IT202000021877A1

IT202000021877A1 - Sistema biologico privo di cellule che è compatibile con e/o opera in condizioni fisiologiche

Info

Publication number: IT202000021877A1
Application number: IT102020000021877A
Authority: IT
Inventors: Omer Duhan Toparlak; Sheref Samir Mansy; Lorena Cebolla Sanahuja
Original assignee: Univ Degli Studi Di Trento
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2020-12-16

Description

Descrizione dell?Invenzione Industriale avente per titolo:

?Sistema biologico privo di cellule che ? compatibile con e/o opera in condizioni fisiologiche?

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un sistema biologico privo di cellule, una cellula artificiale, compatibile e/o operante in condizioni fisiologiche.

Gli attuali sistemi di rilascio di farmaci non rilevano l'ambiente locale trovato all'interno dell'ospite e non sintetizzano e rilasciano molecole terapeutiche nel sito necessario, portando infine alla rottura involontaria del vettore di rilascio e al rilascio incontrollabile delle molecole del farmaco. Le tecnologie all'avanguardia inondano i pazienti con farmaci a tempi non ottimali in un modo non coordinato alla fluttuazione della fisiologia del paziente, portando a una bassa efficienza di consegna e ad alta probabilit? di effetti collaterali.

Come mezzi di ricerca e strumenti industriali, sono stati studiati per decenni macchinari di trascrizione/traslazione senza cellule e sistemi di modelli liposomiali. Tuttavia, solo negli ultimi due decenni, gli scienziati hanno sviluppato vescicole (alias liposomi) che contenevano sistemi di trascrizione/traslazione senza cellule (alias cellule artificiali) per studiare l'espressione genica. Tuttavia, questi tentativi di costruire cellule artificiali si concentrano sulla ricostituzione di attivit? di tipo biologico in condizioni di laboratorio in assenza di altre cellule viventi. Al contrario, alcuni laboratori hanno iniziato a assemblare ecosistemi pi? complessi costituiti da cellule artificiali distinte o cellule artificiali mescolate con cellule viventi naturali. Questi sistemi percepiscono i batteri viventi e in risposta sintetizzano e rilasciano un messaggio chimico che viene rilevato dallo stesso e da altri batteri (Ding, Contreras-Llano, Morris, Mao, & Tan, 2018; Lentini et al., 2017). Inoltre, sono state costruite cellule artificiali in grado di rilevare sostanze chimiche che non sono state secrete da un organismo (Adamala, Martin-Alarcon, Guthrie-Honea, & Boyden, 2017; Dwidar et al., 2019; Lentini et al., 2014).

? risaputo che le cellule artificiali che si integrano nella pi? ampia comunit? cellulare possono fornire opportunit? per progettare sistemi avanzati di somministrazione di farmaci.

Tuttavia, non sono noti esempi precedenti di sistemi biologici sintetici privi di cellule che comunicano chimicamente con cellule eucariotiche in condizioni fisiologiche. La dimostrazione di tali processi potrebbe portare al rilascio coordinato e cooperativo di molecole farmacologiche sintetizzate, soddisfacendo le esigenze di distinte posizioni fisiologiche nell'ospite e mirando a un'ampia variet? di disturbi.

L?invenzione ? definita nelle rivendicazioni. Forme di realizzazione preferite dell?invenzione sono definite nelle rivendicazioni dipendenti.

L?invenzione sar? meglio descritta con riferimento alle Figure allegate, in cui:

Fig. 1. Riepilogo semplificato dell'invenzione. Quadro teorico per cellule artificiali come agenti di rilascio di farmaci. Qui, i compartimenti che incapsulano la trascrizione / traslazione senza cellule rilevano un agente esterno in condizioni fisiologiche. In risposta, il carico delle cellule artificiali viene rilasciato in modo controllabile. Le cellule artificiali sono compatibili con la possibilit? di essere sradicate dal sistema ospite mediante proteasi mirate.

Fig. 2. Quadro esemplificativo per la comunicazione tra cellule staminali artificiali e neurali. (A) Un esempio di una rete di comunicazione tra cellule artificiali ed eucariotiche (mammiferi). Qui la cellula di mammifero ? una cellula staminale neurale. (B) Esempio dettagliato dell'interazione tra cellule artificiali e cellule di mammifero. I componenti di trasduzione del segnale sono stati presentati come una versione semplificata del percorso cellulare. PFO ? un polipeptide formante pori, LuxR ? un componente del trigger di formazione dei pori, BDNF ? un polipeptide effettore. Dopo il rilascio di BDNF, sono attesi i cambiamenti fenotipici nelle cellule eucariotiche come la differenziazione in neuroni. La via di segnalazione e le componenti di trasduzione del segnale sono evidenziate Sono state caratterizzate proteine / sistemi associati alle vie di segnalazione eucariotiche, riportate sono state BDNF, TrkB, PLCgamma1, ERK1/2MAPK e CREB. Gli schemi non sono disegnati in scala e non rappresentano l'invenzione rivendicata, ma servono piuttosto come strumento di visualizzazione per un sistema modello di prova del concetto per l'invenzione.

