CN116688099A - 一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物和应用 - Google Patents

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CN116688099A CN202310665377.8A CN202310665377A CN116688099A CN 116688099 A CN116688099 A CN 116688099A CN 202310665377 A CN202310665377 A CN 202310665377A CN 116688099 A CN116688099 A CN 116688099A
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Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物和应用，属于溶栓药物技术领域。本发明提供了一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物，活性成分包括大麻二酚和成纤维细胞生长因子21，FGF21抗凝和溶栓，CBD舒张血管，且没有出血风险。FGF21和CBD的药物半衰期长，可透过血脑屏障，在溶栓同时保护血管内皮细胞，两种药物联用达到协同增效的效果：可升高血液中和/或D‑Dimer的水平、降低血液中TNF‑α和/或IL‑1β的水平、升高血液中tPA和/或uPA的水平、降低血液中PAI‑1的水平，从而降低血浆中纤维蛋白原水平、抑制炎症反应、增强溶纤能力，达到抑制血栓发生、抑制血栓发展程度的效果。

Description

一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物和应用
技术领域
本发明属于溶栓药物技术领域，具体涉及一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物和应用。
背景技术
血栓是指血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和红细胞组成。正常情况下，血液本身具有可凝固性，帮助人体在外伤、流血情况下发挥局部凝固、止血等作用，但凝血过程中若凝血-抗凝机制平衡被破坏，便可导致血栓形成。血栓可发生于动脉、静脉、毛细血管等整个循环系统部位，患有肿瘤、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病、血管炎等疾病可增加血栓发生风险。
近年来，可能由于诊断意识和诊治水平的提高，导致漏诊率和误诊率下降，使得我国血栓性疾病的患病人数明显上升。血栓的患者可以选择药物治疗、介入治疗以及手术治疗等方式进行治疗。药物治疗如抗血小板药物(阿司匹林片等)或溶栓剂等，能够有效的抑制血小板聚集、抗凝等；介入治疗则是通过大血管将支架等器械放置到血栓发生的部位，能够取出血栓，撑开狭窄的血管，能够起到疏通血管，改善组织血液供应的作用；手术治疗则是通过手术的方式，切开病变的血管取出血栓，以起到根治的作用。
但是目前的药物治疗，包括阿司匹林易产生不同程度的耐药性，溶栓剂，如尿激酶和重组组织型纤溶酶原激活剂等，存在半衰期短、副作用大、价格昂贵和溶栓时间窗窄等不足，导致治疗后复发率较高。因此寻找安全性高、疗效好、经济适用的溶栓药物具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物和应用，创造性地将大麻二酚(CBD)和成纤维细胞生长因子21(FGF21)联合用药，达到了协同增效作用，溶栓的同时保护血管内皮细胞。
本发明提供了一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物，活性成分包括大麻二酚和成纤维细胞生长因子21。
优选的，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
优选的，所述成纤维细胞生长因子21为如下(a)或(b)：
(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有治疗和/或预防血栓的功能的衍生蛋白质；
(c)与(a)所述蛋白质或(b)所述衍生蛋白质的氨基酸序列具有至少80％同源性且具有相同功能的蛋白质。
本发明还提供了上述联合用药物在制备以下至少一项所述制剂中的应用，所述制剂包括：
(1)用于升高血液中D-Dimer水平的制剂；
(2)用于降低血液中炎症因子水平的制剂；
(3)用于升高血液中组织型纤溶酶原激活剂水平的制剂；
(4)用于降低血液中纤溶酶原激活物抑制剂水平的制剂；
(5)保护血管内皮细胞的制剂。
