ha demostrado que los modelos de BHE de la presente divulgación sembrados con 1,5 % a 24 % de células microgliales son funcionales. Un modelo de este tipo con un 80 % o más de células microgliales también es totalmente funcional.
En el cerebro, las células microgliales representan del 1,5 % al 24 % de las células, dependiendo en particular de la región del cerebro (Kettenmann y Ransom, 2012), y se ha demostrado que el dispositivo descrito en el presente documento es funcional con un 1,5 % o un 24 % de células microgliales con respecto al contenido total de células del compartimento cerebral. La cuantificación y mezcla de células se realiza preferentemente al sembrar las células en el compartimento cerebral, ya que en esta etapa se precisa tripsinizar las células para recuperarlas del cultivo celular y sembrarlas. Sin embargo, ya que se espera que se produzca poca división celular o muerte durante el período desde la siembra de células hasta el uso experimental del dispositivo, la relación establecida en el momento de la siembra puede ser una aproximación cercana o una subestimación, de la relación final en el dispositivo.
En un aspecto particular, las células microgliales representan el 1,5 % de las células de dicho compartimento. En un aspecto particular, las células microgliales representan el 24 % de las células de dicho compartimento. En otro aspecto particular, las células microgliales representan el 15 % de las células de dicho compartimento. En aspectos particulares, las células microgliales representan del 1,5 % al 15 %, del 1,5 % al 24 %, o del 5 % al 20 % o del 10 % al 20 % de células en dicho compartimento. En aspectos particulares, las células microgliales representan del 1,5 % al 5 % o del 20 % al 24 % de las células en el compartimento cerebral. El experto en la materia apreciará que la relación de células microgliales en el compartimento cerebral puede variar a medida que las células crecen en dicho compartimento, en particular porque los diferentes tipos de células pueden tener diferentes tasas de crecimiento y/o supervivencia. En aspectos particulares, el dispositivo descrito en el presente documento contiene la relación anterior de células microgliales en el compartimento cerebral en el momento de la adición de células (en otras palabras, el compartimento cerebral del dispositivo descrito en el presente documento está sembrado con células que comprenden células microgliales en la relación divulgada anteriormente con respecto al contenido total de células). En aspectos particulares, la relación de células microgliales es de un 24 % o más, un 50 % o más, 75 % o más en el compartimento cerebral cuando el dispositivo divulgado en el presente documento se usa para un ensayo. La relación se puede medir al comienzo del ensayo y/o la relación se puede evaluar al final del ensayo. Preferentemente, la relación se mantiene en los siguientes intervalos durante todo el ensayo: del 10 % al 100 %, del 15 % al 100 %, del 24 % al 100 %, del 50 % al 100 %, de 70 % al 100 % o del 80 % al 100 %. En un aspecto particular, el dispositivo se siembra con una relación del 15 % de células microgliales en el compartimento cerebral y esta relación es del 80 % o más dos días después de la siembra.
En términos generales, los métodos para cultivar, manipular y mantener las células requeridas para preparar el dispositivo descrito en el presente documento son fácilmente conocidos por los expertos. En concreto, sin embargo, debido a que el cocultivo de células endoteliales, tales como hCMEC/D3, y de células microgliales, tales como el CHME, nunca se logró en el estado de la técnica, los presentes inventores han creado condiciones de cultivo específicas. En aspectos particulares, las células del dispositivo están en (o el recipiente de cultivo celular contiene) un medio de cultivo celular que comprende EBM-2, complementado con suero fetal bovino, hidrocortisona, bFGF, ácido ascórbico, lípidos químicamente definidos, HEPES y opcionalmente penicilina-estreptomicina, preferentemente en cantidades que no difieran significativamente de las divulgadas en la sección de ejemplos, particularmente no difieren en más del 50 %, preferentemente no en más del 25 %, 10 % o más preferentemente del 5 %. En aspectos particulares, el compartimento cerebral o de inyección, o ambos compartimentos del dispositivo contienen medio EndoGRO™-LC o EndoGRO™-MV (Merck-millipore, Francia), o cualquier medio adecuado para la diferenciación de células SK-N-SHD en células neuronales. En aspectos preferidos, ambos compartimentos contienen el mismo medio de cultivo. En las publicaciones citadas en el presente documento y en la sección de ejemplos se pueden encontrar orientaciones adicionales sobre el cultivo celular y las manipulaciones. Las características técnicas específicas y las condiciones experimentales divulgadas en la sección de ejemplos definen aspectos de los métodos para preparar un dispositivo y/o del dispositivo descrito en el presente documento.
En un aspecto particular, las células microgliales (y posiblemente otras células cerebrales) no están en contacto con la monocapa de células endoteliales y/o el filtro sobre el que se siembran dichas células, o no están muy cerca de dichas células o filtro.
En otro aspecto, las células microgliales se colocan debajo de las células endoteliales y/o del filtro o muy cerca de los mismos.
Los métodos de preparación de un dispositivo como se describe en el presente documento. están incluidos en la presente divulgación. Dichos métodos generalmente comprenderán los pasos de:
- Obtener células endoteliales, preferentemente células cerebrales endoteliales humanas inmortalizadas;
- Sembrar dichas células endoteliales en un filtro apto para cultivo celular y después
- Hacer crecer dichas células hasta la confluencia en dicho filtro;
Y los pasos de:
- Obtener células microgliales, preferentemente células microgliales humanas inmortalizadas;
- Opcionalmente, obtener otras células cerebrales, especialmente neuronas y/o astrocitos, especialmente neuronas y astrocitos obtenidos por diferenciación de células cerebrales humanas inmortalizadas, en particular células Ntera-2clD/1 y/o SK-N-SHD;
- Sembrar dichas células microgliales, opcionalmente junto con las otras células cerebrales, en un recipiente adecuado para cultivo celular, y preferentemente llenar dicho recipiente con medio EBM-2 complementado como se ha descrito anteriormente;
Y a continuación los pasos de:
- Proporcionar, en particular transportar el filtro que lleva la una o más capas confluentes de células endoteliales en el recipiente donde se sembraron las células microgliales;
- colocar dicho filtro de manera que separe dicho recipiente en dos compartimentos,
- proporcionar células microgliales y, opcionalmente, otras células, en particular, otras células cerebrales en uno de los compartimentos así obtenidos en el recipiente.