Fig. 3. Scelta e ottimizzazione della reazione senza cellule per condizioni fisiologiche. (A) Citotossicit? di diversi sistemi di trascrizione/traslazione senza cellule. A sinistra: il test, che ? un test di collasso ex vivo altamente sensibile, ha utilizzato neuroni coltivati non dissociati sotto forma di organocoltura per far crescere gli assoni de novo. La salute della punta principale dell'assone, cio? il cono di crescita, ? stata utilizzata come indicatore di tossicit?. I coni di crescita malsani hanno la tendenza a collassare se esposti a composti tossici (determinato come collasso> 40%). A destra: l'estratto di E. coli S12 era il meno tossico per gli assoni, poich? l'applicazione del bagno ha prodotto livelli fisiologici di coni di crescita collassati. HeLa: reazione di trascrizione/traslazione del lisato delle cellule HeLa, RRL: reazione di trascrizione/traslazione del lisato di reticolociti di coniglio, S12: reazione di E. coli S12, assemblato da un estratto di E. coli S12 fatto in casa, sistema PURE: NEB PURExpress. (B) Rappresentazione in fumetto del costrutto genetico utilizzato per l'ottimizzazione delle reazioni con l'estratto di E. coli S12. I dettagli della sequenza si trovano nella sezione "Sperimentale". sfGFP indica la supercartella GFP. Tutte le reazioni sono state a 30 ? C per 12 ore. (C) Ottimizzazione dell'osmolalit? (a circa 300 mOsm/kg H2O) della reazione di E. coli S12 valutando i livelli di espressione del punto finale di sfGFP dal costrutto genetico nel pannello (B). La differenza di pressione osmotica tra l'interno e l'esterno delle cellule artificiali porterebbe alla rottura delle vescicole; pertanto, l'osmolalit? dei contenuti interni, cio? la reazione di E. coli S12, ? stata ridotta a livelli fisiologici. Le reazioni sono state assemblate come riportato nella sezione sperimentale "trascrizione/traslazione in vitro". Le soluzioni concentrate di miscela di amminoacidi equimolari e soluzioni per la rigenerazione energetica sono riportate nella Tabella 1, insieme alle quantit? ottimizzate. La soluzione madre di saccarosio era 500 mM e questa soluzione ? stata titolata. Le quantit? ottimali di ciascun ciclo sono indicate da un quadrato e sono state utilizzate per il ciclo di ottimizzazione successivo. Le condizioni finali sono indicate con un rettangolo. (D) Osmolalit? della reazione ottimizzata di E. coli S12 rispetto ad altre soluzioni utilizzate in questo studio. Per il pannello A, le barre di errore rappresentano ? SD della media per esperimenti indipendenti (repliche biologiche) per n = 8 per PBS en = 2 per il resto delle condizioni. Il test statistico era un normale ANOVA unidirezionale seguito dal test multiplo di Dunnett, dove * ? p <0,001. Per il pannello (C), le barre di errore rappresentano ? SD della media di esperimenti indipendenti con n = 3. ;;Fig. 4. Dettagli sull'ottimizzazione della reazione di E. coli S12 per condizioni fisiologiche. Le reazioni di trascrizione/traslazione in vitro erano a 30 ? C per 12 ore. I grafici a barre mostrano i punti temporali finali. Gli esperimenti di fluorescenza hanno monitorato l'emissione derivante dall'espressione della superfolder GFP dal costrutto (A). L'effetto dei diversi punti di forza del promotore trascrizionale. Tutte le sequenze N-terminali erano identiche ad eccezione della regione del promotore. (B) Effetto di soluzioni supplementari sulla sintesi di sfGFP, Mg2 ? glutammato/K ?glutammato indicato come Mg2 /K . (C) Effetto di potenziali contaminanti della reazione S12 ottimizzata. PBS, DMEM, alanina (300 mM in acqua priva di nucleasi) sono stati aggiunti come 10% (v/v) del volume di reazione. Nessun effetto negativo ? stato rilevato rispetto al controllo positivo, che conteneva acqua deionizzata priva di nucleasi. (D) Sinistra: effetto del maltosio sul punto finale (10 h). A destra: effetto del maltosio sulla trascrizione/traslazione precoce. (E) Effetto dell'agente di affollamento macromolecolare PEG 8000 sulla trascrizione/traslazione. Valori superiori al 2% (p/v) di PEG 8000 hanno dato una resa maggiore; tuttavia, a causa della maggiore osmolalit? della reazione di E. coli S12, abbiamo scelto il 2% (p/v) per ulteriori esperimenti. (F) Rappresentazioni dei cartoni animati di ogni costrutto. m.BDNF indica BDNF maturo, pr.MW ? un promotore trascrizionale ibrido (BBa_J23106 e BBa_J23117) e pdt ? un tag di degradazione della proteina del fiore del mesoplasma (Cameron & Collins, 2014). (G) A sinistra: analisi Western blot dell'espressione di BDNF, LuxR e PFO per l'ottimizzazione della concentrazione di plasmidi. L'immunoblotting era contro il tag FLAG N-terminale. Forti promotori trascrizionali sono stati selezionati per BDNF. Il promotore debole ibrido di LuxR ha consentito la sintesi di PFO mediante trascrizione/traslazione in vitro per induzione con 10 ?M 3OC6 HSL. Per garantire che le risorse limitate della cellula artificiale fossero principalmente dirette alla sintesi di BDNF, sono stati selezionati promotori trascrizionali forti e deboli per l'espressione di BDNF e LuxR, rispettivamente. A destra: le concentrazioni plasmidiche ottimali (verde) per la produzione di proteine erano 20 nM per il plasmide BDNF e 10 nM per il plasmide LuxR ? PFO. L'induzione dell'espressione del PFO ? avvenuta dopo 45 min di incubazione a 30 ?C. ;;Fig. 5. Esempio di processo di ottimizzazione della reazione privo di cellule per condizioni fisiologiche. In sequenza, la quantit? di componenti di reazione privi di cellule utilizzati ? stata modificata in ogni fase. In modo iterativo, le condizioni di osmolalit? pi? produttive e pi? basse sono state considerate (e riportate qui) per il ciclo successivo. Alla fine di 8 cicli di screening delle condizioni di reazione, sono stati raggiunti livelli soddisfacenti di produzione di proteine reporter, mantenendo l'osmolalit? della reazione complessiva vicino a 300 mOsm/kg H2O. ;;Fig. 6. Attivit? dell'estratto S12 in diverse condizioni. (A) Stabilit? dell'estratto senza cellule a 30 ?C. (B) stabilit? dell'estratto senza cellule a 37 ?C. La differenza di segnale di 1,5 volte, rispetto alla reazione senza DNA, ? stata rilevata dopo 24 ore di incubazione prima dell'aggiunta del DNA stampo codificante sfGFP. Questo valore corrisponde alla produzione in lotti di ca. 16 ?g/mL sfGFP (vedere la Fig. 9 per i calcoli) (C) Confronto in vitro (modalit? batch) con la produzione di sfGFP in emulsione acqua in olio. Per la modalit? batch, le reazioni sono state prima eseguite in provette PCR da 0,2 mL, e successivamente incapsulate all'interno delle emulsioni, per raggiungere lo stesso ambiente. Le letture provenivano dal lettore di piastre Tecan M200 dopo 16 ore di incubazione a 30 ?C. (D) Esempi rappresentativi di emulsioni generate e analizzate. Tomaia: immagini al microscopio dell'intensit? di sfGFP all'interno delle emulsioni. Inferiore: esempio di profilo linea-trama per un'intensit? del segnale di emulsione rappresentativa. Per tutti gli esperimenti, il DNA stampo era di 20 nM codificante sfGFP. Per (A) e (B), il DNA stampo ? stato aggiunto alla miscela di reazione in punti temporali indicati, dopo l'incubazione senza DNA alle temperature indicate. Tutte le barre della scala sono 20 ?m. ;;Fig. 7. Caratterizzazione di BDNF sintetizzato senza cellule con cellule umane e murine. (A ? C) con cellule HEK293T ingegnerizzate, (D) con assoni Xenopus laevis RGC, (E ? G) con cellule staminali neurali. (A) Espressione rappresentativa di GFP in cellule HEK293T geneticamente modificate trattate con BDNF espresso senza cellule. Le barre della scala indicano 100 ?m. (B) Analisi statistica delle cellule HEK293T positive a GFP rappresentate nel pannello a. I dati mostrano la media. Le barre di errore rappresentano ? SEM per n = 3 esperimenti indipendenti, repliche biologiche. Il test statistico era il test t di uno studente (spaiato, a due code). (C) Analisi Western blot dell'attivazione della via TrkB nella linea cellulare HEK293T ? CMV ? TrkB. ? stata rilevata la fosforilata-ERK1/2MAPK (cinasi extracellulare regolata da segnale/2-proteina chinasi attivata dal mitogeno) e la Lamina A/C ? stata utilizzata come controlli di caricamento SDS-PAGE per la normalizzazione. L'analisi dell'intensit? della banda (densitometria) ha rivelato un ca. Aumento del 25% dell'intensit? del segnale. Western blotting ? stato eseguito per n = 2 esperimenti indipendenti (replica biologica). (D) Effetto del BDNF commerciale sugli assoni RGC di Xenopus laevis. I dati devono essere considerati rispetto alla Fig. 8. Analisi della velocit? media di allungamento degli assoni come risposta a PBS e BDNF commerciale (100 ng/mL). n = 3 esperimenti indipendenti, repliche biologiche. Sono stati contati almeno 47 coni di crescita per condizione. Il test statistico era un Mann-Whitney (MW) a due code, p = 0,0039. I dati non erano normalmente distribuiti secondo il test di Shapiro ? Wilk (SW); quindi, ? stato applicato il test MW. I dati mostrano la mediana con intervallo interquartile. (E) Immagini di microscopia immunocoloranti rappresentative della differenziazione delle cellule mNS in neuroni a 13 giorni in vitro. Tutte le barre della scala indicano 50 ?m. (F) Analisi statistica della popolazione cellulare complessiva per il cambiamento di ?III-tubulina (immagini rappresentate nel pannello E). Le colture trattate con BDNF commerciale (Com. BDNF) e PBS sono state considerate rispettivamente al 100% e 0%. (G) Analisi statistica della popolazione cellulare complessiva per il cambiamento nella caspasi-3 tagliata (immagini rappresentate nel pannello E). Le colture trattate con BDNF e PBS commerciali sono state considerate rispettivamente allo 0% e al 100%. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti come repliche biologiche indipendenti, n = 3. I dati mostrano la media e le barre di errore rappresentano ? SEM. I test statistici erano il test t di Student (spaiato, a due code). ;;Fig. 8. Caratterizzazione di BDNF sintetizzato senza cellule con organocolture di X. laevis. (A) Panoramica sperimentale della strategia di imaging dal vivo a singolo assone di Xenopus laevis ex vivo organoculture dell'occhio. (B) ? stato osservato un aumento della velocit? degli assoni quando ? stato fornito BDNF espresso senza cellule. (C) Immagini rappresentative degli assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC) da immagini in tempo reale. Le barre della scala indicano 10 ?m. I dati mostrano una mediana con interquartile per n = 4 repliche biologiche indipendenti. Il test statistico era il test di Mann-Whitney a due code, in cui i dati non erano distribuiti normalmente (test di Shapiro-Wilk). Sono stati contati almeno 55 coni di crescita per ogni gruppo. ;;Fig. 9. Quantificazione del BDNF sintetizzato senza cellule. ;6xHis-sfGFP ? stato espresso in modo ricombinante in E. coli BL21 (DE3) e purificato con una colonna Ni2 -NTA. Quantit? note di 6xHis-sfGFP, determinate dal coefficiente di estinzione, sono state utilizzate per generare soluzioni stock. Il western blotting di BDNF con tag FLAG e sfGFP con tag FLAG ? stato eseguito con diluizioni seriali (diluizioni 1: 1) per generare una curva standard. Gli adattamenti lineari della quantificazione del blot sono stati utilizzati per stimare la quantit? di BDNF e sfGFP prodotti dalla reazione di trascrizione/traslazione in vitro. I dati sono stati quindi confrontati con quantit? note di sfGFP 6xHis purificato. (A) Produzione basata sul tempo di BDNF sintetizzato mediante trascrizione/traslazione in vitro. (B) Curva standard della concentrazione di sfGFP determinata dall'analisi BCA. (C) Curva standard della fluorescenza sfGFP rispetto alla concentrazione proteica in cui la fluorescenza ? stata misurata con una macchina qPCR Rotor-Gene Q (Qiagen). (D) western blotting sfGFP e BDNF con diluizioni lineari. Vengono mostrate immagini o repliche rappresentative. (E) Quantificazione dell'intensit? della banda delle macchie da (D). In queste condizioni, la concentrazione di BDNF espresso senza cellule era ca. 100 ? 20 ?g/mL. (F) Western blot SDS-PAGE non denaturanti per il ripiegamento del BDNF e la quantificazione dell'intensit? della banda. Il BDNF espresso senza cellule corrispondeva a <10% della frazione multimerica o solubile totale della proteina. ;;Fig. 10. Quantificazione del GABA sintetizzato senza cellule. (A) Panoramica della produzione di GABA nella reazione privo di cellule di E. coli, con L-glutammato come substrato. (B) Per il rilevamento sensibile del GABA in soluzione, ? stato impostato un test fluorometrico basato su enzimi sulla base della letteratura precedente (Ippolito & Piwnica-Worms, 2014). Il sistema di rilevamento utilizzava una molecola fluorescente di resazurina come reporter. In questo saggio brevemente, il GABA viene prima digerito da GABase, una miscela enzimatica di amino butirraldeide transaminasi (ABAT), che converte il GABA in semialdeide succinica (SSAL) e semialdeide deidrogenasi (ALDH5A1). A sua volta, ALDH5A1 converte la semialdeide succinica in succinato. ABAT utilizza ?-chetoglutarato e ALDH5A1 utilizza NADP come cofattori, rispettivamente. Nella fase finale, l'enzima diaforasi viene utilizzato per convertire la resazurina in resorufina fluorescente che ossida il NADPH in NADP, rendendo ALDH5A1 riutilizzabile per la conversione continua di SSAL in succinato per l'amplificazione del segnale. Usando il test sopra, GABA ? stato rilevato nel mezzo S12. L'aumento dell'intensit? del segnale di fluorescenza di Resorufin era proporzionale all'aumento della quantit? di GABA puro nelle reazioni prive di cellule. Il limite minimo affidabile di rilevamento del GABA in S12 ? stato calcolato in ~ 5-10 ?M. Non ? stato utilizzato alcun modello di DNA contenente reazioni S12 come sfondo. (C) Produzione di GABA in reazioni fisiologiche senza cellule. Analisi Western blot della produzione di GadB con tag FLAG e di alfa-emolisina (?HL) in S12. L'ottimizzazione del pH di S12 ? stata eseguita con HCl concentrato (stock 1 M). Entrambi i DNA stampo plasmidici sono stati forniti a una concentrazione di 10 nM. (D) Rilevazione enzimatica (vedi pannello B) di GABA sintetizzato senza cellule in S12 a pH = 6,5. Le letture di fluorescenza grezze sono state normalizzate rispetto al fondo e le concentrazioni sono state determinate da una curva standard con concentrazioni di GABA note. n = 2 replicati biologici, le barre di errore indicano ?SD. (E) Curva standard del test di rilevamento del GABA fluorometrico utilizzato in questa sezione. ;;Fig. 11. Caratterizzazione della serotonina sintetizzata senza cellule. (A) Via biosintetica della serotonina. Il percorso in due fasi prevede una fase di idrossilazione e una di decarbossilazione. (B) La sintesi privo di cellule dei polipeptidi della via biosintetica della serotonina associata nella reazione S12. TH sta per Tyrosine Hydroxylase, hTPH2 sta per human Tryptophan Hydroxylase 2 (solo dominio funzionale), Cpn1046 ? un amminoacido batterico aromatico idrossilasi ottenuto da Chlamydia pneumoniae, AADCm sta per Aromatic Amino Acid Decarbossilasi da Mus musculus, AADCd sta per Aromatic Amino Decarbossilasi acida da Drosophila melanogaster. (C) Verifica della risposta della linea cellulare HEK293T alla serotonina commerciale, in cui la linea cellulare ? ingegnerizzata per generare una risposta di espressione GFP in presenza di serotonina e attivazione del recettore accoppiato alla proteina G a valle. (D) Titolazione della serotonina sintetizzata privo di cellule su una piastra a 96 pozzetti per l'attivazione dei recettori 5-HT7 (n = 1). ;;Fig. 12. Panoramica e convalida della formazione delle vescicole con il metodo dell'emulsione invertita. (A) Una soluzione di olio minerale (olio leggero, ? = 0,84 g/mL) ? stata preparata per sciogliere i componenti lipidici. Le emulsioni acqua in olio (invertite) sono state preparate con una soluzione acquosa al 2% (v/v) nella fase olio minerale lipidica. Ad esempio, 10 ?L di soluzione interna sono stati pipettati in 500 ?L di soluzione lipidica/olio minerale. Successivamente, la provetta da 1,5 mL contenente la miscela ? stata rapidamente aspirata su un rack per formare emulsioni invertite (vedere le sezioni Descrizione sperimentale e dettagliata dell'invenzione per maggiori dettagli). ? stata applicata una leggera forza centrifuga per formare vescicole sfruttando la differenza di densit? tra la soluzione esterna (?alanina = 1,42 g/mL) e quella interna (?saccarosio = 1,59 g/mL). (B) Immagini che illustrano il processo di formazione delle vescicole. (C) Immagini al microscopio di vescicole contenenti saccarosio generate dalla tecnica dell'emulsione invertita descritta nel pannello (A). La composizione della soluzione interna era di saccarosio 280 mM e HPTS 500 ?M. Una soluzione di alanina equiosmolare (cio? 300 mM) o DPBS (senza Mg<2+ >e Ca<2+>) ? stata utilizzata come soluzione esterna, per sfruttare la differenza di densit? tra l'interno e l'esterno delle vescicole. Risultati identici sono stati ottenuti con l'estratto di E. coli S12. Per aumentare la differenza di densit? e l'efficienza della reazione senza cellule, la soluzione interna ? stata ulteriormente integrata con 20 mM di saccarosio e 6 mM di maltosio (Fig. 4 e 5). La barra della scala indica 100 ?m. (D) Analisi citometrica a flusso di cellule artificiali generate mediante tecnica di emulsione invertita. La soluzione interna per le cellule artificiali conteneva una reazione di E. coli S12 ottimizzata per osmosi e 10 ?M di AlexaFluor488 etichettato con 10 kDa destrano. Lo strumento ? stato calibrato con perle di polistirolo di dimensioni note. Dopo la calibrazione, la frazione della vescicola gigante ? stata selezionata per una distribuzione uniforme delle particelle e una caratterizzazione affidabile della popolazione cellulare artificiale. ;Fig. 13. Caratterizzazione della produzione di polipeptidi all'interno di cellule artificiali. (A) A sinistra: immagini al microscopio rappresentative di cellule artificiali (AC) che sintetizzano una proteina di fusione BDNF-sfGFP at = 5 h. Le frecce indicano AC. Le barre della scala indicano 10 ?m. A destra: citometria a flusso rappresentativa di AC che producono BDNF-sfGFP. (B) A sinistra: immagini al microscopio di sfGFP che producono cellule artificiali. Le barre della scala indicano 10 ?m. A destra: analisi mediante citometria a flusso di cellule artificiali che sintetizzano sfGFP. Il diagramma a punti ? di dati at = 0 e t = 5 h. (C) L'istogramma si sovrappone per t = 0 et = 5 h. La reazione ? stata a 30 ?C. (D) Costruzione di proteine chimeriche per BDNF-sfGFP etichettati con FLAG N-terminale. (E) Curva standard per la determinazione della concentrazione di BDNF ? sfGFP all'interno di cellule artificiali. Le cellule artificiali contenevano quantit? note di 6xHis-sfGFP con una composizione ottimizzata dell'estratto. Dopo che la strategia di gating ? stata applicata per selezionare vescicole giganti (Fig. 12), le intensit? medie FITC sono state calcolate per concentrazioni note 6xHis-sfGFP e utilizzate per determinare lo sfGFP sintetizzato all'interno delle cellule artificiali. Le concentrazioni medie di sfGFP sono state quindi estrapolate dall'adattamento lineare della curva standard. ;Fig. 14. Scelta della composizione della membrana, test di funzionalit? del PFO e dell'alfa-emolisina. (A) Rappresentazione cartoon del circuito genetico utilizzato. (B) Il test di perdita di calceina ? stato utilizzato per valutare la funzionalit? del PFO e per schermare le concentrazioni di colesterolo. POPC: le vescicole di colesterolo sono state preparate mediante idratazione di liposomi vuoti liofilizzati (FDEL). Vescicole di 100 nm di diametro contenenti calceina 80 mM sono state aggiunte a reazioni di trascrizione/traslazione in vitro a 30 ?C e la variazione di fluorescenza ? stata monitorata nel tempo. Dopo l'induzione della sintesi di PFO con 10 ?M 3OC6 HSL, ? stato osservato un aumento della fluorescenza, indicante la sintesi e l'assemblaggio dei pori funzionali. L'aumento della fluorescenza era dovuto al dequenching della fluorescenza in soluzioni pi? diluite esterne alle vescicole. (C) Selezione della composizione della membrana cellulare artificiale per i pori PFO funzionali e la formazione delle vescicole. Per l'espressione del PFO sono state utilizzate concentrazioni plasmidiche ottimizzate (Fig. 5). 1: 0,5 POPC: le membrane del colesterolo non consentivano la formazione di un poro PFO funzionale. Le linee tratteggiate indicano il valore massimo di fluorescenza ottenuto aggiungendo 0,5% (v/v) Triton X ? 100 o 4 ?M 6xHis marcato PFO che ? stato espresso e purificato in modo ricombinante. (D) ? stata studiata l'influenza di un tag di degradazione delle piccole proteine C-terminale (pdt) sull'efficienza della formazione dei pori del PFO. Non ? stata rilevata alcuna inibizione significativa o perdita di funzionalit?. Mentre 1: 0,6 POPC: membrane di colesterolo consentivano anche la formazione di pori di PFO, 1: 0,85 POPC: colesterolo ? stato scelto per esperimenti successivi per compensare potenziali cambiamenti nella composizione della membrana dovuti allo sfruttamento della tecnica dell'emulsione invertita. (E) Analisi del saggio di rilascio di calceina di alfa-emolisina sintetizzata in reazioni prive di cellule S12. ;;Fig. 15. ;;Caratterizzazione della produzione di proteine con differenti composizioni di membrana. Analisi FACS dopo incubazione a 30 ?C per 1,5 h. Tutte le composizioni testate hanno mostrato attivit? di espressione genica. Il rapporto di molarit? tra POPC e colesterolo variava da 1: 0,16 a 1: 1. ;;Fig. 16. Schema del disegno del recettore chimerico e caratterizzazione dell'attivazione del circuito genetico. (A) Design del sistema di recettore chimerico L-glutammato esemplare di Tar-EnvZ (TaZ). La TaZ ? stata espressa in condizioni prive di cellule, non fornita come componente purificato. TaZ ha un'attivit? fosfatasica costitutivamente attiva. Quando ? legata agli amminoacidi, questa attivit? della fosfatasi si riduce e consente l'accumulo di fosforilato-OmpR (p-OmpR). A sua volta, p-OmpR si lega alla regione del promotore trascrizionale OmpC nel DNA plasmidico (pr.OmpC), che ? costituita da tre siti di legame consecutivi per OmpR e controlla l'espressione genica del polipeptide reporter, Firefly Luciferase (Fluc) o sfGFP. (B) La funzionalit? del TaZ con sistema reporter sfGFP in reazione privo di cellule. Il fattore di trascrizione OmpR ? stato fornito come componente purificato. (C) Ottimizzazione del contenuto di amminoacidi del sistema PURExpress per il recettore Tar-EnvZ. L'output dell'espressione genica era Firefly luciferase (Fluc), espressione dal promotore trascrizionale OmpC con fattore di trascrizione purificato OmpR. Concentrazioni di L-glutammato variabili sono state utilizzate sia per testare l'induzione genica che il limite massimo di produzione di Fluc. Sol. A ? la composizione tampone commerciale del New England Biolabs (NEB). ? stata osservata una riduzione dell'espressione genica di quasi 10 volte tra il tampone fatto in casa e il prodotto commerciale. ;;Fig. 17. Analisi di vescicole contenenti saccarosio e reazione di E. coli S12. (A) Caratterizzazione della perdita di contenuto indotta da PFO ricombinante espresso e purificato. I vescicole contenevano 280 mM di saccarosio in PBS e 10 ?M di AlexaFluor488 etichettato con 10 kDa destrano. Le vescicole sono state preparate come indicato in Fig. 12, purificate e lavate con PBS in eccesso. La perdita di materiale intrappolato ? stata valutata mediante cromatografia ad esclusione dimensionale con una colonna 4b sefarosio. Vescicole eluite tra le frazioni 9-15. Il materiale fuoriuscito ? stato eluito dopo la frazione 15, indicata con la linea rossa tratteggiata. La soluzione madre 3OC6 HSL ? stata conservata in 100% DMSO e diluita in acqua prima dell'induzione dell'espressione genica, ottenendo una concentrazione finale dell'1% (v/v) DMSO. Pertanto, il controllo negativo conteneva l'1% (v/v) di DMSO nella soluzione della vescicola. (B) Analisi citometrica a flusso dell'associazione PFO-membrana. Le vescicole sono state preparate come indicato nel pannello (A). I singoli eventi diminuiscono e gli eventi multipli aumentano con l'associazione PFO-membrana, presumibilmente a causa delle interazioni vescicola-vescicola innescate dall'oligomerizzazione del PFO. (C) Dimostrazione mediante citometria a flusso del rilascio di contenuto indotto da PFO dalla reazione di E. coli S12 che incapsula cellule artificiali. Tutte le cellule artificiali contenevano destrano 10 ?M 10 kDa marcato con AlexaFluor488 e nessun modello di DNA. A sinistra: analisi della citometria a flusso dopo 5 min di esposizione al PFO, analisi del dot plot. A destra: l'istogramma si sovrappone ai dati t = 0 e t = 5 min. (E) Titolazione del PFO ricombinante con cellule artificiali in soluzione sfusa. Il rilascio di GFP ? stato monitorato da FACS. Le barre di errore sono ? SD. Tutte le incubazioni sono state a 30 ?C per 16 ore. ;;Fig. 18. Stabilit? delle cellule artificiali in condizioni fisiologiche a 24 h. Tutte le cellule artificiali contenevano reazione di E. coli S12, destrano marcato con AlexaFluor488 10 ?M 10 kDa e DNA codificante per LuxR e PFO e sono state incubate a 30 ?C senza induzione. Salvo diversa indicazione, tutte le cellule artificiali sono state incubate in PBS. (A) Effetto dell'1% (v/v) DMSO sulla stabilit? delle cellule artificiali. A sinistra: un grafico a confronto dell'istogramma delle cellule artificiali "Nessun trattamento a 24 h" e "DMSO a 24 h". A destra: analisi del diagramma a punti dei dati dell'istogramma, il quadrante "Nessun trattamento a 24 h" era del 77,2% e il quadrante "DMSO a 24 h" era dell'80%. Non ? stata osservata alcuna differenza significativa. Le vescicole sono state ottenute da un lotto identico di preparati. (B) Analisi mediante citometria a flusso della stabilit? delle cellule artificiali al trattamento con l'80% di terreno L-15 (come rappresentazione della stabilit? di condizioni di bassa osmolalit? con una riduzione dell'osmolalit? del 20% da PBS) come "L-15 a 24 h" e 4 ?M PFO, come "PFO a 24 h". I quadranti erano i seguenti, da sinistra a destra, "Nessun trattamento a 24 h" era 82,4%, "L-15 a 24 h" era 83,8% e "PFO a 24 h" era 63,2%. Le vescicole nel pannello (B) provenivano da un lotto diverso del pannello di preparazione (A). ;;Fig. 19. Stabilit? delle cellule artificiali in presenza di cellule eucariotiche a 24 h. Per i grafici side-scatter (SSC-A) e forward-scatter (FSC-A), ? stata applicata una strategia di gating per differenziare le cellule artificiali dalle cellule eucariotiche (riga superiore). Successivamente (riga inferiore), il canale FITC ? stato utilizzato per determinare la fluorescenza delle cellule artificiali nel tempo. (A) Analisi della rottura delle vescicole. Cellule artificiali che incapsulano piranina (HPTS) e S12 (senza DNA) sono state coincubate con cellule HEK293T per 24 ore a 37 ?C. Prima dell'analisi mediante citometria a flusso, le cellule (insieme alle cellule artificiali) sono state staccate dal piatto di coltura mediante tripsinizzazione, diluite in DMEM e analizzate senza fissazione. I dati provenienti da diversi punti temporali hanno indicato che non era presente alcuna rottura significativa della vescicola dopo 24 ore di coincubazione, come pu? essere valutato dalla percentuale invariata di fluorescenza della vescicola. Non ? stato rilevato alcun calo significativo della fluorescenza dopo 24 ore di co-incubazione. (B) Analisi della potenziale associazione vescicola-cellula eucariotica. Le cellule artificiali della stessa formulazione del pannello (A) sono state quindi lavate via e la popolazione di cellule eucariotiche ? stata analizzata per un aumento della fluorescenza HPTS. A sinistra: la stessa strategia di gating del pannello (A) ? stata applicata per escludere le cellule artificiali. A destra: il canale FITC ? stato utilizzato per determinare l'intensit? di fluorescenza delle cellule eucariotiche, che potrebbe essere aumentata a causa di eventi di fusione. Non ? stato rilevato alcun aumento significativo della fluorescenza (variazione dello 0,05%, entro una ragionevole manipolazione ed errore di fondo). I dati sono stati riprodotti almeno due volte in giorni diversi. ;;Fig. 20. Stabilit? delle cellule artificiali in condizioni di crescita delle cellule eucariotiche. Tutte le cellule artificiali hanno incapsulato la reazione S12 con piranina (HPTS) e tutte le co-incubazioni erano a 37 ?C. (A) stabilit? delle cellule artificiali senza FBS a 24 h. Le cellule HEK293T e le cellule artificiali sono state incubate con o senza l'uso di un Transwell, come illustrato nei saggi per simulare le condizioni sperimentali in Fig. 27 e Fig. 30. (B) Stabilit? delle cellule artificiali con il 10% (v/v ) FBS a 24 h. Le cellule artificiali che non erano in contatto con le cellule eucariotiche sono indicate come gruppo di controllo e utilizzate come riferimento per gli eventi FITC massimi, sia nei test FBS che Transwell. In questo gruppo, le cellule artificiali sono state incubate separatamente a 37 ?C in PBS per 24 he quindi lavate brevemente con cellule eucariotiche e isolate immediatamente, in modo da corrispondere allo stesso ambiente di coltura del gruppo di test. In presenza di FBS, la popolazione di cellule artificiali ha mostrato un ca. Diminuzione del 7% entro 24 h, considerando il gruppo delle vescicole di controllo al 100%. Tuttavia, questo effetto non ? stato osservato in assenza di FBS. Presumibilmente il rapido aumento dell'osmolalit?, i componenti sconosciuti del siero bovino e un aumento degli eventi derivati da cellule eucariotiche dovuti alla crescita cellulare sono i tre fattori che contribuiscono alla perdita di eventi cellulari artificiali. ;;Fig. 21. Stabilit? delle cellule artificiali e crescita delle cellule HEK293T nell'arco di una settimana. Tutte le cellule artificiali hanno incapsulato la reazione S12 con piranina (HPTS) e tutte le co-incubazioni erano a 37 ?C. (A) Risultati rappresentativi della citometria a flusso, nel corso di una settimana di co-incubazione di cellule artificiali e cellule HEK293T e crescita cellulare in presenza di FBS al 10% (v/v) in DMEM completo a 37 ?C. (B) Curva di morte cellulare artificiale nel corso di una settimana a 37 ?C. A sinistra: gli eventi delle cellule artificiali hanno mostrato una diminuzione fino al 30% in presenza di FBS. La tendenza decrescente degli eventi delle cellule artificiali non ? cambiata in modo significativo in presenza o assenza di DNA plasmidico che codifica per BDNF. Mentre gli eventi di cellule artificiali FITC sono diminuiti, gli eventi FITC di origine cellulare eucariotica sono aumentati ("Solo cellule HEK293T"). L'influenza dei detriti cellulari e delle vescicole extracellulari sugli eventi fluorescenti ? risultata essere presente fino al 10-20% degli eventi significativi. Considerando che, le vescicole incubate in PBS hanno mostrato una diminuzione complessiva del 5-10%, indicando che la perdita di cellule artificiali non era principalmente dovuta alle cellule eucariotiche. (C) La stabilit? delle cellule artificiali in assenza di FBS dopo una settimana a 37 ?C. Tenendo conto del gruppo delle vescicole di controllo (come in Fig. 20), gli eventi delle cellule artificiali sono diminuiti solo del 15% dopo una settimana di co-incubazione. (D) Immagini al microscopio per determinare la compatibilit? delle cellule artificiali con le cellule HEK293T dopo una settimana di co-incubazione a 37 ?C. Le cellule HEK293T sono state coltivate in terreni contenenti FBS. Le cellule HEK293T eccessivamente confluenti si sovrappongono e si integrano con le cellule artificiali. La presenza di cellule artificiali non ha disturbato la crescita delle cellule eucariotiche. Inoltre, cellule eucariotiche eccessivamente confluenti non hanno indotto la lisi o la rottura delle vescicole, n? con mezzi chimici n? meccanici. Tutte le barre della scala indicano 100 ?m. ;Fig. 22. Test di tossicit? di cellule artificiali su cellule HEK293T. (A) Risultati del test MTT a seguito di coincubazione con PFO ricombinante espresso e purificato. La concentrazione inibitoria (IC50) del PFO ricombinante ? risultata essere ca. 3,7 nM per le cellule HEK293T. ? probabile che questo valore sia una concentrazione di PFO maggiore di quella che le cellule artificiali possono produrre e rilasciare. Questo controllo ? stato utilizzato come riferimento. Questi dati combinati con i dati nella Fig. 17D erano coerenti con quantit? di PFO prodotte e/o fuoriuscite per via intra-vesicolare approssimativamente uguali o inferiori a 4 nM. (B) Risultati del test MTT in seguito alla co-incubazione con cellule artificiali prive di DNA nei giorni 1 e 7. Non sono stati osservati effetti citotossici significativi con le cellule HEK293T. Le letture irregolari sono dovute alla crescita cellulare e ai differenziali di semina, poich? carenze di crescita simili sono state osservate anche in pozzetti non trattati. Una singola dose di cellule artificiali viene determinata come quantit? finale utilizzata per generare la Fig. 27. (C) Risultati del test MTT a seguito di co-incubazione con estratto privo di cellule senza DNA nei giorni 1 e 7. Entro 24 h, il La dose di reazione privo di cellule utilizzata con le cellule HEK293T per la valutazione della funzionalit? del BDNF sintetizzato senza cellule (0,25 ?L) non ha mostrato alcun effetto citotossico. Dopo 1 settimana di incubazione, la reazione privo di cellule ha iniziato ad esercitare un effetto citotossico. In questi test, la morte cellulare completa ? stata ottenuta aggiungendo Triton X-100 a una concentrazione finale dello 0,5% (v/v), che era il controllo negativo. Il controllo positivo era il gruppo senza trattamento. Il controllo positivo ? stato considerato 100% di vitalit? cellulare, mentre il controllo negativo ? stato utilizzato come 0% di vitalit? cellulare. I dati sono stati adattati al sigmoidale, dove i valori X erano considerati come concentrazione, per generare i valori IC50 su GraphPad Prism versione 7. ;;Fig. 23. Caratterizzazione della funzionalit? cellulare artificiale per il rilascio controllato di polipeptidi in condizioni fisiologiche. (A) Rappresentazione del fumetto del rilascio di GFP da cellule artificiali. (B) Analisi FACS (citometria a flusso) del rilascio di polipeptidi da cellule artificiali dopo aver rilevato un agente esterno. PFO ricombinante, indicato come "PFO puro", ? stato fornito a una concentrazione finale di 4 ?M (0,2 ?g/?L). I dati mostrano una media ? SEM per esperimenti indipendenti, n = 4 replicati biologici. Il test statistico era il test t di studente (accoppiato, a due code). (C) Dati rappresentativi della citometria a flusso che dimostrano la funzionalit? dei pori del PFO e il rilascio di GFP incapsulato. Le cellule artificiali sono state preparate come nella sezione "Generazione di cellule artificiali" nei Metodi e contenevano DNA plasmidico codificante LuxR e PFO, rispettivamente sotto promotori trascrizionali deboli e 3OC6 HSL inducibili. Nessuna vescicola contenente GFP incapsulante di DNA ? stata presa come riferimento al 100% (a sinistra). Qui il modello di DNA contenente vescicole ha dato ca. 3% e ca. Rilascio del 13% di GFP, rispettivamente senza e con 3OC6 HSL. ;;Fig. 24. Analisi tramite citometria a flusso esemplificativa del rilascio di sostanze chimiche mediante digestione di proteasi (diagramma a punti). Esempio di analisi aggiuntiva dei dati utilizzati nella Fig. 23. ;;Fig. 25. Caratterizzazione mediante citometria a flusso del rilascio chimico mediante digestione della proteasi (dot plot). Le cellule artificiali contenevano vari livelli di agente di affollamento molecolare