JPS6148918B2 - - Google Patents
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- JPS6148918B2 JPS6148918B2 JP58061028A JP6102883A JPS6148918B2 JP S6148918 B2 JPS6148918 B2 JP S6148918B2 JP 58061028 A JP58061028 A JP 58061028A JP 6102883 A JP6102883 A JP 6102883A JP S6148918 B2 JPS6148918 B2 JP S6148918B2
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、ウロキナーゼを高純度高収率に精製
するためのアフイニテイークロマトグラフイー用
の新規吸着体に関する。 ウロキナーゼは人尿中に微量存在する酵素であ
り、これを分離し、高度に精製した製剤は人間に
投与した時優れた血栓溶解促進作用を示し、ま
た、制癌剤と併用することによりその制癌作用を
著るしく増強するなど独特の作用により医薬品と
して広く利用されている。 ウロキナーゼ精製用の吸着体は従来より多数報
告されており、例えば、燐酸カルシウムゲル，シ
リカゲル等の無機質担体や、アンバーライト
CG50，DEAE―セフアデツクス，CM―セフアデ
ツクス等のイオン交換体などが広く用いられてい
る。 また、近年、アフイニテイークロマトグラフイ
ーによるウロキナーゼの精製法も多数報告されて
おり、例えば、アルギニン，リジン，ベンザミジ
ンあるいはベンズグアニジン等をリガンドとする
方法が知られている。 しかしながら、これら従来法では、比活性約１
万国際単位／mg蛋白程度以下の粗ウロキナーゼか
ら１工程で発熱性物質を除去して比活性約10万国
際単位／mg蛋白前後の高純度ウロキナーゼを得る
ことは出来ない。 本発明者等は、高度に純化されたウロキナーゼ
を高収率で簡便且つ経済的に取得する方法を種々
検討し、精製効果の著しく高い新規なアフイニテ
イークロマトグラフイー用吸着体の創製に成功し
た。 即ち、本発明は、 (1) 水不溶性の担体に式(A)で示される基及び式(B)
で示される基を、(A)基：(B)基のモル比が75：25
乃至35：65の範囲になるように化学結合させて
なるウロキナーゼ精製用吸着体。 （但し、式中Ｒはアミジノ基又はグアニジノ基
を示す） に関するものである。 すでに、６―アミノカプロン酸をスペーサーと
し、パラアミノベンザミジンをリガンドとした吸
着体及びそれを用いるウロキナーゼの精製法は特
公昭57―13266号公報及びBiochimica et
Biophysica Acta445，215〜222（1976）、により
公知である。 しかしながら、それら刊行物に記載されている
吸着体は不溶性担体にスペーサーとして６―アミ
ノカプロン酸を結合させ、その末端のカルボキシ
基の全部にパラアミノベンザミジンを結合させた
物であり、それらの吸着体には遊離のカルボキシ
基は殆んど存在していない。 本発明者等は不溶性担体に６―アミノカプロン
酸を結合させ、その末端のカルボキシ基に対して
種々の割合でリンガンドを結合させた物を作り、
その結合割合と粗ウロナーゼの精製効果との関係
を種々検討した結果、カルボキシ基の25〜65％、
好ましくは25〜45％をリガンドと結合させた吸着
体が極めて顕著なウロキナーゼの精製効果を発揮
するという予想外の効果を見出した。 本発明によれば、吸着体をカラムに充填し、該
カラムに粗ウロキナーゼ含有液を通塔してウロキ
ナーゼを吸着させ、吸着したウロキナーゼを中性
水溶液で洗浄後、酸性の塩類水溶液で溶出すると
発熱性物質を含まない比活性80000〜130000国際
単位／mg蛋白のウロキナーゼを80％以上の収率で
得ることが出来る。粗ウロキナーゼは通常の方法
で人尿から得られた比活性500〜10000国際単位／
mg蛋白のものとを用い、これを食塩0.2〜0.4M含
む0.1M燐酸緩衝液（PH＝６〜８）に40000〜
100000国際単位／mlの濃度に溶解して通塔吸着さ
せる。洗浄液は通常粗ウロキナーゼの溶解に使用
した緩衡液を使用する。緩衡液中の塩濃度は0.05
〜0.5M、好ましくは0.2〜0.4Mがよい。ウロキナ
ーゼの溶出液は食塩濃度は0.05〜0.5M、好まし
くは0.2〜0.4Mを含む0.1M酢酸緩衡液（PH＝３〜
５）が好ましい。本発明の吸着体は、それ自体公
知の反応を適宜組合せることにより容易に製造す