Los usos del dispositivo divulgado en el presente documento están incluidos en la presente descripción. Dichos usos comprenden cualquier método en el que la disponibilidad de un dispositivo in vitro que imita el comportamiento de la BHE humana (un modelo "in vitro de BHE" como se usa en el presente documento) pueda considerarse ventajoso. Dichos usos son conocidos por el experto en la materia y son comunes en el campo del desarrollo de fármacos, especialmente para fármacos o candidatos a fármacos destinados a utilizarse en el tratamiento de enfermedades o afecciones cerebrales y fármacos o sustancias destinados a utilizarse en procedimientos de diagnóstico que implican el cerebro, por ejemplo, en los procedimientos de obtención de imágenes cerebrales. En consecuencia, se divulga el uso de un dispositivo como modelo in vitro de BHE, en particular, para analizar la capacidad de las moléculas que han cruzado la BHE para dirigirse a otras células del parénquima cerebral, como la microglía, neuronas o astrocitos. Los aspectos particulares son los métodos de análisis, especialmente métodos para analizar la permeabilidad de una sustancia de prueba a través de la BHE y métodos para analizar la toxicidad de una sustancia de prueba en la BHE, que comprende aplicar la sustancia de prueba al recipiente de cultivo celular del dispositivo descrito en el presente documento y/o incubar dicha sustancia de prueba en el recipiente del dispositivo y determinar si dicha sustancia de prueba penetra la BHE y/o tiene un efecto tóxico sobre la BHE y/o está dirigido a células específicas del compartimento cerebral.
La sustancia de prueba, como podrá apreciar claramente un experto, puede ser cualquier sustancia, especialmente una destinada para su uso in vivo (especialmente en mamíferos no humanos y/o humanos), especialmente una sustancia que se está creando para su uso como fármaco o como agente de diagnóstico. Las cantidades de la sustancia de prueba que pueden aplicarse al dispositivo dependen del objetivo de los métodos de prueba. En particular, debido a que solamente una fracción de una sustancia permeable generalmente penetrará a través de la BHE en condiciones experimentales comunes, la cantidad aplicada inicialmente debe ser tal que una fracción (preferentemente más del 0,1 %, más preferentemente más del 0,5 %, 1 %, 2,5 % o 5 % e incluso más preferentemente más del 10 %) de dicha cantidad es fácilmente detectable por los métodos disponibles para detectar esta sustancia, en métodos de análisis de la permeabilidad de dicha sustancia a través de la BHE. Por otra parte, una cantidad muy grande de sustancia puede provocar efectos no deseados, incluida la saturación de los mecanismos de transporte celular que permiten que la sustancia penetre en la BHE o los efectos debidos a la unión inespecífica o de baja afinidad de la sustancia a los componentes celulares o extracelulares, sin relevancia biológica o fisiológica cuando se utilizan cantidades razonables de la sustancia, pero significativa en presencia de grandes cantidades.
Por ejemplo, para probar la permeabilidad, las cantidades habituales de proteínas aplicadas en los pocillos de un dispositivo basado en una placa de 12 pocillos serían iguales o superiores a 0,1 pg, preferentemente iguales o superiores a 1 pg, 2 pg o 5 pg, más preferentemente iguales o superiores a 10 pg e inferiores a 10 mg, 1 mg, 100 μg, 10 μg o 1 μg, preferentemente inferiores a 100 ng, 10 ng o 1 ng.
Al analizar la toxicidad, el experto en la materia apreciará que la cantidad de sustancia de prueba aplicada normalmente debería reflejar al menos la mayor cantidad de dicha sustancia a la que se espera que esté expuesta la BHE en el uso previsto de dicha sustancia. Por ejemplo, en el análisis de un fármaco que actúa en el cerebro, la toxicidad en la BHE debe analizarse en cantidades significativamente más altas que la cantidad que se espera que produzca el efecto terapéutico máximo, para que el análisis permita concluir, cuando no reveló toxicidad, que la cantidad terapéuticamente eficaz de sustancia no es tóxica para la BHE. Esto también es cierto cuando una sustancia está destinada a utilizarse con fines experimentales, incluyendo pruebas de su permeabilidad: pruebas de toxicidad de antemano, con cantidades superiores a la cantidad máxima destinada a utilizarse en el ensayo de permeabilidad, permitirá, si la prueba de toxicidad no revela toxicidad, concluir que los resultados del análisis de permeabilidad no están relacionados con un efecto tóxico. Normalmente, la cantidad de sustancia aplicada en la prueba de toxicidad es 10 veces, 5 veces, 2 veces o 1 vez la cantidad máxima de sustancia aplicada o que se pretende aplicar, en pruebas de permeabilidad. En aspectos particulares, un método de prueba comprende los pasos del método para analizar la toxicidad de una sustancia de prueba en la BHE y los pasos del método para analizar la permeabilidad de dicha sustancia de prueba a través de la BHE, en donde al menos la misma cantidad, preferentemente al menos 2 veces o 5 veces y más preferentemente al menos 10 veces la cantidad, de dicha sustancia de prueba se aplica al dispositivo en la prueba de toxicidad, con respecto a la cantidad en la prueba de permeabilidad.
El análisis de la permeabilidad de la sustancia de prueba a través de la BHE (o la capacidad de la sustancia de prueba para cruzar la BHE) comprende el paso de determinar la presencia de dicha sustancia de prueba en el compartimento donde no se aplicó inicialmente (el "compartimento 'trans'"), especialmente el compartimento que comprende las células microgliales o compartimento cerebral. Normalmente se permite un tiempo razonable entre la aplicación de la sustancia de prueba en un compartimento y la determinación de su presencia en el otro compartimento. Los tiempos habituales para el análisis oscilan preferentemente entre 10 min y 4 horas, preferentemente 10 min, 30 min, 45 min, 1 h, 90 min, 2 h, 3 h o 4 h. En un aspecto, los métodos son para analizar la permeabilidad de dicha sustancia de prueba a partir del flujo sanguíneo general al cerebro y, en consecuencia, la sustancia de prueba se aplica inicialmente en el compartimento de inyección (es decir, el compartimento que no comprende células microgliales) y su presencia se detecta en el compartimento cerebral.