per rilevare una diffusione efficiente del polipeptide nel lume della cellula artificiale. Il polipeptide/proteina formante pori ? stato utilizzato per indurre il rilascio di polipeptidi e la digestione non mirata del peptide di membrana ha confermato la diminuzione della fluorescenza rilevata, indicando la rottura totale e l'eradicazione dei compartimenti. ;;Fig. 26. Caratterizzazione mediante citometria a flusso del rilascio chimico mediante digestione di proteasi (istogramma). La funzionalit? del PFO marcato con pdt3 C-terminale ? stata verificata qui, nel contesto cellulare artificiale con lipidi PEGilati. La composizione della membrana era 1: 0,85: 0,01 POPC: colesterolo: 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N- [biotinile (polietilenglicole) -2000]. (A) Controllo negativo, senza alcun trattamento. (B) Controllo positivo senza tag PFO, fornito in forma purificata come N-terminus 6xHis-tagged, (C) Espressione di PFO-pdt3 controllata dal promotore LuxR con induzione 3OC6 HSL (D) senza induzione. ;;Fig. 27. ;;Le cellule artificiali guidano la differenziazione neuronale. (A) Panoramica del trattamento delle cellule artificiali e della strategia di differenziazione delle cellule staminali neurali (mNS) di topo. A sinistra: panoramica della segnalazione tra cellule artificiali e cellule staminali neurali. Gli omodimeri di BDNF maturo (verde) agiscono sul recettore affine TrkB, attivando le vie di segnalazione attraverso la fosforilazione di ERK1/2MAPK (arancione) tramite Shc (marrone) e/o tramite PLC?1 (viola). Entrambi i nodi portano alla fosforilazione (cerchio rosso) e alla traslocazione di CREB e di CREB fosforilato (p-CREB) nel nucleo, a livelli citosolici elevati di cAMP e/o Ca2 . Questo, a sua volta, attiva l'espressione dei geni dietro un promotore regolato da CRE, che erano fattori favorevoli alla sopravvivenza/pro-differenziazione. Centro: le cellule artificiali sono state incubate con cellule mNS per 15 giorni. Per fornire BDNF durante la differenziazione e per evitare gli effetti di una possibile rottura (cosa improbabile), le cellule artificiali sono state lavate via e le cellule artificiali fresche in terreni freschi sono state aggiunte ogni 24 ore. Il fumetto rappresenta una sezione trasversale di un pozzetto di coltura cellulare. A destra: dopo aver coltivato cellule mNS con fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) per 4 giorni, il giorno 0, l'EGF ? stato rimosso ei livelli di cellule artificiali secernenti BDNF sono stati gradualmente aumentati a partire dal giorno 4, mentre bFGF era contemporaneamente diminuito. (B) Immagini di microscopia immunocoloranti rappresentative della differenziazione delle cellule mNS in neuroni maturi in vitro a 19 giorni. Le cellule artificiali biologicamente inattive (che non producono e secernono BDNF, cio? secrezione di sfGFP, indicato come "Sfondo") sono state considerate come un trattamento fittizio e utilizzate per la normalizzazione (cio? 0%) per valutare il cambiamento del segnale tra condizioni con e senza sintesi dei pori del PFO (+/- 3OC6 HSL). (C) Analisi statistica delle cellule mNS che sovraesprimono ?III-Tubulina. Culture trattate con BDNF commerciale, ovvero Com. BDNF, sono stati presi come riferimento, cio? attivo al 100% rappresentato da una linea tratteggiata. I dati del pannello B sono stati utilizzati per generare il grafico. I dati grezzi prima della normalizzazione sono in Fig. 28, F e G. (D) Analisi western blot rappresentativa di cellule mNS pre-differenziate come risposta al trattamento con cellule artificiali a 19 giorni in vitro. Dopo 24 ore di deprivazione sierica, le cellule artificiali preincubate sono state co-incubate con la popolazione di cellule mNS per 30 minuti a 37 ?C. Per l'analisi dell'intensit? di banda (densitometria), i controlli di carico (Calnexin e Lamin A/C) e i segnali PLC?1 totali e ERK1/2MAPK totali sono stati utilizzati per normalizzare le intensit?. Diverse membrane sono state utilizzate per accogliere le incompatibilit? degli anticorpi e le diverse dimensioni delle proteine. Le barre della scala indicano 50 ?m e i dati mostrano ? media SEM per n = 3 repliche biologiche, esperimenti indipendenti. Il test statistico era il test t di Student (spaiato, a due code). ;;Fig. 28. Dati di supporto per la funzionalit? delle cellule artificiali con cellule staminali neurali. (A) Analisi statistica dell'immunocolorazione di MAP2 e ?III-Tubulina. Segnali sovrapposti sono stati utilizzati per valutare i livelli di maturazione e la specificit? del segnale. I dati indicano la media di tre diversi campi con ? SD. Il test statistico era il test t di Student (spaiato, a due code), dove p <0,05 era considerato significativo. (B) Immagini al microscopio rappresentative dell'immunocolorazione delle cellule mNS a 19 giorni in vitro, dopo il trattamento con cellule artificiali, gli anticorpi erano contro la Caspasi-3 (rossa) scissa per valutare l'apoptosi e la ?III-Tubulina (verde) per valutare il successo della differenziazione da apprezzare segnali di Caspase-3 scissi non sovrapposti. (C) Analisi statistica della popolazione cellulare complessiva per Caspase-3 scissa. I dati indicano la media di tre esperimenti indipendenti (n = 3) e le barre di errore indicano ? SEM. Il test statistico era il test t di Student (spaiato, a due code), dove p <0,05 era considerato significativo. "N.s." sta per "non significativo". (D) Immagini di immunocolorazione rappresentative di cellule mNS a 19 giorni in vitro, dopo il trattamento con cellule artificiali. L'anticorpo ?-proteina acida fibrillare gliale (GFAP, rosso) ? stato utilizzato per valutare le cellule gliali, cio? la popolazione di astrociti durante la differenziazione e la maturazione con cellule artificiali. (E) Analisi statistica della popolazione cellulare complessiva per GFAP. I dati indicano la media di due diversi campi con ? SD. Il test statistico era il test t di Student (spaiato, a due code), dove p <0,05 era considerato significativo. (F) Dati grezzi per la differenziazione delle cellule mNS in neuroni. Per valutare la qualit? della differenziazione neurale ? stata utilizzata una formula cellulare artificiale che incapsula BDNF commerciale e rilascia al momento del rilevamento 3OC6 HSL. "Com. BDNF "sta per Commercial BDNF (Peprotech) Tutti i punti dati sono repliche biologiche. Questo set di dati ? stato utilizzato per generare la Fig. 2C. (G) Le immagini rappresentative al microscopio di cellule artificiali senza proteine e BDNF commerciali che incapsulano e secernono cellule artificiali a 19 giorni in vitro. Tutte le barre della scala indicano 50 ?m. ;;Fig. 29. Validazione delle linee cellulari Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T). (A) Schema della procedura per la generazione della linea cellulare monoclonale CMV-TrkB, dove l'espressione genica della Tropomiosina chinasi B (TrkB) ? stata controllata dalle regioni potenziatore e promotore del citomegalovirus (CMV). (B) Colorazione di immunofluorescenza della linea cellulare con sovraespressione di TrkB basso, dove la trasduzione CMV-GFP ? stata utilizzata come segnale di fondo per l'immunocolorazione ?-TrkB. Sono stati selezionati circa 15 cloni diversi ed ? stata selezionata la linea cellulare che esprime il TrkB pi? basso per ridurre il rumore potenziale derivante dall'autofosforilazione del recettore TrkB sovraespresso. (C) Analisi Western blot dell'attivazione della via TrkB nella linea cellulare HEK293T ? CMV ? TrkB. Superiore: rilevamento basato sul tempo di ERK1/2MAPK fosforilato (entrambe le isoforme, 42 e 44 kDa) utilizzando segnali Calnexin come controllo del caricamento SDS-PAGE. "Com. BDNF "sta per BDNF commerciale, utilizzato a una concentrazione finale di 20 ng/mL. Inferiore: attivazione della via di segnalazione TrkB ? BDNF da parte di BDNF commerciale (20 ng/mL) a 10 min. L'analisi dell'intensit? della banda ha mostrato una differenza del 400% in ERK1/2MAPK fosforilato rispetto al PBS. (D) Generazione e validazione della linea cellulare policlonale TrkB/CRE ? GFP a partire dalla linea cellulare monoclonale CMV ? TrkB. (E) Risposta della linea cellulare CRE ? GFP a BDNF commerciale. BDNF commerciale ? stato utilizzato a una concentrazione finale di 100 ng/mL. Il western blotting ? stato eseguito per n = 2 esperimenti indipendenti (replica biologica) e il conteggio delle cellule ? stata eseguita per n = 3 esperimenti indipendenti (replica biologica). I test statistici erano il t-test non appaiato di Student dove un valore p inferiore a 0,05 era considerato statisticamente significativo. Tutte le barre della scala indicano 50 ?m. ;;Fig. 30. Le cellule artificiali influenzano il comportamento delle cellule HEK293T. (A) Panoramica del trattamento con cellule artificiali (AC) delle cellule HEK293T. A sinistra: panoramica della segnalazione tra AC e cellule staminali neurali. Gli AC attivano l'espressione dei geni dietro un promotore regolato da CRE, la proteina fluorescente verde (GFP). A destra: rappresentazione cartoon del trattamento e una sezione trasversale di un pozzetto di coltura cellulare. (B) Immagini di microscopia rappresentative dell'espressione di GFP in cellule HEK293T geneticamente ingegnerizzate. Come in Fig. 27, gli AC biologicamente inattivi sono stati considerati come un trattamento fittizio e utilizzati per la normalizzazione per valutare il cambiamento del segnale (indicato come "Sfondo"). Le barre della scala indicano 50 ?m. (C) Analisi statistica della GFP che esprime cellule HEK293T trattate con AC. La variazione del numero di cellule che esprimono GFP ? stata calcolata utilizzando i livelli di fondo come 0%. La differenza percentuale ? stata calcolata come variazione pro capite delle cellule GFP sull'intera popolazione rispetto allo sfondo. I dati mostrano una media /- SEM per n = 3 repliche biologiche, esperimenti indipendenti. Il test statistico era il test t di Student (spaiato, a due code). ;;Tabella 1. Elenco esemplificativo di condizioni di reazione prive di cellule ottimizzate. ;;Tabella 2. Elenco esemplificativo delle malattie associate alla segnalazione cellulare e alle vie di trasduzione del segnale. ;;Tabella 3. Elenco esemplificativo dei recettori polipeptidici di segnalazione (tirosina chinasi) simili alla segnalazione cellulare e alle vie di trasduzione del segnale di TrkB-BDNF. ;Tabella 4. Elenco esemplificativo di polipeptidi di segnalazione simili alla segnalazione cellulare e alle vie di trasduzione del segnale di TrkB-BDNF. ;;Tabella 5. Elenco esemplificativo di elementi/polipeptidi di regolazione genica associati e/o regolati da segnali cellulari e vie di trasduzione del segnale simili a TrkB-BDNF. ;;Tabella 6. Elenco dei recettori associati alla segnalazione neurale e al bersaglio dei neurotrasmettitori. ;;Tabella 7. Elenco esemplificativo di polipeptidi di segnalazione coinvolti nella comunicazione cellulare, segnalazione cellulare, trasduzione del segnale, simile alla via di segnalazione BDNF-TrkB e ai suoi elementi associati. ;;Tabella 8. Elenco dei segnali noti e dei percorsi associati ai segnali negli esseri umani. ;;Gli inventori forniscono un sistema chimicamente complesso che ? compatibile e/o pu? funzionare in condizioni fisiologiche. Il sistema ? definito come una cellula artificiale ed ? composto da un macchinario di trascrizione/traslazione privo di cellule incapsulato che ? sufficiente per produrre polipeptidi/proteine funzionali, contenenti acidi nucleici modello che codificano per i polipeptidi che costituiscono la funzionalit? del sistema chimico complessivo. La presente invenzione ? descritta in modo abilitante nei dettagli nei seguenti esempi, che possono rappresentare pi? di una forma di realizzazione della presente invenzione. La presente invenzione riguarda un sistema biologico privo di cellule, una cellula artificiale, compatibile e/o operante in condizioni fisiologiche. L'invenzione ? un bioreattore (nano) reattivo agli stimoli geneticamente controllato o nanofabbrica che pu? produrre polipeptidi, sostanze chimiche, terapie e rilasciare materiali di carico dopo aver sintetizzato i polipeptidi, sostanze chimiche, terapie. L'invenzione pu? essere programmata geneticamente, pu? essere completata da polipeptidi esterni, prodotti chimici, terapie e si ? dimostrata funzionale con due sistemi modello: cellule staminali neurali murine e cellule renali embrionali umane. In alcuni esempi, le cellule artificiali vengono utilizzate come dispositivi intelligenti per la somministrazione di farmaci. Le applicazioni di questa tecnologia della piattaforma non sono limitate all'uso in medicina o nella somministrazione di farmaci. L'invenzione funziona bene con le cellule eucariotiche e pu? funzionare anche con le cellule batteriche. Ad esempio, le cellule eucariotiche possono essere piante e le cellule artificiali possono intervenire con le cellule batteriche all'interno degli ambienti fisiologici degli organismi ospiti. L'invenzione qui descritta dimostra la capacit? delle cellule artificiali di comunicare chimicamente e influenzare il comportamento delle cellule eucariotiche. Finora non ? stato segnalato nulla di simile. ;;In un aspetto dell'invenzione, la cella artificiale ? composta da pi? componenti, dove l'effetto individuale o combinatorio dei componenti porta alla funzionalit? del sistema. In un aspetto dell'invenzione, la cellula artificiale comprende un sistema di trascrizione/traslazione privo di cellule batteriche, che ? sufficiente e sufficientemente funzionale per produrre polipeptidi. In una forma di realizzazione, il sistema di trascrizione/traslazione senza cellule batteriche pu? costituire una o pi? sostanze chimiche e/o composizioni distinte, che sono complessivamente definite come contenuti interni. In un aspetto dell'invenzione, il contenuto interno del sistema comprende un macchinario di trascrizione/traslazione senza cellule con componenti chimici complementari, in cui l'osmolalit? della soluzione complessiva ? costituita da valori di osmolalit? fisiologicamente compatibili. In una forma di realizzazione, i contenuti interni sono integrati con componenti chimici o polipeptidici esterni e purificati che contribuiscono alla funzionalit? del sistema. In un aspetto dell'invenzione, il contenuto interno ? incapsulato all'interno di vescicole composte da sostanze chimiche anfifiliche. In un altro aspetto dell'invenzione, le sostanze chimiche incapsulanti sono integrate da lipidi PEGilati, contribuendo alla stabilit? complessiva dei compartimenti. In una forma di realizzazione, il sistema senza cellule ? stabile in condizioni fisiologiche almeno per 1 settimana. In alcune forme di realizzazione, le cellule artificiali sostengono l'integrit? chimica, strutturale e compositiva fino all'85% della popolazione iniziale. In un aspetto dell'invenzione, il sistema senza cellule rimane funzionale fino a 24 ore di incubazione in condizioni fisiologiche. In alcune forme di realizzazione, il contenuto interno delle cellule artificiali mantiene la funzionalit? fino a 24 ore. ;;In un aspetto dell'invenzione, il sistema o una composizione ? adatto per essere utilizzato in medicina. In alcune forme di realizzazione, il sistema viene utilizzato per la somministrazione controllata del farmaco. In alcuni aspetti dell'invenzione, il farmaco ? definito come una sostanza chimica, piccola molecola o polipeptide o farmaceutico o terapeutico. In alcuni aspetti dell'invenzione, il sistema ? definito come un veicolo o agente per la somministrazione di farmaci intelligente. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione viene utilizzata per suscitare cambiamenti fenotipici nelle cellule eucariotiche. In una o pi? composizioni dell'invenzione, la cellula eucariotica che susciterebbe il cambiamento fenotipico ? una cellula di mammifero o umana. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, le cellule artificiali sono state utilizzate per promuovere la differenziazione e la maturazione delle cellule staminali neurali. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, le cellule artificiali sono state utilizzate per influenzare e/o modulare e/o modificare i livelli di espressione genica nelle cellule umane. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, le cellule artificiali possono essere utilizzate per modulare il comportamento cellulare per l'intervento di malattie delle vie di segnalazione negli esseri umani. In un aspetto dell'invenzione, una composizione comprendente una pluralit? di cellule artificiali viene utilizzata con una pluralit? di cellule eucariotiche. In alcune forme di realizzazione, la pluralit? di cellule eucariotiche ? costituita da cellule di mammifero o umane. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il sistema pu? essere utilizzato per intervenire con una variet? di malattie umane. In altre forme di realizzazione dell'invenzione, il sistema pu? essere riproposto per essere utilizzato al di fuori della medicina umana, per esempio sulle piante, all'interno della biotecnologia vegetale. ;;In un aspetto dell'invenzione, viene utilizzata una composizione del sistema tale che la soluzione interna della cellula artificiale e/o della cellula artificiale rilevi una sostanza chimica esterna. In alcune forme di realizzazione, la sostanza chimica esterna rilevata pu? essere una piccola molecola o un insieme di piccole molecole, che sono di origine eucariotica e/o procariotica, che possono essere trovate in nicchie fisiologiche. In un aspetto dell'invenzione, la cellula artificiale e/o la soluzione interna della cellula artificiale sintetizza una sostanza chimica utile dal punto di vista medico. In una forma di realizzazione, la sostanza chimica sintetizzata dalla cellula artificiale ? di origine eucariotica e/o procariotica, che pu? essere trovata in nicchie fisiologiche. In alcune forme di realizzazione, la sostanza chimica ? una piccola molecola o un polipeptide. ;;In un aspetto dell'invenzione e una composizione del sistema, la cellula artificiale e/o la soluzione interna della cellula artificiale sintetizza un polipeptide associato alla membrana. In alcune forme di realizzazione, il polipeptide ? una proteina/polipeptide che forma pori. In alcune forme di realizzazione il polipeptide ha residui rivolti verso l'esterno (della cellula artificiale) e richiede o non richiede colesterolo per la funzionalit?. In una forma di realizzazione dell'invenzione, il polipeptide viene utilizzato per il rilascio del contenuto interno dalla cellula artificiale. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il contenuto interno viene rilasciato entro 5 minuti a 24 ore. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il polipeptide possiede polipeptidi di fusione N-terminale e/o C-terminale, che conserva ancora la funzionalit? e residui rivolti verso l'esterno. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il polipeptide ha domini recettoriali che sono adatti per l'ingegneria proteica chimerica. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il dominio del sensore utilizza un sistema di trasduzione del segnale a due componenti, preferibilmente entrando in contatto con sostanze chimiche esterne e/o piccole molecole come amminoacidi. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, il sistema di trasduzione del segnale a due componenti contiene polipeptidi sintetizzati purificati e/o privi di cellule, che costituiscono la funzionalit? del sistema per rilevare un segnale esterno come sostanze chimiche o radiazioni elettromagnetiche. ;;In un aspetto dell'invenzione, la cellula artificiale rilascia sostanze chimiche in modo controllato. In un altro aspetto dell'invenzione, la cellula artificiale rilascia sostanze chimiche dopo aver sintetizzato sostanze chimiche utili dal punto di vista medico e polipeptidi associati alla membrana, e in presenza di una sostanza chimica/agente esterno che innesca il rilascio controllato delle sostanze chimiche. In alcune forme di realizzazione, la sostanza chimica rilasciata dalla cellula artificiale ? di origine eucariotica e/o procariotica, che pu? essere trovata in nicchie fisiologiche. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, la sostanza chimica rilasciata ? integrata e incapsulata all'interno della cellula artificiale come componente purificato, dove la sostanza chimica rilasciata ? una piccola molecola o un polipeptide. In alcune forme di realizzazione, la sostanza chimica viene rilasciata solo dopo aver rilevato un'altra sostanza chimica, che viene erogata come un agente chimico/chimico esterno ed ? di origine eucariotica e/o procariotica, che pu? essere trovata in nicchie fisiologiche. Tuttavia, in altre forme di realizzazione, l'invenzione pu? essere riproposta per sintetizzare sostanze chimiche solo dopo aver rilevato altre sostanze chimiche. In alcune forme di realizzazione, la sostanza chimica/agente esterno attiva processi trascrizionali per il rilascio di sostanze chimiche sintetizzate. ;;In un aspetto dell'invenzione, viene identificato, descritto e ottimizzato un processo per l'ottimizzazione del contenuto interno della cellula artificiale che ? compatibile e/o opera in condizioni fisiologiche. In alcune forme di realizzazione, il processo utilizza uno o pi? acidi nucleici stampo che rientrano principalmente nell'intervallo da 3 a 40 nM o nell'intervallo che consente la produzione di polipeptidi. In alcuni aspetti, gli acidi nucleici stampo vengono utilizzati in modo combinatorio, all'interno dell'intervallo di concentrazione. In alcune forme di realizzazione, l'acido nucleico stampo codifica per componenti e gli acidi nucleici sono utilizzati nell'intervallo da 1 a 99% della forza/potenza relativa del promotore all'interno di un circuito genetico. In alcune forme di realizzazione, i circuiti genetici sono usati in modo combinatorio con pi? differenti forze di sequenza del promotore. In alcune forme di realizzazione del processo, la soluzione interna ? composta da amminoacidi, rigenerazione energetica e/o componenti di soluzioni chimiche supplementari, in cui queste soluzioni sono combinatorie e utilizzate nell'intervallo 0-100%, dove sono definiti i limiti superiore e inferiore dalla metodologia comune in letteratura. ;;In un aspetto dell'invenzione, un processo per la generazione della cellula artificiale utilizza una generazione di monostrato chimico anfifilico, incubazione e forza centrifuga, in cui le soluzioni interne e/o esterne sono costituite da componenti fisiologicamente compatibili. In alcune forme di realizzazione del processo, la trascrizione/traslazione privo di cellule e/o sostanze chimiche supplementari generano un gradiente di densit? della soluzione tra la soluzione interna ed esterna, preferibilmente maggiore di 0,1 g/mL. In alcune forme di realizzazione, la soluzione interna ha una densit? maggiore o uguale alla soluzione esterna. In alcune forme di realizzazione, la soluzione interna ha una forza ionica paragonabile alla soluzione esterna. ;;L'invenzione sar? ulteriormente descritta nelle sezioni seguenti e nelle rivendicazioni le cui definizioni sono parte integrante della presente descrizione. ;L'invenzione descrive un nuovo modo modulare per manipolare l'ospite o il metabolismo dell'ospite, il processo decisionale cellulare o il comportamento cellulare. In generale, gli scienziati usano manipolazioni genetiche per alterare il comportamento delle cellule eucariotiche. In un aspetto della presente invenzione, la fase di intervento genetico diretto ? eliminata; pertanto, l'invenzione ? pi? sicura dei metodi attuali. In questo modo, la fisiologia della cellula ospite pu? essere modificata in modo transitorio, quando necessario. Se necessario, gli effetti possono essere ripristinati o il comportamento cellulare potrebbe essere riportato alle condizioni originali. Ci? che viene qui descritto ed esemplificato dall'invenzione ? una nuova classe di cellule artificiali geneticamente controllate, sensibili agli stimoli che comunicano chimicamente con cellule eucariotiche e/o di mammifero, (direttamente o indirettamente) inclusi i neuroni promuovendo la differenziazione delle cellule staminali neurali. Le cellule artificiali sono specificamente formulate per essere funzionali in condizioni fisiologiche in modo da facilitare gli sforzi futuri nella costruzione di cellule artificiali utili dal punto di vista medico. I dati presentati nella descrizione dettagliata dell'invenzione suggeriscono che le cellule artificiali sono un telaio versatile per la sintesi in situ e il rilascio su richiesta di segnali chimici e potrebbero essere progettate per andare oltre le capacit? dei tipici veicoli intelligenti per la somministrazione di farmaci sintetizzando e fornire molecole terapeutiche specifiche adattate alle condizioni fisiologiche locali. Ci? che si intende per molecola terapeutica ? una sostanza chimica biologicamente attiva e rilevante dal punto di vista medico o una sostanza, un polipeptide o un farmaco. ;;Come illustrato nell'esempio generalizzato nella Figura 1, un sistema di trascrizione/traslazione senza cellule ? stato incapsulato all'interno di vescicole, che possono essere composte da molecole a base di lipidi o polimeri. L'operazione risultante pu? essere definita come un sistema chimico bioispirato (complesso), (nano) bioreattore, nanofabbrica o semplicemente un sistema biologico privo di cellule, tutti riferiti a una cellula artificiale e utilizzati come definizioni/descrizioni intercambiabili. Il sistema di trascrizione/traslazione senza cellule pu? derivare da lisati cellulari di origine batterica o eucariotica o pu? essere ricostituito da componenti purificati. Le condizioni fisiologiche/ambientali esterne sono state rilevate da cellule artificiali tramite molecole di segnalazione permeabili a membrana o impermeabili a membrana che sfruttano rispettivamente la solubilit? intrinseca o sensori transmembrana. Al rilevamento del segnale/agente esterno, ? stata generata una risposta geneticamente controllata all'interno delle cellule artificiali, innescando il rilascio controllato di sostanze chimiche / polipeptidi / farmaci / terapeutici. La sintesi chimica / polipeptide / farmaco / terapeutica sensibile agli stimoli e geneticamente controllata al rilevamento del segnale esterno pu? anche essere ottenuta in condizioni controllate descritte nella presente invenzione. Le condizioni fisiologiche/ambientali sono definite come qualsiasi cosa al di fuori delle cellule artificiali come l'incapsulante, opposto al contenuto interno. Ci? che intendiamo per rilevamento del segnale/agente esterno ? generare una risposta all'interno o sulla superficie dell'artificiale al contatto con il segnale/agenti che risiedono all'esterno del compartimento e preferibilmente appartiene al sistema ospite in cui operano le cellule artificiali. La natura del segnale/agente pu? essere basata su qualsiasi molecola, sostanza chimica, polipeptide che abbia la capacit? di interagire e entrare in contatto con la parte o le parti dell'invenzione. Qui, il rilascio dei componenti interni dalla cellula artificiale ? stato ottenuto con una proteina che forma i pori. Ci? che si intende per proteina formatrice di pori ? un polipeptide idrosolubile e compatibile con il contenuto interno delle cellule artificiali in forma monomerica, ma che inizia a oligomerizzare spontaneamente al raggiungimento di una concentrazione critica sulle membrane della cellula artificiale. ;Il polipeptide formante pori preferibilmente oligomerizza in condizioni caratterizzate e definite compatibili con la nicchia fisiologica dell'ospite e possiede dimensioni dei pori sufficientemente piccole o grandi in modo tale che i polipeptidi globulari si diffondano attraverso. Ci? che intendiamo per piccola dimensione dei pori ?, la porzione cava e permeabile all'acqua del poro oligomerizzato che si trova tra 1-3 nM. Ci? che si intende per grande dimensione dei pori ? la porzione cava e permeabile all'acqua del poro oligomerizzato che ? superiore a 3 nm, raggiungendo fino a 30 nm. Tale caratterizzazione della dimensione dei pori cavi ? stata effettuata in letteratura mediante microscopia elettronica e microscopia a forza atomica. In un aspetto dell'invenzione, al fine di ridurre al minimo la tossicit? per l'ospite e/o massimizzare il rilascio, un'etichetta di degradazione delle proteine ortogonale ? stata facoltativamente incorporata come applicazione migliorata. La riduzione al minimo della tossicit? dell'ospite pu? essere definita come una ridotta mortalit? cellulare e una diminuzione dei livelli di risposta immunitaria all'agente estraneo di livelli simili di agenti di rilascio del farmaco a base di lipidi (rilascio liposomiale). La consegna massimizzata significa che una consegna/rilascio del carico interno delle cellule artificiali superiore al 40% dove le capacit? attuali delle cellule artificiali potrebbero raggiungere teoricamente. Un tag di degradazione proteica ortogonale ? stato definito come una piccola catena polipeptidica che ? composta da un massimo di 20 residui di amminoacidi e contiene un ordine di sequenza univoco da riconoscere da polipeptidi non-E. coli-proteasi, per ottenere una degradazione mirata del polipeptide etichettato. In questo modo, se necessario, il polipeptide che forma i pori, quindi il compartimento cellulare artificiale, pu? essere sradicato dalla digestione proteolitica. ;;Un telaio cellulare artificiale da integrare con le cellule eucariotiche ;;Nel modello proof-of-concept dell'invenzione come illustrato nella Figura 2, le cellule artificiali (a sinistra) sono progettate per generare una risposta biologica nelle cellule eucariotiche (a destra) in condizioni fisiologiche. La risposta biologica qui ? definita come una distinta alterazione fenotipica della cellula ospite/ricevente dovuta al cambiamento del metabolismo interno o alla regolazione dell'espressione genica o alla riproposizione dovuta all'attivazione o all'intervento della via di segnalazione. In questa forma di realizzazione, un telaio cellulare artificiale progettato per integrarsi con cellule eucariotiche nel modo seguente. Le cellule artificiali erano alloggiate all'interno di una vescicola fosfolipidica che consisteva principalmente di 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e colesterolo. Le cellule artificiali contenevano macchinari di trascrizione/traslazione e modelli di DNA che codificavano per il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), LuxR e perfringolisina O (PFO). La cellula ospite/ricevente ? definita come cellula eucariotica in condizioni fisiologiche o qualsiasi altra condizione fisiologicamente compatibile che riceve il segnale tramite cellule artificiali. In altre forme di realizzazione, la cellula ospite pu? essere una cellula di mammifero, una pianta o una cellula di mammifero che interagisce tramite una cellula batterica poich? si trova in condizioni compatibili con le cellule eucariotiche che si trovano in relazione patogena o simbiotica con l'ospite. Le descrizioni di cui sopra della cella ospite/ricevente sono puramente esemplificative e non limitate a quanto descritto. La risposta biologica pu? essere generata da una molecola effettrice, magari attraverso pi? ospiti o interazioni, attraverso una fase intermedia come la pluralit? di cellule artificiali o cellula batterica, dove la molecola effettrice pu? anche essere definita una molecola terapeutica. In questo esempio rappresentativo, una molecola terapeutica ? BDNF. Il BDNF ? un fattore neurotrofico che ? fondamentale per lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso promuovendo la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni, portando alla crescita dei neuriti, alla ramificazione e alla formazione e stabilizzazione delle sinapsi. ;;La produzione di BDNF murino maturo era controllata da un forte promotore trascrizionale costitutivamente attivo. Il forte promotore trascrizionale costitutivamente attivo ? stato definito rispetto alle sequenze di promotori note e pu? essere trovato nel sito web del registro della competizione International Genetically Engineered Machines (iGEM) (parts.igem.org). In questo aspetto dell'invenzione, BDNF ? un rappresentante di una classe di fattori di crescita che si trovano comunemente nei tessuti dei mammiferi. Ad esempio, BDNF ? descritto e definito come appartenente a una classe di peptidi di segnalazione, che include anche citochine, interferoni e interleuchine. Inoltre, il BDNF ? un polipeptide idrosolubile che pu? essere prodotto in modo ricombinante in E. coli e pu? essere disponibile in commercio in una forma biologicamente attiva in un modo che pu? generare una risposta comparabile nell'uso attivo, rispetto alle fonti mammifere del polipeptide. BDNF qui rappresenta una molecola di segnalazione proof-of-concept per manipolare il sistema ospite mediante trasduzione del segnale. ;;In questo modello dell'invenzione, la produzione di PFO monomerico, solubile in acqua, un polipeptide formante pori, ? stata regolata da un gate AND geneticamente controllato. Ci? che si intende per porta AND ? l'operazione logica che fornisce un output positivo solo in presenza di due componenti contemporaneamente. Ad esempio, se il componente A ? presente ma non il componente B, il sistema non ha dato risposta positiva; qui la risposta positiva ? stata esemplificata come produzione di PFO. Allo stesso modo, se il componente B ? presente ma non il componente A, neanche il sistema ha dato una risposta positiva. Il sistema ha dato risposta positiva solo in presenza sia del componente A che del componente B. Qui, in questo particolare esempio, gli elementi genetici corrispondenti ai componenti A e B sono stati definiti come segue. Il componente A era una piccola molecola permeabile alla membrana, N-3-ossoesanoil omoserina lattone (3OC6 HSL). Il componente B era il repressore trascrizionale reattivo 3OC6 HSL LuxR (un polipeptide), che ? un attivatore trascrizionale ad azione cis. L'espressione del PFO ? stata controllata da 3OC6 HSL e LuxR. In altre parole, questo sistema in due parti ? un gate AND che utilizza una coppia di 3OC6 HSL e LuxR. Qui, l'espressione di LuxR era controllata da un debole promotore trascrizionale. Ci? che si intende per promotore trascrizionale debole in questo particolare esempio, ? qualsiasi sequenza di nucleotide che guida l'uscita trascrizionale meno dell'uscita BDNF, o molecola effettrice in altre parole. In questo esempio, l'attivazione trascrizionale delle unit? produttrici di PFO ? funzionale solo in presenza simultanea di LuxR e 3OC6 HSL. ;;In questa configurazione, il BDNF sintetizzato per via intravesicolare ? sfuggito dalla vescicola attraverso i pori delle proteine. Le subunit? monomeriche del PFO sono state espresse in forma solubile all'interno delle cellule artificiali e assemblate in pori oligomerici in presenza di membrane lipidiche contenenti colesterolo. Le concentrazioni relative di questi due agenti possono variare l'una rispetto all'altra, tuttavia, l'essenza ? la loro co-presenza per guidare una risposta nella cellula artificiale. In questo esempio, i monomeri del PFO si associano con il tempo delle frazioni di colesterolo nella membrana, che ? definito rispetto alla velocit? di produzione del PFO e alla quantit? di colesterolo presente nelle membrane della cellula artificiale, che sono definite nei successivi paragrafi della descrizione dettagliata dell'invenzione. I diametri esterni dell'omodimero BDNF e del poro PFO sono rispettivamente di 4 nm e 25-30 nm. Pertanto, i pori PFO funzionali hanno consentito la fuoriuscita di BDNF dalla cellula artificiale. In questa disposizione, BDNF ? stato sempre sintetizzato ma rilasciato solo dalla cellula artificiale in presenza di 3OC6 HSL (Fig. 2A). ;I monomeri PFO spontaneamente oligomerizzati formano pori funzionali che consentono la fuoriuscita del contenuto interno. Dopo il rilascio di BDNF, gli omo-dimeri interagenti spontaneamente di BDNF maturo agiscono sul recettore affine Tropomiosina chinasi B (TrkB). L'associazione fisica tra BDNF e TrkB attiva le vie di segnalazione che passano attraverso ERK1/2MAPK tramite Shc (proteina contenente il dominio Src homology 2, marrone) e/o tramite Phospholipase gamma 1 (PLC?1). In questi percorsi separati per la trasduzione del segnale, entrambi i nodi portano alla fosforilazione e alla traslocazione della proteina di legame dell'elemento di risposta dell'AMP ciclico (CREB). I domini chinasi dei polipeptidi a valle fosforilano il CREB, portando a fosfo-CREB (p-CREB) e guida la traslocazione del p-CREB nel nucleo. In questa fase, ci sono livelli citosolici elevati di cAMP e/o Ca2 nel citosol della cellula eucariotica. Questa, o una sequenza simile di eventi a sua volta, attiva l'espressione dei geni sotto il promotore regolato da CRE, vale a dire, le cellule 293T della proteina fluorescente verde per il rene embrionale umano (nel caso di seguenti esempi dettagliati di seguito) o pro-sopravvivenza e pro-differenziazione fattori per le cellule staminali neurali. L'attivazione delle vie di segnalazione nelle cellule staminali neurali porta alla differenziazione e maturazione delle cellule staminali neurali (vedere l'esempio dettagliato di seguito). ;L'invenzione e il sistema privo di cellule qui descritto possono essere facilmente riutilizzati dall'esperto del ramo per l'intervento di percorsi di segnalazione simili a quanto qui presentato. La caratterizzazione dei componenti di segnalazione indica la generalit? dell'approccio ed evidenzia l'ampia gamma di applicazioni. I recettori, i componenti di trasduzione del segnale e i fattori di trascrizione hanno tutti risposto in modo coerente al segnale cellulare artificiale ed esempi dimostrativi dell'influenza generalizzabile delle cellule artificiali sulle cellule ospite/ricevente. L'esempio sopra descritto in Fig. 2 dimostra un modo per influenzare il comportamento delle cellule di mammifero mediante un intervento non genetico. In questo modo, le cellule mirate possono essere uccise selettivamente, se la molecola rilasciata ? tossica, o salvate, se la molecola rilasciata ? benefica. ;;Una piattaforma di espressione privo di cellule fisiologicamente compatibile ;;In una forma di realizzazione dell'invenzione, con la definizione delle condizioni fisiologiche come ci? che ? osmoticamente e ionicamente simile alla fisiologia umana, all'ambiente di sangue e soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), ? stata sviluppata una nuova formulazione in vitro di macchine di trascrizione/traslazione e utilizzato per tutti gli esperimenti descritti. Al fine di valutare la potenziale tossicit? di diversi sistemi di trascrizione/traslazione di privo di cellule e di espressione di polipeptidi, pi? sistemi sono stati esaminati con un saggio di collasso ex vivo altamente sensibile sin dall'inizio. Questo test di collasso fisiologicamente rilevante ha misurato l'entit? del collasso indotto dalla tossicit? della punta principale degli assoni, cio? il cono di crescita (Fig. 3A). Ci? che ? stato testato e preso in considerazione per l'ospite dalle cellule artificiali sono stati l'estratto di cellule HeLa, il lisato di reticolociti di coniglio e il sistema PURE. Tutti questi sistemi hanno aumentato il collasso del cono di crescita di oltre 2 volte (Fig. 3A). Questa estrema sensibilit? dei sistemi privo di cellule indica l'incompatibilit? solo per l'applicazione a valle pianificata da utilizzare con un sottoinsieme specifico di neuroni dell'organocoltura dell'occhio. Questo test presenta dei limiti riguardo alla generalizzabilit? delle complicazioni di tossicit? che possono insorgere nell'organismo ospite. Pertanto, i dati apparenti non devono essere considerati come eliminazione dei suddetti sistemi privo di cellule da utilizzare all'interno della cellula artificiale, bens? sforzi di ottimizzazione per la dimostrazione del particolarissimo esempio per la funzionalit? delle cellule artificiali sui neuroni. In confronto, l'estratto cellulare grezzo di E. coli S12 ha fornito dati simili a quelli della soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Fig. 3A). Tuttavia, l'osmolalit? della reazione completamente assemblata era ca. 500 mOsm/kg H2O (Fig. 3C). Per confronto, l'osmolalit? del plasma umano ? 