JP2983287B2 - タンパク質及び色素の分離 - Google Patents
タンパク質及び色素の分離Info
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Description
いて、“タンパク質”という用語は天然タンパク質、非
天然タンパク質及びリガンド結合部位を有するほど十分
大きな他のポリペプチドを含み、“精製”という用語は
所定レベルの純度を付与するよりもむしろ“より純粋に
する”ことを意味する。
がタンパク質を産生する醗酵培地からのタンパク質の分
離において、タンパク質含有液体は固体支持体に結合さ
れたタンパク質結合化合物からなるクロマトグラフィー
カラムに多くは通される。タンパク質結合化合物はタン
パク質上でリガンド結合部位に結合するが、一方他の物
質はカラムを通過して、タンパク質はより純粋な形でカ
ラムから後で溶出される。
又はその一部分は時々タンパク質と共に溶出し、特にタ
ンパク質が医療用である場合にはそのタンパク質から後
で分離されねばならない。単純に架橋セファデックス
〔R.T.M.ファルマシア(Pharmacia)〕のカラムに色素
を吸着させるという提案が以前あった。
and Practice"(タンパク質精製、原理及び実施)(Spr
inger Verlag,N.Y.,USA,2nd Edition,pp.141−157)は
色素含有カラムからの溶出液中の微量の色素がアニオン
交換剤で除去されうると述べていたが、それがタンパク
質であるか又はアニオン交換剤と結合すべき色素である
かについては開示せず、破壊剤の使用については言及し
なかった。英国特許出願GB−A第2 053 296号明細書
はアフィニティ媒体からヒト血清アルブミンを溶出させ
るため特に塩化ナトリウム及びカプリル酸ナトリウムを
含有した緩衝液の使用について開示していた。しかしな
がら、当業者が行ったことは色素汚染問題が知覚されて
いようとなかろうと次の処理前に塩及びカプリル酸塩を
透析することであった。我々がここに発見したことは、
色素−タンパク質結合を壊すためアニオン交換剤プロセ
スと高温/カプリル酸塩濃度の使用との組合せが所望タ
ンパク質から色素の効率的な分離を果たすことである。
合物とそれが結合できる又は結合されたタンパク質を含
有した水性液体からタンパク質結合化合物の一部又は全
部を除去するためのプロセスを提供するが、そのプロセ
スは(1)タンパク質とタンパク質結合物質との結合を
壊すため液体を破壊物質に接触させ;(2)タンパク質
結合物質を樹脂に結合させるため液体をイオン交換樹脂
に接触させ;及び(3)樹脂を液体から分離するステッ
プからなり、その場合に破壊物質は塩と、タンパク質及
びタンパク質結合化合物間の疎水性相互作用を壊す化合
物との混合物である。
が樹脂と接触したときにそれが破壊剤となおも接触され
ているように少くともオーバーラップしていてもよい。
ステップ(3)はタンパク質結合物質を比較的含有しな
いタンパク質の溶液が得られるように樹脂のカラムに液
体を通すことで通常実施される。
たような合成織物色素化合物を除去する上で特によく適
している。多くの(おそらく何千もの)このようなタン
パク質はこのような色素の使用により精製できる。1つ
だけの色素チバクロン・ブルー3−GA(Cibacron Blue3
−GA)を選ぶため、これはキナーゼ、デヒドロゲナーゼ
とアデニル含有補因子、例えばNADP+及びNAD+を要する
ほとんどの他の酵素を精製する上で使用できる。このよ
うなタンパク質としてはアルコールデヒドロゲナーゼ、
アデニル酸シクラーゼ、アデニル酸キナーゼ、グルコー
ス−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ及びグルセルアルデヒド−3−リ
ン酸デヒドロゲナーゼがある。チバクロン・ブルー3−
GA色素はこれら種類のタンパク質と結合するが、ジヌク
レオチド結合部位を有さないタンパク質を精製するため
チバクロン・ブルー3−GA色素を用いることも可能であ
る。これらにはアルブミン、リポタンパク質、血液凝固
因子、インターフェロン及びチロキシン結合グロブリン
がある。これらの色素化合物はアニオン交換剤が本発明
のプロセスで最も適するケースにおいて通常アニオン性
であるが、但し一部はカチオン交換剤が最も適するケー
スにおいてカチオン性である。タンパク質結合化合物は
好ましくはポリスルホン化芳香族化合物であり、最も好
ましくはトリアジン色素である。プロシオン・ブラウン
(Procion Brown)MX−5BR、チバクロン・ブルー3−GA
(ヒト血清アルビミンの分離に適する)、プロシオン・
レッドH−8BN(カルボキシペプチダーゼG2の場合)、
プロシオン・イエロー(Procion Yellow)MX−AG(IMP
デヒドロゲナーゼの場合)、プロシオン・レッドHE−3B
(乳酸デビドロゲナーゼの場合)、プロシオン・グリー
ン(Procion Green)H−4G(ヘキソキナーゼの場
合)、プロシオン・ブルー(Procion Blue)MX−4GD
(リンゴ酸デヒドロゲナーゼの場合)、プロシオン・レ
ッドH−3B(3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの場