Determinar la presencia de la sustancia de prueba puede implicar o no la cuantificación de la cantidad de dicha sustancia en el compartimento 'trans'. Dicha determinación podrá realizarse in situ en el compartimento 'trans', es decir, se permite que el contenido del compartimento 'trans' o una fracción de dicho contenido permanezca en dicho compartimento para los pasos posteriores de detección/cuantificación. Como alternativa, dicha determinación podrá realizarse tras la recuperación de los contenidos de dicho compartimento o de una muestra de dichos contenidos, comprendiendo o consistiendo dicha recuperación en pipetear y/o aspirar y/o recuperar de otro modo el medio líquido en dicho compartimento y/o recuperar células en suspensión en dicho medio y/o recuperar, especialmente por tripsinización, células adherentes de dicho compartimento y transferir dicho medio y/o células en un recipiente separado, tal como un tubo de ensayo, para los pasos posteriores de detección/cuantificación. En aspectos particulares, la determinación de la presencia de dicha sustancia de prueba en el compartimento 'trans' comprende un paso de realizar, sobre el compartimento 'trans' o sobre su contenido o una muestra de dicho contenido, un método que detecta cantidades significativas de dicha sustancia de prueba (pero no detecta cantidades insignificantes), preferentemente un método que detecta cantidades que no son mínimas de dicha sustancia de prueba (pero no detecta cantidades mínimas), y determinar si dicha sustancia de prueba se detecta o no mediante dicho método en el compartimento “trans”. En estos aspectos, el método da lugar a la conclusión de que la sustancia de prueba es permeable a través de la BHE si dicha sustancia de prueba se detecta en el compartimento “trans” y viceversa. Los métodos que permiten la detección de cantidades que no son mínimas (y/o cantidades significativas) y que no permiten la detección de cantidades mínimas (y/o cantidades insignificantes) incluyen, en particular, inmunohistoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia de Western, radioinmunoensayos, PCR en el caso de ácidos nucleicos, etc. El experto apreciará que la mayoría de los métodos de detección de biología molecular convencionales pueden detectar una sustancia de prueba en cantidades que no son mínimas (y/o en cantidades significativas), cuando se adapta a través del conocimiento común en el campo, mientras que las cantidades mínimas (y/o cantidades insignificantes) generalmente no se detectarán. Sin embargo, métodos altamente sensibles tales como la espectrometría de masas o, en el caso de ácidos nucleicos, PCR y métodos relacionados, especialmente PCR anidada y otros métodos conocidos por amplificar con éxito cantidades diminutas de ácidos nucleicos, podrían dar lugar a la detección de cantidades mínimas y el experto apreciará que tales métodos podrían dar lugar a concluir que una sustancia es permeable cuando en realidad no lo es si no se establece un umbral de cantidad más bajo para la detección. Esto también se aplica a algunos ensayos ELISA, radioinmunoensayos, etc. que se han optimizado para la detección de cantidades mínimas de por ejemplo, proteínas.
En aspectos particulares, la determinación de la presencia de dicha sustancia de prueba en el compartimento 'trans' comprende los pasos de realizar, sobre el compartimento 'trans' o su contenido o una muestra de dicho contenido, un método que permite la cuantificación de la cantidad de dicha sustancia de prueba. La cuantificación, preferentemente utilizando el mismo método, se puede realizar, generalmente antes de la aplicación de la sustancia de prueba al dispositivo divulgado en el presente documento, para determinar la cantidad de sustancia de prueba aplicada inicialmente y/o la cuantificación, preferentemente utilizando el mismo método se puede realizar para determinar la cantidad de sustancia de prueba que queda en el compartimento donde se inyectó inicialmente. Cuando la medición precisa de la cantidad se puede obtener a través de varios métodos, no es necesario utilizar el mismo método para cuantificar las diferentes fracciones. Cuando no se disponga de un método adecuado o no sea factible para determinar la medición exacta de las cantidades de la sustancia de prueba en al menos una de las fracciones, se utiliza preferentemente el mismo método en todas las fracciones para estimar las cantidades relativas con la mayor precisión posible.
En dichos aspectos, la cantidad de sustancia que penetra a través de la BHE puede expresarse en términos relativos, ya sea relacionado con la cantidad de sustancia inyectada inicialmente o con la cantidad de sustancia que no ha penetrado. Si se han determinado dos de estas cantidades, la tercera se puede calcular fácilmente, y ambas relaciones también se calculan fácilmente, a menos que la cantidad total de sustancia detectable se modifique durante el tiempo de incubación, por ejemplo, degradación o amplificación. Si sólo se pueden establecer valores estimados, normalmente ese prefiere sobrestimar la cantidad de sustancia inyectada inicialmente y subestimar la cantidad de sustancia permeada, por lo que la relación entre la sustancia permeada y la inyectada inicialmente se puede expresar como "al menos un x %". Dichos protocolos dan lugar a la conclusión de que la sustancia de prueba es permeable a través de la BHE si al menos un 0,1 %, 0,2 % o 0,5 % de la cantidad inyectada inicialmente de dicha sustancia penetró a través de la capa de separación en un período de tiempo razonable, preferentemente si al menos penetró un 1 %, 2 % o 3 % de dicha sustancia, más preferentemente si al menos penetró un 5 %, 10 % o 20 % de dicha sustancia. Los métodos que permiten la cuantificación de una sustancia de prueba son conocidos por el experto en la materia y comprenden transferencia Western, radioinmunoensayos, ELISA cuantitativa, qPCR o PCR semicuantitativa en el caso de ácidos nucleicos, clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), etc.
