KR20050016877A - 알부민 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)을 포함하는 세포 배양 상층물 (CCS)을 이종형 (bimodal) 고염 내성 매트릭스 상의 양이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 음이온 교환하는 것을 포함하는, 용액으로부터 rHSA를 정제하는 방법이다. 사용된 이종형 고염 내성 양이온 교환 매트릭스는 어떠한 추가의 희석도 필요하지 않기 때문에 세포 배양 상층물의 정제를 직접 수행할 수 있게 한다. 또한, 상기 이종형 양이온 교환 매트릭스는 고결합능을 갖기 때문에 상응하는 통상적인 양이온 교환 매트릭스에 비해 매트릭스를 소량으로 사용할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 부피 면에서, 결국 작업 비용 면에서 실질적인 절약을 제공할 수 있다.

Description

알부민 정제 방법 {Method for Albumin Purification}

본 발명은 단백질의 정제 분야, 특히 인간 혈청 알부민의 정제에 관한 것이다. 이 방법은 대규모 작업에 사용하기 적합한 효율적인 정제가 이루어지는 일련의 크로마토그래피 단계를 사용한다.

인간 혈청 알부민 (HSA)은 혈장에 존재 하는 가장 풍부한 단백질로서, 그의 혈장내 역할은 삼투압의 유지에 기여하고 영양분 및 대사물질에 결합하여 이들의 운반을 가능하게 하는 것이다. 예를 들어 알부민 손실이나 알부민 합성 감소로 인한 저알부민혈증의 치료약으로서, 출혈 쇼크 등에서 HSA에 대한 제약적, 학문적 관심은 높다. 이용가능한 최초의 방법에서는 HSA를 혈액으로부터 정제하였다. 그러나, 이러한 방법은 산발적인 혈액 공급, 경제적 단점, 및 간염 바이러스 및 특히 AIDS 바이러스와 같은 바람직하지 못한 물질들로 인한 오염 등의 문제를 유발하였다. 이런 문제를 피하기 위하여 재조합 DNA 기술에 기초한 대안적 방법이 최근 개발되어 재조합 HSA (rHSA)를 생산하게 되었다. 많은 재조합 방법이 제안되었으나, 발효 브로쓰로부터 rHSA를 정제하는 것이 결정적인 단계인 것으로 입증되었으며, 이러한 목적을 위한 개선은 여전히 필요하다.

EP 0 612 761은 유리 비항원성 오염물을 함유하지 않는 고순도의 재조합 인간 혈청 알부민의 제조 방법을 개시하고 있다. 이 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 다른 단계, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피, 붕산 또는 그의 염으로 처리 후의 한외여과, 및 열처리와 합쳐진 특수한 조건 하에서 사용한다. 그러나, 이러한 일련의 많은 단계들은 여전히 너무 복잡하기 때문에, 산업상의 대규모 작업에서 만족스럽게 사용하기 위해서는 지나치게 많은 비용이 들 것이다.

또한, EP 0 570 916도 유전자 작업 기술에 의해 재조합 인간 혈청 알부민을 제조하는 방법을 개시하고 있으며, 여기서 정제는 배양 상층물을 한외여과, 열처리, 산 처리 및 또다른 한외여과에 뒤이어, 양이온 교환기, 소수성 크로마토그래피 담체 및 음이온 교환기로 후처리, 및 염석하는 단계들의 조합에 의한다. 그러나, 상기 언급한 특허와 마찬가지로 이 정제 체계도 너무 복잡하고 시간이 많이 소요되기 때문에, 지나치게 고가여서 대규모 작업에 사용하기 위한 효과적인 절차를 제공하지 못한다.

EP 0 699 687은 배양 배지를 열처리하여 프로테아제를 불활성화시킨 다음 양이온 교환 입자의 유동층과 접촉하게 하는, rHSA의 정제 방법을 기재한다. 그 후 용출물을 한외여과, HIC 및 음이온 교환 크로마토그래피로 처리할 수 있다. 그러나, 유동층의 사용은 통상적인 충전층 (packed bed) 크로마토그래피 단계와는 다른 장치를 필요로 할 것이다. 따라서, 배양 브로쓰로부터의 rHSA의 정제를 위한 더 효율적이고 경제적으로 매력적인 방법이 여전히 필요하다.