合)及びプロシオン・ブルーMX−R(L−乳酸デヒドロ
ゲナーゼの場合)が例である。これら及び他は下記表で
要約されている: 色素自体が(色素をカラムに付着させるために常用さ
れるスペーサーと共に又はそれなしで)汚染を起こすか
又はその問題は色素の誘導体もしくは色素の合成に用い
られる中間体により起こされる。
ースト・フロー(Fast Flow)がある。
ト・フロー及びQファースト・フローがある。好ましく
はマトリックスはダウエックス−1(Dowex−1)であ
り、これは好ましくは2%架橋された乾燥メッシュサイ
ズ50〜100の強塩基性アニオン交換樹脂である。通常、
強アニオン交換剤は弱交換剤よりも良い。
ク質、リポタンパク質、因子VIIIもしくは因子IXのよう
な血液凝固因子、チロキシン結合グロブリン又はα−イ
ンターフェロンである。好ましくは、タンパク質はヒト
アルブミン(HA)又は(欧州特許出願EP−A第322 094
号明細書で記載されたような)色素結合ドメインを留め
たその変異体もしくは断片あるいはHA又はその変異体も
しくは断片と他のタンパク質との融合体である。水性液
体は醗酵培地又はその分画をタンパク質結合化合物に接
触された直接的又は間接的結果物であることが適切であ
る;この関係における“間接的”とはタンパク質結合化
合物との接触後における醗酵培地が本発明のプロセスが
適用される前に1以上のプロセスステップで処理してよ
いことを意味する。“醗酵培地”とは、我々はタンパク
質を産生できる生物の醗酵から得られる培地を意味す
る。生物(その用語は細胞系を含む)はタンパク質を産
生するために形質転換又はトランスフェクトされている
ことが好ましく、そのタンパク質はその生物に対して通
常異種である。生物は細菌〔例えば、大腸菌(E.coli)
又は枯草菌(B.subtills)〕、酵母菌〔例えば、サッカ
ロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)〕、非酵母菌〔例えば、アスペルギルス・ニガー(A
spergillus niger)〕、昆虫細胞〔例えば、スポドプテ
ラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)〕、植物
細胞〔例えば、アトロパ・ベラドンナ(Atropa bellado
nna)の毛根細胞培養物〕又は哺乳動物細胞〔例えば、
ヴェロ(Vero)細胞〕である。好ましくは、生物は酵母
である。本発明の実施上有用と考えられる酵母属の例は
ピチア(Pichia)、サッカロミセス、クルイヴェロミセ
ス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、トルロプ
シス(Torulopsis)、ハンセヌラ(Hansenula)、シゾ
サッカロミセス(Schizosaccharomyces)、シテロミセ
ス(Citeromyces)、パキソレン(Pachysolen)、デバ
ロミセス(Debaromyces)、メチュニコウィア(Metschu
nikowia)、ロードスポリジウム(Rhodosporidium)、
ロイコスポリジウム(Leucosporidium)、ボトリオアク
スク(Botryoascus)、スポリジオボルス(Sporidiobol
us)、エンドミコプシス(Endomycopsis)等である。好
ましい属はピチア、サッカロミセス、シゾサッカロミセ
ス、クルイヴェロミセス、ヤロウィア(Yarrowia)及び
ハンセヌラからなる群から選択される属であるが、その
理由はこれら酵母のDNAを取り扱える能力が前記他の属
に関する場合よりも現在高度に発達しているからであ
る。
(特に好ましい)、サッカロミセス・イタリクス(ital
icus)及びサッカロミセス・ロウキシイ(rouxii)であ
る。クルイヴェロミセスの例はクルイヴェロミセス・フ
ラギリス(fragilis)及びクルイヴェロミセス・ラクチ
ス(lactis)である。ハンセヌラの例はハンセヌラ・ポ
リモルファ(polymorpha)、ハンセヌラ・アノマラ(an
omala)及びハンセヌラ・カプスラタ(capsulata)であ
る。ヤロウィア・リポリチカ(lipolytica)が適切なヤ
ロウィア種の例であり、シゾサッカロミセス・ポムベ
(pombe)がもう1つの適切な酵母である。
ら発現されるヒトアルブミンの産生は当業界で周知であ
り、ここでは説明を要しない。具体的な従来技術プロセ
スと例としては欧州特許出願EP−A第147 198号〔デル
タ・バイオテクノロジー(Delta Biotechnology)〕、
欧州特許出願EP−A第201 239号(デルタ)、欧州特許
出願EP−A第60 057号〔ジュネンテック(Genentec
h)〕、欧州特許出願EP−A第88 632号(ジュネンテッ
ク)、欧州特許出願EP−A第251 744号(デルタ)及び
欧州特許出願EP−A第286 424号(デルタ)明細書で記
載されたものがある。
セスも当業界で公知である。良い概説は“Protein Puri
fication−Principles and Practice"(タンパク質精製
−原理及び実施),2nd Edition(Springer Verlag,N.