La determinación de la presencia de la sustancia de prueba en el compartimento “trans” puede, especialmente cuando dicha sustancia se aplica en el compartimento de inyección, comprender adicionalmente el paso de determinar en qué sitio de dicho compartimento se encuentra la sustancia. Sitio se usa en el presente documento en un sentido amplio con el significado de cualquier ubicación o tipo de ubicación o entorno específicos o entidad funcional que se puede describir, posiblemente incluyendo el estado fisicoquímico de la sustancia, por ejemplo, "adsorbido en la superficie (o el revestimiento molecular) del recipiente de cultivo celular", "en solución en el medio", "unido a la superficie celular [de un tipo celular dado]", "en un compartimento celular dado, por ejemplo, lisosomas", "en complejos que contienen una proteína dada", etc. En aspectos particulares, el método comprende un paso adicional para determinar si dicha sustancia de prueba está asociada con un tipo celular dado, especialmente se internaliza y/o se une a la superficie celular de, dicho tipo celular, especialmente de un tipo celular del compartimento cerebral. En aspectos particulares, el método comprende los pasos de determinar por inmunohistoquímica si una sustancia está dirigida a un tipo celular dado, es decir, está asociado con dicho tipo celular y no, o significativamente menos, con otras células en el compartimento. Los métodos que permiten determinar el sitio en el que se encuentra una sustancia de prueba son conocidos por los expertos e incluyen métodos basados en microscopía (en particular, inmunohistoquímica, microscopía de fluorescencia, microscopía confocal, microscopía electrónica, etc.), métodos para determinar la asociación con un compartimento celular específico que implican la alteración celular, como el fraccionamiento celular y/o la centrifugación en gradiente para la separación de dichos compartimentos, métodos para determinar la presencia de una proteína en un complejo multiproteico como la inmunoprecipitación, etc. Analizar la toxicidad de la sustancia de prueba en la BHE comprende el paso de determinar si la sustancia de prueba tiene un efecto tóxico sobre las células endoteliales que constituyen la capa de separación del dispositivo. En otro aspecto, analizar la toxicidad de la sustancia de prueba en la BHE comprende el paso de determinar si la sustancia de prueba tiene un efecto tóxico en las otras células cerebrales presentes en el recipiente. Dicha sustancia se aplica al compartimento de inyección y/o al compartimento cerebral y la determinación del efecto tóxico se realiza normalmente después de la incubación de la sustancia de prueba durante un período de tiempo determinado. Los tiempos habituales de incubación en dichos métodos oscilan preferentemente entre 2 h y 7 días, más preferentemente de 6 horas a 4 días. Los tiempos de incubación son preferentemente iguales o superiores a 1 h, más preferentemente iguales o superiores a 2 h o 4 h y más preferentemente iguales o superiores a 6 o 12 h. Los tiempos de incubación son preferentemente iguales o inferiores a 7 días, más preferentemente iguales o inferiores a 6 días o 5 días e incluso más preferentemente iguales o inferiores a 4 días, 3 días o 2 días. Puede detectarse un efecto tóxico cuando las células presentan una viabilidad reducida en comparación con las células que no se incubaron o se incubaron en condiciones experimentales comparables pero sin la aplicación de la sustancia de prueba (o con la aplicación de una sustancia de control que no tiene efectos tóxicos sobre la BHE). La viabilidad celular se puede determinar utilizando métodos conocidos por los expertos. Otros métodos para detectar un efecto tóxico también son conocidos por el experto en la materia, incluyendo detectar y/o cuantificar marcadores de muerte celular o apoptosis tales como proteínas y/o genes expresados en células en muerte celular o apoptosis y no en células viables (o expresados en mayor cantidad que en células viables).
Aunque se dan detalles de un método para analizar la existencia de un efecto tóxico de una sustancia de prueba en las células endoteliales o en otras células cerebrales del dispositivo, se aplican métodos similares para analizar otros efectos biológicos de una sustancia de prueba en dichas células y/o en otras células del dispositivo, en particular las células del compartimento cerebral.
Ejemplos
Ejemplo 1: Secuencias de VHH y de polipéptidos que comprenden VHH.
El VHH con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, llamado VHH A12, se seleccionó de una biblioteca inmunitaria de VHH. Las bibliotecas inmunitarias de VHH se han creado previamente como se describió en 1997 por Ghahroudi et al. Se ha inmunizado una alpaca con un extracto de hipocampo de cerebro humano, aislado de un paciente con enfermedad de Alzheimer. Este extracto contiene diferentes proteínas. El ARNm extraído de los linfocitos B circulantes se retrotranscribió. Para seleccionar ADNc que codifican solo para VHH y no para anticuerpos convencionales, se han amplificado gracias a cebadores complementarios a las regiones FR1 y CH2. Las secuencias de VHH se clonaron en el fagémido pHEN1 en fusión con la proteína de cubierta del fago III (pIII), y el fagémido se usó para transformar bacterias E. coli TG1. La expresión de VHH recombinante se indujo con IPTG. Después de cribar con la tecnología de presentación en fagos, se seleccionaron, cultivaron y analizaron colonias individuales. Cuando los presentes inventores han seleccionado el VHH específico, los presentes inventores realizaron un paso de digestión por NcoI y NotI durante 3 horas a 37 °C en el cultivo de bacterias. Los productos de la digestión se cargaron en un gel de agarosa y se realizó una electroforesis a 180 V durante 45 min para separar el inserto del vector plásmido pHEN1. Se recuperó la fracción de 400 pb correspondiente a las secuencias de v Hh y se realizó una unión con otro plásmido pASK-Iba2, previamente digerido con NcoI y NotI, a 16 °C durante la noche. Para la unión, la relación plásmido/inserto fue 1/5. Las bacterias XL2 ultracompetentes (tecnologías Agilent) se trataron primero agregando betamercaptoetanol y se incubaron 10 min a 4 °C, girando suavemente cada 2 min. Se añadió 1 μl de ADN (30 ng) y se incubó 30 min a 4 °C. Se realizó un pulso de calor a 42 °C durante 30 segundos y luego las bacterias se incubaron en hielo durante 2 minutos. Se añadieron 500 μl de 2YT y los cultivos se incubaron durante 1 hora a 37 °C con agitación. Se esparcieron doscientos cultivos en placas de Petri y se incubaron durante la noche a 37 °C. La misma manipulación se realizó para controlar la buena transformación de las bacterias. Se incubó un precultivo durante la noche a 30 °C en 2YT A. Se usó un ml de precultivo para sembrar 100 ml de 2YTA A. Cuando la DO550 es igual a 0,5, se añaden 10 μl de anhidrotetraciclina (concentración final: 200 ng/ml) y se agita durante la noche a 20 °C. Los VHH se expresaron en el periplasma bacteriano y contenían una etiqueta de estrep. en la región carboxiterminal. Gracias a la etiqueta, se purificaron del extracto de bacterias con una columna de cromatografía de afinidad, Strep-Tactine Sepharose (Iba), según las recomendaciones del fabricante. Para controlar la pureza de la muestra, se podría realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida. Las proteínas se revelaron por coloración con azul brillante de Coomassie durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Posteriormente se completó la decoloración mediante baños de agua sucesivos.
Las selecciones se realizaron con una biblioteca inmunitaria de presentación en fagos (Inti), contra un extracto de cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer (Sg tau 4697). Entre 61 clones aislados con el cribado Sg tau 4697, se expresaron 2 clones VHH-A12 y VHH-E8 en E. Coli (figura 1) y se caracterizaron adicionalmente.