优选的，所述炎症因子包括TNF-α和/或IL-1β；
所述组织型纤溶酶原激活剂包括tPA和/或uPA；
所述纤溶酶原激活物抑制剂包括PAI-1。
优选的，所述制剂中，大麻二酚以醇溶液为溶剂，成纤维细胞生长因子21以缓冲溶液为溶剂。
优选的，所述制剂中，大麻二酚的用量为2.5～10mg/kg，所述成纤维细胞生长因子21的用量为0.5～5mg/kg。
本发明还提供了上述联合用药物在制备以下至少一项所述药物中的应用，所述药物包括：
1)抑制血栓发生的药物；
2)抑制血栓发展的药物；
3)降低血浆中纤维蛋白原水平的药物；
4)抑制炎症反应的药物；
5)增强溶纤能力的药物；
6)保护血管内皮细胞的药物。
优选的，所述药物的给药形态包括针剂。
优选的，所述药物的给药途径包括：成纤维细胞生长因子21注射，大麻二酚注射或内服。
有益效果：本发明提供了一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物，活性成分包括大麻二酚和成纤维细胞生长因子21，所述FGF21发挥抗凝和溶栓作用，CBD舒张血管，且没有出血风险。FGF21和CBD的药物半衰期长，可透过血脑屏障，在溶栓同时保护血管内皮细胞，两种药物联用达到协同增效的效果，工艺成熟且成本较当前市售溶栓剂低。经实施例验证，所述联合用药物可升高血液中和/或D-Dimer的水平、降低血液中TNF-α和/或IL-1β的水平、升高血液中tPA和/或uPA的水平、降低血液中PAI-1的水平，从而降低血浆中纤维蛋白原水平、抑制炎症反应、增强溶纤能力，达到抑制血栓发生、抑制血栓发展程度的效果。
附图说明
图1为hFGF21类似物溶液的聚丙烯凝胶电泳图；
图2为FeCl3诱导小鼠颈动脉后所取的颈动脉组织切片的HE染色结果图，黑色箭头所指为血栓；
图3为D-Dimer基因的表达水平统计结果图；
图4为TNF-α和IL-1β基因的表达水平结果图；A为ELISA检测TNF-α蛋白的结果土；B为ELISA检测IL-1β蛋白的结果图；
图5为tPA和uPA基因的表达水平结果图；A为ELISA检测tPA蛋白的结果图；B为ELISA检测uPA蛋白的结果图；
图6为PAI-1基因的表达水平结果图；
图7为血管内皮细胞凋亡检测结果图；
图8为FGF21半衰期实验结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物，活性成分包括大麻二酚和成纤维细胞生长因子21。
本发明所述联合用药是为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用，其具有发挥药物的协同治疗作用以提高疗效、延迟或减少耐药性的发生、减少给药剂量从而降低毒副反应的优点。因此选择适合的药物组合对于改善溶栓治疗的不足具有重要意义。本发明所述成纤维细胞生长因子21优选为如下(a)或(b)：
(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有治疗和/或预防血栓的功能的衍生蛋白质；
(c)与(a)所述蛋白质或(b)所述衍生蛋白质的氨基酸序列具有至少80％同源性且具有相同功能的蛋白质。
本发明对所述FGF21的来源并没有特殊限定，可为本领域的常规市售产品，也可为利用表达系统表达并纯化后得到的蛋白质，实施例中采用原核表达的方式为例进行说明，但是并不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明利用原核表达构建重组FGF21(hFGF21)的方法优选包括：将所述FGF21的编码基因克隆入原核表达载体，然后表达得到所述融合蛋白；收集所述融合蛋白，进行亲和层析后得到所述hFGF21类似物。本发明所述编码基因的核苷酸序列优选包括以下任一项：SEQ ID No.2所示的DNA分子；或在严格条件下SEQIDNo.1所示的DNA分子杂交且编码所述hFGF21的DNA分子；或与上述两种DNA分子具有至少80％同源性且编码所述hFGF21的DNA分子。
本发明所述联合用药物除包含上述活性成分外，还包括药学上可接受的载体和/或辅料，如可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和/或添加剂等。本发明所述联合用药物的给药形态可为针剂，如粉剂、水剂或油剂等，所述药物的给药途径可为注射或内服，所述注射优选包括皮下注射、静脉注射或肌肉注射。本发明对所述联合用药物的制备方法并没有特殊限定，利用本领域技术人员所熟知的制备方法制备得到对应的剂型。本发明所述联合用药物进行给药时，两个活性成分单独给药，因为2者不溶于同一溶剂，CBD需醇溶，hFGF21 PBS溶即可，hFGF21可通过腹腔或静脉给药，CBD可通过腹腔或灌胃给药。本发明在给药时，所述FGF21的有效浓度是0.5～5mg/kg，CBD的有效浓度是2.5～10mg/kg。本发明实施例中进行联合给药时，先将FGF21注射小鼠，再注射CBD，联合用药物最佳的摩尔比为2:1。