발명의 요약

본 발명의 한 목적은 대규모 작업에 용이하게 적합되는 재조합 HSA의 정제 방법을 제공하는 것이다. 이 목적은, rHSA를 포함하는 세포 배양 상층물 (CCS)을

(a) 이종형 (bimodal) 고염 내성 매트릭스 상의 양이온 교환 크로마토그래피 단계,

(b) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계,

(c) 음이온 교환 크로마토그래피 단계

로 처리하는 것을 포함하는 방법에 의하여 달성된다.

본 발명에 따른 방법은 상기한 방법들보다 더 적은 공정 단계를 포함한다. 또한, 단계 (a)에 사용된 이종형 고염 내성 양이온 교환 크로마토그래피는 어떠한 추가의 희석없이도 세포 배양 상층물의 사용을 가능하게 하며, 이는 총 부피를 크게 감소시켜 종래 기술의 방법에 비해 비용이 절감된다는 점에서 유리하다.

본 발명의 다른 목적은 rHSA의 정제에 사용되는 크로마토그래피 단계의 흡착능을 개선하는 것이다. 이는 단계 (a)에 고염 리간드 (HSL)로서 알려진 리간드를 포함하는 양이온 교환기를 사용하는 상기 방법에 의하여 달성될 수 있다. 상기 리간드는 이들이 단리될 물질과 상호작용하는 부위를 적어도 2개 포함한다는 의미에서 이종형인데, 그 부위 중 하나는 하전된 상호작용을 제공하고, 하나는 수소 결합에 기초한 상호작용 및(또는) 소수성 상호작용을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 최종 생성물의 착색물 함량(colour content)을 더 감소시키는 것, 더 구체적으로는 최종 생성물의 순도를 더 높이는 것이다. 이는 약 음이온 교환기가 사용되는 상기한 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다.

도 1a 내지 1d는 본 발명에 따른 양이온 교환, 소수성 상호작용 및 음이온 교환 크로마토그래피의 상이한 단계에 사용하기에 적합한 가능한 매트릭스 물질을 도시한다.

도 2는 미희석된 세포 배양 상층물 (CCS)의 본 발명에 따른 방법 중 단계 (a)에 따른 양이온 교환 크로마토그래피의 결과를 보여준다.

도 2b는 rHSA를 함유한다.

도 3은 도 2로부터 분획 2B의 HIC의 결과를 보여준다. rHSA는 분획 3A에서 용출된다.

도 4는 도 3의 분획 3A의 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 보여준다. 정제된 rHSA는 분획 4B에서 용출된다.

도 5는 본 발명에 따른 3단계 정제 프로토콜을 사용하여 얻은 주요 분획의 전기영동 분석을 보여준다.

본 발명의 한 측면은 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)을 포함하는 세포 배양 상층물 (CCS)을

(a) 이종형 고염 내성 매트릭스 상의 양이온 교환 단계,

(b) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계, 및

(c) 음이온 교환 단계

의 크로마토그래피 단계로 처리하는 것을 포함하는, 용액으로부터 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)을 정제하는 방법이다.

본 방법의 특정 실시양태에서는 단계 (a)에 적용될 때, CCS의 전도도가 약 10 mS/cm 이상, 예를 들면 약 15 mS/cm 이상, 바람직하게는 약 20 mS/cm 이상, 즉 약 25 내지 50, 더 구체적으로는 25 내지 30 mS/cm이며, 이는 고염 리간드 (HSL)로서 알려진 타입의 리간드를 포함하는 것인 사용되는 종류의 양이온 교환기로 인해 가능하다. 따라서, 본 방법의 중요한 이점은 CCS를 희석시킬 필요가 없어서 앞서 기재된 rHSA 정제 방법들에 비해 양이온 교환 단계 동안 상당히 감소된 샘플 부피를 사용할 수 있다는 점이다.

CCS는 세포를, 바람직하게는 원심분리 등에 의하여 제거해 낸 임의의 발효 브로쓰일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 단리된 rHSA의 기원은 에쉐리키아 콜리 (Esherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등의 미생물 세포, 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등의 효모 세포, 또는 동물 세포주와 같은 임의의 적합한 숙주일 수 있다. 유리한 실시양태에서는 숙주 세포가 피키아 파스토리스이다. 재조합 숙주 세포의 제조 방법 및 rHSA 등의 단백질을 숙주 세포로부터 발현하기 위한 조건은 공지되어 있으며, 예를 들어, 이 분야 내에서 여러 특허 출원을 참조하기 위해 앞서 논의한 EP 0 612 761을 참고한다.