La secuencia NV3-Cyto (NV) (SEQ ID NO: 7) se divulga en el documento WO2013068430 como Neurovita 3. Teniendo en cuenta que NV3 tiene que mantener su extremo carboxilo libre (que contiene el PDZ-BD), la secuencia NV3-Cyto se ha insertado en la porción -COOH de la molécula neurocargo-Neurovita. Dicha secuencia de Neurovita puede estar codificada en particular por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000024_0001
Como alternativa, en el polipéptido que comprende VHH VHH3, se fusiona un péptido Neurovita inactivado por eliminación de PDZ-BS en el extremo carboxiterminal de dicho polipéptido que comprende VHH. Dicho Neurovita inactivado tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9 y puede estar codificado por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000024_0002
Se ha aislado un VHH A12 que no reconoce ninguna proteína cerebral humana a partir de una presentación en fago de alpaca inmunizado. Está bien expresado y tiene un pI básico (9,78). Este VHH tiene la secuencia de:
Figure imgf000024_0003
y puede estar codificado en particular por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000024_0004
Con el fin de aumentar la especificidad de la molécula de nanocuerpo solo hacia las células neuronales, se utilizaron las secuencias RDP (es decir, el péptido derivado de la rabia) derivadas de la proteína G de la secuencia CVS-NIV (patente europea 09290257.6 (2009), documentos PCTIB2010000967 (2010), US 13/263050 y US2012100116). Se pueden usar dos secuencias particulares, ya sea RDP1 YTIWMPENPr Lg MSCDIFTNSRGKrAs KG (SEQ ID nO: 1), particularmente codificadas por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000024_0005
o RDP2 KSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGGG (SEQ ID NO: 32). Los dos péptidos se han diseñado para contener epítopos implicados en el reconocimiento de dos moléculas neuronales diferentes utilizadas por RABV como receptores (Lafon M., 2005). En un primer conjunto de moléculas neurocargo-Neurovita, únicamente se ha adaptado RDP1. Otros péptidos dirigidos a células neuronales que se pueden usar incluyen los péptidos con la secuencia de: KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPH (SEQ ID NO: 33)
o con la secuencia de YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG (SEQ ID NO: 34).
Los polipéptidos que comprenden VHH comprenden una secuencia de etiqueta de estrep. GGGSAWSHPQFEKAAA (SEQ ID No : 5) para marcar la molécula, que puede estar codificada en particular por el ácido nucleico con la secuencia de:
GGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCA (SEQ ID NO: 6). También contiene un péptido con la secuencia MA (péptido MA), incluyendo el iniciador metionina (particularmente codificada por el ácido nucleico con la secuencia de: At GGCC).
Los péptidos anteriores se han fusionado en el siguiente orden (desde el extremo amino al extremo carboxilo): péptido MA, RDP1, VHH A12, etiqueta de estrep., NV. El polipéptido resultante, denominado en el presente documento VHH1, tiene la secuencia de:
Figure imgf000025_0001
Dicho polipéptido puede estar codificado en particular por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000025_0002
que incluye dos codones de parada en el extremo 3'.
Como control, se han generado las moléculas correspondientes que carecen del dominio de unión a PDZ de NV3-Cyto (PDZ-BD) (o secuencia de unión a PDZ, PDZ-BS), denominadas en el presente documento VHH3, o que carecen de la secuencia RDP1, denominadas en el presente documento VHH2. Estos polipéptidos corresponden a los siguientes péptidos fusionados y tienen las siguientes secuencias: VHH2: péptido MA, VHH A12, etiqueta de estrep., NV;
Figure imgf000025_0003
que pueden estar codificados en particular por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000026_0001
que incluye dos codones de parada en el extremo 3';
VHH3: péptido MA, RDP1, VHH A12, etiqueta de estrep., NV con PDZ-BD eliminado:
Figure imgf000026_0002
que pueden estar codificados en particular por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000026_0003
p También se puede utilizar el polipéptido que consiste en la fusión de los siguientes péptidos en el siguiente orden: péptido MA, RDP1, VHH A12, NV; teniendo dicho polipéptido la secuencia de: MAYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMA WYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRL GAARAYDYWGQGTQVTVSRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL (SEQ !D N0: 45) y estando codificado particularmente por el ácido nucleico con la secuencia de:
Figure imgf000026_0004
(SEQ ID NO: 46), que incluye dos codones de parada en el extremo 3'.
Todas las construcciones se han generado por los procedimientos convencionales utilizados en ingeniería genética (como se describe brevemente en Préhaud C. et al, 2010).
Sorprendentemente, las secuencias del VHH A12 divulgadas en el presente documento muestran cierta divergencia con las secuencias de los VHH del estado de la técnica, incluso en restos donde estos últimos muestran una conservación relativamente fuerte.
Ejemplo 2: Clonación y expresión de moléculas neurocargo-Neurovita
Las secuencias del gen neurocargo-Neurovita (VHH1: SEQ ID NO: 12, VHH2: SEQ ID NO: 14, VHH3: SEQ ID NO: 16) se sintetizaron químicamente por la compañía Eurofin MWG Operon y se insertaron en el plásmido pASK-IBA2 (IBA, BioTAGnology, EE. UU.) bajo el control del promotor de tetraciclina. En este plásmido, la secuencia señal de ompA dirige la proteína expresada hacia el espacio periplásmico y se escinde durante el proceso de translocación. En el espacio periplásmico, se pueden encontrar proteínas formadoras de enlaces disulfuro que se pliegan correctamente. Los plásmidos recombinantes se usaron para transformar bacterias E. coli XL1-blue (Stratagene, EE. UU.). Las bacterias recombinantes se identificaron por PCR y se prepararon reservas de glicerol. Los polipéptidos que comprenden VHH se expresaron y purificaron a partir del periplasma bacteriano como describe P. Lafaye (2008). Como alternativa, las proteínas también se pueden extraer directamente del citoplasma. El extracto periplásmico se purificó adicionalmente mediante cromatografía de inmunoafinidad usando un mAb de ratón contra etiqueta de estrep. de alta afinidad tal como C23.21 (P. Lafaye, colección biológica del Institut Pasteur). La expresión de polipéptidos que comprenden VHH se controló mediante transferencia Western utilizando mAb C23.21.
Adicionalmente, para mostrar su presentación dimérica, el Neurocargo-Neurovita purificado se resolvió en gel NuPage™ (Life Technologies, Francia) con tampón de ejecución NuPage MES, ya sea como muestras desnaturalizadas (NuPage™ LDS+DTT+ebullición) o muestras naturales (NuPage™ LDS) según las instrucciones del fabricante. Las especies de moléculas neurocargo-Neurovita se identificaron mediante transferencia Western con el mAb contra etiqueta de estrep. C23.21 (figura 1C).
Ejemplo 3: Caracterización de VHH A12 neutro
Se demostró que VHH A12 tiene las siguientes características: un pI básico (es decir, pI>8,5; en particular 9,86 para el VHH solo y 10,36 para el polipéptido VHH1); sin reactividad contra un extracto de cerebro humano (es decir, Sg tau4697) y un extracto de cerebro de ratón (es decir, Tg 4510) y GFAP (es decir, proteína astrocítica fibrilar glial) mediante transferencia Western; y ninguna inmunorreactividad en tejido cerebral de ratón Tg 4510 por inmunohistoquímica.