Y.),特にpp.141−157でみられる。
マトグラフィー)ステップに醗酵培地を通して得る。
酵培地又はその産物からタンパク質を精製するために用
いられた場合にタンパク質結合化合物をタンパク質から
分離する上で特によく適しているが、そのプロセスはあ
らゆる適切なタンパク質結合汚染物質をタンパク質から
分離するためにも通常使用できることに注目されるべき
である。そのプロセスの利点は、それがタンパク質を樹
脂に結合させる必要がなく、このため比較的多量のタン
パク質が所定容量の樹脂に対して精製されうることであ
る。
カリウム)とタンパク質及びタンパク質結合化合物間の
疎水性相互作用を壊す化合物、例えば(好ましくは、非
イオン系)界面活性剤、有機溶媒又は好ましくは脂肪酸
との混合物からなる。タンパク質との疎水性相互作用の
代わりに破壊剤としてはN−アセチルトリプトファン及
びマンデル酸があり、これらは通常それらの塩、例えば
ナトリウム塩として使用される。脂肪酸はオクタン酸が
好ましいが、但し他の脂肪酸(好ましくはC6−C10及び
好ましくは飽和)も用いてもよい。脂肪酸は通常その
塩、例えばナトリウム塩の形で存在する。塩及び脂肪酸
の濃度は該当する具体的なタンパク質とタンパク質結合
化合物に適合するように変えてよい。通常0.1〜3M、好
ましくは0.5〜2.0Mの塩濃度が有用である。通常10〜100
mM、好ましくは25〜60mM、最も好ましくは約50mMの脂肪
酸濃度が有用である。
合物含有カラムからタンパク質を溶出させるために用い
られる緩衝液から通常大部分なる。それには破壊物質又
はその成分も加えてよい。例えば、溶出緩衝液がpH7.0
の50mMリン酸緩衝液中に2M NaClを含有する場合、更に
塩を加えることは不要であり、脂肪酸のみが加えられ
る。pHは所望であれば変えることができる。我々は約7.
0のpHが適するが、但し通常5.0以上であればいかなるpH
であってもあらゆる脂肪酸に適用しうることを発見し
た。
うなpHであるべきである;例えばほとんどポリスルホン
化トリアジン色素はpH2〜3以上で負に荷電される。液
体が緩衝液を含有することは常に必要というわけではな
い。
ン交換樹脂及び破壊物質と接触される最も便利な手段は
破壊物質を混合物に加え、しかる後得られた液体をイオ
ン交換樹脂のカラムに通すことである。これは用いられ
る緩衝液及び樹脂の量と失われるタンパク質の量を最少
に抑える。しかしながら、最初にタンパク質/タンパク
質結合化合物混合物を樹脂に接触させ、しかる後タンパ
ク質を破壊物質含有緩衝液で溶出させることも技術的に
可能である。樹脂のより大きなカラムが通常このような
態様で要求され、その際にはおそらく単純に捨てられる
よりもむしろ適切な酸及び溶媒で厳重に洗浄されねばな
らないであろう。
ッジであってもよい。
図1はヒトアルブミンを精製するためカラムで使用でき
る織物色素(チバクロン・ブルー3−GA)及びスペーサ
ー(4−アミノブチル基)の構造について示す。
て、ヒト血清アルブミンの3mg/ml溶液を2M NaCl、pH7.