단계 (a)의 주요 목적은 음 하전된 안료 등 저분자량 착색 물질을 제거하는 것이다. 따라서, 단계 (a)는 고염 리간드 (HSL)로서 알려진 타입의 리간드를 포함하는 양이온 교환기를 사용한다. 이와 관련하여, "고염 (high salt)"이란 이런 종류의 이온 교환기들의 특징인 고염 농도 내성이라는 상기 언급한 특질을 가리킨다. 이 특질은 각 리간드가 단리될 물질 (본 발명의 경우에는 rHSA)과 상호작용할 수 있는 두 가지 기를 포함한다는 점에서 이종형인 리간드의 성질에 의하여 부여된다. 일차적인 결합 방식은 하전된 결합 기, 즉 이온 교환 기에 의해 제공되며, 따라서 매트릭스의 HSL-타입은 이온 교환기로서 분류된다. 제2 결합 방식은 제2 결합 기에 의하여 제공되며, 이 제2 결합 기는 단리될 물질과 추가의 상호작용을 제공한다. 통상, 제2 결합 기는 수소 결합 또는 소수성 상호작용을 제공하나, 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이 다른 상호작용이 관찰될 수 있다. 이런 맥락에서 주의할 것은, "이종형"이라는 용어가 본 명세서에서는 둘 이상의 결합 방식이 관련됨을 정의하는 데 사용되므로 오직 두 개의 결합 방식에만 한정되는 것은 아니라는 점이다. 본 출원에서, HSL-타입의 양이온 교환기가 사용되며, 이러한 양이온 교환기는 상세히 기재된 바 있고, 예를 들면 PCT/EP01/08203 (Amersham Pharmacia Biotech AB)를 참고한다. 그러나, 이의 일반적인 설명은 다음과 같다.

양이온 고염 리간드 (HSL) 상에 존재 하는 하전된 결합 기는 술포네이트 (-SO₃ ^-/-SO₃H), 술페이트 (-OSO₃ ^-/-OSO₃H), 카르복실레이트 (-COO^-/-COOH), 포스페이트 (-OPO₃ ^2-/-OPO₃H^-/-OPO₃H₂) 및 포스포네이트 (-PO₃ ^2-/-PO₃H^-/-PO₃H₂)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 한 유리한 실시양태에서, 양이온 교환기의 HSL-타입은 약한 양이온-교환기, 즉 pKa가 3 이상인 양이온 교환기이다. 다른 실시양태에서는 이들은 pKa가 3 이하인 강한 양이온 교환기이다. 이러한 약한 양이온 교환기의 전형적인 예는 카르복실레이트 (-COO^-/-COOH), 포스페이트 (-OPO₃ ^2-/-OPO₃ H^-/-OPO₃H₂) 및 포스포네이트 (-PO₃ ^2-/-PO₃H^-/-PO₃H₂)이다.

제2 결합 기는 양이온 교환 기로부터 1-7 원자 거리에 위치하는 수소 결합 원자를 하나 이상 포함한다. 수소 결합 원자는 수소 결합에 참가할 수 있는 원자 (수소 제외)이다. 문헌[Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973) 제42쪽]을 참고한다. 수소 결합 원자는 산소 (카르보닐 산소, 에테르 산소, 에스테르 산소, 히드록시 산소, 술폰 산소, 술폰 아미드 산소, 술폭시드 산소, 방향족 고리 중의 산소 등), 질소 (아미드 질소, 방향족 고리 중의 질소 등), 황 (티오에테르 황, 방향족 고리 중의 황 등) 등의 이종원자, 및 sp- 및 sp²-혼성화 탄소, 및 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도 등의 할로 기 (바람직하게는 플루오로)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 제2 결합 기는 전형적으로는 하전된 원자 또는 pH 변화에 의해 하전될 수 있는 원자를 전혀 포함하지 않는다.