本发明还提供了上述联合用药物在制备以下至少一项所述制剂中的应用，所述制剂包括：
(1)用于升高血液中D-Dimer水平的制剂；
(2)用于降低血液中炎症因子水平的制剂；
(3)用于升高血液中组织型纤溶酶原激活剂水平的制剂；
(4)用于降低血液中纤溶酶原激活物抑制剂水平的制剂；
(5)保护血管内皮细胞的制剂。
在本发明中，D-Dimer是纤维蛋白单体经FXIII交联后，再经纤溶酶水解产生的特异性降解产物，主要反映纤维蛋白的溶解能力，是特异性的纤溶过程标志物。实施例中证实模型对照组小鼠D-Dimer含量升高；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组D-Dimer含量显著升高，联合给药组D-Dimer含量进一步升高。结果表明，联合给药组促进血栓小鼠体内的纤维蛋白降解能力优于单独给药组。
炎症参与凝血过程的许多环节，不仅从内源性途径发挥作用，还可从外源性凝血途径发挥作用。TNF-α由激活的单核巨噬细胞产生，能改变内皮细胞的通透性，损害内皮细胞，引起血管功能障碍，进一步加剧血栓形成。IL-1β由多种细胞分泌的作用于血管的细胞因子，刺激肝脏产生PAI-1，降低纤溶能力，促进血小板聚集和血栓形成。本发明实施例中，模型对照组小鼠TNF-α和IL-1β表达水平显著升高，即炎症反应过度激活；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组TNF-α和IL-1β表达水平显著降低，联合给药组TNF-α和IL-1β表达水平进一步降低。结果表明，联合给药组抑制血栓小鼠体内的炎症反应能力优于单独给药组。
体内纤溶系统的生理性激动剂，如tPA和uPA属于丝氨酸蛋白酶，在tPA或uPA作用下，将无生物活性的纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，进而水解纤维蛋白。本发明实施例中，模型对照组小鼠tPA和uPA表达水平升高，即小鼠自体有纤溶能力但不足以缓解血栓发生发展；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组tPA和uPA表达水平升高，联合给药组tPA和uPA表达水平显著升高。结果表明，联合给药组促进血栓小鼠体内纤维蛋白溶解能力优于单独给药组。
PAI-1是纤溶系统中一个重要的负反馈调节因子，PAI-1能快速降低tPA的活性，两者结合形成无活性的复合物，调节纤溶过程。本发明实施例中，模型对照组小PAI-1表达水平显著升高，即小鼠纤溶能力被抑制；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组PAI-1表达水平显著降低，联合给药组PAI-1表达进一步显著降低。结果表明，联合给药组降低PAI-1的表达水平，进而使血浆中游离的tPA活性升高，提高小鼠纤溶能力优于单独给药组。
本发明还提供了上述联合用药物在制备以下至少一项所述药物中的应用，所述药物包括：
1)抑制血栓发生的药物；
2)抑制血栓发展的药物；
3)降低血浆中纤维蛋白原水平的药物；
4)抑制炎症反应的药物；
5)增强溶纤能力的药物；
6)保护血管内皮细胞的药物。
由实施例可知，本发明所述联合用药物相比于单独给药，可显著抑制血栓发生、发展，并降低血浆中纤维蛋白原水平、抑制炎症反应，并增强溶纤能力。因此可将其作为药物应用于血栓的预防和/或治疗。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的试验材料，如无特殊说明，均可自常规生化试剂商店购买得到。本发明实施例中所涉及的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
原核表达载体为pSUMO：LifeSensors Inc，Cat.No.1005,1006。
SUMO蛋白酶：索莱宝，P2070。
大肠杆菌Rosetta(DE3)：北京全式金生物技术有限公司，目录号CD801。
雄性昆明小鼠：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心。
三氯化铁：Sigma-Aldrich公司；CAS号7705-08-0。
大麻二酚(CBD)：罗恩试剂，13956-29-1。
AccuPrimeTM Taq高保真DNA聚合酶：Thermo Fisher，12346086。
PBS缓冲液(pH 7.2)：溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L。
HepG2细胞(人肝癌细胞)：上海艾研生物科技有限公司。
EA.hy 926细胞(脐静脉血管内皮细胞)：武汉普诺赛生命科技有限公司。
实施例1