285-305 mOsm/kg H2O. Questa gamma ha rappresentato un riferimento definitivo per testare la funzionalit? iniziale delle cellule artificiali, tenendo presente che i sistemi di vescicole a base di fosfolipidi possono trattenere fino a 200-300 mOsm/kg di differenza di pressione H2O tra i componenti interni ed esterni. In effetti, lo screening completo di vari terreni di crescita delle cellule eucariotiche ha rivelato un intervallo di osmolalit? di lavoro di 250-350 mOsm/kg H2O. Qui il valore e la differenza di 250 mOsm/kg H2O possono corrispondere alle caratteristiche di osmolalit? di un sistema enzimatico ricostituito in vitro o NEB PURExpress. Nonostante il fatto che la differenza di pressione osmotica avrebbe creato una presunta perdita di funzionalit? per le cellule artificiali e problemi di stabilit? sia a breve che a lungo termine, abbiamo scelto di eliminare la potenziale influenza della pressione osmotica. Inoltre, la compatibilit? dei componenti di reazione della privo di cellule con le condizioni fisiologiche indica che la futura costruzione delle cellule artificiali pu? essere eseguita con la massima efficienza per la formazione delle vescicole, con il massimo incapsulamento e ritenzione del materiale dopo l'incapsulamento. Tale compatibilit? ? dovuta alle membrane stabilizzate e alla limitata perdita di materiali attraverso la diffusione passiva attraverso le membrane o l'eliminazione di una rottura totale della membrana. Questo ? il motivo per cui gli sforzi inventivi e costruttivi sono stati diretti dopo aver scelto l'estratto non tossico di E. coli S12 come candidato principale. Pertanto, la composizione dell'estratto di E. coli S12 ? stata ottimizzata in modo da mantenere e massimizzare l'integrit? delle cellule artificiali in condizioni fisiologiche (Fig. Da 3 a 5). Il sistema senza cellule S12 fatto in casa e ottimizzato ? stato utilizzato per ogni esperimento ad eccezione di questo screening iniziale della tossicit? con il test di collasso assonale e lo screening delle condizioni di reazione S12. ;;In una forma di realizzazione dell'invenzione e del sistema, viene descritto un processo per l'ottimizzazione del contenuto interno della cellula artificiale. Come flusso esemplificativo di partenza di esperimenti, uno o pi? acidi nucleici stampo vengono utilizzati principalmente entro l'intervallo di 3 - 40 nM, preferibilmente per essere usati in modo combinatorio. Con il significato di modo combinatorio, gli acidi nucleici stampo che codificano la molecola effettrice o le parti componenti per rilasciare il contenuto interno potrebbero essere usati in rapporti molari differenti l'uno rispetto all'altro. Ad esempio, in un'applicazione, le cellule artificiali contenevano 20 nM di DNA stampo produttore di BDNF e 10 nM di DNA stampo produttore di PFO. Le concentrazioni date di ogni templato sono puramente esemplificative e il rapporto di ogni componente pu? essere alterato all'interno dell'intervallo di concentrazione di ogni maschera, simile a quello qui testato a partire da 3 nM a 40 nM (Fig. 3A e 4G, Fig.13). I rapporti qui presentati sono puramente esemplari. Qualsiasi altro rapporto sufficiente a produrre polipeptidi potrebbe essere utilizzato nell'ambito dell'invenzione. ;;La libreria del promotore trascrizionale, in cui l'acido nucleico modello codifica per i componenti viene utilizzata nell'intervallo 1 - 99% della forza/potenza del promotore relativo all'interno di un circuito genetico combinatorio, ? stata utilizzata per ottimizzare ulteriormente l'output trascrizionale per il DNA stampo. Ad esempio, diverse sequenze di acidi nucleici sono state selezionate e sottoposte a screening per l'output differenziale per sfGFP come polipeptide reporter (Fig. 3A). In questo modo, ? stata ottenuta una copertura pi? ampia del polipeptide effettore, del polipeptide che forma i pori e del componente secondario (cio? LuxR) per reindirizzare le risorse limitate delle cellule artificiali principalmente verso la produzione massima del polipeptide effettore, mantenendo al contempo risorse soddisfacenti per la produzione del polipeptide formante pori (Fig. 3G). Un tale approccio generalizzato sarebbe soddisfacente per il processo di ottimizzazione per la maggior parte delle applicazioni all'interno delle cellule artificiali. L'ulteriore schermo del promotore trascrizionale e i dettagli della sequenza possono essere trovati nelle Fig. 3 e 4. In conclusione, i promotori trascrizionali e le concentrazioni di DNA stampo sono stati ottimizzati per produrre una quantit? massima di BDNF e una quantit? minima di LuxR e PFO con le risorse limitate disponibili all'interno la cellula artificiale (Fig. 4F e 4G). Pertanto, sono stati utilizzati promotori trascrizionali forti e deboli per l'espressione di BDNF e LuxR, rispettivamente. L'uso dei punti di forza del promotore trascrizionale dell'acido nucleico modello presentati qui sono semplicemente esemplificativi. Qualsiasi altra combinazione sufficiente a produrre polipeptidi potrebbe essere utilizzata nell'ambito dell'invenzione. ;;Composizioni interne del sistema qui definito composte da amminoacidi, rigenerazione energetica e/o componenti di soluzioni chimiche supplementari. Questi componenti sono selezionati per una funzionalit? ottimale e sono utilizzati nell'intervallo 0-100% di quelli impiegati dalla metodologia comune. I componenti della soluzione chimica supplementare possono essere definiti come tutto ci? che viene utilizzato nelle condizioni di reazione della privo di cellule, che sono riportate nella Tabella 1 e nelle Fig. Da 3 a 5. La valutazione iniziale delle condizioni di reazione monitorate dall'espressione di superfolderGFP, denotata come sfGFP (Fig. 3C e da 4A a 4E). In un esempio, sono stati usati solo 6 mM di soluzione di maltosio, che corrispondono al 50% delle quantit? comunemente impiegate (Fig. 4D). Tuttavia anche lo 0% della quantit? di maltosio comunemente impiegata consente una produzione efficiente di polipeptidi, pertanto questa quantit? ? considerata all'interno dell'intervallo di ottimizzazione. In un altro esempio, la soluzione di saccarosio non rientrava nell'elenco delle soluzioni comunemente impiegate, quindi l'uso del saccarosio nella reazione di E. coli privo di cellule d? di per s? una novit? nel processo di ottimizzazione, in cui altri sali di magnesio e potassio comunemente impiegati sono stati mantenuti identici alla letteratura, a causa della mancanza di importanza per l'ottimizzazione a basse concentrazioni, che porta a un intervallo del 100%. Allo stesso modo, il 100% delle quantit? di maltosio comunemente impiegate porterebbe alla massima produzione di polipeptidi, tuttavia, l'osmolalit? sarebbe stata influenzata come descritto di seguito. Nonostante questa limitazione, il contributo del 100% del maltosio non pu? essere eliminato dal pool di ottimizzazione, poich? il processo di ottimizzazione iterativo consente di tenere conto di tutte le composizioni in modo coerente, piuttosto che sequenziale. ;Ancora in un altro esempio del processo per l'ottimizzazione dei componenti di reazione, il contributo della pressione osmotica da tutti i principali componenti della reazione privo di cellule ? stato caratterizzato e preso in considerazione come contributo sostanziale basato sulla concentrazione. Ad esempio, l'1% (p/v) di polietilenglicole 4000 (PEG) come composizione finale per creare un effetto di affollamento molecolare all'interno della reazione privo di cellule, corrispondeva a circa 10 unit? di differenza di osmolalit? (passaggi da 5 a 6 in Fig. 5), che non sarebbe stato facilmente valutato senza eseguire gli esperimenti in Fig. 5. In un altro esempio, la diminuzione del 50% nelle soluzioni di amminoacidi porta ad una diminuzione dell'osmolalit? di ca. ;140 unit? (passaggi da 2 a 3 in Fig.5). Gli esempi di ciascun collaboratore possono essere forniti con una metodologia simile su base iterativa. La Fig. 5 rappresenta solo una frazione degli esperimenti eseguiti e possibilmente potrebbero essere eseguiti. In un altro esempio nella Fig. 3B, i cicli iterativi per l'ottimizzazione sono iniziati con il cambiamento delle concentrazioni di amminoacidi, quindi sono passati allo schermo del livello dei componenti di rigenerazione energetica e sono terminati con lo schermo dell'additivo di saccarosio per migliorare le rese di produzione del polipeptide e la densit? della soluzione interna per facilitare la formazione di cellule artificiali nelle fasi successive. Allo stesso modo, in ancora un altro esempio nelle Figure da 5C a 5E, le concentrazioni di maltosio, PEG e magnesio e sale di potassio sono state vagliate e convalidate per la produzione ottimale del polipeptide reporter. Gli sforzi di questi schermi completi sono stati eseguiti in modo iterativo per monitorare attentamente l'osmolalit? della reazione per ciascuna prestazione, poich? nella Fig.6 ? stata fornita una via presa per il miglior risultato. ;;I risultati degli schermi completi per le migliori concentrazioni di sfGFP e l'osmolalit? pi? bassa hanno prodotto un livello ottimale di componenti di reazione privo di cellule cooperativa, che sono riassunti nella Tabella 1. Tuttavia, questo risultato e la composizione qui usata non significa che ci sia un unico ottima composizione. La descrizione ? solo un esempio e utilizzata per stabilire una serie di regole, confini e metodologia di ottimizzazione. I dati e le cifre forniti dimostrano chiaramente le operazioni logiche. Qualsiasi altra combinazione sufficiente a produrre polipeptidi potrebbe essere utilizzata nell'ambito dell'invenzione. Il motivo per cui si verifica la reazione massima di privo di cellule non ? del tutto chiaro, tuttavia, poich? l'estratto di privo di cellule ? metabolicamente attivo poich? viene estratto da cellule di E. coli viventi lungo il processo (descritto nella sezione sperimentale), ? prevista l'altra reazione massima. Il requisito finale atteso ? la coerenza delle vie metaboliche e di reazione tra i componenti per ottenere una produzione sostenibile di polipeptidi. Ecco perch? e come ? possibile introdurre meno componenti del materiale di partenza (o quantit? comunemente impiegate in letteratura) ma livelli di espressione genica comparabili. In conclusione, le condizioni di soluzione finale hanno sfruttato sostanzialmente meno di ogni componente molecolare. Ad esempio, sono stati utilizzati il 66% in meno di amminoacidi e il 33% in meno delle soluzioni di rigenerazione energetica rispetto alle condizioni comunemente utilizzate (Tabella 1). Sono probabili altri risultati ottimali nello spazio chimico, che possono essere rivelati da algoritmi di apprendimento automatico e screening ad alto rendimento. ;;Un sistema privo di cellule costruito dai principi di cui sopra funziona per la traslazione all'interno di cellule artificiali tipicamente per 5 h. Tuttavia, ci sono cambiamenti nella composizione dei contenuti interni forse a causa della perdita dei substrati necessari per la sintesi proteica. Tuttavia, l'estratto S12 che supportava la sintesi di mRNA e proteine era durevole, conservando il 50% di attivit? dopo 6 ore di dormienza a 37 ? C (Fig. 6B). La reazione priva di cellule qui possiede quindi il potenziale per rimanere dormiente anche per un giorno in condizioni fisiologiche ed esercitare ancora prestazioni una volta incontrati i trigger chimici (agenti esterni) per avviare il processo di rilascio del carico (Fig. 6B, confronto pi? a destra). ;;Processi e metodi per produrre cellule artificiali in condizioni fisiologiche ;;In una forma di realizzazione dell'invenzione, un sistema biologico privo di cellule, una cellula artificiale, ? compatibile e/o opera in condizioni fisiologiche, in cui la cellula artificiale ? costituita da una o pi? parti componenti. Le parti componenti delle cellule artificiali includono ma non sono limitate a un sistema biologico privo di cellule che ? compatibile con e/o opera in condizioni fisiologiche in cui le sostanze chimiche anfifiliche incapsulano i contenuti interni del sistema, i contenuti interni del sistema comprendono la trascrizione priva di cellule/sistema di traslazione con componenti chimici complementari, in cui l'osmolalit? complessiva della soluzione ? compresa tra 250 mOsm/kg H2O e 600 mOsm/kg H2O e/o in cui i contenuti interni del sistema sono integrati da componenti proteiche esterne e/o in cui i prodotti chimici anfifilici comprendono PEGilati o altri lipidi stabilizzanti. I componenti possono contenere una pluralit? di sistemi. In un aspetto dell'invenzione, la pluralit? di cellule artificiali pu? essere descritta come tessuti artificiali. Cellule artificiali o tessuti artificiali possono comportarsi come complementari alle cellule eucariotiche. Cellule artificiali o tessuti artificiali possono comportarsi in modo analogo alle cellule eucariotiche artificiali. Cellule artificiali o tessuti artificiali possono comportarsi in modo analogo alle cellule del sangue artificiali se contengono componenti enzimatici o chimici necessari. ;;In una forma di realizzazione, una sostanza chimica anfifila o una serie di sostanze chimiche anfifiliche incapsulano il contenuto interno della cellula artificiale. Ci? che si intende per sostanza chimica anfifilica ? la sostanza chimica che ha un gruppo di testa idrofilo "amante dell'acqua"; Le frazioni lipofile (e/o idrofobe) "amanti del petrolio" e/o "che odiano l'acqua", possiedono complessivamente la capacit? di formare doppi strati all'interno di soluzioni acquose. In alcuni esempi, la sostanza chimica anfifilica ? un lipide e il termine lipide pu? essere utilizzato in modo intercambiabile al posto della sostanza chimica anfifila. La formazione del doppio strato pu? essere dovuta ao da fosfolipidi biologici, componenti di membrane biologiche aggiuntive come il colesterolo o qualsiasi altra sostanza chimica non biologica e/o un polimero che pu? contenere in modo soddisfacente le soluzioni interne delle cellule artificiali per sostenere reazioni chimiche interne come ma non limitato alla trascrizione/traslazione priva di cellule. In questo caso, la miscela chimica di lipidi pu? contenere un lipide stabilizzante, in particolare ma non limitato al quale fornisce stabilit? come risposta alla pressione osmotica tra i lati interno ed esterno dei doppi strati. In un esempio, il lipide utilizzato all'interno delle membrane pu? essere una molecola PEGilata, con o senza una particolare porzione idrofobica o modificazioni del gruppo di testa idrofile. In un esempio, una delle essenze di tale sostanza chimica ? creare un distanziamento fisico tra le cellule artificiali, le membrane e le cellule ospiti o l'organismo. Gli esempi di tali lipidi stabilizzanti sono stati forniti per aumentare la durata della circolazione sanguigna negli esseri umani. Un esperto del ramo pu? facilmente trovare sostituzioni funzionanti ai componenti qui descritti per ospitare/creare i compartimenti del sistema. Qui, ci? che si intende per contenuto interno della cellula artificiale ? che il contenuto interno comprende un sistema di trascrizione/traslazione privo di cellule con componenti chimici complementari, in cui detti componenti chimici sono solubilizzati all'interno di una soluzione interna. L'osmolalit? complessiva della soluzione ? compresa tra 250 mOsm/kg H2O e 600 mOsm/kg H2O. Qui il valore di 250 mOsm/kg H2O ? preso come riferimento per un valore di coltura cellulare eucariotica a bassa osmolarit? e un valore di riferimento inferiore di un sistema enzimatico ricostituito in vitro e/o osmolalit? NEB PURExpress. All'esperto del ramo risulta chiara una strategia di ottimizzazione che porti ad un valore inferiore a tale valore ottenuto dalle operazioni logiche qui descritte. I componenti interni possono essere integrati con componenti purificati come sostanze chimiche bioattive o terapeutiche e/o polipeptidi. In un esempio, i fattori di trascrizione o le sostanze chimiche possono essere riproposti all'interno delle cellule artificiali per ottenere la funzionalit? descritta. In un altro esempio ancora, le cellule artificiali si sono dimostrate funzionali con componenti completati esternamente, come descritto nelle sezioni successive. L'essenza ? il mantenimento della funzionalit? di base del sistema senza compromettere l'integrit? complessiva in modo tale che il sistema non si discosti da livelli soddisfacenti di incapsulamento e livelli soddisfacenti di rilascio del contenuto. I livelli soddisfacenti sono stati descritti nella sezione della descrizione dettagliata. In termini pi? elementari, i livelli soddisfacenti includono la quantit? di agente rilasciato per esercitare una risposta biologica minima nella cellula ospite. ;;L'esperto del ramo pu? generare cellule artificiali operanti in condizioni fisiologiche impiegando metodi diversi da quelli descritti principalmente nella sezione sperimentale. Tuttavia, il metodo distintivo che tiene conto dell'osmolalit? consente le migliori prestazioni e la massima efficienza. L'esperto del ramo pu? decidere di compromettere l'efficienza sostanziale piuttosto che evitare di utilizzare i metodi descritti come tecnica di conversione di emulsioni invertite acqua-in-olio in vescicole. Pertanto, altri metodi disponibili in letteratura rientrano nell'ambito del sistema biologico privo di cellule che ? compatibile e/o opera in condizioni fisiologiche. Ad esempio, il metodo di idratazione dei liposomi vuoti liofilizzati (FDEL) genera liposomi polidispersi con un'efficienza di incapsulamento sostanzialmente bassa sulla differenza dell'ordine di grandezza. Tuttavia, le barriere alla diffusione per l'attraversamento di una sostanza si moltiplicano e diventano pi? difficili come l'attraversamento di una singola apertura dei pori sostenuta da pi? strati di membrana differenti. Nonostante questi inconvenienti, se l'esperto accetta una sostanziale perdita di efficienza, l'esperto del ramo pu? realizzare vescicole unilamellari relativamente monodisperse che possono ancora ospitare la soluzione interna e possono ancora operare in condizioni fisiologiche. La tecnica e la metodologia per farlo, sono state esemplificate nella sezione Sperimentale e hanno dimostrato di consentire il passaggio di molecole attraverso i pori. ? importante sottolineare che il materiale non incapsulato che risiede all'esterno dei liposomi verrebbe rimosso mediante purificazione, fasi di lavaggio estese o dialisi. A tal fine, l'unilamellarit? nella membrana cellulare artificiale ? preferibilmente ottenuta mediante forze meccaniche, come l'estrusione o il filtraggio attraverso una certa dimensione dei pori. ;;In una forma di realizzazione dell'invenzione, un processo per la generazione del sistema biologico privo di cellule, cio? una cellula artificiale, che ? rappresentato in Fig. 12. In cima a una soluzione fisiologica, una miscela sterile-minerale disciolta di un prodotto chimico anfifilico viene lentamente aggiunto per generare un monostrato in cui i gruppi di testa idrofili dei lipidi sono rivolti verso la fase acquosa e le frazioni idrofobe sono rivolte verso la soluzione di olio minerale (Fig 12A). In un esempio, la miscela chimica anfifilica conteneva 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), colesterolo e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N- [biotinile (polietilene glicole) -2000] (sale di ammonio) (DSPE ? PEG (2000) -Biotina con un rapporto molare di 1: 0,85: 0,01. Il rapporto fornito ? esemplare e la funzionalit? del sistema pu? essere ottenuta con diverse composizioni, per particolare applicazioni, descritte anche di seguito. La miscela esemplificata ? stata sciolta mediante calore, agitazione meccanica e sonicazione, secondo la sezione sperimentale. La soluzione interna delle cellule artificiali ? stata assemblata come descritto nella sezione sperimentale, ed ? stata creata l'emulsione acqua in olio mediante agitazione meccanica della soluzione che viene dispersa in una soluzione di olio minerale lipidico con un rapporto approssimativo del 2% (v/v). L'agitazione meccanica ? stata trafilando i tubi di plastica contenenti le miscele di soluzione su un rack. Il metodo descritto pu? essere sostituito con altro mezzi di agitazione meccanica sufficienti per creare un'emulsione invertita (acqua in olio), come descritto in Fig.12. Dopo un breve periodo di incubazione per consentire la sedimentazione dell'emulsione sopra il monostrato creato, viene applicata una leggera forza centrifuga, che era di circa 5000 g. La forza centrifuga pu? variare fino al limite superiore di 20.000 g, con livelli accettabili di perdita di soluzione/contenuto interno durante l'incapsulamento per generare cellule artificiali. Le variazioni di questo metodo sono state pi? volte riportate in letteratura, ed ? gestibile dall'esperto del ramo. In questo modo, il monostrato della sostanza chimica anfifilica viene convertito in doppio strato, mentre l'ambiente acquoso innesca la formazione di doppio strato e vescicola, incapsulando cos? il contenuto interno. ? importante che le soluzioni interne e/o esterne siano costituite da componenti fisiologicamente compatibili. Altrimenti l'efficienza per l'incapsulamento della soluzione interna sarebbe inferiore e la perdita di materiale contribuirebbe alla minore efficienza funzionale delle cellule artificiali. Le soluzioni interne ed esterne devono avere valori di osmolalit? comparabili tra loro. Ad esempio, il PBS ha un valore di osmolalit? di 285-295 mOsm/kg H2O e la soluzione di alanina 300 mM ha un valore di osmolalit? di ca. ;320 mOsm/kg H2O. ? importante che la trascrizione/traslazione priva di cellule e/o le sostanze chimiche supplementari generino un gradiente di densit? della soluzione tra la soluzione interna ed esterna, preferibilmente maggiore di 0,1 g/mL, una sfumatura chiave che non ? stata ampiamente esplorata in precedenza in letteratura. In un esempio, PBS o una soluzione di alanina ? stata utilizzata come soluzione esterna appropriata. Come principio generale, la soluzione interna dovrebbe avere una densit? maggiore o uguale alla soluzione esterna, al fine di generare cellule artificiali con una resa soddisfacente. In un esempio, l'alanina ha una densit? di 1,42 g/mL mentre il saccarosio, come componente della soluzione interna delle cellule artificiali, ha una densit? di 1,59 g/mL. In questo modo, il processo di incapsulamento ? pronunciato. La soluzione interna preferibilmente dovrebbe avere una forza ionica paragonabile alla soluzione esterna. Considerati insieme, la composizione dell'intero sistema, la forza ionica della soluzione esterna e l'osmolalit? influenzerebbero le rese delle cellule artificiali generate. L'uso di questo metodo ? una scelta primaria ed ? importante ottenere membrane cellulari artificiali unilamellari con questo metodo, in particolare per un'attivit? efficiente per i pori del PFO e la diffusione del carico interno attraverso i pori. ;L'integrit? delle cellule artificiali costruite come descritto sopra non ? stata compromessa e le cellule artificiali non sono state interrotte dopo 24 ore n? a 30 C n? a 37 judC, come giudicato dalla fuoriuscita di destrano e piranina incapsulati (Fig.17 e 18). La stabilit? delle cellule artificiali ? definita come la capacit? di trattenere i materiali incapsulati senza compromettere in modo significativo la struttura vescicolare. In altre parole, le cellule artificiali devono rimanere strutturalmente intatte per essere considerate stabili, da almeno 24 ore a 1 settimana in condizioni fisiologiche. In alcuni esempi, le cellule artificiali potrebbero resistere a terreni di coltura di osmolalit? ancora pi? bassa o pi? alta, ad esempio terreno di crescita L-15 (Fig.18), mezzo di Dulbecco Modified Eagle (DMEM) con alto contenuto di glucosio (4,5 g/L), 100 ?g/mL di penicillina/streptomicina e L-glutammina 2 mM (Fig. 17 e 18), e DMEM completo che ? integrato con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (Fig. 20). In alcuni esempi, dopo una settimana, l'85% delle cellule artificiali ? sopravvissuto alla coincubazione con cellule HEK293T in condizioni di deprivazione di siero (fig. 21). Le condizioni descritte contenevano cellule eucariotiche all'interno del mezzo di crescita, in assenza del siero bovino fetale al 10% (v/v). Nel complesso, ampi dati di stabilit? sono coerenti con le cellule artificiali che sopravvivono in condizioni fisiologiche per monitorare le condizioni ambientali. Inoltre, n? le cellule artificiali n? le reazioni prive di cellule non erano tossiche per le cellule HEK293T. Nessuna tossicit? delle cellule artificiali ? stata osservata con il saggio di vitalit? cellulare MTT dopo co-incubazione per 24 ore e 1 settimana (Fig. 22). Il test MTT misura l'attivit? metabolica della soluzione, dove le cellule eucariotiche generano l'uscita colorimetrica. Poich? le reazioni prive di cellule erano anche metabolicamente attive, i dati generati, se di natura irregolare, potrebbero essere dovuti alla presenza di enzimi di reazione privi di cellule, che interferiscono con il saggio di vitalit?. Si noti inoltre che il rilascio liposomiale di molecole di farmaci attualmente in uso e l'incorporazione di lipidi PEGilati aumenta il tempo di circolazione, in modo simile alle cellule artificiali qui descritte contenenti 1% molare di lipidi PEGilati, secondo un esempio dell'invenzione. ;;Le parti component delle cellule artificiali sono funzionali ;;In un aspetto dell'invenzione, le cellule artificiali sono descritte come stabili e funzionali. Ci? che si intendeva per stabilit? delle cellule artificiali ? stato definito e presentato sopra. La funzionalit? della cellula artificiale pu? essere definita come attiva trascrizionalmente e traslazionalmente per adempiere ai compiti programmati, come il rilascio di una sostanza chimica. Ad esempio, la funzionalit? della cellula artificiale ? contrassegnata, dove vengono rilasciate le sostanze chimiche, non dove ? cessata la traslazione della trascrizione. In alcune forme di realizzazione contenenti polipeptidi formanti pori, il processo di oligomerizzazione pu? aver luogo dopo che la traslazione effettiva cessa. Inoltre, in un aspetto dell'invenzione, il sistema pu? rimanere attivo e dormiente, prolungando la funzionalit? del sistema, fino a 24 ore (Fig. 6A e 6B). Questa capacit? ? dovuta alla durata del sistema di trascrizione/traslazione privo di cellule. Dopo la generazione delle cellule artificiali, se il sistema non viene immediatamente attivato per la formazione dei pori, la funzionalit? pu? durare fino a 48 ore. Inoltre, i limiti di funzionalit? possono essere influenzati dal processo di ripiegamento e maturazione delle proteine del polipeptide sintetizzato e dalla sua durata. Il piegamento dei polipeptidi sintetizzati per essere funzionali pu? richiedere pi? tempo della traslazione. ;;In un aspetto dell'invenzione, la soluzione interna della cellula artificiale e/o della cellula artificiale sintetizza una sostanza chimica, in cui le sostanze chimiche sintetizzate possono essere trovate nelle nicchie fisiologiche. In un esempio, la sostanza chimica sintetizzata ? un polipeptide. In alcuni aspetti, l'espressione priva di cellule pu? essere usata in modo intercambiabile come produzione priva di cellule di sostanze chimiche / farmaci / terapie / agenti / polipeptidi / effettori. In molti degli esempi rappresentativi, il polipeptide ? BDNF, LuxR, PFO, L-glutammato decarbossilasi (GadB), amminoacido aromatico decarbossilasi (AADC), tirosina idrossilasi (TH), GFP o alfaemolisina. In un aspetto dell'invenzione, la sintesi chimica/polipeptide/farmaco pu? essere collegata al dominio di rilevamento, in cui vengono realizzati prodotti chimici/polipeptidi utili dal punto di vista medico in seguito all'interazione con agente chimico/trigger esterno. In un altro esempio, la sostanza chimica sintetizzata ? l'acido gamma amino butirrico (GABA) o la serotonina. Secondo alcuni esempi, BDNF, GABA e serotonina possono essere trovati in nicchie fisiologiche di cellule e organismi eucarioti. Inoltre, la serotonina e il GABA possono essere definiti come origine eucariotica o procariotica, poich? GABA e serotonina possono essere utilizzati per la comunicazione battericobatterica e possono essere sintetizzati da cellule batteriche, non solo da cellule eucariotiche. In questi esempi rappresentativi, l'esperto del ramo pu? estendere notevolmente l'ambito della produzione chimica e progettare il sistema cellulare artificiale secondo l'applicazione prevista. ;;Secondo un aspetto dell'invenzione, per garantire che le parti componenti delle cellule artificiali funzionassero in condizioni fisiologiche come previsto, ? stata confermata la produzione di polipeptidi all'interno delle vescicole. La produzione intravescicolare della supercartella GFP geneticamente codificata (sfGFP, Fig. 13) e una chimera BDNF-sfGFP ? stata valutata mediante imaging a fluorescenza e citometria a flusso. Dopo 5 ore, il 19 ? 3% delle cellule artificiali ha prodotto livelli rilevabili di BDNF-sfGFP (Fig. 13B). Il confronto con una curva standard ha mostrato un'espressione robusta, con una concentrazione intravesicolare di ca. 65 ng/mL (Fig. 13E). Il fatto che circa una cellula artificiale su cinque fosse attiva in condizioni fisiologiche ha confermato la funzionalit? dell'invenzione/sistema presentato, in particolare se si considera la complessit? dell'incapsulamento del gran numero di componenti necessari per la traslazione priva di cellule. Inoltre, la produzione di sfGFP all'interno di cellule artificiali con diverse composizioni di membrana ? stata confermata dalla citometria a flusso, con un contenuto di colesterolo inferiore (Fig. 5). Pertanto, concentrazioni fisiologicamente rilevanti di polipeptidi potrebbero essere prodotte e rilasciate dalle cellule artificiali per suscitare una risposta dalle cellule eucariotiche. ;;In una forma di realizzazione dell'invenzione, una cellula artificiale e/o una soluzione interna della cellula artificiale sintetizza una sostanza chimica utile dal punto di vista medico. Le sostanze chimiche utili dal punto di vista medicinale possono essere definite come classi di molecole e polipeptidi con attivit? biologica sull'organismo ospite o sulla cellula bersaglio. In alcuni esempi dell'invenzione, le sostanze chimiche utili dal punto di vista medico erano piccole molecole o polipeptidi. Secondo l'esperto del ramo, altri tipi e classi di sostanze chimiche possono essere prodotti senza alterare l'ambito dell'invenzione. Ad esempio, pu? essere possibile lo sfruttamento del macchinario di trascrizione/traslazione per diversi polipeptidi per sintetizzare un'altra sostanza chimica rispetto alla serotonina, ad esempio la dopamina, altri neurotrasmettitori monoaminici o altre piccole molecole che possono essere trovate in nicchie fisiologiche. Qui, l'essenza ? fornire i substrati e le sostanze chimiche appropriate come materiale di partenza, che sono descritti nello scopo delle sezioni precedenti come sostanze chimiche complementari al sistema definito. In particolare, la sostanza chimica sintetizzata dalla cellula artificiale pu? essere utile anche quando ? anche di origine eucariotica e/o procariotica. Possono essere forniti esempi specifici per ciascuna sostanza chimica per le proprie nicchie fisiologiche relative al metabolismo di E. coli (come base del sistema S12 privo di cellule) e alla capacit? di traslazione. La sintesi o le parti della sintesi della sostanza chimica utile dal punto di vista medico generano preferibilmente un'uscita trascrizionale e traslazionale, che pu? essere un polipeptide che ha attivit? sulla cellula ospite/ricevente. ;;Secondo un aspetto ed esempio dell'invenzione, il BDNF sintetizzato senza cellule pu? essere la sostanza chimica utile dal punto di vista medico. In alcuni aspetti, il sistema produce livelli fisiologicamente rilevanti della sostanza chimica/polipeptide o sostanza chimica utile dal punto di vista medico. In questo schema, la reazione ottimizzata di E. coli S12 era in grado di produrre quantit? biologicamente rilevanti di BDNF. Il BDNF sintetizzato era in forma matura, senza una sequenza polipeptidica di segnale come in pro-BDNF. La funzionalit? ultima del BDNF sintetizzato privo di cellule ? stata verificata nella sezione degli esempi. Le concentrazioni in vitro di BDNF espresso senza cellule sono state determinate mediante quantificazione con immunoblot. Con concentrazioni totali di BDNF espresse libere da cellule pari a 100 ? 