ることが出来る。即ち、前記式(A)で示される基を
水不溶性の担体に結合させるにはCDI（Ｎ，N′―
カルボニルジイミダゾール）活性化法、臭化シア
ン活性化法等の通常の方法を利用することが出来
る。 また、式(A)の基の末端にリガンドを縮合させて
式(B)の基に変換するためにはCMC〔１―シクロ
ヘキシル―３―（２―モルフオリノエチル）カル
ボジイミド・メト―Ｐ―トルエンスルフオン
酸〕，EDC〔１―エチル―３―（３―ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド〕等の通常の縮合
剤を用いることができる。 水不溶性担体としては前記式(A)で示される基を
結合し得るものであればよく、例えばアガロー
ス，架橋化デキストラン，セルロース類，寒天等
の多糖類，ポリアクリルアマイド等の高分子が用
いられる。 次に本発明の効果を試験例で示す。 試験例 セフアロースCL―6B（フアルマシア・フアイ
ンケミカルズ社製）を活性化して６―アミノカプ
ロン酸をゲル１ml当り77.6μmole結合させ、これ
にパラアミノベンザミジンを種々の割合で縮合さ
せた吸着体を作り、それら吸着体６mlをそれぞれ
カラムに充填し、粗ウロキナーゼ（比活性3400国
際単位／mg蛋白）をゲルに吸着させ、0.4M食塩
含有0.1M燐酸緩衡液（PH＝7.0）で洗浄後、0.4M
食塩含有0.1M酢酸緩衡液（PH＝４）で溶出し、
溶出されたウロキナーゼについて、比活性、収率
及び発熱性物質の試験を行つた。 本試験の結果は第１表に示す通りである。
するためのアフイニテイークロマトグラフイー用
の新規吸着体に関する。 ウロキナーゼは人尿中に微量存在する酵素であ
り、これを分離し、高度に精製した製剤は人間に
投与した時優れた血栓溶解促進作用を示し、ま
た、制癌剤と併用することによりその制癌作用を
著るしく増強するなど独特の作用により医薬品と
して広く利用されている。 ウロキナーゼ精製用の吸着体は従来より多数報
告されており、例えば、燐酸カルシウムゲル，シ
リカゲル等の無機質担体や、アンバーライト
CG50，DEAE―セフアデツクス，CM―セフアデ
ツクス等のイオン交換体などが広く用いられてい
る。 また、近年、アフイニテイークロマトグラフイ
ーによるウロキナーゼの精製法も多数報告されて
おり、例えば、アルギニン，リジン，ベンザミジ
ンあるいはベンズグアニジン等をリガンドとする
方法が知られている。 しかしながら、これら従来法では、比活性約１
万国際単位／mg蛋白程度以下の粗ウロキナーゼか
ら１工程で発熱性物質を除去して比活性約10万国
際単位／mg蛋白前後の高純度ウロキナーゼを得る
ことは出来ない。 本発明者等は、高度に純化されたウロキナーゼ
を高収率で簡便且つ経済的に取得する方法を種々
検討し、精製効果の著しく高い新規なアフイニテ
イークロマトグラフイー用吸着体の創製に成功し
た。 即ち、本発明は、 (1) 水不溶性の担体に式(A)で示される基及び式(B)
で示される基を、(A)基：(B)基のモル比が75：25
乃至35：65の範囲になるように化学結合させて
なるウロキナーゼ精製用吸着体。 （但し、式中Ｒはアミジノ基又はグアニジノ基
を示す） に関するものである。 すでに、６―アミノカプロン酸をスペーサーと
し、パラアミノベンザミジンをリガンドとした吸
着体及びそれを用いるウロキナーゼの精製法は特
公昭57―13266号公報及びBiochimica et
Biophysica Acta445，215〜222（1976）、により
公知である。 しかしながら、それら刊行物に記載されている
吸着体は不溶性担体にスペーサーとして６―アミ
ノカプロン酸を結合させ、その末端のカルボキシ
基の全部にパラアミノベンザミジンを結合させた
物であり、それらの吸着体には遊離のカルボキシ
基は殆んど存在していない。 本発明者等は不溶性担体に６―アミノカプロン
酸を結合させ、その末端のカルボキシ基に対して
種々の割合でリンガンドを結合させた物を作り、
その結合割合と粗ウロナーゼの精製効果との関係
を種々検討した結果、カルボキシ基の25〜65％、
好ましくは25〜45％をリガンドと結合させた吸着
体が極めて顕著なウロキナーゼの精製効果を発揮
するという予想外の効果を見出した。 本発明によれば、吸着体をカラムに充填し、該
カラムに粗ウロキナーゼ含有液を通塔してウロキ
ナーゼを吸着させ、吸着したウロキナーゼを中性
水溶液で洗浄後、酸性の塩類水溶液で溶出すると
発熱性物質を含まない比活性80000〜130000国際