原核表达FGF21蛋白
一、重组质粒pSUMO-hFGF21的构建
1、合成SEQ ID No.2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1得到的双链DNA分子为模板，采用P1(SEQ ID No.3)和P2(SEQ ID No.4)组成的引物对，采用AccuPrimeTM Taq高保真DNA聚合酶，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
P1：5′-GGTCTCTAGGTATGGACTCGGACGAGACCGGGTT-3′；
P2：5’-CGCGGATCCTTA GGAAGCGTAGCTGGGGCTTAGG-3。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃30s、56℃30s、72℃60s，25个循环；72℃延伸10min。
3、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BsaI和BamHI双酶切原核表达载体pSUMO，回收约5700bp的载体片段。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pSUMO-hFGF21。重组质粒pSUMO-hFGF21表达融合蛋白即载体上的分子伴侣SUMO编码序列，His标签编码序列和hFGF21序列(融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和hFGF21成熟肽)。
二、hFGF-21成熟肽的制备和纯化
1、将重组质粒pSUMO-hFGF21导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌的单菌落接种至5mL LB培养基中，37℃、120rpm振荡培养10h，然后取菌液，以1:100的体积比接种于500mL含50mg/mL青霉素的LB培养基中，37℃、120rpm振荡培养2h，此时OD600为0.5左右。
3、向步骤2得到的菌液中加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L以进行诱导(30℃、70rpm振荡培养6h)，然后4℃、4000rpm离心30min，收集菌体。
4、取步骤3得到的菌体，进行超声破碎(AMP35％，8～12min，工作1s停1s)，4℃、12000rpm离心，分别收集上清液和沉淀。
分别将上清液和沉淀进行12％SDS-PAGE电泳分析。
5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为10mL。
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L咪唑、500mmol/LNaCl和50mmol/LNa3PO4；pH7.4)洗脱以去除杂蛋白，流速为1mL/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/LNa3PO4；pH7.4)洗脱，流速为1mL/min，280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于80mAU的峰)，即为融合蛋白溶液。
6、采用HiPrepTM 26/10Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶(SUMO蛋白酶与融合蛋白的摩尔比为1:50)和终浓度为2mmol/L的DTT 4℃切割过夜。
8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为15mL，280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于30mAU的峰)，即为hFGF21成熟肽溶液。
hFGF21成熟肽溶液的聚丙烯凝胶电泳结果如图1所示(泳道M为分子量标记，泳道2为hFGF21成熟肽溶液)。回收目的带并进行N端测序，结果表明，N端前15个氨基酸残基如SEQID No.1自N末端第1至15位氨基酸残基所示。
实施例2
联合用药对血栓的治疗作用
1、小鼠实验设计
小鼠经适应性饲养1周后，随机分为4组，每组8只，分别进行如下平行处理：
模型对照组：试验第1～7天，每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液，单次注射体积为0.2mL；每天上午10:00左右PBS溶液，单次灌胃体积为1mL；试验第七日上午9:00左右腹腔注射一次10％水合氯醛麻醉；分离左侧颈总动脉2cm，下方置小片塑料薄膜(3×1.5cm)，用于保护血管周围组织，将吸有2.16mol/LFeCl3溶液的小滤纸片(1×1cm)敷于暴露的动脉表面上，滤纸片要紧贴血管壁；