0の50mMリン酸緩衝液中で調製し、スペーサーに共有結
合されたチバクロン・ブルー色素(図1)21μg/mlを加
えた。その色素は色素分子をマトリックスに付着させる
ために用いられるスペーサーと更に色素合成中間体を含
有していた。疎水性相互作用の破壊剤として1Mオクタン
酸ナトリウムを加え、50mMの濃度とした。次いでこの溶
液(20ml)をダウエックス−1樹脂〔2%架橋;ダウケ
ミカル社(Dow Chemical Co.)〕の1mlカラムに流速0.5
ml/minで通した。HAからブルー色素の除去は620nmでス
ペクトル測定した。これらの条件下で、ブルー色素の約
97%が樹脂に結合した。カラムを通過した未結合分画は
カラムに適用されたHAの97%以上を含有していた。
NaCl、カプリル酸塩及びこれら成分の組合せの存在下で
評価した。表1の結果からわかるように、塩及び脂肪酸
の組合せは個別的成分よりもかなり有効であった。
・ブルー3−GA(ブルー)、プロシオン・グリーンH−
4G(グリーン)、プロシオン・ブラウンMX−5BR(ブラ
ウン)及びプロシオン・レッドHE−3B(レッド)色素を
用いて繰り返した。結果は表2で示されている。
表3で示されている。アルカリホスファターゼをブルー
又はレッド色素と混ぜた。
Claims (15)
- 【請求項1】合成織物色素又はその中間体もしくは誘導
体であるタンパク質結合化合物と、それが結合できる又
は結合されたタンパク質を含有した水性液体から、タン
パク質結合化合物の一部又は全部を除去するための方法
であって、 タンパク質結合化合物を樹脂に結合させるために上記液
体をイオン交換樹脂に接触させる工程及び該液体から樹
脂を分離する工程からなり、 上記化合物及びタンパク質が樹脂上に存在する間、少な
くとも0.5Mの塩と脂肪酸又はその塩との混合物からなる
破壊物質に接触させることを特徴とする上記方法。 - 【請求項2】タンパク質結合化合物が、トリアジン色素
又はその中間体もしくは誘導体である、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項3】イオン交換樹脂が、強塩基性アニオン交換
樹脂である、請求項1又は2に記載の方法。 - 【請求項4】タンパク質が、ヒトアルブミン(HA)又は
色素結合ドメインを留めたその変異体もしくは断片、あ
るいはヒト血清アルブミン(HSA)又は上記変異体もし
くは断片と他のタンパク質との融合体である、請求項1
〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項5】脂肪酸がC6〜C10の脂肪酸である、請求項
1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項6】タンパク質及びタンパク質結合化合物の混
合物を破壊物質と混合し、しかる後得られた液体をイオ
ン交換樹脂のカラムに通す、請求項1〜5のいずれか一
項に記載の方法。 - 【請求項7】液体を、イオン交換樹脂しかる後破壊物質
に接触させる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項8】(i)タンパク質が産生されるようにタン
パク質を産生できる生物を醗酵させる; (ii)ステップ(i)から得られたタンパク質含有醗酵
培地又はそこから誘導され上記タンパク質を含有した液
体を固定されたタンパク質結合化合物に接触させる; 但し、該タンパク質結合化合物は合成織物色素又はその
中間体もしくは誘導体である; (iii)固定されたタンパク質結合化合物からタンパク
質を分離する;及び (iv)タンパク質と結合したあらゆるタンパク質結合化
合物のうち少くとも一部を除去するためにステップ(ii
i)からのタンパク質を請求項1〜7のいずれか一項に
記載された方法に付す; ことからなるタンパク質の製造方法。 - 【請求項9】タンパク質結合化合物である合成織物色素
と、それが結合できる又は結合されたタンパク質を含有
した水性液体から上記タンパク質結合化合物の一部又は
全部を除去するための方法であって、 タンパク質結合化合物を樹脂に結合させるために上記液
体をイオン交換樹脂に接触させる工程及び該液体から樹
脂を分離する工程からなり、 上記化合物及びタンパク質が樹脂上に存在する間、少な
くとも0.5Mの塩と脂肪酸又はその塩との混合物からなる
破壊物質に接触させることを特徴とする上記方法。 - 【請求項10】イオン交換樹脂が、強塩基性アニオン交
換樹脂である、請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】タンパク質が、ヒトアルブミン(HA)又
は色素結合ドメインを留めたその変異体もしくは断片、
あるいはヒト血清アルブミン(HSA)又は上記変異体も
しくは断片と他のタンパク質との融合体である、請求項
9又は10に記載の方法。 - 【請求項12】脂肪酸が、C6〜C10の脂肪酸である、請
求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項13】タンパク質及びタンパク質結合化合物の
混合物を破壊物質と混合し、しかる後得られた液体をイ
オン交換樹脂のカラムに通す、請求項9〜12のいずれか
一項に記載の方法。 - 【請求項14】液体を、イオン交換樹脂しかる後破壊物
質に接触させる、請求項9〜12のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項15】(i)タンパク質が産生されるようにタ
ンパク質を産生できる生物を醗酵させる; (ii)ステップ(i)から得られたタンパク質含有醗酵
培地又はそこから誘導され上記タンパク質を含有した液
体を固定されたタンパク質結合化合物に接触させる; 但し、該タンパク質結合化合物は合成織物色素である; (iii)固定されたタンパク質結合化合物からタンパク
質を分離する;及び (iv)タンパク質と結合したあらゆるタンパク質結合化
合物のうち少くとも一部を除去するためのステップ(ii
i)からのタンパク質を請求項9〜14のいずれか一項に
記載された方法に付す; ことからなるタンパク質と製造方法。
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