単位／mg蛋白のウロキナーゼを80％以上の収率で
得ることが出来る。粗ウロキナーゼは通常の方法
で人尿から得られた比活性500〜10000国際単位／
mg蛋白のものとを用い、これを食塩0.2〜0.4M含
む0.1M燐酸緩衝液（PH＝６〜８）に40000〜
100000国際単位／mlの濃度に溶解して通塔吸着さ
せる。洗浄液は通常粗ウロキナーゼの溶解に使用
した緩衡液を使用する。緩衡液中の塩濃度は0.05
〜0.5M、好ましくは0.2〜0.4Mがよい。ウロキナ
ーゼの溶出液は食塩濃度は0.05〜0.5M、好まし
くは0.2〜0.4Mを含む0.1M酢酸緩衡液（PH＝３〜
５）が好ましい。本発明の吸着体は、それ自体公
知の反応を適宜組合せることにより容易に製造す
ることが出来る。即ち、前記式(A)で示される基を
水不溶性の担体に結合させるにはCDI（Ｎ，N′―
カルボニルジイミダゾール）活性化法、臭化シア
ン活性化法等の通常の方法を利用することが出来
る。 また、式(A)の基の末端にリガンドを縮合させて
式(B)の基に変換するためにはCMC〔１―シクロ
ヘキシル―３―（２―モルフオリノエチル）カル
ボジイミド・メト―Ｐ―トルエンスルフオン
酸〕，EDC〔１―エチル―３―（３―ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド〕等の通常の縮合
剤を用いることができる。 水不溶性担体としては前記式(A)で示される基を
結合し得るものであればよく、例えばアガロー
ス，架橋化デキストラン，セルロース類，寒天等
の多糖類，ポリアクリルアマイド等の高分子が用
いられる。 次に本発明の効果を試験例で示す。 試験例 セフアロースCL―6B（フアルマシア・フアイ
ンケミカルズ社製）を活性化して６―アミノカプ
ロン酸をゲル１ml当り77.6μmole結合させ、これ
にパラアミノベンザミジンを種々の割合で縮合さ
せた吸着体を作り、それら吸着体６mlをそれぞれ
カラムに充填し、粗ウロキナーゼ（比活性3400国
際単位／mg蛋白）をゲルに吸着させ、0.4M食塩
含有0.1M燐酸緩衡液（PH＝7.0）で洗浄後、0.4M
食塩含有0.1M酢酸緩衡液（PH＝４）で溶出し、
溶出されたウロキナーゼについて、比活性、収率
及び発熱性物質の試験を行つた。 本試験の結果は第１表に示す通りである。
【表】
【表】
第１表の試験成績から明らかなように、パラア
ミノベンザミジンの結合割合が多くなるにしたが
つて溶出液中のウロキナーゼの比活性が低下し、
また発熱性物質も除去されにくくなる。一方パラ
アミノベンザミジンの結合割合が25％以下の場合
にはウロキナーゼの収率が極端に低下した。 一方表１のNo.９に示したようにパラアミノベン
ザミジンの縮合量がNo.１の16.3μmol.／ml．Gel
より少なくても結合割合が25〜65％の範囲内にあ
れば80％以上の収率が得られることを発見した。 またパラアミノベンザミジンの結合割合が45〜
65％の範囲では発熱性物質試験が疑陽性になるこ
ともある。これはパラアミノベンザミジンの結合
量によるものではなく、結合割合によることも明
らかである。 なお、本発明に於いて、ウロキナーゼの活性は
フイブリン平板法〔Biochim.Biophys.Acta24278
（1957）．〕により測定し、スペーサー及びリガン
ドのゲルへの結合量はケルダール法による窒素の
定量値から算出した。 以下実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 １ セフアロースCL―6B（フアルマシア・フアイ
ンケミカルズ社製）20mlをPH11において臭化シア
ン３ｇで活性化し、つぎに６―アミノカプロン酸
25ｇと20℃で10時間反応させセフアロースCL―
6B―アミノカプロン酸結合体を合成した。この
反応で、ゲル１ml当り、６―アミノカプロン酸は
80μmole結合した。このゲル20mlにCMC3ｇを加
えた後、パラアミノベンザミジン180mgを添加
し、PH4.2〜4.6で12時間反応させ、パラアミノベ
ンザミジンを縮合させた。結合したパラアミノベ
ンザミジンはゲル１ml当り24μmole、したがつ
てスペーサーに対する結合率は30％であつた。 この吸着体６mlをカラムに充填し、0.4M食塩
含有0.1M燐酸緩衝液（PH7.2）で平衡化し、発熱
性物質試験陽性の粗ウロキナーゼ5100000国際単
位（比活性3500国際単位／mg蛋白）80mlの同じ緩
衝液に溶解して、不溶物を除去後、カラムに通塔
した。カラムを0.4M食塩含有0.1M燐酸緩衝液