CBD单独给药组：试验第1～7天，每天上午8:00左右灌胃CBD溶液，5mg CBD/kg体重，单次灌胃体积为1mL；试验第七日上午9:00左右腹腔注射一次10％水合氯醛麻醉；分离左侧颈总动脉2cm，下方置小片塑料薄膜(3×1.5cm)，用于保护血管周围组织，将吸有2.16mol/LFeCl3溶液的小滤纸片(1×1cm)敷于暴露的动脉表面上，滤纸片要紧贴血管壁；
hFGF21单独给药组：试验第1～7天，每天上午8:00左右腹腔注射hFGF21成熟肽溶液(用PBS缓冲液调整蛋白浓度)，单次注射剂量为2mg hFGF21成熟肽(以总蛋白计)/kg体重，单次注射体积为0.2mL；试验第七日上午9:00左右腹腔注射一次10％水合氯醛麻醉；分离左侧颈总动脉2cm，下方置小片塑料薄膜(3×1.5cm)，用于保护血管周围组织，将吸有2.16mol/LFeCl3溶液的小滤纸片(1×1cm)敷于暴露的动脉表面上，滤纸片要紧贴血管壁；
联合给药治疗组：试验第1～7天，每天上午8:00左右腹腔注射FGF-21成熟肽溶液(用PBS缓冲液调整蛋白浓度)，单次注射剂量为0.5mg hFGF21成熟肽(以总蛋白计)/kg体重，单次注射体积为0.2mL；每天上午10:00左右灌胃CBD溶液，2.5mg CBD/kg体重，单次灌胃体积为1mL；试验第七日上午9:00左右腹腔注射一次10％水合氯醛麻醉；分离左侧颈总动脉2cm，下方置小片塑料薄膜(3×1.5cm)，用于保护血管周围组织，将吸有2.16mol/LFeCl3溶液的小滤纸片(1×1cm)敷于暴露的动脉表面上，滤纸片要紧贴血管壁；
正常对照组：试验第1～7天，每天上午8:00左右皮下注射PBS缓冲液，单次注射体积为0.2mL；每天上午10:00左右PBS溶液，单次灌胃体积为1mL；试验第七日上午9:00左右腹腔注射一次10％水合氯醛麻醉；分离左侧颈总动脉2cm，下方置小片塑料薄膜(3×1.5cm)，用于保护血管周围组织，将吸有PBS溶液的小滤纸片(1×1cm)敷于暴露的动脉表面上，滤纸片要紧贴血管壁；
作用90s后去掉滤纸(从敷上滤纸片开始计时)，剪下血栓发生部位的血管，再从右侧颈总动脉采取血，3000r/min4℃离心15min，取上清血浆用于检测；
试验第7天，麻醉处死小鼠，分别取小鼠全血和颈动脉组织。
2、脐静脉血管内皮细胞EA.hy 926的实验设计
EA.hy 926细胞常规培养，培养基为含有10％牛血清的DMEM，分别进行如下平行处理：
模型对照组：将细胞接种到6孔板中，待细胞汇合度达到70％-80％时，更换无血清培养液，饥饿培养24小时，每孔加入LPS(1000μg/mL)继续培养12小时；
CBD单独给药组：将细胞接种到6孔板中，待细胞汇合度达到70％-80％时，更换无血清培养液，饥饿培养24小时，每孔加入LPS(1000μg/mL)和CBD(5μM)继续培养12小时；
hFGF21单独给药组：将细胞接种到6孔板中，待细胞汇合度达到70％-80％时，更换无血清培养液，饥饿培养24小时，每孔加入LPS(1000μg/mL)和hFGF21(1μM)继续培养12小时；
联合给药治疗组：将细胞接种到6孔板中，待细胞汇合度达到70％-80％时，更换无血清培养液，饥饿培养24小时，每孔加入LPS(1000μg/mL)、hFGF21(0.1μM)和CBD(1.25μM)继续培养12小时；
正常对照组：将细胞接种到6孔板中，待细胞汇合度达到70％-80％时，更换无血清培养液，饥饿培养24小时，每孔加入等体积PBS继续培养12小时。
3、检测及结果
3.1对FeCl3诱导的颈动脉血栓造模后所取的颈动脉切片进行显微观察，结果如图2所示：模型对照组小鼠颈动脉内均可见血栓形成；与模型对照组相比，CBD和hFGF21单独给药组小鼠颈动脉内血栓程度降低，而CBD和hFGF21联合给药组小鼠颈动脉内血栓程度低于单独给药组。结果表明，CBD和hFGF21联合给药可以显著抑制血栓的形成。
3.2D-Dimer含量测定小鼠右侧颈总动脉取血，3000r/min 4℃离心15min，取上清血浆，ELISA检测D-Dimer含量，结果如图3所示：模型对照组小鼠D-Dimer含量升高；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组D-Dimer含量显著升高，联合给药组D-Dimer含量进一步升高。结果表明，联合给药组促进血栓小鼠体内的纤维蛋白降解能力优于单独给药组。
3.3炎症因子表达量测定小鼠右侧颈总动脉取血，3000r/min 4℃离心15min，取上清血浆，ELISA分别检测TNF-α蛋白和IL-1β蛋白的表达水平，结果如图4所示：模型对照组小鼠TNF-α和IL-1β表达水平显著升高，即炎症反应过度激活；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组TNF-α和IL-1β表达水平显著降低，联合给药组TNF-α和IL-1β表达水平进一步降低。结果表明，联合给药组抑制血栓小鼠体内的炎症反应能力优于单独给药组。