20 ?g/mL, in cui almeno il 5?10% della proteina solubile totale (10 ? 2 ?g/mL) era nello stato dimerico attivo (Fig. 9F). BDNF nel presente documento, ha suscitato cambiamenti fenotipici su cellule eucariotiche di cellule staminali neurali murine e cellule 293T di rene embrionale umano. Inoltre, il BDNF sintetizzato privo di cellule ha mostrato attivit? ex vivo con organocolture derivate da embrioni (Fig. 7 e 8). Ad esempio, sono stati confrontati BDNF espresso commerciale e senza cellule. Entrambi hanno attivato la via di segnalazione TrkB e indotto l'espressione di GFP nelle cellule HEK293T ingegnerizzate (Fig. 7). Parallelamente all'aumento dell'espressione di GFP, sono stati rilevati livelli elevati della proteina di segnalazione ERK1/2MAPK all'induzione con BDNF. Il BDNF espresso senza cellule ha anche promosso la differenziazione e la sopravvivenza dei neuroni in vitro con cellule mNS. Dopo 13 giorni in vitro, le cellule mNS trattate con BDNF prive di cellule si differenziano pi? ampiamente in neuroni rispetto al controllo negativo, che consisteva nella miscela di reazione priva di cellule senza il modello di DNA che codifica per BDNF (Fig. 7E). In questo esempio, il privo di cellule ha espresso BDNF, (1) ha innescato cambiamenti metabolici nelle cellule eucariotiche, (2) ha innescato la riprogrammazione trascrizionale delle cellule bersaglio/riceventi e (3) ha provocato un cambiamento fenotipico sulle cellule bersaglio/riceventi. Inoltre, il BDNF espresso senza cellule ? protetto dall'apoptosi, come valutato dal conteggio delle cellule immunocolorate per la forma scissa di Caspase-3 (Fig. 7G). Infine, la capacit? del BDNF espresso senza cellule di promuovere la differenziazione dei neuroni ex vivo ? stata misurata valutando l'attivit? acuta del BDNF sull'allungamento degli assoni. Utilizzando una strategia di imaging dal vivo a singolo assone (Fig. 8), l'applicazione nel bagno di BDNF espresso senza cellule ha provocato un aumento del 40% della velocit? di crescita entro 35 minuti di esposizione. ? importante notare che a causa dell'elevata sensibilit? degli assoni ex vivo alla concentrazione di BDNF, non ? stato possibile con l'attuale formulazione di cellule artificiali impostare un significativo esperimento analogo. Tuttavia, per tutti e tre i sistemi modello, i dati raccolti con BDNF espresso senza cellule erano paragonabili a quelli del BDNF commerciale. ;;In un esempio dell'invenzione, GABA ? sintetizzato in sistemi privi di cellule come una sostanza chimica utile dal punto di vista medico. A tal fine, ? stato impiegato l'enzima E. coli L-glutammato decarbossilasi (GadB) (Fig. 10A). GadB ? responsabile dell'eliminazione dello stress acido in E. coli e la sua espressione ? regolata principalmente da condizioni gastriche, pH <2 - 6. GadB utilizza L-glutammato come substrato e lo converte in GABA. Sebbene si trovi nel citosol al di sopra del pH 7,0, ? selettivamente localizzato sulla membrana e sul periplasma in seguito a stress acido. L'enzima utilizza residui di L-glutammato e arginina nel suo sito attivo e dipende dal cofattore piridossal-5?-fosfato (PLP, vitamina B6), per cui il PLP pu? essere integrato come componente aggiuntivo del sistema privo di cellule. L'attivit? dell'enzima ? presente solo al di sotto del pH 7.0. Per la funzionalit? in condizioni acide ? necessario un riarrangiamento conformazionale nel sito attivo. In una forma di realizzazione, la reazione S12 ? stata prima acidificata fino a 6,5-7,0 con HC1 concentrato (1 M). L'integrit? della reazione S12 ? stata valutata empiricamente a occhio per la presenza o l'assenza di precipitazione torbida biancastra. La reazione S12 intatta/funzionale non dovrebbe avere precipitazione torbida biancastra. Controllato da un forte promotore trascrizionale tac, l'espressione del gene sfGFP ? stata verificata in condizioni acide, indicando che un'acidit? estrema non era in grado di inibire la funzionalit? della reazione priva di cellule (pH = ~ 6.5). ? stata inoltre dimostrata la sintesi/espressione priva di cellule di GadB, sia in presenza che in assenza di espressione genica dell'alfa-emolisina (Fig. 10C). I livelli di GABA nelle reazioni prive di cellule sono stati rilevati dalle fasi enzimatiche descritte nella Fig. 10B e dalle condizioni di reazione secondo la letteratura, sezione sperimentale (Fig. 10B). Impiegando questo test fluorometrico, concentrazioni di GABA intorno a 55 ?M dopo 6 ore di espressione/incubazione (Fig. 10D). Questi livelli di produzione di GABA in vitro sono probabilmente superiori ai requisiti minimi per esercitare un'attivit? biologica, dove la potenza abituale ? intorno a livelli di ?M molto bassi. I livelli di sintesi di GABA si sono abbassati a circa 15 ?M in presenza di espressione di alfa-emolisina, indicando che la disponibilit? dell'enzima GadB ? stata ridotta a causa del consumo condiviso di risorse limitate da parte di due cassette di espressione genica (Fig. 10D). ;;In un altro esempio dell'invenzione, il sistema privo di cellule pu? produrre un'altra sostanza chimica utile dal punto di vista medico, che ? la serotonina. La sintesi privo di cellule della serotonina avviene in due fasi enzimatiche. In primo luogo, l'idrossilazione dell'amminoacido aromatico triptofano, in modo cofattore e metallo dipendente (Fig. 11). La fase di idrossilazione ? il fattore limitante della velocit? per l'efficienza complessiva della biosintesi, poich? la reazione e l'attivit? enzimatica sono piuttosto labili alle condizioni cellulari, vale a dire microambienti riducenti/ossidanti, e in particolare alla disponibilit? locale dei substrati. Inoltre, ? noto che il cofattore tetraidrobiopterina (BH4) ? sensibile alle condizioni ossidanti; pertanto, nel nucleo catalitico dell'enzima si ritiene che condizioni relativamente anossiche siano mantenute per la massima attivit?. Il secondo passaggio nella biosintesi della serotonina ? la decarbossilazione del 5-idrossitriptofano (5-HTP) in serotonina (5-HT). Questo passaggio richiede anche un cofattore unico, piridossal-5?-fosfato (PLP o vitamina B6). Le evidenze sperimentali esistenti in vivo e in vitro suggeriscono che una volta effettuata la fase di idrossilazione, i prodotti intermedi si catalizzano in serotonina. Prendendo in considerazione i fattori limitanti la velocit? di entrambe le fasi, i geni dell'enzima del primo stadio sono stati posti sotto il controllo di un promotore trascrizionale pi? forte rispetto agli enzimi del secondo stadio. Simile al riarrangiamento in BDNF e LuxR, le limitate risorse metaboliche verso la produzione di idrossilasi invece di decarbossilasi. A tal fine, i costrutti genetici per il forte promotore di E. coli tet e i promotori trascrizionali del registro iGEM J23101 sono stati utilizzati per idrossilasi e AADC. In questo modo, sono stati prodotti livelli maggiori di idrossilasi in reazioni prive di cellule, piuttosto che AADC (Fig. 11B). L'espressione priva di cellule degli enzimi biosintetici ? stata rilevata mediante immunoblotting basato su anticorpi contrassegnati da FLAG. Nelle prove successive, questa riorganizzazione ? stata conservata. Per un altro aspetto dell'invenzione, una linea cellulare responsiva a CREB di cellule HEK293T ? stata generata per testare la reattivit? BDNF. Poich? le cellule HEK293T esprimevano intrinsecamente bassi livelli di recettore della serotonina come 5-HT7, la linea cellulare risultante CREB-responsive, GFP che esprimeva potrebbe essere stata anche sensibile alla serotonina. Tenendo presente ci?, la reattivit? della linea cellulare HEK293T ingegnerizzata ? stata verificata in base alla serotonina disponibile in commercio (Fig. 11C). Dopo aver dimostrato la risposta funzionale dalla linea cellulare, la reazione priva di cellule ? stata assemblata per gli enzimi di biosintesi della serotonina, testata e verificata per la risposta fluorescente nella linea cellulare reporter HEK293T (Fig. 11D). ;;Secondo un altro aspetto dell'invenzione, una cellula artificiale e/o una soluzione interna della cellula artificiale sintetizza un polipeptide associato alla membrana. In questo contesto, il polipeptide associato alla membrana pu? essere utilizzato per scopi di rilascio del contenuto interno o rilevamento di agenti esterni. Ad esempio, il polipeptide che forma i pori pu? essere PFO o alfa-emolisina. In un altro aspetto dell'invenzione, la sintesi chimica / polipeptide / farmaco pu? essere collegata al dominio di rilevamento, in cui sostanze chimiche/polipeptidi utili dal punto di vista medico vengono prodotti su PFO trigger come analogia alla perforina eucariotica, come killer di cellule bersaglio, simile a come i linfociti uccidono le cellule cancerose nei tumori maligni. Nel presente documento, il contenuto di colesterolo nella membrana non ? un prerequisito per la funzionalit? come discusso e dimostrato in precedenza. La funzionalit? e l'utilizzo per il rilascio del contenuto interno sono dimostrate sia per il PFO che per l'alfa-emolisina. Per il PFO, il rapporto ottimale del colesterolo all'interno della membrana ? risultato essere 1: 0,6 per POPC: colesterolo. ;Tuttavia, 1: 0,85 (Fig. 14C) potrebbe funzionare anche 1: 0,6 (Fig. 14D), pertanto, il primo rapporto ? stato mantenuto come costante per gli esempi seguenti. La funzionalit? dell'alfaemolisina non dipendeva dal contenuto di colesterolo, tuttavia la proteina che formava i pori funzionava meglio in presenza di colesterolo (Fig. 14E). Poich? il PFO interagisce con i gruppi idrossilici del colesterolo vicino alla sua estremit? C-terminale, sarebbe stato necessario valutare l'influenza del tag C-terminus sulla funzionalit? del PFO. Il costrutto predefinito di PFO conteneva il tag FLAG N-terminale e la funzionalit? del polipeptide ? stata verificata in precedenza. Secondo la citometria a flusso e i saggi fluorometrici, i polipeptidi di fusione C-terminale all'interno del polipeptide associato alla membrana possono anche consentire l'oligomerizzazione spontanea e quindi il rilascio del contenuto interno (Fig. 14E). ;;Secondo un altro esempio dell'invenzione, lo scopo ultimo a seguito della sintesi del GABA da abbondante fonte di L-glutammato in reazioni prive di cellule era quello di rilasciarlo successivamente dai pori dell'alfa-emolisina. Se la produzione di GadB ? stata controllata da un forte promotore trascrizionale e la produzione di alfa-emolisina ? stata controllata da un promotore trascrizionale di media intensit? (registro iGEM, pJ23117), i protocolli di sintesi chimica e di rilascio potrebbero aver fornito un intervallo di tempo nei livelli di espressione genica e separazione dei due eventi. In tal modo, con l'aspettativa di una sintesi efficiente del GABA entro la prima ora e della produzione di ?alfa-emolisina nei minuti o nelle ore successive, pu? facilitare il raggiungimento di una concentrazione critica nel sistema efficiente formazione dei pori e rilascio di sostanze chimiche. Per quanto riguarda la funzionalit? del sistema, i livelli di espressione di GadB e ?alfa-emolisina sono stati dimostrati mediante western blotting in condizioni acide, a pH ~ 7.0, sia individualmente che complessivamente (Fig. 10D). GadB ha mostrato diverse coppie di livelli di proteine pi? elevati rispetto all'alfa-emolisina, suggerendo un altro aspetto dell'invenzione per la sintesi pre-programmata basata sul tempo e il rilascio delle sostanze chimiche. ;;Secondo un altro aspetto dell'invenzione, il polipeptide associato alla membrana pu? essere utilizzato per rilevare un segnale/agente esterno. Questo tipo specifico di polipeptide pu? contenere un recettore e domini chinasi adatti per l'ingegneria proteica. Ad esempio, il dominio del recettore pu? essere determinato da un diverso background metabolico ed essere fuso con domini citosolici dell'istidina chinasi per creare polipeptidi chimerici. Un sistema contenente un'operazione logica simile per avviare un sistema di trasduzione del segnale dovuto alla fosforilazione da chinasi ? chiamato sistema a due componenti o sistema di trasduzione del segnale a due componenti. In una forma di realizzazione, l'invenzione pu? includere tale sistema a due componenti per identificare bersagli extracellulari e sostanze chimiche fisiologiche che possono essere trovate in nicchie eucariotiche e/o procariotiche. Ci? che si intende con la parola "extracellulare" ? un qualsiasi agente che risiede al di fuori del plasma cellulare -o se adattato all'ambito dell'invenzione- membrana cellulare artificiale. ;;In un esempio, i domini di Tar e EnvZ batterici sono stati utilizzati come polipeptidi chimerici e la funzionalit? ? stata verificata da pi? letture all'interno dell'ambiente privo di cellule. Tar-EnvZ ? un polipeptide chimerico con un dominio extracellulare e uno citosolico. Ci? che si intende con la parola "dominio extracellulare" ? un gruppo di residui amminoacidici rivolti verso l'esterno della membrana plasmatica cellulare -o se adattato allo scopo dell'invenzione- membrana cellulare artificiale. Per descrivere meglio, il Tar ? una proteina batterica intermembrana che ha un ruolo cellulare come recettore degli amminoacidi, rivolta verso l'esterno del periplasma di E. coli. Il catrame pu? entrare in contatto fisico e riconoscere specifiche catene laterali di amminoacidi. Un noto compito cellulare particolare di questa proteina di membrana ? quello di rilevare le concentrazioni ambientali di L-aspartato e L-glutammato. In risposta, Tar attiva la via di segnalazione a due componenti per generare un movimento chemiotassi basato sulla disponibilit? della sostanza chimica. Per fare ci?, questo polipeptide passa lungo il segnale rilevato e si amplifica all'interno del citosol. In forma non chimerica (cio? non Tar-EnvZ), Tar ha anche una parte del dominio periplasmico/dominio transmembrana/dominio HAMP simile ai domini citosolici di EnvZ, che sono accoppiati a istidina chinasi responsabili della fosforilazione dei fattori trascrizionali e del controllo flagellare proteine. EnvZ ? un'altra proteina intermembrana rivolta verso il periplasma di E. coli. EnvZ ? utilizzato principalmente come proteina osmoregolatrice che rileva i cambiamenti nella pressione osmotica e si attiva al variare delle concentrazioni di sale citosoliche e ambientali (Cai & Inouye, 2002). EnvZ ha un dominio citosolico, cio? un'istidina chinasi, che a sua volta trans-fosforila il fattore di trascrizione OmpR. Quando fosforilato, OmpR si lega a un dominio regolatorio chiamato promotore OmpC e attiva l'espressione genica correlata all'osmoregolazione. Sia Tar che EnvZ hanno dimostrato di avere topologie di membrana e domini transmembrana simili, aprendo possibilit? di strategie di ingegneria polipeptidica chimerica, in cui i domini dei sensori esterni sono adatti e utilizzati per il riconoscimento della catena laterale del polipeptide e le interazioni proteina-proteina. Il sistema EnvZ-OmpR ? stato ampiamente riconosciuto come un esempio primitivo di meccanismo di trasduzione del segnale, simile ai recettori accoppiati a proteine G, in termini di elaborazione e amplificazione del segnale. Per fornire una possibile strategia di ingegneria del polipeptide chimerico, un polipeptide chimerico basato su EnvZ era stato precedentemente utilizzato come regolatore optogenetico con un'uscita dipendente dalla luce in E. coli. In questo esempio, il sistema basato su OmpR-EnvZ ? stato accoppiato a molecole cromoforiche fotosensibili di varie linee batteriche. Dopo l'eccitazione/esposizione con lunghezze d'onda specifiche della radiazione elettromagnetica (luce), i fotorecettori ingegnerizzati hanno risposto alle luci verdi e rosse, consentendo l'auto-fosforilazione di OmpR, che controllava l'espressione genica a valle. Con la presenza dell'enzima Cph8 che genera il pigmento, che converte l'eme in ficocianobilina (PCB), sono stati generati modelli di crescita batterica attivati dalla luce controllando l'espressione della betagalattosidasi (LacZ). In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, polipeptidi attivati dalla luce simili possono essere utilizzati per innescare il rilascio del contenuto interno dalle cellule artificiali. In altri aspetti dell'invenzione, i domini esterni di polipeptidi simili possono essere utilizzati per l'interazione proteina-proteina, poich? i residui di amminoacidi possono gi? essere rilevati, come L-glutammato, L-aspartato, L-alanina, L-serina e L -treonina. ;;In un esempio dell'invenzione, la proteina chimerica Tar-EnvZ (TaZ) si ? comportata come previsto nei confronti degli amminoacidi, ad es. L-glutammato e L-aspartato. Nelle condizioni di saturazione, TaZ ? stato proposto che il dominio citosolico arresti la fosforilazione, quando si trova di fronte a concentrazioni eccessive di ligando. Per generare un sistema reporter privo di cellule per il rilevamento di L-glutammato, sfGFP o Firefly luciferase (Fluc) ? stato posto sotto il controllo trascrizionale del promotore OmpC, controllato dal fattore trascrizionale OmpR (Fig. 16). Con questa configurazione, nel sistema reporter sfGFP, ? stato osservato un aumento di due volte del segnale sfGFP (Fig. 16). Al fine di ottenere livelli di segnale di fondo ridotti e ridurre al minimo la diafonia, la funzionalit? del sistema in PURExpress? ? stata verificata in un ambiente di amminoacidi ridotto (Fig. 16). I livelli di fondo potenzialmente elevati di autoattivazione del dominio Tar-EnvZ sono stati aggirati dalla preparazione di una miscela di aminoacidi priva di L-aspartato e L-glutammato ed ? stata osservata una differenza di espressione genica quasi tripla (Fig. 16). ? importante sottolineare che qui il gene TaZ era controllato da un forte promotore trascrizionale J23101 (registro iGEM) e il sistema reporter del promotore OmpC dell'espressione genica Fluc ? stato utilizzato per migliorare i limiti di sensibilit? del sistema (Fig 16). La differenza di concentrazione tra 500 ?M e 50 ?M ? stata sufficiente per innescare la fosforilazione di OmpR, che ? stata aggiunta alla miscela PURExpress come componente ricombinante espresso e purificato. ;;Esempi ;;Agenti esterni di senso di cellule artificiali e sostanze chimiche interne di rilascio ;;In una forma di realizzazione dell'invenzione, la soluzione interna della cellula artificiale e/o della cellula artificiale rileva una sostanza chimica. In un esempio, la sostanza chimica rilevata innesca una riprogrammazione trascrizionale nella cellula artificiale. Le sostanze chimiche possono essere trovate in nicchie fisiologiche di origine eucariotica e/o procariotica e che ? compatibile con l'ambito dell'invenzione. In un esempio, 3OC6 HSL o qualsiasi altra molecola di rilevamento del quorum potrebbe essere integrata con le cellule artificiali. Nelle altre forme di realizzazione, il rilevamento di amminoacidi, neurotrasmettitori come L-glutammato o ioni potrebbe seguire un percorso d'azione simile ma diverso. Il sensore pu? essere parte di un elemento che risponde agli stimoli. La reattivit? agli stimoli della cellula artificiale pu? essere attivata da agenti esterni, come sostanze chimiche o luce. I sistemi attivati dalla luce sono gi? stati descritti e facili da integrare nei moduli della presente invenzione. Come descritto sopra, un sistema bicomponente riproposto pu? essere attivato dalla luce. Il rilascio di sostanze chimiche sintetizzate/polipeptidi/farmaci pu? anche essere innescato da agenti esterni. Una simile influenza genetica del rilascio di polipeptidi ? dimostrata di seguito, nell'ambito della presente invenzione. Secondo ancora un altro esempio, una cellula artificiale pu? rilasciare sostanze chimiche di origine eucariotica e/o procariotica, che possono essere trovate in nicchie fisiologiche. I dati forniti supportano il fatto che la sostanza chimica rilasciata pu? essere sintetizzata all'interno della cellula artificiale o essere integrata come componente purificato, nell'ambito degli esperimenti di controllo degli esempi seguenti. La sostanza chimica purificata fornita esternamente viene incorporata insieme ad altri componenti durante la generazione delle cellule artificiali come descritto sopra. ? stato descritto un processo compatibile con la presente invenzione perch? la sostanza chimica rilasciata ? una piccola molecola o un polipeptide. In ancora un altro aspetto ed esempio dell'invenzione la cellula artificiale che rilascia sostanze chimiche solo dopo aver rilevato un'altra sostanza chimica. In un altro esempio, il ritardo di espressione basato sul tempo nel sistema pu? essere utilizzato come riprogrammazione per rilasciare il contenuto interno come meccanismo alternativo, dopo aver raggiunto una concentrazione critica all'interno della cellula artificiale. Questa modalit? di erogazione pu? essere ottenuta dalla libreria di promotori fornita dalla presente invenzione. ;;In questo esempio, abbiamo cercato di caratterizzare la formazione di pori funzionali all'interno delle cellule artificiali. In primo luogo, i pori PFO funzionali sono stati confermati quantificando il rilascio di fluoroforo mediante spettrofluorometria, citometria a flusso e cromatografia ad esclusione dimensionale (Fig. 17 e 23). Quindi, ? stata confermata l'espressione priva di cellule all'interno delle cellule artificiali. Il co-incapsulamento del sistema di espressione senza cellule con GFP purificato ha portato al rilascio regolato della proteina fluorescente dalle cellule artificiali, confermando che il PFO espresso privo di cellule potrebbe rilasciare polipeptidi globulari (Fig. 23). Dopo 16 h in presenza di 3OC6 HSL, ? stato osservato un aumento di quasi 3 volte della fuga di GFP dalle cellule artificiali rispetto alle cellule artificiali in assenza di 3OC6 HSL (Fig. 23C e Fig. 23D). Nella Fig. 23, i dati/controllo positivi "PFO puro" rappresentano l'aggiunta di PFO espresso e purificato esternamente in modo ricombinante. Cio?, non c'erano limitazioni imposte dall'efficienza dell'incapsulamento quando il PFO veniva aggiunto all'esterno delle cellule artificiali. ;Supponendo che anche se tutte le cellule artificiali fossero funzionali, il numero di PFO sintetizzato sarebbe molto inferiore a 4 ?M, che ? la concentrazione di PFO aggiunto esternamente. Il volume interno totale di tutte le cellule artificiali era al massimo di 10 ?L, dove sono stati utilizzati 10 ?L di soluzione acquosa per produrre le goccioline di emulsione di acqua in olio e notando che le reazioni di trascrizione/traslazione in vitro producono tipicamente 2-3 nM di polipeptide. Anche se si presume che 10 nM di PFO siano stati sintetizzati dall'interno di tutte le cellule artificiali, il numero di monomeri di PFO sarebbe di circa 1010. Cio?, nella migliore delle ipotesi, molecole di PFO 10.000 volte inferiori rispetto a quelle aggiunte esternamente per il controllo reazione PFO, che ? 1014 monomeri polipeptidici. Pertanto, si conclude che la frazione di cellule artificiali che era in grado di sintetizzare proteine (Fig. 13) era coerente con la frazione di cellule artificiali che rilasciavano il carico tramite l'attivit? del PFO espresso. Le titolazioni con PFO ricombinante espresso e purificato erano coerenti con la formazione di pori funzionali con meno di 30 nM di PFO (Fig. 17E). I dati di tossicit? con cellule HEK293T (Fig. 22) e i dati di funzionalit? con cellule artificiali (Fig. 23) insieme indicavano che le cellule artificiali producevano e/o perdevano PFO nell'intervallo nanomolare. L'attuale formulazione ? robusta e funzionale in condizioni fisiologiche. ;;Secondo un aspetto dell'invenzione, il polipeptide formante pori pu? essere digerito per l'eradicazione completa delle cellule artificiali. I dati hanno dimostrato che i pori del PFO erano in grado di rilasciare macromolecole intrappolate (Fig. 23) che erano coerenti con le cellule artificiali che rilasciavano contenuti all'induzione con 3OC6 HSL e non a causa della decomposizione della membrana. Inoltre, la caratterizzazione della citometria a flusso ha rivelato che l'etichetta C-terminale del polipeptide che forma i pori non si associava alle capacit? di rilascio del contenuto interno (Fig. 24). In un esempio, la digestione proteolitica aspecifica del polipeptide che forma i pori ha dimostrato la massimizzazione del rilascio del contenuto interno fino a ca. ;85% in determinate occasioni (Fig.25 e 26). In questo modo, se una ipotetica risposta immunitaria deriva dall'ospite o dalla cellula eucariotica, le cellule artificiali possono essere eliminate dal sistema il pi? velocemente possibile, senza innescare ulteriori effetti negativi. In un altro aspetto dell'invenzione, il sistema pu? integrarsi o interagire con il sistema immunitario ospite. Ad esempio, la sintesi chimica/polipeptide/farmaco pu? essere collegata al dominio di rilevamento, in cui vengono prodotti prodotti chimici/polipeptidi utili dal punto di vista medico su trigger. Qui, il PFO ? analogo al polipeptide perforinico delle cellule immunitarie eucariotiche, come agente killer delle cellule bersaglio, simile a come i linfociti uccidono le cellule cancerose nei tumori maligni. Tuttavia, in questo particolare esempio, le concentrazioni di PFO sono state regolate per un effetto non tossico, quindi il PFO non ? stato utilizzato come agente di uccisione. ;;Le cellule artificiali guidano la differenziazione delle cellule staminali neurali ;;Le cellule artificiali costruite come descritto sopra erano in grado di influenzare la differenziazione e la maturazione delle cellule staminali neurali (mNS) derivate da cellule staminali embrionali di topo. In 19 giorni, le cellule artificiali sono state scambiate ogni 24 h in modo da soddisfare la crescente domanda di BDNF durante la differenziazione delle cellule mNS. Questo ? il motivo per cui le vecchie cellule artificiali venivano continuamente rimosse e le nuove cellule artificiali venivano continuamente fornite. I dati di stabilit? erano coerenti sul fatto che le cellule artificiali non si sono interrotte entro 24 ore; tuttavia, come misura precauzionale, le vecchie cellule artificiali sono state rimosse e sostituite con nuove cellule artificiali ogni 24 h (Fig. 27A). Al termine di questo protocollo in vitro di 19 giorni (Fig. 27A), le cellule mNS hanno mostrato chiari segni di differenziazione in neuroni, come rivelato dall'aumento della percentuale di neuroni sovraesprimenti ?III-Tubulina (Fig. 27B e 27C). L'efficienza della differenziazione neurale ? stata determinata dal conteggio delle cellule neuronali mediante immunocolorazione per i marcatori neuronali pan-neuronali e neuronali maturi ?III-Tubulina e Proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2), rispettivamente. I segnali sovrapposti di MAP2 e ?III-Tubulina hanno confermato la specificit? dell'immunocolorazione e della marcatura con ?III-Tubulina dei neuroni maturi (Fig. 27B e Fig. 28A). Al contrario, quando le cellule artificiali non sono state indotte a formare pori con 3OC6 HSL, i livelli di differenziazione di fondo sono rimasti gli stessi di quando sono stati incubati con cellule artificiali che non sintetizzano BDNF (differenza ? 1%). Livelli di differenziazione di fondo simili sono stati osservati quando solo PBS ? stato aggiunto al mezzo di differenziazione (21 ? 3% della popolazione complessiva). Il confronto ha dimostrato che il BDNF sintetizzato privo di cellule ? efficiente quanto il BDNF disponibile in commercio (Fig. 28F e 28G). Inoltre, i dati hanno suggerito che i polipeptidi complementari forniti esternamente che sono disponibili in commercio e/o componenti purificati possono essere incapsulati in cellule artificiali ed essere rilasciati in modo regolato e controllato. Inoltre, il BDNF rilasciato dalle cellule artificiali ha inibito l'apoptosi (Fig. 28B e 28C), compatibilmente con l'attivit? biologica della molecola di segnalazione sintetizzata. Se esposte a condizioni tossiche durante la differenziazione neuronale, le cellule mNS potrebbero dare origine a cellule non neuronali, cio? astrociti. Tuttavia, non ? stato osservato alcun effetto di questo tipo (Fig. 28D e 28E). I dati suggeriscono che le cellule artificiali non rappresentano una tossicit? sostanziale per le cellule mNS. ;;Se la funzionalit? delle cellule artificiali era dovuta alla sintesi e al rilascio di BDNF, allora dovrebbe essere possibile rilevare l'attivazione delle vie di segnalazione responsive al BDNF nelle cellule staminali neurali. A tal fine, le colture di cellule mNS sono state differenziate per 18 giorni in presenza di cellule artificiali e analizzate per l'attivazione della segnalazione TrkB-BDNF. La differenziazione in neuroni e la fosforilazione delle proteine della via di segnalazione sono state valutate mediante immunoblotting per ?III-Tubulina, fosfo-PLC?1 e fosfo-ERK1/2MAPK il 19 ? giorno (Fig. 27A e 27D). Il rilascio di BDNF dalle cellule artificiali ha indotto un aumento dei PLC?1 fosforilati e ERK1/2MAPK (normalizzati a totale ? PLC?1 e totale ? ERK1/2MAPK) (Fig. 2D). ? stato riscontrato che ?III-Tubulina, fosfo-PLC?1 e fosfo-ERK1/2MAPK aumentano rispettivamente di 1,8?, 2? e 1,5 volte. I dati erano coerenti con la differenziazione delle cellule mNS risultante dalla stimolazione di TrkB e dall'attivazione dei percorsi a valle. Prese insieme, le cellule artificiali hanno guidato la differenziazione delle cellule staminali neurali in neuroni maturi in risposta a un segnale ambientale. La funzionalit? dell'invenzione era dovuta alla sintesi e al rilascio di BDNF e non ad altri componenti della cellula artificiale. Ad esempio, il rilascio di BDNF era dovuto all'attivit? del PFO e non alla degradazione delle cellule artificiali. ;;Dopo l'assemblaggio delle cellule artificiali, si stima che sia stato mantenuto solo il 10% della reazione priva di cellule inizialmente incapsulata, che corrispondeva a un volume di 1 ?l. Il volume interno di tutte le cellule artificiali sommate era di circa 1/500 del volume del mezzo di crescita, tenendo conto delle perdite dovute alla manipolazione. L'incapsulamento del contenuto interno ha portato a ca. Riduzione di 3,5 volte della quantit? di proteine sintetizzate rispetto alle reazioni batch (Fig. 6C). Poich? il 20% della proteina sintetizzata ? stata rilasciata dalle cellule artificiali (Fig. 27C), la concentrazione finale di BDNF era 2500 volte inferiore. Tuttavia, il protocollo di differenziazione sfruttato ha aumentato del 50% la quantit? di cellule artificiali fresche aggiunte ogni 3 giorni. Pertanto, la concentrazione di BDNF rilasciato ? stata stimata in modo prudenziale a 50 ? 10 ng/mL nel corso dell'intero protocollo di differenziazione cellulare mNS. Questo valore era in accordo con lo sfGFP prodotto all'interno delle vescicole (circa 65 ng/mL, Fig. 13), rapporti precedenti di altri sulla sintesi proteica nelle vescicole e protocolli di differenziazione precedentemente ottimizzati. I dati suggeriscono che le cellule artificiali possono sintetizzare e rilasciare concentrazioni fisiologicamente rilevanti di polipeptidi biologicamente attivi per suscitare cambiamenti fenotipici sulle cellule di mammifero. ;;Le cellule artificiali comunicano con le cellule HEK293T ingegnerizzate ;;In un esempio dell'invenzione, la funzionalit? delle cellule artificiali ? stata ulteriormente confermata con una linea cellulare di rene embrionale umano (HEK293T) progettata per esprimere GFP in risposta a BDNF (Fig. 30A). La linea cellulare sovra-esprime il recettore BDNF Tropomiosina chinasi B (TrkB) ed ? stata progettata per rispondere a livelli aumentati di CREB fosforilata (proteina di legame dell'elemento di risposta dell'AMP ciclico) (Fig. 29). L'attivazione di CREB mediante fosforilazione era attesa attraverso il segnale TrkB-BDNF, portando all'attivazione trascrizionale di geni sotto il controllo di un promotore CRE, in questo caso GFP. In altre parole, l'espressione di GFP verrebbe rilevata solo se le cellule artificiali sintetizzassero e rilasciassero BDNF in risposta a 3OC6 HSL. A causa della natura policlonale della linea cellulare finale, erano attesi livelli variabili di espressione di GFP dopo l'induzione. Per valutare meglio i cambiamenti nell'espressione di GFP, le cellule HEK293T sono state analizzate a livello di popolazione. Rispetto al controllo negativo, in cui le cellule artificiali hanno prodotto e secreto una proteina inerte, ? stato rilevato un aumento del 45 ? 4% nel numero di cellule HEK293T che esprimevano GFP quando ? stato aggiunto il trigger chimico 3OC6 HSL (Fig. 30B e 30C). Al contrario, l'incubazione con cellule artificiali che non esprimevano i pori delle proteine ha prodotto solo un aumento del 10 ? 