（PH7.0）で洗液の280nmの吸光値が0.02以下にな
るまで充分洗浄した。洗浄終了後0.4M食塩含有
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）で吸着しているウロキ
ナーゼを溶出した。かくして得られたウロキナー
ゼは比活性115000国際単位／mg蛋白，収率85％
で、発熱性物質試験の結果、15000国際単位／Kg
家兎体重で、陰性であつた。 実施例 ２ セフアロースCL―4B 20mlをPH11において臭
化シアン３ｇで10分間活性化し、実施例１と同様
にしてセフアロースCL―4B―アミノカプロン酸
結合体を合成した。得られたゲルは１ml当り６―
アミノカプロン酸が70μmole結合していた。 このゲル20mlにEDC350mgを添加した後パラア
ミノフエニルグアニジン250mgを加え、PH4.5〜
4.7に保持しながら室温で５時間撹拌した。得ら
れたゲルは１ml当り17.5μmoleのパラアミノフエ
ニルグアニジンを結合していた。したがつてリガ
ンドのスペーサーに対する結合率は25％である。 この吸着体６mlをカラムに充填し、0.3M食塩
を含む0.1M燐酸緩衝液（PH7.2）で平衡化し、発
熱性物質試験陽性の粗ウロキナーゼ2700000国際
単位（比活性600国際単位／mg蛋白）を50mlの
0.3M食塩含有燐酸緩衝液（PH7.2）に溶解し不溶
物を除去した後、カラムに通塔して、ウロキナー
ゼを吸着させ、続いて同じ緩衝液で洗液の280nm
の吸光値が0.01以下になるまでカラムを洗浄し
た。洗浄終了後0.4M食塩を含む0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）で吸着しているウロキナーゼを溶出し
た。 かくして得られたウロキナーゼは比活性80000
際単位／mg蛋白、収率83％で、発熱性物質試験の
結果15000国際単位／Kg家兎体重で陰性であつ
た。
ミノベンザミジンの結合割合が多くなるにしたが
つて溶出液中のウロキナーゼの比活性が低下し、
また発熱性物質も除去されにくくなる。一方パラ
アミノベンザミジンの結合割合が25％以下の場合
にはウロキナーゼの収率が極端に低下した。 一方表１のNo.９に示したようにパラアミノベン
ザミジンの縮合量がNo.１の16.3μmol.／ml．Gel
より少なくても結合割合が25〜65％の範囲内にあ
れば80％以上の収率が得られることを発見した。 またパラアミノベンザミジンの結合割合が45〜
65％の範囲では発熱性物質試験が疑陽性になるこ
ともある。これはパラアミノベンザミジンの結合
量によるものではなく、結合割合によることも明
らかである。 なお、本発明に於いて、ウロキナーゼの活性は
フイブリン平板法〔Biochim.Biophys.Acta24278
（1957）．〕により測定し、スペーサー及びリガン
ドのゲルへの結合量はケルダール法による窒素の
定量値から算出した。 以下実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 １ セフアロースCL―6B（フアルマシア・フアイ
ンケミカルズ社製）20mlをPH11において臭化シア
ン３ｇで活性化し、つぎに６―アミノカプロン酸
25ｇと20℃で10時間反応させセフアロースCL―
6B―アミノカプロン酸結合体を合成した。この
反応で、ゲル１ml当り、６―アミノカプロン酸は
80μmole結合した。このゲル20mlにCMC3ｇを加
えた後、パラアミノベンザミジン180mgを添加
し、PH4.2〜4.6で12時間反応させ、パラアミノベ
ンザミジンを縮合させた。結合したパラアミノベ
ンザミジンはゲル１ml当り24μmole、したがつ
てスペーサーに対する結合率は30％であつた。 この吸着体６mlをカラムに充填し、0.4M食塩
含有0.1M燐酸緩衝液（PH7.2）で平衡化し、発熱
性物質試験陽性の粗ウロキナーゼ5100000国際単
位（比活性3500国際単位／mg蛋白）80mlの同じ緩
衝液に溶解して、不溶物を除去後、カラムに通塔
した。カラムを0.4M食塩含有0.1M燐酸緩衝液
（PH7.0）で洗液の280nmの吸光値が0.02以下にな
るまで充分洗浄した。洗浄終了後0.4M食塩含有
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）で吸着しているウロキ
ナーゼを溶出した。かくして得られたウロキナー
ゼは比活性115000国際単位／mg蛋白，収率85％
で、発熱性物質試験の結果、15000国際単位／Kg