단계 (a)에 사용된 양이온 교환 리간드의 안정성은 적어도 40 시간 동안 수 중 0.1 또는 1 M NaOH를 견디는 능력으로서 일반적인 용어로 정의될 수 있다. 본 방법의 단계 (a)에 유용한 양이온 교환기의 적합한 화학적 리간드 구조의 실례에 관하여는 상기 언급한 PCT/EP01/08203을 참조한다. 본 발명의 특정한 실시양태에서는 단계 (a)는 본 명세서의 도 1a에 도시된 HSL 양이온 교환 리간드를 사용한다.

기능적 용어로 정의하면, 본 방법의 단계 (a)에 사용된 양이온 교환기는

(a) 0.3 M NaCl에 상응하는 이온 강도에서 수성 참고 액체 중에서 양이온 교환에 의해 rHSA에 결합하고,

(b) 물질에 대한 누출능(break through capacity)이, 상기한 이온 강도에서 술포프로필 기 -CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-를 포함하는 참고 양이온-교환기에 대한 물질의 누출능의 ≥200 %, 예컨대 ≥300 % 또는 ≥500 % 또는 ≥1000 %이 되게 할 수 있다.

PCT/EP01/08203에는 이러한 참고 이온 교환기가 더 상세히 기재되어 있다. 본 방법에 사용되는 양이온 교환기에서 양이온-교환 리간드의 양은 통상 1 내지 4000 μmol/ml 매트릭스, 예컨대 2 내지 500 μmol/ml 매트릭스 사이에서 선택되며, 바람직한 것은 5 내지 300 μmol/ml 매트릭스이다. 가능한 바람직한 범위는 무엇보다도 매트릭스의 성질, 리간드 등에 의하여 결정된다. 따라서, 양이온-교환 리간드의 양은 아가로오스-기재 매트릭스의 경우 10-300 범위 내인 것이 보통이다. 덱스트란-기재 매트릭스의 경우 간격은 통상 10-600 μmol/ml 매트릭스이다.

상기 언급한 PCT/EP01/08203는 또한 HSL-타입의 양이온 교환기와 함께 유용한 매트릭스 물질에 대한 광범위한 논의를 포함한다. 간략하게 설명하면, 이러한 매트릭스는 유기 또는 무기 물질을 기재로 할 수 있다. 그것은 바람직하게는 친수성이며 수중에서 다소 팽윤가능하고 불용성인 중합체 형태이다. 친수성이 되도록 유도체화된 소수성 중합체도 이 정의에 포함된다. 적합한 중합체는 폴리히드록시 중합체, 예를 들면 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스, 전분, 풀루란 등의 다당류를 기재로 하는 것, 및 완전 합성 중합체, 예를 들면, 폴리아크릴 아미드, 폴리메타크릴 아미드, 폴리(히드록시알킬비닐 에테르), 폴리(히드록시알킬아크릴레이트) 및 폴리메타크릴레이트 (예를 들면, 폴리글리시딜메타크릴레이트), 폴리비닐알코올, 및 스티렌과 디비닐벤젠을 기재로 하는 중합체, 및 상기 언급한 중합체에 상응하는 단량체 둘 이상이 포함된 공중합체이다. 수용성인 중합체는 흡착 또는 공유 결합을 통하여 불용체 (insoluble body)에 커플링되거나 또는 가교 결합하는 등에 의하여 불용성이 되게 유도체화될 수 있다. OH로 전환될 수 있는 기를 나타내는 단량체의 중합에 의하여, 또는 최종 중합체의 친수성화에 의하여 (예를 들면, 친수성 중합체와 같은 적합한 화합물의 흡착에 의하여) 친수성 기가 소수성 중합체 (예를 들면 모노비닐과 디비닐벤젠의 공중합체)에 도입될 수 있다. 적합한 매트릭스의 실례는 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스사 (Amersham Biosciences)에서 입수할 수 있는 아가로오스-기재의 시판되는 비드형 세파로오스 (Sepharose)이다. 지지체 매트릭스로서 사용될 적합한 무기 물질은 실리카, 산화지르코늄, 흑연, 산화탄탈 등이다.

상기 언급한 PCT/EP01/08203은 HSL-타입의 양이온 교환기의 제조 방법에 대한 광범위한 내용을 포함한다. 또한 표면에 리간드-형성 화합물을 고정시키는 방법의 개관이 문헌[Hermanson, G.T., Mallia, A.K. & Smith, P.K., (Eds.), Immobilisation Affinity Ligand Techniques, Academic Press, INC, 1992]에 제공된다.