7% della popolazione di cellule fluorescenti (Fig. 30C). Prese insieme agli esempi precedenti, le cellule artificiali erano in grado di suscitare i cambiamenti fenotipici desiderati nelle cellule umane attraverso il rilascio controllato di BDNF. ;;Discussione ;;Secondo un aspetto dell'invenzione, un sistema o una composizione possono essere utilizzati in medicina. L'invenzione e gli esempi descrivevano un metodo per influenzare il destino e il comportamento cellulare dei mammiferi senza un intervento genetico. A tal fine, ? stato dimostrato che i componenti della cellula artificiale o della pluralit? di cellule artificiali rispondono a un agente esterno e successivamente rilasciano una sostanza chimica terapeutica e/o medicinale. Lo scopo dei risultati attuali ? solo esemplificativo di ci? di cui ? capace il sistema proofof-concept qui descritto. Ad esempio, il polipeptide sintetizzato era BDNF, che ? un membro di un peptide di segnalazione, un fattore di crescita. La funzionalit? del polipeptide BDNF indica la funzionalit? di classi uguali o simili di polipeptidi derivanti da cellule artificiali e reazioni prive di cellule. Gli esempi estesi possono essere citochine, fattori di crescita e altri piccoli peptidi di segnalazione, che possono passare attraverso il polipeptide transmembrana sintetizzato delle cellule artificiali. Ad esempio, l'uso di un polipeptide globulare generico come la proteina fluorescente verde (GFP), indica la versatilit? dell'invenzione e la compatibilit? per adattare la tecnologia ad altri usi per l'esperto del ramo. Le proteine globulari rilasciate dalla cellula artificiale qui in questa invenzione stimolano e attivano le principali vie di segnalazione eucariotica. Non ? stato riportato alcun esempio di questo tipo di associazione della via di segnalazione in letteratura. Pertanto, le applicazioni estese dell'invenzione possono essere associate con gli altri peptidi di segnalazione e i loro componenti di segnalazione a valle associati. Gli esempi e l'elenco di tali percorsi e componenti sono descritti nelle tabelle 2-7. Spesso, gli esempi forniti nell'elenco condividono componenti strutturalmente e funzionalmente simili o identici che sono stati manipolati dall'attuale esempio dell'invenzione. ? quindi naturale conseguenza trovare un uso dell'invenzione correlato al trattamento e/o alla gestione dei sintomi, magari insieme ad altri elementi terapeutici. In un esempio dell'invenzione, le cellule artificiali possono essere utilizzate in una variet? di disturbi neurologici non solo in quelli che coinvolgono la differenziazione neurale. ;;Secondo ancora un altro aspetto dell'invenzione, il sistema pu? essere utilizzato per la somministrazione controllata del farmaco. Il rilascio di sostanze chimiche dalle cellule artificiali pu? essere considerato controllato perch? le cellule artificiali rispondono agli stimoli e possono essere modulate da agenti esterni. In una forma di realizzazione, una composizione comprende una pluralit? di cellule artificiali e una pluralit? di cellule eucariotiche. La cellula eucariotica pu? essere una cellula umana o mammifera o un intero organismo. In un aspetto dell'invenzione, la pluralit? di cellule artificiali pu? essere descritta come tessuti artificiali. Cellule artificiali o tessuti artificiali possono comportarsi come complementari alle cellule eucariotiche. Cellule artificiali o tessuti artificiali possono comportarsi in modo analogo alle cellule eucariotiche artificiali. Cellule artificiali o tessuti artificiali possono comportarsi in modo analogo alle cellule del sangue artificiali se contengono componenti enzimatici o chimici necessari. In una forma di realizzazione, il processo di rilascio del farmaco pu? suscitare cambiamenti fenotipici nelle cellule eucariotiche. I cambiamenti fenotipici possono essere riprogrammazione metabolica o (epi) genetica come in caso di mancanza di risposta insulinica, ipossia, neoplasia, risposte infiammatorie come effetti secondari e alterazioni del livello di espressione genica come nel caso di neoplasia, disordini metabolici, tossicodipendenza o destino cellulare determinazione, come malattie neurologiche, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson o differenziazione delle cellule staminali neurali in neuroni maturi o qualsiasi altro processo cellulare e processo decisionale che include la segnalazione cellula-cellula e le vie di trasduzione del segnale. La segnalazione extracellulare prevede generalmente le seguenti fasi: sintesi e rilascio della molecola di segnalazione da parte della cellula di segnalazione; trasporto del segnale alla cellula bersaglio; legame del segnale da parte di un recettore specifico che porta alla sua attivazione e infine all'inizio delle vie di trasduzione del segnale. All'interno degli esempi e delle descrizioni dell'invenzione, le cellule artificiali erano in grado di influenzare tutti questi passaggi e la risposta cellulare finale. Di conseguenza, i processi di tipo simile, che coinvolgono le molecole di segnalazione, i loro bersagli, il loro legame e il potenziamento del segnale sono di diretta somiglianza con lo scopo dell'invenzione e rientrano nelle aree di applicazione biologica delle cellule artificiali erano funzionali. A tal fine, le Tabelle 3-7 includono e descrivono polipeptidi di segnalazione simili che possono essere utilizzati dalla classe di cellule artificiali qui descritta, la classe di recettori simile su cui le cellule artificiali possono avere un'influenza diretta, l'elenco di CREB-associati o CREB-simili cambiamenti del livello di espressione genica associati al fattore di trascrizione. La tabella 3 riassume i recettori tirosin chinasi simili a TrkB. La Tabella 4 riassume i peptidi di segnalazione simili a BDNF. La Tabella 5 riassume gli elementi che regolano l'espressione genica simili a CREB. La Tabella 6 riassume i recettori dei neurotrasmettitori. La Tabella 7 riassume altri polipeptidi di segnalazione che utilizzano percorsi di segnalazione simili e meccanismi qui dimostrati. Tutti gli elenchi sono esemplificativi e i componenti non possono essere limitati a ci? che viene presentato nel modello di prova del concetto funzionante dell'invenzione. La Tabella 8 riassume l'elenco delle vie di segnalazione note nel metabolismo umano. Le informazioni fornite nelle tabelle 2-8 possono essere trovate in linea tramite il World Wide Web. ;;La segnalazione cellulare e la manipolazione dell'espressione genica, alterando cos? l'aspetto fenotipico dei sistemi ospiti, condividono caratteristiche comuni. Spesso, processi cellulari molto distinti e diversificati sono controllati attraverso nodi metabolici e di segnalazione simili. Segnalazione del fattore di crescita e proteine correlate alla trasduzione del segnale che sono classificate in diverse famiglie sulla base delle loro cellule bersaglio, funzioni, strutture ed evoluzione molecolare. Le reti di interazione proteina-proteina associate, gli schemi di fosforilazione e le alterazioni nei livelli di espressione genica sono tutti correlati a meccanismi simili di trasduzione del segnale. La presente invenzione riassume solo un'applicazione esemplificativa di una grande classe di fattori di trascrizione, cio? la proteina di legame dell'elemento di risposta dell'AMP ciclico (CREB). CREB e/o simili elementi correlati alla trasduzione del segnale sono obiettivi della presente invenzione. Semplicemente riproponendo i principi alla base della presente invenzione, le cellule artificiali possono monitorare le condizioni ambientali dell'ospite e sintetizzare un'ampia gamma di proteine eucariotiche come terapeutiche. Inoltre, la presente invenzione pu? essere utilizzata per sintetizzare piccole molecole come farmaci, poich? le cellule artificiali possono essere metabolicamente attive a causa degli enzimi di E. coli e dove la reazione priva di cellule pu? essere programmata geneticamente. In questo modo sono stati raggiunti la sintesi e il rilascio controllati del farmaco. ;;Poich? le cellule artificiali sono versatili da (ri) programmare e la loro produzione ? scalabile e possono essere progettate diverse cellule artificiali per applicazioni specifiche, le cellule artificiali possono trovare impiego praticamente in qualsiasi segmento della somministrazione di farmaci, nel campo della medicina. Le tabelle 2-7 descrivevano le possibili associazioni con la tecnologia attuale e l'ambito delle applicazioni in relazione agli organismi ospiti. Per riferimento e confronto, la Tabella 8 riassume l'elenco delle vie di segnalazione note nel metabolismo umano. Le capacit? delle cellule artificiali possono raggiungere ulteriormente l'ambito di tutte le malattie associate ai componenti della Tabella 8. Come un altro aspetto rilevante dell'invenzione, la Tabella 3 riassume la famiglia dei recettori tirosin chinasi e i loro membri, che somiglia a TrkB in funzione e meccanismo d'azione. Pertanto, l'invenzione pu? essere riproposta senza sostanziali passaggi inventivi da associare a recettori simili, i cui esempi sono riportati nella Tabella 3. In ancora un altro aspetto dell'invenzione, i recettori accoppiati a proteine G hanno dimostrato di essere funzionali o il bersaglio del cellule sintetizzate sostanze chimiche utili dal punto di vista medico. I bersagli di una classe simile di recettori e il loro elenco esemplificativo sono forniti nella Tabella 6, in associazione con i neurotrasmettitori caratterizzati e utilizzati all'interno della presente invenzione, vale a dire L-glutammato, serotonina e GABA. Ad esempio, poich? la dopamina condivide percorsi biosintetici simili con la serotonina, ? con associazione immediata con la dopamina o classi simili di recettori per la presente invenzione. Allo stesso modo, in un altro esempio, a causa dell'attivit? metabolica del sistema di trascrizione/traslazione privo di cellule (cio? estratto S12) che componeva cellule artificiali, le cellule artificiali possono sintetizzare altre molecole di farmaci associate alle Tabelle 2-7 e rilasciarle in modo controllato e programmato. ;;Tutte le cellule comunicano tra loro e all'interno della pi? ampia comunit? cellulare. Pertanto, l'interruzione, il malfunzionamento o l'interferenza nella segnalazione o nelle vie di segnalazione associate possono portare a malattie associate alle vie di segnalazione negli esseri umani. Tale elenco ? fornito nella Tabella 2, ponendo l'accento sulla somiglianza e rilevanza con le vie di segnalazione caratterizzate come scopo della presente invenzione. In molti esempi, le cellule artificiali possono essere utilizzate per associarsi a neoplasia, SLA, infiammazione, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, autismo, tossicodipendenza, AIDS, malattie neurologiche (come epilessia, schizofrenia, ecc.) E come una classe pi? ampia di malattie e disturbi, malattie da disregolazione cellulare, malattie e disturbi immuno-correlati, malattie e disturbi oncologici, malattie e disturbi del sangue e della coagulazione, malattie e disturbi metabolici, epatici, renali e proteici. In alcune associazioni di queste malattie, le cellule ospiti possono anche utilizzare una fase intermedia come le cellule microbiche. In un aspetto, la cellula eucariotica pu? essere una cellula di mammifero che interagisce con una cellula batterica e artificiale. I sistemi di questo tipo potrebbero essere testati come proof-ofconcept, e grazie a piccole molecole caratterizzate che possono essere trovate in nicchie procariotiche (es.LuxR, 3OC6 HSL, GABA, L-glutammato, serotonina), l'esperto dell'arte pu? riutilizzare cellule artificiali fisiologicamente compatibili in pluralit? per avere influenza sulla pluralit? delle cellule ospite/ricevente. ;;Ancora, in un altro esempio, catene polipeptidiche pi? piccole associate/ispirate a polipeptidi di segnalazione o ormoni con funzionalit? simili ai polipeptidi di segnalazione possono anche essere usati come componenti di segnalazione nell'ambito dell'invenzione. Un tale elenco rappresentativo ? fornito nella Tabella 4. In un aspetto dell'invenzione, la funzionalit? dei polipeptidi di segnalazione sui loro recettori affini ? stata caratterizzata e dimostrata con successo senza sostanziali modifiche post-traduzionali. Questa scoperta ancora un'altra volta, indica che l'efficacia del polipeptide di segnalazione non ? sempre correlata alla presenza della modifica post-traduzionale. In un esempio specifico di BDNF maturo, l'omodimerizzazione del polipeptide richiede schemi specifici di ponti di legame disolfuro, che sono tre legami in totale in un singolo monomero. L'attivit? biologica del BDNF suggerisce che il sistema S12 privo di cellule basato su E. coli ? in grado di produrre polipeptidi bioattivi di mammiferi. Questa scoperta ? supportata dal fatto che l'espressione e la purificazione del BDNF vengono eseguite regolarmente nelle cellule di E. coli, che ? anche un importante indicatore dell'attivit? biologica del polipeptide. Esempi simili possono essere forniti dall'esperto del ramo, che la produzione ricombinante di E. coli indica una forte relazione tra bioattivit?. Tuttavia, ci sono molti casi in cui la glicosilazione, l'acetilazione o la modifica della lisina o qualsiasi altra modifica post-traduzionale non ? strettamente richiesta per il livello basale o ottimale di funzionalit? dei polipeptidi. Gli esempi forniti nella Tabella 4 possiedono pi? membri dei casi summenzionati. Ci sono polipeptidi che possono essere sintetizzati in E. coli e ci sono polipeptidi che non richiedono strettamente modifiche post-traduzionali. In un altro aspetto dell'invenzione, gli elementi regolatori del gene possono essere influenzati tramite l'attivazione delle molecole di segnalazione come descritto e delineato nella presente invenzione. L'elenco degli elementi di segnalazione associati che sono nella stessa classe di CREB ? riportato nella Tabella 5. In un altro esempio dell'invenzione, la reazione privo di cellule pu? essere riprogrammata per produrre polipeptidi contenenti amminoacidi non naturali, non canonici o brevi catene di polipeptide derivante dai polipeptidi di segnalazione, purch? le metodologie comunemente impiegate siano utilizzate anche nella particolare applicazione/esempio in sistemi privi di cellule. ;;La presente invenzione deve essere considerata come una tecnologia di piattaforma, in cui le applicazioni target varierebbero dall'intervento diretto con le malattie umane, microbiche o derivate dall'ospite, come il cancro, il malfunzionamento della segnalazione cellulare e altre malattie associate al metabolismo. In un'altra applicazione ancora, le cellule artificiali possono essere programmate per rilasciare/fornire macchinari per l'editing del genoma. In un aspetto, l'invenzione ? stata esemplificata sopra come un dispositivo di rilascio di polipeptidi globulari, che rilascia polipeptidi/proteine in modo controllato e programmato. Questo esempio dell'invenzione suggerisce che le cellule artificiali possono essere riprogrammate e riproposte in un macchinario di modifica del genoma di rilascio, perch? in un aspetto dell'invenzione, la dimensione dell'apertura dei pori del polipeptide che forma i pori oligomerizzati (cio? PFO) era compresa tra 25-30 nm. La dimensione del PFO pu? consentire la diffusione di Cas9 o altri polipeptidi di ingegneria/editing genomici associati o simili e/o complessi polipeptide/polinucleotide, perch? le dimensioni di tali complessi sono inferiori a 25 nm. In un altro aspetto, le cellule artificiali possono essere riproposte per cooperare con le cellule immunitarie naturali del corpo umano, perch? le cellule artificiali sono fisiologicamente compatibili e possono rilasciare proteine globulari relativamente semplici, come fattori di crescita e citochine. In questo modo, le cellule artificiali verrebbero utilizzate per il trattamento di un'ampia variet? di malattie e complicazioni. Le cellule artificiali possono sintetizzare polipeptidi eucariotici con pi? legami disolfuro, dove il macchinario traslazionale e cellulare di E. coli gestisce i corretti schemi di ripiegamento del polipeptide per produrre terapie biologicamente attive come qui descritto. Ultimo ma non meno importante, le cellule artificiali possono essere ulteriormente progettate per interagire con le piante, il che fornisce anche numerose applicazioni, come l'intervento con la segnalazione cellulare delle piante, la maturazione, il miglioramento dei raccolti, il miglioramento della resistenza delle colture agli agenti patogeni o il trattamento di una variet? di malattie. ? interessante notare che l'attuale invenzione delinea i passaggi per interagire con le cellule eucariotiche, non solo con le cellule di mammifero. Non ? nota una tecnologia cos? versatile al momento. ;;Conclusione ;;La capacit? delle cellule artificiali di sintetizzare e rilasciare molecole su richiesta fornir? probabilmente numerose possibilit? di influenzare i sistemi biologici in modo sicuro ed efficace. Un sistema geneticamente programmabile che ? simile a quanto qui descritto potrebbe essere previsto per integrarsi all'interno dell'asse intestino-cervello-cervello sfruttando le vie di segnalazione del quorum naturale tra i batteri. Ulteriori progressi potrebbero derivare da miglioramenti alle capacit? di rilevamento del sistema ingegnerizzato in modo che le cellule artificiali possano rispondere ai cambiamenti fisiologici dell'ospite, ad es. modifiche alla concentrazione di cationi, neurotrasmettitori o altre molecole e fattori presenti nella matrice extracellulare. Per fare ci?, sar? importante ideare sistemi che possano effettuare traslazioni maggiori di quanto descritto dalla presente invenzione, magari sfruttando i nutrienti dell'ospite. I materiali simili a tessuti composti da cellule artificiali stampate in 3D possono essere progettati per aiutare nella guarigione del tessuto danneggiato attraverso la differenziazione delle cellule staminali e la rigenerazione degli assoni, in particolare per le lesioni del midollo spinale. Il rilascio mirato ai tessuti potrebbe essere ottenuto visualizzando i recettori di superficie, in modo che le cellule artificiali possano essere ingegnerizzate per produrre e rilasciare peptidi di segnalazione eucariotici. Una volta progettate e decorate, tali cellule artificiali potrebbero integrarsi all'interno dell'ospite per rilasciare in modo controllabile fattori extracellulari e piccole molecole o per fornire macchinari di editing genetico. Inoltre, le cellule artificiali possono funzionare come unit? di cellule T CAR complementari, rilasciando citochine e impiegando perfringolisina O simile ai granzimi e alle perforine delle cellule immunitarie. Le relazioni analoghe tra cellule immunitarie di mammiferi e cellule artificiali possono essere chiaramente tracciate dall'esperto del ramo. ;;L'invenzione qui delineata e descritta insieme ad esempi di prova di concetto avvicina il campo alla costruzione e all'uso di cellule artificiali che vanno oltre ci? che ? tipicamente previsto per i sistemi intelligenti di somministrazione di farmaci e apre nuove possibilit? nella teranostica e nella terapia. Le cellule artificiali sono in grado di fare molto di pi? che funzionare come semplici veicoli per la somministrazione di farmaci. Con le tecnologie qui descritte come una piattaforma, sar? possibile sviluppare cellule artificiali che monitorano regolarmente le condizioni fisiologiche e in risposta sintetizzano e rilasciano diverse molecole di farmaci. In questo modo, le mutevoli esigenze dell'ospite sarebbero soddisfatte rapidamente in modo da non inondare l'intero organismo con molecole di farmaci. ;;Parte sperimentale ;;Materiali e reagenti ;;Tutti i prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma ? Aldrich (Merck) con la massima purezza possibile, salvo diversa indicazione. Il BDNF commerciale ? stato espresso in modo ricombinante in E. coli e acquistato da Peprotech. I lipidi provenivano da Avanti Polar Lipids. Per la preparazione dell'estratto S12 ? stato utilizzato E. coli Rosetta2 (DE3). E. coli NEB5? (New England Biolabs) ? stato utilizzato per scopi generali di clonazione molecolare. E. coli BL21 (DE3) (New England Biolabs) ? stato utilizzato per l'espressione di polipeptidi/proteine ricombinanti. ;;Costrutti genetici e proteine ricombinanti ;;Tutta la clonazione ? stata eseguita da Gibson Assembly, se non diversamente specificato. Per tutti i costrutti utilizzati con le cellule artificiali, pSB1A3 dal registro iGEM (parts.igem.org) era la spina dorsale del vettore. Le sequenze del promotore, del terminatore e del tag breve (<50 bp) sono state prese dal registro iGEM (BBa_R0040, BBa_J23101, BBa_J23106, BBa_J23117, BBa_R0062, BBa_B0010). Una sequenza ottimizzata del codone di E. coli di BDNF murino maturo ? stata sintetizzata da GenScript. Il cDNA di TrkB umano ? stato sintetizzato da GenScript in due parti, unite internamente da Gibson Assembly e clonato in un vettore pLenti con tecniche di clonazione molecolare standard. Il gene LuxR ? stato preso dal plasmide di registro BBa_T9002. Il gene per la perfringolisina O (PFO) proveniva da un costrutto pubblicato in precedenza. Il plasmide di espressione genica regolato da CRE ? stato preso da un precedente rapporto. Le proteine ricombinanti sono state espresse e purificate come descritto in precedenza. ? stato utilizzato un tag N-terminale 6xHis-tag con la sequenza del linker flessibile (GGGS) 1 o 2. ;;Preparazione dell?estratto di E. coli S12 ;;L'estratto di E. coli S12 fatto in casa ? stato preparato come segue. Rosetta2 (DE3) ? stata striata su piastre di agar 2xYT P contenenti cloramfenicolo (34 ?g/mL) e incubata per una notte a 37 ? C. Una singola grande colonia ? stata raccolta per una coltura durante la notte (precisamente 15 h) per preparare gli stock congelatori di avviamento (concentrati 10x) in 2xYT P, contenente il 12,5% di glicerolo, 100 mM MgSO4, 25 mM Tris-Cl, pH 8,0. Per preparare l'estratto di E. coli S12, ? stata preparata una nuova coltura durante la notte (15 h) in 2xYT P con cloramfenicolo (34 ?g/mL) e il giorno successivo trasferita in 1 L di 2xYT P preriscaldato in fiasche da 5 L con Diluizione 1: 100 e incubata con agitazione (220 rpm) a 37 ? C senza disturbare per 3?3,5 h. Le cellule sono state quindi immediatamente raccolte e centrifugate per 10 minuti a 6000 g, 4 ? C. Da questo punto in poi, le cellule sono state mantenute costantemente a 4 ? C e tutte le centrifugazioni sono state eseguite in condizioni identiche. I pellet batterici sono stati lavati brevemente, risospesi in tampone S12A preraffreddato (14 mM Mg2 ?glutammato, 60 mM K ?glutammato, 2 mM DTT, 50 mM Tris ? Cl, pH 7,7 aggiustato con acido acetico concentrato), centrifugati di nuovo sotto il stesse condizioni e risospese in 1/10 del volume del tampone S12A originale per trasferire le cellule in provette Falcon da 50 mL precaricate. Dopo un secondo ciclo di lavaggio, il tampone residuo ? stato rimosso e il peso del pellet umido ? stato determinato. Perle di vetro autoclavate (5 volte del peso totale, 100 ?m di diametro) e tampone S12A (0,9 volte del peso totale) sono stati quindi aggiunti al pellet cellulare in 3 cicli con agitazione su vortex dopo ogni aggiunta. ;;Le provette Falcon sono state quindi tagliate a met? e la miscela di impasto liquido e granuli ? stata trasferita con cura in tubi battitori di palline utilizzando siringhe da 1 mL senza ago. Si ? prestata attenzione per evitare bolle visibili all'interno delle provette e la miscela risultante ? stata conservata per una notte a ?80 ?C. Dopo aver scongelato la miscela di impasto semiliquido su ghiaccio per <2 ore, ? stata eseguita la battitura del granulo a una velocit? di battimento di 6,5 m/s per 30 s (x2) (FastPrep-24, MP Biomedicals). Quindi, l'estratto cellulare grezzo ? stato separato dalle perle di vetro mediante centrifugazione con colonne Bio ? Rad Bio ? Spin. L'estratto cellulare ? stato trasferito in nuove provette per rimuovere i detriti cellulari, richiedendo almeno due centrifugazioni. L'estratto cellulare grezzo ? stato incubato a 37 ?C con agitazione (220 rpm) per 90 min in provette con tappo aperto e successivamente chiarificato almeno due volte mediante centrifugazione. Infine, l'estratto ? stato dializzato contro tampone S12B appena preparato (14 mM Mg<2+ >? glutammato, 60 mM K<+ >?glutammato, 1 mM DTT, portato a pH 8,2 con 2 M Tris-base). Il primo ciclo di dialisi ? stato di <3 ore. Il secondo ciclo di dialisi ? stato eseguito durante la notte (<24 h) a 4 ?C. La dialisi ha sfruttato un tubo per dialisi MWCO SnakeSkin da 10 kDa (ThermoFisher Scientific) con una leggera agitazione. Dopo la dialisi, l'estratto ? stato suddiviso in aliquote, conservato a ?80 ?C e utilizzato entro un anno dalla data di preparazione. ;;Trascrizione/Traslazione in vitro ;;Le reazioni di trascrizione/traslazione cellulare in vitro e artificiali con il sistema S12 sono state eseguite a 30 ?C in un volume finale di 10?50 ?l. Le reazioni in vitro si sono verificate in una macchina qPCR Rotor ? Gene Q (Qiagen) o in un lettore di piastre senza agitazione (Tecan Infinite M200). Le reazioni delle cellule artificiali erano in un incubatore. Per gli esperimenti con lettore di piastre, ogni pozzetto nella piastra a 96 pozzetti con fondo nero/trasparente (Costar 3603) ? stato coperto con 50 ?l di olio minerale sterile per evitare l'evaporazione. Per le reazioni di E. coli S12 in condizioni fisiologiche, la composizione finale della soluzione di amminoacidi era 0,5 mM ciascuna. La soluzione energetica era acido 3-fosfoglicerico 20 mM, ATP 1 mM, GTP 1 mM, CTP 0,6 mM, UTP 0,6 mM, tRNA 0,133 mg/mL, coenzima A 0,17 mM, NAD 0,22 mM, cAMP 0,5 mM, acido folinico 0,045 mM , 0,66 mM di spermidina, 33 mM Na ?HEPES, pH 8,0. La soluzione supplementare era il 2% (p/v) di polietilenglicole 4000 (PEG 4000), 10 mM Mg2 ?glutammato, 10 mM K ?glutammato, 20 mM di saccarosio, 6 mM di maltosio. La tabella 1 riassume le concentrazioni finali del sistema ottimizzato, dove i valori dovrebbero essere considerati come esemplari di una sola possibile via di ottimizzazione presa per la massima produzione di polipeptidi. Per il confronto tra l'espressione dell'emulsione in modalit? batch e l'acqua in olio, le reazioni sono state incapsulate all'interno delle emulsioni dopo l'incubazione in vitro o avviate direttamente all'interno dell'emulsione. I lipidi disciolti con olio minerale per le emulsioni acqua in olio sono stati preparati come descritto in "Generazione di cellule artificiali" e contenevano POPC integrato con 1% (v/v) di sorbitano monooleato (Span 80). Il DNA plasmidico ? stato ottenuto utilizzando i kit Qiagen Plasmid Midi (12145) e risospeso in acqua deionizzata priva di nucleasi. Il DNA ? stato quantificato con un NanoDrop 2000c (ThermoFisher), diluito, suddiviso in aliquote e conservato a ?20 ?C a una concentrazione di 200 nM e utilizzato a una concentrazione finale di 10?40 nM. I componenti di reazione sono stati assemblati nel seguente ordine con breve agitazione su vortex dopo ogni aggiunta e senza centrifugazione: estratto di E. coli S12, soluzione di amminoacidi, soluzione energetica, PEG, soluzione di supplemento, acqua e DNA plasmidico. ;;Sintesi e rilevamento dei neurotrasmettitori ;;La sintesi priva di cellule (nei sistemi basati su estratto di E. coli S12) di enzimi della via dei neurotrasmettitori e neurotrasmettitori conteneva estratto di E. coli S12, insieme a FeCl2 0,1 mM, catalasi 0,1 mg/mL, tetraidrobiopterina 0,2 ?M (BH4), 0,1 mM DNA stampo TPH2 umano PLP, (concentrazione finale di 20 nM, espressione controllata con promotore trascrizionale di E. coli tet), AADC (promotore di espressione controllata con registro J23106, parts.igem.org, concentrazione finale 10 nM). Le sintasi GABA basate su S12 sono state eseguite con gruppi di reazione contenenti estratto di E. coli S12, catalasi 0,1 mg/mL e PLP 0,1 mM, con stampo plasmidico che codifica per E. coli GadB (espressione controllata dal promotore J23106 del registro, parts.igem.org), dove reazioni complessive acidificate con acido cloridrico 25 mM, concentrazione finale. Le analisi dei componenti di reazione e la rilevazione enzimatica dei livelli di GABA sono state eseguite come nella sezione "immunoblot". In breve, la miscela principale della reazione conteneva 0,063 U/mL di GABasi, 0,063 U/mL di diaforasi, 6,25 mM di resazurina, 100 mM di nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADP), 5 mM alfa-chetoglutarato e 3,125 mM ditiotreitolo (DTT) in 100 mM Tris -Cl a pH 8,8. Questa miscela master ? stata preparata in 1,11x stock concentrati e diluita fino alle concentrazioni finali riportate con 10 ?l di campione in 100 ?l di volume totale. Successivamente, la reazione ? stata incubata a 30 ?C per 30 minuti e suddivisa in aliquote in piastre a 96 pozzetti con fondo nero/trasparente (Costar 3603) e la fluorescenza ? stata monitorata con ?ex = 545 ? 25 nm e ?em = 590 ? 50 nm. Le curve standard per GABA commerciale sono state tracciate per ciascun test di reazione e utilizzate per determinare l'intervallo di rilevamento del dosaggio. ;;Le reazioni utilizzando componenti privi di cellule purificati (PURExpress?, NEB), le incubazioni sono state a 37 ?C per 6 h. Le reazioni sono state lette al lettore di piastre Tecan M200 (BioTek), dotato di analizzatore di luminescenza. La miscela enzimatica (Soluzione A) ? stata usata come 0,3 unit? di 1,0 unit? finale di reazione ricostituita. Considerando che, la miscela tampone fatta in casa (soluzione B) ? stata utilizzata come 0,4 unit? di 1,0 unit? finale di reazione ricostituita. La composizione tampone fatta in casa era HEPES-KOH 50 mM a pH 7,6, miscela di amminoacidi equimolari (senza L-aspartato e L-glutammato) 2 mM ciascuno, acetato di potassio 300 mM, spermidina 1 mM, acetato di magnesio 18 mM, creatina fosfato 50 mM, DTT 5 mM, ATP 3,75 mM, GTP 2,5 mM, CTP 1,25 mM, UTP 1,25 mM, miscela tRNA 4 ?g/mL, 0,06 ?g/mL acido 10-formil-5,6,7,8, -tetraidrofolico. Il resto della miscela di reazione era composto da DNA stampo codificanti per Tar-EnvZ (Michalodimitrakis, Sourjik e Serrano, 2005) sotto il promotore J23106 del registro iGEM, (parts.igem.org) e sfGFP controllato dal promotore OmpC di E. coli o luciferasi di lucciola (codone E. coli ottimizzato) con concentrazioni finali di 20 nM per tutti. OmpR 6xHis marcato con N-terminale espresso e purificato in modo ricombinante ? stato fornito in 200 nM finali con tampone fisiologico. Le reazioni sono state integrate con l'inibitore della RNasi (ThermoFisher) e l'acqua certificata PCR (Qiagen) fino a 10 ?L. ;;Generazione delle cellule artificiali ;Le vescicole e le cellule artificiali sono state generate utilizzando la conversione dell'emulsione acqua in olio alla metodologia delle vescicole, se non diversamente specificato (Fig. 12). In generale, sono state utilizzate soluzioni di uguale osmolalit? per le soluzioni delle vescicole esterne (alanina o tampone fosfato di Dulbecco, DPBS) e interne (reazione di E. coli S12 o saccarosio). Le vescicole sono state realizzate con 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e colesterolo (Sigma Aldrich) a una concentrazione finale totale di 380 ?M, con o senza 1 mol% 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil (polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) (DSPE ? PEG (2000) Biotin, Avanti Polar Lipids). Le vescicole sono state preparate in fiale di vetro sterilizzate utilizzando olio minerale sterile per colture cellulari (BioXtra 5310, Sigma Aldrich) e protette dalla luce avvolgendole in un foglio di alluminio o utilizzando fiale color ambra. In breve, le scorte di lipidi di cloroformio sono state pipettate in fiale di vetro e asciugate con cura sotto un flusso costante di N2. Il film lipidico secco risultante ? stato posto sotto vuoto per> 4 ore per rimuovere il solvente residuo. Il lipide essiccato ? stato sciolto in olio minerale, agitato su vortex e incubato brevemente a 80 ?C in un forno pi? volte finch? il materiale non disciolto non era pi? visibile. I lipidi disciolti sono stati sonicati a bagnomaria (50-60 ?C) per 30-60 minuti, a seconda delle dimensioni della fiala e dello spessore del vetro. I lipidi sono stati quindi conservati al buio e utilizzati entro una settimana dalla preparazione. La soluzione lipidica risultante ? stata accuratamente sovrapposta su una soluzione esterna in una provetta Eppendorf. La miscela ? stata lasciata indisturbata per 30?60 min per consentire la separazione di fase e la formazione di un monostrato (Fig. 12). Quindi, 10 ?L di reazione di E. coli S12 appena assemblata sono stati pipettati in 500 ?L di soluzione di olio minerale-lipidi in una provetta separata per generare un'emulsione acqua-in-olio mediante agitazione tirando rapidamente la provetta su un rack. L'emulsione ? stata lasciata equilibrare a temperatura ambiente per ca. 1 min e sovrapposto all'interfaccia, seguito da 2-3 min di incubazione. ;;Le cellule artificiali sono state formate e pellettizzate mediante centrifugazione a 5000 g per 5 min. Lo strato di olio minerale superiore ? stato rimosso mediante vuoto fino a ca. Sono rimasti 50 ?l di soluzione acquosa. Il pellet cellulare artificiale ? stato lavato almeno due volte (1 mL ciascuno) con alanina o DPBS senza Mg<2+ >e Ca<2+ >(per esperimenti di colture cellulari) e con centrifugazione a 5000 g per 1 min. Dopo questo work-up, ogni campione da 1,5 mL di cellule artificiali conteneva al massimo 0,5?1 ?L di reazione priva di cellule incapsulata. In alternativa a questa metodologia, l'idratazione del metodo FDEL (Freeze-Dried Empty Liposomes) con modifiche potrebbe essere utilizzata per generare cellule artificiali per il funzionamento in condizioni fisiologiche, anche se con un'efficienza sostanzialmente inferiore. I vantaggi e i limiti del metodo FDEL sono stati discussi nella sezione "Descrizione dettagliata dell'invenzione". Il metodo qui descritto "la conversione dell'emulsione acqua in olio in vescicola" ? stato utilizzato principalmente per aumentare l'efficienza di incapsulamento e per generare membrane unilamellari in modo che i polipeptidi formanti pori possano consentire la diffusione di polipeptidi sintetizzati privi di cellule in modo pi? efficiente. Un esperto del ramo pu? facilmente sostituire i metodi FDEL utilizzando semplici modifiche descritte nella sezione seguente "analisi del rilascio di calceina e funzionalit? dei pori del PFO". ;;Determinazione dell?osmolalit? della soluzione ;;L'osmolalit? ? stata determinata dall'osmometro a depressione punto di congelamento di L?ser. Lo strumento ha misurato il punto di congelamento delle soluzioni acquose, rispetto a quello dell'acqua pura. Per riferimento, l'acqua pura congela a 0 ?C e 1 Osm/kg H2O si congela a ?1,858 ?C. A causa della concentrazione osmotica della soluzione acquosa, si verifica la depressione del punto di congelamento. Ad esempio, 1 mol di una sostanza che viene disciolta in 1 kg di H2O corrisponde a 1 Osm/kg di osmolalit? H2O, portando a una depressione del punto di congelamento di ?1,858 ?C. Lo strumento ha misurato la temperatura di congelamento nell'intervallo corrispondente di 0?1000 mOsm/kg H2O. Per calibrare lo strumento, sono state utilizzate soluzioni con contenuto di sale noto e osmolalit? come punto di riferimento, per generare una curva standard lineare. Lo strumento ? stato calibrato prima delle misurazioni per le soluzioni 0 mOsm/kg H2O, 300 mOsm/kg H2O e 900 mOsm/kg H2O, secondo le istruzioni del produttore. Per rilevare l'osmolalit? del contenuto interno ed esterno della cellula artificiale, le reazioni prive di cellule sono state assemblate ed eseguite come indicato nella sezione "trascrizione/traduzione in vitro". Le reazioni assemblate e analizzate sono state eseguite almeno in tre repliche. Quando possibile, gli esperimenti sono stati replicati almeno altre due volte in giorni diversi. Le reazioni sono state campionate in provette di plastica da 500 ?L come un volume di 25 ?L per ciascuna condizione. Prima di ogni campione e alla fine di ogni analisi, la punta dell'ago dell'osmometro ? stata immersa e lavata via dai contaminanti di reazione privi di cellule almeno due volte con acqua fresca deionizzata ;;Analisi a rilascio di calceina e funzionalit? dei pori PFO ;;La preparazione delle vescicole in questa sezione ha utilizzato l'idratazione del metodo FDEL (Freeze-Dried Empty Liposomes). Le vescicole ("vuote") che non incapsulano la reazione S12 con diverso contenuto di colesterolo sono state preparate mediante idratazione di film lipidico sottile con milliQ-acqua fino a 100 ?L. La concentrazione lipidica totale era di 23 mM (POPC colesterolo). La miscela di lipidi idratati ? stata sottoposta a cinque cicli di congelamento/scongelamento. Le vescicole "vuote" sono state omogeneizzate con un omogeneizzatore portatile (IKA T10 Basic) ed estruse a 100-400 nm con un mini estrusore di Avanti Polar Lipids. La dimensione di estrusione ? esemplificativa e potrebbe essere utilizzata per altre dimensioni come 200 nm, 400 nm, 800 nm o 1 micron per generare vescicole relativamente monodisperse, prive di aggregati lipidici. Le vescicole sono state quindi liofilizzate durante la notte con Rotavap R ? 