家兎体重で、陰性であつた。 実施例 ２ セフアロースCL―4B 20mlをPH11において臭
化シアン３ｇで10分間活性化し、実施例１と同様
にしてセフアロースCL―4B―アミノカプロン酸
結合体を合成した。得られたゲルは１ml当り６―
アミノカプロン酸が70μmole結合していた。 このゲル20mlにEDC350mgを添加した後パラア
ミノフエニルグアニジン250mgを加え、PH4.5〜
4.7に保持しながら室温で５時間撹拌した。得ら
れたゲルは１ml当り17.5μmoleのパラアミノフエ
ニルグアニジンを結合していた。したがつてリガ
ンドのスペーサーに対する結合率は25％である。 この吸着体６mlをカラムに充填し、0.3M食塩
を含む0.1M燐酸緩衝液（PH7.2）で平衡化し、発
熱性物質試験陽性の粗ウロキナーゼ2700000国際
単位（比活性600国際単位／mg蛋白）を50mlの
0.3M食塩含有燐酸緩衝液（PH7.2）に溶解し不溶
物を除去した後、カラムに通塔して、ウロキナー
ゼを吸着させ、続いて同じ緩衝液で洗液の280nm
の吸光値が0.01以下になるまでカラムを洗浄し
た。洗浄終了後0.4M食塩を含む0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）で吸着しているウロキナーゼを溶出し
た。 かくして得られたウロキナーゼは比活性80000
際単位／mg蛋白、収率83％で、発熱性物質試験の
結果15000国際単位／Kg家兎体重で陰性であつ
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水不溶性の担体に式(A)で示される基及び式(B)
で示される基を、(A)基：(B)基のモル比が75：25乃
至35：65の範囲になるように化学結合させてなる
ウロキナーゼ精製用吸着体。 （但し、式中Ｒはアミジノ基又はグアニジノ基
を示す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58061028A JPS59187779A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | ウロキナ−ゼ精製用吸着体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58061028A JPS59187779A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | ウロキナ−ゼ精製用吸着体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59187779A JPS59187779A (ja) | 1984-10-24 |
| JPS6148918B2 true JPS6148918B2 (ja) | 1986-10-27 |
Family
ID=13159432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58061028A Granted JPS59187779A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | ウロキナ−ゼ精製用吸着体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59187779A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5132214A (en) * | 1986-04-09 | 1992-07-21 | Monsanto Company | Large scale production of plasminogen activator from normal human colon cells |
| CN111683976B (zh) | 2018-02-05 | 2022-11-18 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 具有阴离子交换-疏水混合模式配体的色谱树脂 |
-
1983
- 1983-04-08 JP JP58061028A patent/JPS59187779A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59187779A (ja) | 1984-10-24 |
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