앞서 언급한 바와 같이, 이온 교환기의 HSL-타입의 이점 중 하나는 통상적인 양이온 교환기 (예를 들어, 앞서 논의한 참고 술포프로필 양이온-교환기)에 대해 통상 행해진 것에 비해 상승된 이온 강도에서 컬럼에 대한 흡착 (즉, 리간드에 대한 rHSA의 결합)을 수행할 수 있다는 점이다. 결합 동안에 사용되는 정확한 이온 강도는 단백질의 성질 및 매트릭스 상의 리간드의 타입 및 농도에 따라 좌우된다. 유용한 이온 강도는 종종 ≥ 0.1 M, 예컨대 ≥ 0.3 M 또는 심지어 ≥ 0.5 M의 NaCl 농도 (순수)에 상응한다. 탈착은 예를 들면, 이온 강도를 증가시키고(시키거나) pH를 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 이온 강도를 변화시키는 데에 사용되는 전형적인 염은 포스페이트, 술페이트 등의 가용성 암모늄염 또는 금속염, 특히 알칼리 금속염 및(또는) 알칼리 토금속염 중에서 선택된다. 동일한 염을 흡착 단계에서 사용할 수도 있으나 그 때는 종종 더 낮은 농도로 사용할 수 있다.

본 방법의 실시양태에서, 단계 (a)에 사용되는 양이온 교환 매트릭스의 양은 단계 (b)에 사용되는 HIC 매트릭스의 양의 약 절반이다. 따라서, 본 발명의 한 이점은 통상적인 양이온 교환기에 비해 부피가 감소되어 작업 비용을 낮출 수 있는 이종형 양이온 교환 매트릭스의 뛰어난 결합능이다. 약 25-30 mS/cm의 전도도와 같은 고염 농도의 존재 하에서, rHSA에 대한 시판되는 SP 세파로오스의 흡착율은 충전겔 (packed gel) 1 ml 당 약 2-4 mg인 반면 고염 리간드 프로토타입의 것은 50 mg/ml 이상인 것으로 입증되었다. 따라서, 이종형 고염 리간드 (HSL)를 사용하면 정제 공정이 상당히 단순화되고 개선되며 대규모 작업 비용이 감소된다.

본 방법의 한 실시양태는 단계 (a)에 앞서 CCS를 열 처리하는 것을 포함한다. 가열은 직접, 즉 숙주 세포가 여전히 존재 하는 동안에 또는 원심분리, 한외여과 또는 임의의 다른 적합한 방법 등을 통해 숙주 세포를 제거한 후에 수행될 수 있다. 가열은 1 분 내지 수 시간까지 50-100 ℃에서, 바람직하게는 20 분 내지 3 시간 동안 60-75 ℃에서, 가장 바람직하게는 약 30 분 동안 약 68 ℃에서 수행할 수 있다. 가열은 항온기가 장착된 수조 내에서 편리하게 수행된다. 한 실시양태에서는 안정화제 (예를 들면 pH 약 6.0에서 카프릴산나트륨)가 가열 전에 첨가된다. 다른 안정화제, 예를 들면 아세틸트립토판, 유기 카르복실산 등이 사용될 수 있다. 가열 후에 CCS의 pH는 양이온 교환기 상의 후속 흡착에 적합한 더 낮은 수치, 예를 들면, pH 4.5로 조절되는 것이 바람직하다.

본 방법의 다른 실시양태에서는 단계 (a)로부터의 생성물 즉, HSL-타입 매트릭스를 포함하는 컬럼에 결합된 분획을 단계 (b) 전에 열처리한다. 바람직하게는 시스테인과 같은 환원제를 첨가한다. 유용한 환원제의 다른 예로는 메르캅토에탄올, 환원된 글루타티온 등이 있다. 이러한 것의 목적은 단계 (b) 동안에 착색 물질의 제거를 용이하게 하려는 것이다. 열처리는 바람직한 실시양태에서도 약 60 분과 같이 약간 장시간 동안 약 60 ℃와 같이 약간 낮은 온도에서 상기한 바와 같이 일반적으로 수행된다.