210 (B?chi) o concentratore di DNA CentriVap (Labconco) e conservate a ?20 ?C. Le scorte liofilizzate sono state utilizzate entro un anno dalla preparazione. Per testare l'efficienza della formazione dei pori mediante PFO, le vescicole sono state reidratate con calceina 80 mM e purificate da fluoroforo non incapsulato mediante cromatografia ad esclusione dimensionale con resina di sefarosio 4b. In questo caso, se la "reidratazione" fosse eseguita dalla soluzione interna descritta in precedenza, l'esperto otterrebbe una soluzione interna polidispersa contenente cellule artificiali. Successivamente, le fasi successive (come la cromatografia ad esclusione dimensionale o la dialisi contro vescicole vuote e/o tampone come soluzione esterna) potrebbero essere state facoltativamente eseguite per rimuovere il materiale non incapsulato. 10 ?L della reazione di trascrizione/traduzione in vitro sono stati assemblati come descritto sopra (vedere la sezione "Trascrizione/traduzione in vitro") con vescicole contenenti calceina appena purificata con almeno 1/10 del volume di reazione finale (1 ?L). La reazione ? stata incubata a 30 ?C e la fluorescenza (?ex = 485 nm, ?em = 515 nm) ? stata monitorata nel tempo con uno strumento RotorGene Q. Per i test di attivit? del PFO espresso all'interno di cellule artificiali, un DNA plasmidico codificante LuxR ? PFO ? stato incapsulato ad una concentrazione di 20 nM. L'espressione del PFO ? stata indotta dopo 30?60 min di incubazione a 30 ?C con 10 ?M 3OC6 HSL da uno stock di 1 mM in dimetilsolfossido al 10% (v/v). La reazione ? stata interrotta 16 ore dopo l'induzione. Le cellule artificiali sono state quindi trattate e analizzate come descritto di seguito in "Citometria a flusso". ;;Citometria di flusso ;;Le cellule artificiali sono state diluite in alanina 300 mM o PBS prima dell'analisi. La citometria a flusso ? stata eseguita con un FACS Canto A (BD Biosciences) con un'impostazione della velocit? di flusso 'bassa' e valori di tensione di 350 V (per SSC ? W), 400 V (SSC ? A, FSC ? A e FITC per AlexaFluor488? destrano e piranina (acido 8-idrossipirene-1,3,6-trisolfonico)) o 700 V (FITC per GFP e sfGFP). Per ogni corsa, sono stati registrati almeno 10.000 eventi significativi o 50.000 eventi totali con una strategia di gating che prendeva in considerazione solo le frazioni che contenevano vescicole giganti come significative (Fig. 12D). Il citometro a flusso ? stato calibrato con particelle da 1 ?m e 10 ?m per l'ottimizzazione della tensione e la determinazione della dimensione delle particelle. Gli eventi singoli e doppi sono stati discriminati dai grafici SSC-A vs SSC-W e solo gli eventi singoli sono stati presi in considerazione per le analisi statistiche (Fig. 23). Per la strategia di gating sperimentale, i campioni "No DNA" e/o "No dextran/GFP" sono stati utilizzati come controlli negativi per determinare gli eventi positivi FITC per creare un nuovo gate. Sia la perdita di intensit? FITC (a causa della fuga di GFP attraverso i pori del PFO) che le variazioni percentuali negli eventi di porte specifiche sono state prese in considerazione per l'analisi statistica. I dati sono stati analizzati con il software FACS Diva (BD Biosciences) o FlowJo v10 (FlowJo LLC). Tutti gli eventi sono stati tracciati in pseudocolore. ;;Microscopia ;Le cellule artificiali sono state sottoposte a imaging con un microscopio Axio Zeiss Observer Z1 dotato di un obiettivo 100X (100x (Plan-Apochromat 100x/1.4 oil DIC)) o 40X (EC Plan ? Neofluar 40x/0.75). Le emulsioni acqua in olio sono state riprese con l'obiettivo 20X LD Plan ? Neofluar 20x/0,4 Korr Ph2 M27. Per entrambi, i valori di eccitazione ed emissione erano ?ex = 484 ? 25 nm e ?em = 525 ? 50 nm. Le immagini di cellule artificiali sono state acquisite con un distanziatore fisico tra il vetrino coprioggetto e i vetrini trattati con Repel Silane (GE Healthcare). Per HEK293T e/o cellule staminali, l'imaging ? stato eseguito con un Axio Zeiss Observer Z1 (10X EC e 20X LD) o un microscopio confocale a disco rotante Nikon Eclipse Ti2. Le cellule HEK293T sono state coltivate con vetrini in vetro da 15 mm pretrattati con 100 ?g/mL di poli-L-lisina (Sigma) e sottoposte a imaging con vetrini preparati con mezzi di montaggio fatti in casa con la seguente ricetta: 4 mM Mowiol (MW: 31.000, Sigma), 25% glicerolo (v/v), 0,3% (p/v) sodio azide, 50 mM Tris-Cl, pH 8,0. Per la raccolta di dati non distorta, tutte le immagini sono state scattate con uno stadio automatizzato (Nikon Eclipse Ti2) o un campo casuale della coltura, focalizzato/determinato solo dai nuclei (Observer Z1). Per i saggi di collasso Xenopus, le immagini di assoni in crescita sono state scattate in campo chiaro con un microscopio Axio Zeiss Observer dotato di un obiettivo 40X EC Plan ? Neofluar 40x/0,75. Per il test di collasso, i vetrini coprioggetto sono stati montati con ImmunoHistoMount (Sigma) su un vetrino e osservati con un microscopio Leica DMi8 dotato di un obiettivo Leica DMi8 HCX PL Fluotar L 40x/0.6. ;;Coltura cellular HEK293T ;;Le cellule HEK293T di tipo selvatico sono state ottenute da American Type Culture Collection (ATCC) coltivate in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Corning) completo ad alto contenuto di glucosio (4,5 g/L) con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS) (Gibco), 100 ?g/mL di penicillina/streptomicina (Corning) e L-glutammina 2 mM (Corning) a 37 ?C con 5% di CO2. La produzione di lentivirus ? stata eseguita con sistemi di produzione virale di seconda generazione comunemente impiegati. In breve, i virus sono stati prodotti in HEK293T wild type, trasfettato con pLenti-CMV-TrkB e plasmide di confezionamento virale ausiliario (psPAX2) che codifica per i polipeptidi HIV gag, pol, rev, tat. La trasfezione ? stata effettuata con Lipofectamine 2000 (ThermoFisher), secondo le istruzioni del produttore. Dopo la trasfezione, il terreno ? stato cambiato dopo incubazione notturna a 37 ?C. Successivamente, 24, 48 e 72 ore dopo, i terreni sono stati raggruppati e concentrati utilizzando il 50% (p/v) PEG 4000. Per la generazione di una linea cellulare stabile CMV-TrkB, le cellule HEK293T di tipo selvatico sono state seminate a una densit? cellulare di Piatti 2 x 106 in 10 cm e trasdotti al 70% di confluenza. Il giorno 3, le cellule sono state stimolate con 1 ?g/mL di puromicina e mantenute in coltura fino a quando non sono state osservate colonie singole chiare (Fig. 29A). Le singole colonie sono state isolate, raccolte e trasferite in nuove piastre a 6 pozzetti per la propagazione, mentre la selezione ? stata mantenuta fino a quando i livelli di espressione sono stati verificati mediante immunofluorescenza contro la proteina TrkB totale (Fig. 29B). Per la linea cellulare CMV ? TrkB ? CRE ? GFP, le cellule sono state trasfettate con DNA plasmidico contenente antigene T SV40 utilizzando polietilenimmina (PEI, 1 mg/mL, Sigma ? Aldrich) con una spina dorsale plasmidica linearizzata con ScaI. Il giorno 2, le cellule sono state stimolate con 400 ?g/mL di zeocina (ThermoFisher) e mantenute in coltura fino alla comparsa di singole colonie chiare (Fig. 29D). La linea cellulare policlonale stabile risultante ? stata utilizzata in tutti gli esperimenti successivi, se non diversamente specificato. A causa della natura policlonale della linea cellulare finale, erano previsti livelli variabili di espressione di GFP all'induzione. Alla serotonina priva di cellule sintetizzata o commerciale sono state fornite le seguenti concentrazioni, diluizione 1/200 della reazione privo di cellule o 100 ?M di serotonina-HCl commerciale, rispettivamente. Le cellule HEK293T sono state sottoposte a imaging come nella sezione "Microscopia" o l'intensit? di fluorescenza corretta di fondo complessiva ? stata determinata nel lettore di piastre Tecan M200 dopo 16 ore di incubazione a 37 ?C come nota nella sezione "trascrizione/traduzione in vitro". Le cellule sono state confermate come micoplasma negative. ;;Funzionalit? del BDNF espresso privo di cellule con HEK293T ;;Per il western blotting, le cellule HEK293T ? CMV ? TrkB sono state seminate in piastre da 12 pozzetti a una densit? di 2 x 105 per pozzetto e coltivate a 37 ?C fino a raggiungere una confluenza del 70%. Il giorno del trattamento, le cellule sono state lavate una volta con DPBS caldo senza Mg2 e Ca2 (Gibco) e quindi affamate di siero per 4 ore con DMEM completo senza siero. Il BDNF espresso senza cellule ? stato prima diluito 1: 3 con DPBS senza Mg2 e Ca2 , quindi ulteriormente diluito a 1/1000. Le cellule sono state incubate per 2?30 min a 37 ? C, lisate con tampone contenente 50 mM HEPES, pH 8,0, 2% (v/v) SDS, 50 mM DTT e poste in ghiaccio o conservate a ?20 ? C fino all'uso per immunoblotting. Per l'imaging in fluorescenza, il giorno prima del trattamento, le cellule HEK293T-CMV-TrkB-CRE-GFP sono state seminate in poli-L-lisina trattata (37 ?C per 1 h con [finale] = 0,1 mg/mL) piastre da 24 pozzetti con una densit? di 2 x 105 per pozzetto. Il giorno del trattamento, le cellule sono state lavate una volta con DMEM completo senza FBS (1 mL) e incubate a 37 ?C per ca. 7 h fino al trattamento (500 ?l di volume finale). La sintesi priva di cellule di BDNF era come descritto in "trascrizione/traduzione in vitro". Dopo 7-12 ore di espressione priva di cellule a 30 ?C, la soluzione contenente BDNF ? stata diluita 1000 o 500 volte (da 4 a piega pre-diluizione) con PBS, prima dell'aggiunta alle cellule HEK293T. Successivamente, le cellule sono state manipolate come descritto nella sezione "Immunofluorescenza" (senza blocco o aggiunta di anticorpi). ;;Comunicazione tra cellule artificiali e cellule HEK293T ;;Le cellule eucariotiche sono state preparate come descritto sopra in "Funzionalit? del BDNF espresso senza cellule con HEK293T" per l'imaging in fluorescenza. L'unica eccezione ? che le cellule sono state seminate su piastre da 24 pozzetti trattate con poli-L-lisina (0,1 mg/mL, Sigma). Le cellule artificiali dello stesso gruppo sperimentale sono state preparate in quattro provette identiche da 1,5 mL, concentrate in singole fiale, incubate a 30 ?C per 5 he aggiunte sopra le cellule eucariotiche (senza Transwell). I campioni di cellule artificiali ed eucariotiche sono stati co-incubati a 37 ?C per ulteriori 16 ore. Successivamente, le cellule HEK293T sono state lavate due volte con 500 ?l di PBS per rimuovere le cellule artificiali. Da questo punto in poi, le cellule eucariotiche sono state trattate come descritto nelle sezioni "Immunofluorescenza" (senza blocco o aggiunta di anticorpi) e "Microscopia". ;;Coltura di cellule staminali neurali ;;Le cellule staminali neurali di topo (mNS) sono state derivate da cellule staminali embrionali murine come segue. Le cellule mNS venivano abitualmente passate ogni 3-4 giorni con un rapporto di 1: 3-1: 5 nel mezzo di auto-rinnovamento mNS composto da Euromed-N (Euroclone), integrato con supplemento di N2 (1% (v/v), Thermo Fisher), EGF (fattore di crescita epidermico) e bFGF (fattore di crescita dei fibroblasti di base) (entrambi 20 ng/ml, Peprotech) e GlutaMAX (2 mM, ThermoFisher Scientific). Per il passaggio, le cellule mNS sono state incubate con StemPro Accutase (ThermoFisher) e centrifugate a 260 g per 3 min. Il pellet ? stato risospeso in terreno fresco e inserito in contenitori di plastica trattati con colture. Per la differenziazione neuronale, le cellule mNS sono state esposte alle condizioni seguenti. In breve, 1 x 105 cellule/cm2 sono state seminate su recipienti di plastica trattati con coltura in terreno D1 composto da terreno Euromed-N (Euroclone) integrato con supplemento N2 (1% (v/v), Thermo Fisher), supplemento B27 (0,5% (v/v) ThermoFisher), fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) (10 ng/ml, Peprotech) e GlutaMAX (2 mM, ThermoFisher Scientific) e coltivato per 72 ore (0?3 giorni in vitro). Nessun BDNF ? stato aggiunto durante questo periodo. Le cellule sono state quindi staccate delicatamente come sopra e riseminate su piastre di plastica a 24 pozzetti rivestite di laminina (3 ?g/ml, ThermoFisher) a una densit? di 3,5 x 104 cellule/cm2 in mezzo D2 (miscela 1: 3 di DMEM/F ?12 e mezzo neurobasale, 0,5% (v/v) N2, 1% (v/v) B27, 10 ng/mL bFGF) per 96 h (4-6 giorni in vitro). Il giorno dopo la nuova semina (il giorno 4), sono stati avviati BDNF commerciale, cellule artificiali o trattamenti di reazione privi di cellule. Per la maturazione neuronale finale (7-16 giorni in vitro), il terreno ? stato passato al mezzo D3 (miscela 1:3 di DMEM/F-12 e mezzo neurobasale, 0,5% (v/v) N2, 1% (v/v) B27, 6,7 ng/mL bFGF) e rinnovato ogni tre giorni insieme al trattamento. Le cellule sono state confermate come micoplasma negative. ;;Funzionalit? del BDNF privo di cellule con cellule staminali neurali ;;Le cellule mNS sono state differenziate come descritto nella sezione "Colture di cellule staminali neurali" con le seguenti modifiche. Dal quarto giorno in vitro, fino alla fine della procedura di differenziazione, ? stata eseguita la reazione di sintesi di BDNF senza cellule come descritto sopra in "trascrizione/traduzione in vitro" per 7-12 ore a 30 ? C. Il BDNF espresso senza cellule ? stato fornito a concentrazioni crescenti ogni 72 ore con le seguenti diluizioni: 1/1000 (4-6 giorni in vitro), 1/750 (7-9 giorni in vitro) e 1/500 (10? 19 giorni in vitro). Il BDNF commerciale ? stato fornito a concentrazioni finali di 20 ng/mL, 30 ng/mL e 40 ng/mL. ;;Comunicazione tra cellule artificiali con cellule staminali neurali ;;Le cellule mNS sono state differenziate come nella sezione "Neural Stem Cell Culture" fino al giorno del trattamento. A partire dal primo giorno di trattamento con cellule artificiali, sono state utilizzate piastre Transwell a 24 pozzetti (Costar 3413, inserto da 6,5 mm, membrana in policarbonato da 0,4 ?m) con supporti permeabili per evitare le influenze del contatto diretto tra le cellule artificiali e le cellule staminali. Il mezzo di crescita ? stato aggiunto alla camera inferiore (500 ?l) e le cellule artificiali (100 ?l) sono state aggiunte alla camera superiore. Le cellule artificiali che producono BDNF contenevano DNA codificante BDNF a 20 nM e un altro plasmide che codificava LuxR e PFO a 10 nM. Ogni 72 ore, la quantit? totale di cellule artificiali ? aumentata di 1,5 volte in concentrazione. In tutti i casi, sono stati usati 10 ?M di 3OC6 HSL per indurre l'espressione di PFO. L'aggiunta di 3OC6 HSL dalla soluzione madre non ha mai dato una concentrazione di coltura finale di dimetilsolfossido (DMSO) superiore allo 0,1% (v/v). Ogni 24 h, 350 ?l di terreno sono stati sostituiti con mezzi freschi e le camere Transwell sono state accuratamente lavate con PBS prima di fornire cellule artificiali fresche. Da questo punto in poi, le cellule sono state gestite come descritto nelle sezioni "Immunocolorazione" e "Microscopia". La differenziazione neurale ? stata interrotta a 19 giorni dopo l'osservazione al microscopio che ha mostrato che livelli soddisfacenti di neuroni nelle colture sono stati raggiunti nelle colture di controllo positivo di riferimento (cio? colture mantenute in condizioni di differenziazione standard con BDNF commerciale). ;;Mantenimento degli embrioni di Xenopus laevis ;;Gli embrioni di Xenopus laevis sono stati ottenuti mediante fecondazione in vitro, allevati in 0,1x MMR (Marc?s Modified Ringer?s Solution) a pH 7,5 a 14-22 ?C e messi in scena secondo la letteratura precedente (Nieuwkoop & Faber, 1994). Tutti gli esperimenti su animali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano con autorizzazione n ? 546/2017 ? PR ai sensi dell'art. 31 del D.lgs. 26/2014. ;;Analisi dell?allungamento di assoni ;;Per le colture di espianto retinico di Xenopus, i vetrini coprioggetto (Bellco) o le piastre con fondo di vetro (MatTek) sono stati rivestiti con poli-L-lisina (Sigma, 10 ?g/mL diluito in acqua) e con laminina (Sigma, 10 ?g/mL) diluita in L-15 medio (Gibco). Occhi interi da embrioni anestetizzati sono stati microdissecati e coltivati a 20 ?C in terreno L-15 60% PSF [1% Antibiotico-Antimicotico (ThermoFisher)]. Il giorno prima del trattamento, le reazioni di sintesi di BDNF senza cellule sono state eseguite come descritto sopra nella sezione "trascrizione/traduzione in vitro" a 30 ? C per 7-12 h. Il BDNF espresso senza cellule e le reazioni di controllo negativo (la stessa reazione senza cellule ma priva del DNA che codifica per BDNF) sono state fornite a una diluizione di 1/200. Il BDNF commerciale (Peprotech) ? stato fornito a una concentrazione finale di 50-100 ng/mL. Tutte le condizioni sono state testate per la crescita all'interno dello stesso esperimento e con condizioni di coltura identiche. L'imaging e l'analisi sono stati eseguiti come indicato in "Microscopia". Uno z-stack di 10-12 piani di 0,7 ?m ? stato acquisito ogni 5 min per 35 min dando luogo a 8 punti temporali in totale. La velocit? media di ogni assone ? stata calcolata come la media della velocit? misurata per ogni punto temporale. Il software Fiji (ImageJ) ? stato utilizzato per analizzare le immagini a partire dai file.czi non elaborati. ? stato selezionato il miglior piano di messa a fuoco per ogni punto temporale. La distanza percorsa dall'assone da un punto temporale a quello successivo ? stata tracciata utilizzando il Plugin Tracking ? ManualTracking di ImageJ. ;Analisi di collasso ;;I test di collasso assonale delle cellule gangliari retiniche (RGC) sono stati eseguiti come segue. Un'aliquota (1?12,5 ?l) delle reazioni ? stata miscelata con 1x PBS fino a un volume finale di 100 ?l e applicata per 10 min agli assoni RGC coltivati in 400 ?l di terreno con coprioggetto come descritto nella sezione "Analisi dell'allungamento degli assoni". Prima dell'imaging, gli espianti sono stati fissati con formaldeide al 2% (v/v) (ThermoFisher) contenente il 7,5% (p/v) di saccarosio (preparato in 1x PBS) per 30 min e successivamente lavati tre volte con 1x PBS. Gli assoni sono stati ripresi come descritto nella sezione "Microscopia" e i coni di crescita collassati sono stati contati alla cieca per l'osservatore. Solo i singoli assoni che crescono individualmente dall'espianto dell'occhio sono stati presi in considerazione e analizzati per evitare influenze biologiche confondenti poich? le interazioni cellula-cellula possono fornire supporto trofico per gli assoni. I dati sono stati espressi come percentuale di coni di crescita collassati rispetto al numero totale di coni di crescita singoli contati. I coni di crescita erano considerati collassati quando i coni di crescita non avevano lamellipodio e erano inferiori o uguali a due filopodi (ciascuno inferiore o uguale a 2 ?m). ;;Stabilit? e tossicit? delle cellule artificiali ;Per l'analisi della tossicit? e della stabilit?, le cellule artificiali sono state preparate come descritto nella sezione "Generazione di cellule artificiali". Un'aliquota di cellule artificiali ? stata purificata su una colonna di sefarosio 4b come descritto in precedenza o analizzata mediante citometria a flusso alla diluizione 1:50. La stessa strategia di gating ? stata utilizzata come descritto nella sezione "Citometria a flusso". Per l'analisi della tossicit?, le cellule con sovraespressione di TrkB HEK293T sono state coltivate come descritto nella sezione "HEK293T Cell Culture" e seminate con una densit? di 4 x 104 o 4 x 104 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti o 24 pozzetti. La tossicit? ? stata valutata con il dosaggio del 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Dopo la co-incubazione con cellule artificiali in determinati momenti, il vecchio terreno di crescita ? stato aspirato e sostituito con terreno di crescita fresco non contenente FBS. Dopo l'aggiunta di 10 ?l di MTT per pozzetto in 200 ?l di volume finale, le cellule sono state incubate per 3,5 ore a 37 ?C. Il mezzo di crescita ? stato quindi sostituito con 200 ?l di DMSO per solubilizzare i sali di formazano. Dopo 15 minuti di incubazione con agitazione a 23 ? C, l'assorbanza ? stata letta a 590 nm, entro 1 ora dall'aggiunta di DMSO. Lo 0,5% (v/v) di Triton X-100 e 1 ?M di PFO ricombinante sono stati utilizzati come controlli negativi per valutare la morte cellulare completa. ;Il controllo positivo era il gruppo senza trattamento. La vitalit? cellulare percentuale ? stata valutata utilizzando questi due confini. ;;Immuno-macchie ;;Per esperimenti con estratti privi di cellule, le reazioni di trascrizione/traduzione in vitro sono state diluite con 2x tampone Laemmli fatto in casa e riscaldate a 95 ?C per 10 min. Un'aliquota ? stata caricata su SDS-PAGE all'11% e tamponata utilizzando sistemi di trasferimento a umido generici (300 mA, 2 h). Le membrane di nitrocellulosa (0,45 ?m, Bio ? Rad) sono state bloccate utilizzando il 5% (p/v) di latte in polvere non grasso (Bio ? Rad) in Tris Buffered Saline with Tween (TBST) contenente 0,1% (v/v) Tween ? 20 e incubato con anticorpo primario monoclonale ? ? FLAG (M2) prodotto nel topo (Sigma Aldrich, F3165) a 23 ?C per 1 ho 4 ?C per 16 h con una diluizione 1/5000 in 5% di latte in TBST. Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, le membrane sono state lavate 3 volte con TBST e incubate per 30?60 min a 23 ?C con anticorpo secondario policlonale ?-topo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) con diluizione 1/80.000 in latte al 5% in TBST. Quindi la membrana ? stata lavata 3 volte con TBST e il segnale di chemiluminescenza ? stato rilevato utilizzando reagenti ECL Select (GE Healthcare) con un Bio ? Rad ChemiDoc XRS e successivamente elaborato utilizzando il software ImageLab (Bio ? Rad). Per il western blotting di proteine da cellule eucariotiche, i lisati cellulari sono stati omogeneizzati con pi? passaggi attraverso un ago sterile misura 25 e caricati su SDS ? PAGE (5?50 ?L). Le condizioni di blotting e rilevamento erano identiche a quelle sopra, tranne per il fatto che le membrane di nitrocellulosa erano bloccate con 2,5% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA, Euroclone) o 3% di latte in TBST. Gli esperimenti con cellule eucariotiche hanno utilizzato anticorpi primari alle seguenti diluizioni: Phospho-ERK1/2 con diluizione 1/2000 in 2,5% BSA (Cell Signaling Technologies (CST), # 4370), totale-ERK1/2 con 1/2000 diluizione in 2,5 % di latte in TBST (CST # 9102), fosfo-PLC?1 con diluizione 1/2000 in 2,5% BSA (CST # 2821), totale-PLC?1 con 1/2000 diluizione in 2,5% latte/TBST (CST # 2822), Lamina A/C con diluizione 1/3200 in 2,5% di latte in TBST (Santa Cruz Biotechnologies), Calnexin con diluizione 1/2000 in 2,5% di latte in TBST (Santa Cruz Biotechnologies), ?III ? Tubulina con diluizione 1/1000 in 2,5% di latte in TBST (Promega, G712A), Caspase-3 scissa con diluizione 1/1000 in 2,5% di latte in TBST (CST, # 9661s). Gli anticorpi secondari coniugati con HRP sono stati forniti come segue: ? ? HRP di coniglio ? coniugato con diluizione 1/2000 in 2,5% BSA (Bio ? Rad), ? ? HRP di topo ? coniugato con diluizione 1/2000 in 2,5% BSA (Bio? Rad). ;;Immuno-fluorescenza ;Tutte le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% (p/v) dopo il trattamento. Dopo 15-20 minuti di incubazione a temperatura ambiente, le cellule sono state lavate tre volte con DPBS in eccesso (senza Ca2 e Mg2 ), successivamente permeabilizzate con 0,5% (v/v) Triton X-100 in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente e bloccate con 5% (p/v) FBS, 0,3% (v/v) Triton X-100 in PBS per 2 ore a temperatura ambiente. Le colture sono state quindi incubate per una notte a 4 ?C con anticorpi primari specifici (vedere sotto) diluiti con 2% FBS, 0,2% Triton X ? 100 in PBS. Le cellule sono state quindi lavate tre volte con PBS e incubate con gli anticorpi secondari appropriati descritti di seguito per 2 ore a temperatura ambiente. I nuclei sono stati controcolorati con 0,2 mg/mL di Hoechst 33258 per 20-30 minuti a temperatura ambiente e lavati tre volte con PBS in eccesso prima dell'imaging. Gli anticorpi primari sono stati forniti come segue: totale-TrkB con diluizione 1/1000 (Santa Cruz, sc-377218), ?III-Tubulina con diluizione 1/1000 (Promega, G712A), Caspase-3 scissa con diluizione 1/500 (CST, # 9661s), MAP2 con diluizione 1/300 (Chemicon ? Millipore, AB5622), GFAP con diluizione 1/1000 (DAKO, Z0334). Gli anticorpi secondari sono stati forniti come segue: ? ? coniglio AlexaFluor488 ? coniugato con diluizione 1/2000 (ThermoFisher), ? ? topo AlexaFluor633 ? coniugato con diluizione 1/2000 (ThermoFisher). ;Statistiche ;;Salvo diversa indicazione, tutte le analisi statistiche sono state eseguite con il software GraphPad Prism versione 7. Per gli esperimenti riguardanti il rilascio di Green Fluorescent Protein (GFP) da cellule artificiali, i dati degli esperimenti in presenza e in assenza di 3OC6 HSL provenivano dallo stesso lotto di vescicole. Pertanto, l'analisi statistica ha sfruttato un t-test appaiato invece di un t-test non appaiato. I citosol sono stati contati manualmente con Fiji (ImageJ) ei nuclei sono stati contati con Fiji (ImageJ) o con lo strumento Operetta (PerkinElmer). I numeri replicati, la dimensione della popolazione e i test statistici sono forniti nelle legende delle figure. Per l'analisi dell'immunofluorescenza e per il conteggio delle cellule GFP che esprimono le cellule HEK293T, sono state contate almeno 3.000 cellule per condizione per ogni antigene. Le cellule immunocolorate e che esprimono GFP sono state sottoposte a imaging con tempi di esposizione identici all'interno dello stesso esperimento ed esportate da file.czi non elaborati (software Zeiss Zen). L'elaborazione, le correzioni dell'istogramma e la quantificazione sono state eseguite con Fiji (ImageJ). I dati sono stati normalizzati dal numero totale di cellule in ogni campo e la distribuzione ? stata valutata per la normalit? utilizzando il test di Shapiro ? Wilk. La significativit? statistica ? stata determinata dall'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita da un test post-hoc di Dunnett o dal test t di Student a due code. Un valore p inferiore a 0,05 ? stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi sono state eseguite alla cieca per l'osservatore, ove possibile. ;In conclusione, un oggetto dell'invenzione ? un sistema biologico privo di cellule che sia compatibile e/o operante in condizioni fisiologiche in cui: ;- le sostanze chimiche anfifiliche incapsulano i contenuti interni del sistema, dove le sostanze chimiche anfifiliche comprendono il gruppo di testa idrofilo e le frazioni lipofile. ;- i contenuti interni del sistema comprendono un sistema di trascrizione/traduzione (TX/TL) privo di cellule e componenti chimici complementari solubilizzati in una soluzione interna, - l'osmolalit? complessiva della soluzione interna ? compresa tra circa 250 mOsm/kg H2O e circa 600 mOsm/kg H2O. ;- Il pH della soluzione interna ? compreso tra circa 6,5 e circa 8,2. ;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, i contenuti interni del sistema sono integrati da componenti esterni, sostanze chimiche, polipeptidi, terapie o farmaci. Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, i prodotti chimici anfifilici comprendono il lipide PEGilato o altro lipide stabilizzante. ;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, i prodotti chimici anfifilici comprendono 1-palmitoil-2-oleoilsn-glicero-3-fosfocolina (POPC). ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, i prodotti chimici anfifilici comprendono 1-palmitoil-2-oleoilsn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e colesterolo, in cui il rapporto tra 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero- La 3-fosfocolina (POPC) e il colesterolo sono compresi rispettivamente da 1: 0,16 a 1: 1 o da 1: 0,6 a 0,85 (peso/peso). ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, i prodotti chimici anfifilici comprendono inoltre 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil (polietilenglicole)-2000]. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il rapporto in peso di 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), colesterolo e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N - [biotinil (polietilenglicole) -2000] ? rispettivamente 1: 0,85: 0,01 (peso/peso). ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, i contenuti interni del sistema comprendono sequenze di DNA che codificano per il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), LuxR e perfringolisina O (PFO). ;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, i contenuti interni del sistema comprendono reagenti chimici e/o terapeutici. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il sistema ? in grado di comunicare con cellule viventi, in cui la cellula ospite/ricevente ? una cellula eucariotica. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, la cellula eucariotica ? una cellula di mammifero o una pluralit? di cellule comprese tramite un'interazione cellulare batterica intermedia. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, la soluzione interna del sistema e/o il sistema rileva una sostanza chimica, in cui la sostanza chimica rilevata: ;;? di origine eucariotica e/o procariotica, che pu? essere trovata in nicchie fisiologiche, ;;innesca la riprogrammazione trascrizionale nel sistema. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, la sostanza chimica ? 3-osso-esanoil-omoserinaelattone. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il BDNF viene rilasciato dal sistema solo in presenza di 3-ossoesanoil-omoserinaelattone. ;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, la sostanza chimica ? L-glutammato. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, la soluzione interna del sistema e/o del sistema sintetizza una sostanza chimica utile dal punto di vista medico in cui la sostanza chimica sintetizzata ?: ;;- - di origine eucariotica e/o procariotica, rintracciabili in nicchie fisiologiche, ;- - una piccola molecola o polipeptide. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, la soluzione interna del sistema e/o del sistema sintetizza un polipeptide associato alla membrana. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il polipeptide sintetizzato ? una proteina formante pori che richiede o non richiede colesterolo per la funzionalit? e utilizzata per il rilascio del contenuto interno dal sistema. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il polipeptide sintetizzato possiede polipeptidi di fusione N-terminale e/o C-terminale. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il polipeptide di fusione del polipeptide sintetizzato viene utilizzato per la digestione proteolitica facoltativa e l'eradicazione del sistema. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il polipeptide sintetizzato ha domini recettoriali che sono adatti per l'ingegneria proteica chimerica e/o il dominio del sensore utilizza un sistema di trasduzione del segnale a due componenti. ;;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il polipeptide ha un dominio del sensore che rileva una singolarit? o una pluralit? di un'entit?, in cui le entit? rilevate possono essere: ;;- di origine eucariotica e/o procariotica, rintracciabili in nicchie fisiologiche, ;- chimica, piccola molecola o polipeptide, o ;- radiazioni elettromagnetiche. ;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il sistema rilascia in modo controllabile sostanze chimiche, in cui la sostanza chimica rilasciata ?: ;- di origine eucariotica e/o procariotica, rintracciabili in nicchie fisiologiche, ;- piccola molecola o polipeptide, o ;- sintetizzato dal sistema o integrato come componente purificato. ;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il sistema sintetizza sostanze chimiche, dopo aver rilevato un'altra sostanza chimica. ;Secondo una forma di realizzazione preferita del sistema, il sistema rilascia sostanze chimiche, dopo aver rilevato un'altra sostanza chimica. ;Un altro scopo ? una composizione comprendente una pluralit? di sistemi biologici privi di cellule secondo quanto descritto sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, e una pluralit? di cellule eucariotiche. ;Secondo una forma di realizzazione preferita della composizione, la cellula eucariotica ? una cellula vegetale, di mammifero o umana. ;Un altro scopo ? un sistema biologico privo di cellule secondo quello descritto sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, o una composizione secondo quella divulgata sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, per l'uso in medicina. ;;Un altro oggetto ? un sistema biologico privo di cellule secondo quello descritto sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, o una composizione secondo quella divulgata sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, da utilizzare per suscitare cambiamenti fenotipici nelle cellule eucariotiche, inclusa la differenziazione neurale o il cambiamento in livelli di espressione genica o cambiamenti basati sulla segnalazione cellulare. ;;Un altro scopo ? un sistema biologico privo di cellule secondo quello descritto sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, o una composizione secondo quella divulgata sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, per segnalare malattie associate alla via nell'uomo. ;;Un altro scopo ? l'uso del sistema biologico privo di cellule secondo quello descritto sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, o una composizione secondo quella divulgata sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, per la somministrazione controllata di farmaci e/o sostanze chimiche. ;;Un altro scopo ? l'uso del sistema biologico privo di cellule secondo quello descritto sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, o una composizione secondo quella descritta sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, per sintetizzare e rilasciare in modo controllabile sostanze chimiche, polipeptidi, terapie o farmaci. ;;Un altro scopo ? l'uso del sistema biologico privo di cellule secondo quanto descritto sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, o una composizione secondo quella descritta sopra, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, in cui il sistema si integra o interagisce con le piante, in cui il sistema viene utilizzato per migliorare la resa delle colture, la maturazione, la resistenza agli agenti patogeni o per il trattamento di una variet? di malattie legate alla segnalazione cellulare nelle piante. ;;Un altro scopo ? un processo per la preparazione del sistema biologico privo di cellule secondo quanto sopra descritto, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, comprendente le seguenti fasi: ;;risospensione e agitazione meccanica della soluzione interna e dei componenti della membrana insieme, ;;purificazione ed eliminazione di materiali non incapsulati. ;;Un processo per la preparazione del sistema biologico privo di cellule secondo quanto sopra descritto, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, comprendente le seguenti fasi: ;;generando un monostrato di una sostanza chimica anfifilica, ;;applicare una forza centrifuga, in cui le soluzioni interne e/o esterne sono costituite da componenti fisiologicamente compatibili. ;Secondo una forma di realizzazione preferita dei suddetti processi, la soluzione interna: ;genera un gradiente di densit? della soluzione tra la soluzione interna ed esterna, ;ha una densit? maggiore o uguale alla soluzione esterna, e ha una forza ionica paragonabile alla soluzione esterna. Un altro scopo ? un processo per l'ottimizzazione dei contenuti interni del sistema biologico privo di cellule secondo quanto sopra descritto, inclusa qualsiasi forma di realizzazione preferita, in cui: ;uno o pi? acidi nucleici stampo vengono utilizzati entro un intervallo sufficiente per produrre polipeptidi, ;i codici di acido nucleico stampo per i componenti sono prodotti nell'intervallo 1-99% della forza/potenza relativa del promotore all'interno di un circuito genetico combinatorio, ;vengono utilizzati amminoacidi, rigenerazione energetica e/o componenti di soluzioni chimiche supplementari. *