La especificidad de un VHH (A12) en comparación con un VHH de control que reconoce proteínas cerebrales (H8/E9, idéntico a VHH E9, Perruchini et al.) se determinó mediante transferencia Western en 3 antígenos diferentes: un extracto de cerebro humano (Sg tau 4697), un extracto de cerebro de ratón (Tg 4510) y en una proteína purificada, GFAP, un marcador específico de astrocitos. Como se muestra en la figura 2, no se detectaron bandas por VHH A12. Asimismo, la inmunohistoquímica de VHH se realizó a partir de tejidos de ratón Tg4510 (Grueninger et al, 2010) que albergaban NFT. Como control, un anticuerpo monoclonal anti-NFT específico, AT8, mostró una excelente sensibilidad y selectividad para la inmunodetección de NFT en secciones de parafina de ratón Tg 4510. Por el contrario, no se observó marcaje con VHH A12 (figura 1).
Para transferencia Western, primero se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida a 200 V durante 45 min. Luego, se transfirieron las proteínas del gel a la membrana de nitrocelulosa durante 1 hora a 30 V. Se saturó la membrana de nitrocelulosa con leche en PBS al 2 % durante 1 hora con agitación. A continuación, la membrana se incubó durante 1 h con VHH seleccionado diluido a 1 μg/ml en leche en PBS al 2 % y se lavó 3 veces durante 5 min con PBS Tween. Un mAb de ratón secundario C23-21 que reconoce etiqueta de estrep. (DI 2012-32 High-affinity monoclonal anti-Strep-Tag antibody C23.21;Girard-blanc C., Krey T., Vasiliauskaite ieva, Nato F., Lafaye P., Dartevelle S., Rey F.) se añadió a 1:2500 y se incubó 1 hora a 37 °C. Luego, después de lavados adicionales, se añadió un anticuerpo contra mAb de ratón marcado con peroxidasa durante 1 h. Se realizaron tres lavados de 5 min en PBS Tween. A continuación se reveló con películas fotosensibles (Thermo Scientific, Pierce® ECL Western Blotting Substrate) según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 4: Crecimiento de neuritas
Los ensayos de crecimiento de neuritas se han descrito ampliamente en Préhaud et al., 2010. Las células Neuroscreen (células NS) son un subclón pC12. Las células se cultivan en medio RPMI como se describe en las instrucciones del fabricante (http://www.cellomics.com/content/menu/Neuroscreen-1_Cells/). Las células NS se controlaron durante 72 h y se trataron con 200 ng/ml de NGF en un tiempo = 0 (un solo resultado) y neurocargo-Neurovita (10 pg, en un tiempo = 6, un solo resultado). El crecimiento de neuritas (NO, por sus siglas en inglés) se realizó básicamente como se describe para SH-SY5Y con la excepción de que el NO se controló 72 horas después de la infección y las células NS siempre se cultivaron en su medio de alimentación (Cellomics, EE. UU.).
Las células NS se visualizan usando un Cellinsight™ (Cellomics, EE. UU.) en pocillos por cuadruplicado. La longitud media de neuritas por neurona se determina utilizando la bioaplicación de perfiles neuronales (Cellomics, EE. UU.).
Ejemplo 5: Ensayo de raspado (regeneración de axones)
Para ensayos inducidos por raspado, se sembraron 200 mm2 de células NT2-N (n=8) en un recipiente de plástico de 12 pocillos de células+ recubiertas de poli-D-lisina-laminina (Sarstedt, Alemania), y se cultivaron durante dos días para recuperarse completamente después de la tripsinización. Se cambió el medio 4 h antes del raspado y se añadieron 10 pg de neurocargo-Neurovita por pocillo. Se hicieron heridas individuales con una aguja de inyección (26GX1/2", 12-4,5). Se realizaron al menos 10 raspados en cada pocillo individual. Como alternativa, se añadió el neurocargo-Neurovita una hora antes del raspado. Las células se fijaron con PFA (4 %) 6 días después de la herida y se tiñeron con una solución de cristal violeta. Se obtuvieron imágenes de las células con un microscopio Leica DM 5000B equipado con una cámara DC 300FX (objetivo x20) y se analizaron con el programa informático ImageJ 1.38X (Wayne Rasband, NIH, EE.UU., http://rsb.info.nih.gov/ij/) y su complemento NeuronJ. El porcentaje medio de neuronas en regeneración se determina a partir de 8 experimentos.
Ejemplo 6: Ensayo de unión y competencia de AchR controlado por citometría de flujo, entrada de neurocargo-Neurovita en células NS
Los procedimientos de citometría de flujo, que se ha seguido, se han descrito en Préhaud et al., 2003. Brevemente, Alfa 7 AchR que expresa células HEK 293 (Yamauchi et al., 2011) y las células HEK 293 precursoras se cultivan en DMEM con alto contenido de glucosa (Life Technologies, Francia) más FBS al 10 %. Se sembraron células HEK 293 o células HEK 293 que expresan AchR en placas de 6 pocillos (1,e+06 células por pocillo). 24 horas después de la siembra, las células se colocaron en hielo y se trataron con 20 pg de neurocargo-Neurovita durante 30 min antes de procesarlas para citometría de flujo utilizando tampón de tinción. Como alternativa para el ensayo de competencia, las células se trataron con 2,e+07 UFP inactivadas con UV de la cepa CVS del virus de la rabia (como se describe en Mégret et al., 2005) o alfa bungarotoxina 16 μM (Sigma, EE. UU.). Para controlar la entrada de las moléculas neurocargo-Neurovita, se realizaron los mismos experimentos pero se utilizó tampón de permeabilización que permitió la detección tanto de las moléculas unidas a los receptores como de las moléculas en el citoplasma. Las moléculas neurocargo-Neurovita unidas a los receptores de la membrana citoplasmática se detectaron con el mAb contra la etiqueta de estrep. descrito anteriormente más un anticuerpo contra el anticuerpo de ratón conjugado con Cy5 (Laboratorio Jackson, EE. UU.).
Ejemplo 7: Determinación de la motilidad del cono de crecimiento de células neuronales (NS)
Las células NS se diferenciaron con 200 ng/ml de NGF en un tiempo = 0 (un solo resultado) y neurocargo-Neurovita (10 pg, en un tiempo = 6, un solo resultado). Como control, las células se trataron con un extracto periplásmico bacteriano de bacterias que no expresan neurocargo-Neurovita. En 48 h, las células se fijaron con PFA, se permeabilizaron con 0,3 % de tritón X100 y se procesaron para inmunofluorescencia como ya se ha descrito (Préhaud et al., 2010). Los núcleos se detectaron con Hoescth 33342, pIII tubulina con un anticuerpo de ratón antibeta 3 tubulina (G7121, Promega, Francia) y un anticuerpo antirratón Alexa 488 (Laboratorio Jackson, EE. UU.), y una red de actina F con faloidina conjugada con Alexa 546 (A22283, Life Technologies, Francia).