3.4体内纤溶系统的生理性激动剂表达含量测定小鼠右侧颈总动脉取血，3000r/min 4℃离心15min，取上清血浆，ELISA分别检测tPA蛋白和uPA蛋白的含量，结果见如图5所示：模型对照组小鼠tPA和uPA表达水平升高，即小鼠自体有纤溶能力但不足以缓解血栓发生发展；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组tPA和uPA表达水平升高，联合给药组tPA和uPA表达水平显著升高。结果表明，联合给药组促进血栓小鼠体内纤维蛋白溶解能力优于单独给药组。
3.5血液中纤溶酶原激活物抑制剂水平测定小鼠右侧颈总动脉取血，3000r/min 4℃离心15min，取上清血浆，ELISA检测PAI-1蛋白的结果如图6所示：模型对照组小PAI-1表达水平显著升高，即小鼠纤溶能力被抑制；与模型对照组相比，CBD单独给药组和hFGF21单独给药组PAI-1表达水平显著降低，联合给药组PAI-1表达进一步显著降低。结果表明，联合给药组降低PAI-1的表达水平，进而使血浆中游离的tPA活性升高，提高小鼠纤溶能力优于单独给药组。
3.6EA.hy 926细胞凋亡检测收集各组细胞，用Annexin-FITC和PI双染细胞，经流式细胞仪检测结果如图7所示：正常对照组细胞凋亡为1.8％，模型组细胞凋亡为6.9％；CBD和FGF21单独给药细胞凋亡分别为5.9％和3.4％，而CBD和FGF21联合给药组细胞凋亡为0.9％。结果表明，联合给药组抑制血管内皮细胞凋亡能力优于单独给药组。
3.7FGF21在小鼠体内半衰期检测小鼠药代动力学结果如图8所示：腹腔单次注射FGF21，小鼠给药后12h达到血药浓度峰值，t1/2为13.2h；腹腔单次注射FGF21和CBD，小鼠给药后18h达到血药浓度峰值，t1/2为19.5h。结果表明，联合给药组药物半衰期较单独给药组长。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种预防和/或治疗血栓疾病的联合用药物，其特征在于，活性成分包括大麻二酚和成纤维细胞生长因子21。
2.根据权利要求1所述联合用药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
3.根据权利要求1所述联合用药物，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子21为如下(a)或(b)：
(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有治疗和/或预防血栓的功能的衍生蛋白质；
(c)与(a)所述蛋白质或(b)所述衍生蛋白质的氨基酸序列具有至少80％同源性且具有相同功能的蛋白质。
4.权利要求1～3任一项所述联合用药物在制备以下至少一项所述制剂中的应用，所述制剂包括：
(1)用于升高血液中D-Dimer水平的制剂；
(2)用于降低血液中炎症因子水平的制剂；
(3)用于升高血液中组织型纤溶酶原激活剂水平的制剂；
(4)用于降低血液中纤溶酶原激活物抑制剂水平的制剂；
(5)保护血管内皮细胞的制剂。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述炎症因子包括TNF-α和/或IL-1β；
所述组织型纤溶酶原激活剂包括tPA和/或uPA；
所述纤溶酶原激活物抑制剂包括PAI-1。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述制剂中，大麻二酚以醇溶液为溶剂，成纤维细胞生长因子21以缓冲溶液为溶剂。
7.根据权利要求4或6所述应用，其特征在于，所述制剂中，大麻二酚的用量为2.5～10mg/kg，所述成纤维细胞生长因子21的用量为0.5～5mg/kg。
8.权利要求1～3任一项所述联合用药物在制备以下至少一项所述药物中的应用，所述药物包括：
1)抑制血栓发生的药物；
2)抑制血栓发展的药物；
3)降低血浆中纤维蛋白原水平的药物；
4)抑制炎症反应的药物；
5)增强溶纤能力的药物；
6)保护血管内皮细胞的药物。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物的给药形态包括针剂。
10.根据权利要求8或9所述应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括：成纤维细胞生长因子21注射，大麻二酚注射或内服。
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