Claims

RIVENDICAZIONI

1) Sistema biologico privo di cellule che ? compatibile con e/o opera in condizioni fisiologiche in cui:

a. le sostanze chimiche anfifiliche incapsulano i contenuti interni del sistema, dove le sostanze chimiche anfifiliche comprendono il gruppo della testa idrofilo e le frazioni lipofile,

b. i contenuti interni del sistema comprendono il sistema di trascrizione/traduzione (TX/TL) privo di cellule e componenti chimici complementari solubilizzati in una soluzione interna,

c. l'osmolalit? complessiva della soluzione interna ? compresa tra circa 250 mOsm/kg H2O e circa 600 mOsm/kg H2O,

d. il pH della soluzione interna ? compreso tra circa 6,5 e circa 8,2.

2) Sistema secondo la rivendicazione 1, in cui i contenuti interni del sistema sono integrati da componenti esterni, prodotti chimici, polipeptidi, terapie o farmaci.

3) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, in cui i prodotti chimici anfifilici comprendono PEGilato o altro lipide stabilizzante.

4) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui i prodotti chimici anfifilici comprendono 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC).

5) Sistema secondo la rivendicazione 4, in cui i prodotti chimici anfifilici comprendono 1-palmitoil-2-oleoil-snglicero-3-fosfocolina (POPC) e colesterolo, in cui il rapporto tra 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e colesterolo ? compreso rispettivamente nei valori da 1:0,16 a 1:1 o da 1:0,6 a 1:0,85 (peso/peso).

6) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 5, in cui i prodotti chimici anfifilici comprendono inoltre 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000].

7) Sistema secondo la rivendicazione 6, in cui il rapporto in peso tra 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), colesterolo e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000] ? rispettivamente 1:0,85:0,01 (peso/peso).

8) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui il contenuto interno del sistema comprende sequenze di DNA che codificano il Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), LuxR e Perfringolysin O (PFO).

9) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui il contenuto interno del sistema comprende reagenti chimici e/o terapeutici.

10) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, in grado di comunicare con cellule viventi, in cui la cellula ospite/ricevente ? una cellula eucariotica.

11) Sistema secondo la rivendicazione 10, in cui la cellula eucariotica ? cellula di mammifero o una pluralit? di cellule anche tramite un'interazione cellulare batterica intermedia.

12) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui la soluzione interna del sistema e/o il sistema rileva una sostanza chimica, in cui la sostanza chimica rilevata:

a. ? di origine eucariotica e/o procariotica, che pu? essere trovata in nicchie fisiologiche,

b. innesca la riprogrammazione trascrizionale nel sistema.

13) Sistema secondo la rivendicazione 12, in cui la sostanza chimica ? 3-osso-esanoil-omoserinaelattone.

14) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 12 a 13, in cui BDNF viene rilasciato dal sistema solo in presenza di 3-osso-esanoil-omoserinaelattone.

15) Sistema secondo la rivendicazione 12, in cui la sostanza chimica ? L-glutammato.

16) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15, in cui la soluzione interna del sistema e/o del sistema sintetizza una sostanza chimica utile dal punto di vista medico in cui la sostanza chimica sintetizzata ?: a. di origine eucariotica e/o procariotica, riscontrabili in nicchie fisiologiche,

b. una piccola molecola o polipeptide.

17) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 16, in cui la soluzione interna del sistema e/o del sistema sintetizza un polipeptide associato alla membrana.

18) Sistema secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui il polipeptide sintetizzato ? una proteina formatrice di pori che richiede o non richiede colesterolo per la funzionalit? e utilizzata per il rilascio del contenuto interno dal sistema.

19) Sistema secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui il polipeptide sintetizzato possiede polipeptidi di fusione N-terminale e/o C-terminale.

20) Sistema secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui il polipeptide di fusione del polipeptide sintetizzato viene utilizzato per la digestione proteolitica opzionale e l'eradicazione del sistema.

21) Sistema secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui il polipeptide sintetizzato ha domini recettoriali che sono adatti per l'ingegneria proteica chimerica e/o il dominio del sensore utilizza un sistema di trasduzione del segnale a due componenti.

22) Sistema secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui il polipeptide ha un dominio sensore che rileva una singolarit? o una pluralit? di un'entit?, in cui le entit? rilevate possono essere:

a. di origine eucariotica e/o procariotica, riscontrabili in nicchie fisiologiche,

b. chimica, piccola molecola o polipeptide, o

c. radiazioni elettromagnetiche.

23) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 22, in cui il sistema rilascia in modo controllabile sostanze chimiche, in cui la sostanza chimica rilasciata ?:

b. piccola molecola o polipeptide, o

c. sintetizzata dal sistema o integrata come componente purificato.

24) Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 23, in cui il sistema sintetizza sostanze chimiche, dopo aver rilevato un'altra sostanza chimica.

25) Un sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 24, in cui il sistema rilascia sostanze chimiche, dopo aver rilevato un'altra sostanza chimica.

26) Composizione comprendente una pluralit? di sistemi biologici privi di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 e una pluralit? di cellule eucariotiche.

27) Composizione secondo la rivendicazione 26, in cui la cellula eucariotica ? cellula vegetale, mammifero o umana.

28) Sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 o una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 26 a 27, per uso in medicina.

29) Sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25, o una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 26 a 27, da utilizzare per suscitare cambiamenti fenotipici nelle cellule eucariotiche, inclusa la differenziazione o il cambiamento neurale nei livelli di espressione genica o nei cambiamenti basati sulla segnalazione cellulare.

30) Sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 o una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 26 a 27, per la segnalazione di malattie associate alla via nell'uomo.

31) Uso del sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 o di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 26 a 27, per somministrazione controllata di farmaci e/o sostanze chimiche.

32) Uso del sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 o di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 26 a 27, per sintetizzare e rilasciare in modo controllabile sostanze chimiche, polipeptidi, terapie o farmaci.

33) Uso del sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 o di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 26 a 27, in cui il sistema si integra o interagisce con il sistema immunitario dell'ospite compreso di cellule eucariotiche.

34) Uso del sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 o di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 26 a 27, in cui il sistema si integra o interagisce con le piante, in cui il sistema ? utilizzato per migliorare la resa delle colture, la maturazione, la resistenza agli agenti patogeni o per il trattamento di una variet? di malattie legate alla segnalazione cellulare nelle piante.

35) Processo per la preparazione del sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 comprendente le seguenti fasi:

1. ri-sospensione e agitazione meccanica della soluzione interna e dei componenti della membrana insieme,

2. purificazione ed eliminazione dei materiali non incapsulati.

36) Un processo per la preparazione del sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25 comprendente le seguenti fasi:

1. generazione di un monostrato di una sostanza chimica anfifilica,

2. applicazione di una forza centrifuga, in cui le soluzioni interne e/o esterne sono costituite da componenti fisiologicamente compatibili.

37) Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 35 a 36, in cui la soluzione interna:

a. genera un gradiente di densit? della soluzione tra la soluzione interna ed esterna,

b. ha una densit? maggiore o uguale alla soluzione esterna, e

c. ha una forza ionica paragonabile alla soluzione esterna.

38) Processo per l'ottimizzazione dei contenuti interni del sistema biologico privo di cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 25, in cui:

a. uno o pi? acidi nucleici stampo vengono utilizzati entro un intervallo sufficiente a produrre polipeptidi, b. i codici degli acidi nucleici stampo per i componenti sono prodotti nell'intervallo 1 - 99% della forza/potenza relativa del promotore all'interno di un circuito genetico combinatorio,

c. vengono utilizzati amminoacidi, rigenerazione energetica e/o componenti di soluzioni chimiche supplementari.