Ejemplo 8: Análisis PCR en tiempo real de la expresión génica celular
El procedimiento de análisis de la expresión génica por RT-PCR se ha descrito ampliamente en Préhaud et al., 2005. En el presente documento, debido al material de plástico de cultivo celular utilizado para los ensayos, las moléculas de ADNc se prepararon con un intervalo de ARN de 200 ng a 1 μg. Los cebadores utilizados en este estudio son: TH (HSTH1SG, Qiagen, Alemania), GFAP (F: CT GCTT CTT AACCCCAGT AAGCCA (SEQ ID NO: 39), R:CAGCAGTGCCCTGAAGATTAGCAG (SEQ ID NO: 40)), AQP4 (F:GGTATAGTCAATTCTTATTTGAAT (SEQ ID NO: 35), R:CTTGAATCTCAATAGGTGCCCTTA (SEQ ID NO: 36)), PYGB (F:TCCTGCTGTGTCCTGAGGTGCATT (SEQ ID NO: 43), R: GCCCAGATCC AGCAT GCAAGGT GC (SEQ ID NO: 44)), NEFH (F:CCCCAGGCGATGGACAATTATGAT (SEQ ID NO: 41), R: CACTTGGTTTTATTGCACAGAAGC (SEQ ID NO: 42)), CD200R (F: TTAACACTTCATGGCCTGTAAGA (SEQ ID NO: 37), R: TGTGCCATTGCTCCAGTATTCTTG (SEQ ID NO: 38)), y de Quiagen, Alemania (HSSLC2A1-1, HSSLC7A5, HSSLC1A1-1, HSSLC38A5-1, HSSLC16A1, HSSLCO1C1, HSSLCABCB1-1, HSABCG2-1, HSABCC1-1, HSABCC2-1, HSABCC4-1, HSABCC5-1, HSLDLR-1, HSLRP1-1, HSINSR -1, HSLEPR-1, HSPVLAP-1, HSLU-1, HSTFRC-1, HSAGER1, HSSTRA6-1).
Ejemplo 9: producción de un modelo in vitro de la BHE humana
La inmortalización de la línea de células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (hCMEC/D3) se realizó por Weksler et al., 2005. hCMEC/D3 se cultivaron en EBM-2 (Lonza, Suiza) complementado con suero fetal bovino (5 %, Eurobio, Francia), hidrocortisona (1,4 uM, Sigma, EE.UU.), bFGF (1 ng/ml, Sigma, EE.UU.), Ácido ascórbico (5 ug/ml, Sigma, EE.UU.), lípidos químicamente definidos (1/100, Life technologies, Francia), HEPES (10 mM, Life technologies, Francia), penicilina-estreptomicina (Life technologies, Francia). Las células se cultivaron habitualmente en colágeno I de cola de rata (150 ug/ml, R&D systems, Reino Unido) - recubrieron matraces de cultivo (Corning, EE. UU.) y se dividieron (a través de tripsinización) dos veces por semana. Se obtuvo una monocapa diferenciada sobre colágeno I-de cola de rata (150 ug/ml, R&D systems, Reino Unido) y fibronectina-(10 ug/ml, Sigma, EE. UU.) transwells de poliéster revestidos (12 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,4 μm Corning, EE. UU.). Las células se sembraron a una densidad de 25.000 células/cm2 y se cultivaron durante 5 días. El medio de cultivo se cambió al día 3 de diferenciación. El día 5, la barrera hematoencefálica endotelial in vitro se cultivó con las células minibrain que se sembraron en el compartimento inferior del dispositivo (es decir, minibrain-BHE) o, como alternativa, se dejaron solo en medio (BHE). El modelo minibrain-BHE por lo tanto comprende, además de las células endoteliales, neuronas, astrocitos y células microgliales, mientras que el modelo BHE comprende solo las células endoteliales.
Se cultivaron células microgliales CHME en DMEM-F12 (Life Technologies, Francia) más FBS al 10 % (Janabi et al., 1995), se diferenciaron y aislaron hNT2N/A (neuronas-astrocitos) de las células de teratocarcinoma humano NTera/cl2D1, tal como lo describe Préhaud et al., 2005, Lafon et al., 2005 y Mégret et al., 2007. Se mantuvieron hNT2N/A en DMEM F12 (Life Technologies, Francia) más FBS al 5 %. Las células CHME y hNT2N/A se aislaron mediante tripsinización ligera y se mezclaron en varias relaciones, que oscilan de 0,015 a 0,24, para igualar las relaciones de microglía frente a neurona-astrocitos de las diferentes áreas del cerebro Kettenmann y Ransom, 2012. Estas células de cocultivo, denominadas en conjunto células minibrain, se sembraron en recipientes de plástico CellBind recubiertos con poli-D-lisina-laminina (Corning, EE. UU.), en medio completo EBM-2 (descrito anteriormente). Después de 24 horas, se añadió la transwell que contenía la monocapa de células endoteliales y el sistema estuvo listo para su uso 24 horas más tarde.
Ejemplo 10: Cruce minibrain-BHE de nanocuerpo y cruce y direccionamiento de neurocargo-Neurovita
Se sembró un dispositivo Minibrain-BHE que contenía un 1,5 % de células de microglía. Un día después de la siembra, un anti-GFAP v Hh conjugado con Alexa 488 (VHHE9, Li et al., 2012) se aplicó a la cámara superior (10 pg de nanocuerpo). 3 y 24 horas después, las células de la cámara inferior se fijaron con PFA, se permeabilizaron con tritón X100 al 0,3 %. Las fotografías se tomaron al azar (> 500) utilizando Cellinsight™ (Cellomics, EE.UU.). Se controlaron los focos fluorescentes.
Como alternativa, para las moléculas neurocargo-Neurovita, los focos fluorescentes se controlaron después de la tinción con el anticuerpo contra etiqueta de estrep. descrito anteriormente y un anticuerpo antirratón conjugado con Alexa 488 (Life Technologies, Francia).
Para determinar el número de neuronas a las que se dirigen las moléculas neurocargo-Neurovita, las células también se tiñeron con un anticuerpo contra el neurofilamento de 200 KDa (Sigma, EE. UU.) y un anticuerpo contra anticuerpo de conejo conjugado con Alexa 546 (Life Technologies, Francia).
Ejemplo 11. Determinación de la permeabilidad paracelular restrictiva con amarillo Lucifer
La permeabilidad paracelular restrictiva de las células hCMEC/D3 se evaluó por su baja permeabilidad al marcador fluorescente no permeable amarillo lucifer (LY, por sus siglas en inglés) (Sigma Aldrich, L0259). Brevemente, después de 6 días de cultivo en filtros, las monocapas de hCMEC/D3 se transfirieron a placas de 12 pocillos que contenían 1,5 ml de medio de transporte (HBSS CaMg (Gibco, 14025-100) complementado con 10 mM de hepes (Life technologies, 15630-080) y 1 mM de piruvato de sodio (Life technologies, 11360)) por pocillo (compartimento aluminal). A continuación, se añadieron al compartimento luminal 0,5 ml de medio de transporte que contenía 50 μM de LY. Las incubaciones se realizaron a 37 °C, CO2 al 5 %, humedad al 95 %. Después de 15, 25 y 45 minutos, los insertos se transfirieron a nuevos pocillos, llenados previamente con 1,5 ml de medio de transporte. Después de 45 minutos, se tomaron alícuotas para cada punto de tiempo, de ambos compartimentos y la concentración de LY se determinó usando un espectrofotómetro de fluorescencia (Tecan Infinite F500).
El coeficiente de permeabilidad endotelial (Pe) de LY se calculó en centímetros/minuto (cm/min), como lo describe Siflinger-Birnboim et al. (1987). Para obtener un parámetro de transporte independiente de la concentración, se utiliza el principio de eliminación. Brevemente, el volumen medio eliminado se representa frente al tiempo y la pendiente se estima mediante regresión lineal. Se consideraron tanto la permeabilidad del inserto (PSf , para inserto solo recubierto con colágeno) como la del inserto más permeabilidad de células endoteliales (PSt , para inserto con colágeno y células), según la siguiente fórmula: 1/PSe=1/PSt - 1/PSf .
A continuación, se dividió el valor de permeabilidad de la monocapa endotelial por el área superficial de la membrana porosa del inserto (Corning, 3460) para obtener el coeficiente de permeabilidad endotelial (Pe) de la molécula (en cm.min-1).
Determinación de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER, por sus siglas en inglés)
La TEER de HCMEC/D3 se determinó a los 5, 6 y 7 días de cultivo en medio Endogro-MV (SCME004, Merck Millipore, Francia) como ya se ha descrito por Weksler et al (2005).
Ejemplo 12. La línea celular SK-N-SH D
La línea celular SK-N-SH D es un subclon de la línea celular de neuroblastoma humano ATCC HTB-11 SK-N-SH. Se ha aislado en un medio de diferenciación como un subclon que puede diferenciarse de forma natural al 100 % como células similares a neuronas que son beta 3-tubulina y actina-F positivas. La línea celular se ha depositado en el CNCM (Institut Patseur, París, Francia) el 4 de septiembre de 2015, con el número de referencia I-5010.
Las células SK-N-SH D se cultivan habitualmente en DMEM Glutamax-I-con alto contenido en glucosa (4,5 g/l)-Na Pyr, (Life Technologies, n.° 31966-021) más suero de ternera fetal al 10 %. Las células se diferencian espontáneamente cuando se transfieren en medios Endogro-LS (n.° SCME 001) o Endogro-MV (n.° SCME004) (Merck-millipore, Francia).
Los modelos de BHE producidos usando estas células en el compartimento cerebral, y por lo demás similares a los modelos descritos anteriormente y producidos de manera similar, se han analizado con éxito para determinar su idoneidad en los usos divulgados en el presente documento.
En particular, un modelo de BHE que comprende, HCMEC-D3 y, en el compartimento cerebral, células SK-N-SH D, se produjo y analizó siguiendo procedimientos similares a los anteriores. Un polipéptido que comprende VHH de la invención que comprende Neurovita, cuando se incuba en este modelo, no alteró la permeabilidad medida por Pe . El polipéptido que comprende VHH, que comprende el péptido dirigido a células neuronales, se demostró mediante microscopía de fluorescencia que cruzaba la capa de células endoteliales y que se dirigía a las células cerebrales en el compartimento cerebral. También podrían crearse con éxito otros modelos, que comprenden HCMEC D3 y, en el compartimento cerebral, células SK-N-SH D (neuronas), células U 373MG MG (ECACC n.° 08061901) (astrocitos, es decir, células macrogliales) y CHME (células microgliales).
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende un VHH de un anticuerpo de cadena pesada de camélido fusionado en marco con péptidos adicionales, en donde dicho polipéptido comprende:
- una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 32 a la SEQ ID NO: 34 en el extremo NH2-terminal de dicho polipéptido;
- un VHH que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3;
- una secuencia fusionada en marco seleccionada entre la lista de: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, preferentemente la secuencia de la SEQ ID NO: 7;
y en donde dicho polipéptido es permeable a través de la barrera hematoencefálica y tiene un punto isoeléctrico igual o superior a 8,5, preferentemente igual o superior a 9.
2. El polipéptido de la reivindicación 1 que tiene capacidad de dimerización, en particular capacidad de homodimerización y preferentemente en donde la homodimerización se logra mediante uno o más puentes disulfuro.
3. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además una etiqueta peptídica o no peptídica.
4. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se inserta un espaciador peptídico entre el VHH y la secuencia fusionada en marco.
5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, la secuencia de VHH de la SEQ ID NO: 3, la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y opcionalmente una secuencia de etiqueta, tal como la SEQ ID NO: 5, y que preferentemente tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 45.
6. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en particular un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2, la secuencia de la SEQ ID NO: 4, la secuencia de la SEQ ID NO: 8, y opcionalmente la secuencia de la SEQ ID NO: 6, en particular un polinucleótido que consiste en la secuencia elegida entre el grupo de la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 46.
7. Un vector que contiene el polinucleótido de la reivindicación 6.
8. Una célula o línea celular, en particular una célula bacteriana, que contiene el vector de la reivindicación 7 o el polinucleótido de la reivindicación 6.
9. Una composición que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un polinucleótido de la reivindicación 6, un vector de la reivindicación 7, una célula o línea celular de la reivindicación 8 en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable adecuado para su administración in vivo.
10. Un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un polinucleótido de la reivindicación 6, un vector de la reivindicación 7, una célula o línea celular de la reivindicación 8 o una composición de la reivindicación 9, para su uso como un medicamento en el tratamiento de enfermedades neurológicas, especialmente enfermedades neurodegenerativas, ictus cerebral, traumatismo, lesión o daño.
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