상기한 바와 같이, 본 방법의 단계 (b)는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용한다. 단계 (b)의 주된 목적은 rHSA의 단백질 분해 생성물 (크기가 통상 약 10 내지 50 kDa임)을 제거하는 것이다. HIC는 크로마토그래피 분야에 공지된 원리이며, 표면 소수성의 차이에 기초하여 분리하는 유용한 수단을 제공한다. 친수성인 것으로 생각되는 많은 생체분자들이 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 소수성 리간드와 상호작용이 가능할만큼 충분한 소수성 기들을 여전히 노출하고 있음이 입증되었다. HIC는 이미 rHSA 정제용으로 제안된 바 있으며, 예컨대 EP 0 699 687을 참조한다. 다른 공지된 분리 원리, 즉 역상 크로마토그래피에 비해 HIC에서 매트릭스 상의 리간드 밀도가 훨씬 낮다. 이런 점은 선택도를 높이면서도 온화한 용출 조건을 가능하게 하여 원하는 단백질의 생체 활성을 유지하는 데 도움이 된다. 이러한 맥락에서, HIC 단계는 상기한 rHSA 단백질 분해 생성물을 흡착시키는데 사용되지만 전장 (full-length) rHSA는 비결합 분획 중에서 용출된다. rHSA와 매트릭스 상의 고정된 리간드 사이의 소수성 상호작용은 사용된 완충액의 이온 강도를 조금 높임으로써 향상된다. 현재 HIC용으로 시판되는 여러 분리 물질이 있으며, 본 발명은 어떠한 특정의 매트릭스 및(또는) 리간드에 한정되는 것이 아니다. 따라서, 일반적인 용어로, 단계 (b)에 사용되는 매트릭스는 유기 또는 무기 물질을 기재로 할 수 있다. 유기 물질의 경우, 그것은 예를 들어, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스, 전분 등의 천연 중합체, 또는 디비닐벤젠, 스티렌 등의 합성 중합체일 수 있다. 무기 매트릭스 물질의 경우에는 실리카가 잘 알려져 있으며 통상 사용되는 물질이다. 유리한 실시양태에서 매트릭스는 가교 결합된 아가로오스로서 여러 회사에서 시판하며, 예를 들면 아머샴 바이오사이언스 (스웨덴 웁살라 소재)사의 세파로오스 (등록 상표) (Sepharose™)가 있다. 한 실시양태에서, 단계 (b)에 사용되는 HIC 매트릭스는 바람직하게는 아가로오스 매트릭스 상에 rHSA와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 소수성 리간드 (페닐, n-부틸과 같은 부틸, n-옥틸과 같은 옥틸 등으로 이루어진 군에서 선택됨)를 나타낸다. 이와 다르게는, 에테르, 이소프로필 또는 페닐 등의 소수성 리간드가 아머샴 바이오사이언스 (스웨덴 웁살라 소재)사의 소스 (등록 상표) (Source™)와 같은 디비닐벤젠 매트릭스 상에 존재한다. 가장 바람직한 실시양태에서는 가교 결합된 아가로오스 매트릭스 상에 페닐 리간드가 단계 (b)에 사용된다. 이 매트릭스는 바람직하게는 다공성 비드로 이루어지므로 수분 함량이 약 90 % 이상, 바람직하게는 약 94 %일 수 있다. 평균 입자 크기는 예를 들어, 습윤 비드에 대해 측정시 10 내지 150 ㎛, 바람직하게는 100 ㎛ 이하, 예컨대 약 90 ㎛일 수 있다. 매트릭스 상의 리간드 밀도는 예를 들어, 1 ml 겔 당 20 내지 60, 예컨대 약 40 μmol일 수 있다. 구체적인 예로서, 사용된 매트릭스는 아머샴 바이오사이언스 (스웨덴 웁살라 소재)사의 페닐 세파오로스(등록 상표) 6 패스트 플로우이다. 이러한 특정 경우에 있어서, 패스트 플로우라는 표시는, 매트릭스의 가교 결합이 1 바 (bar)의 압력에서 15 cm의 비드 높이를 통해 300 내지 400 cm/h의 전형적 유속을 갖는 흐름 특성에 적합된 공정을 제공하도록 최적화된 경우 그 매트릭스에 대해 사용된다. 그러나 이 분야의 숙련자라면 작업의 규모에 따라 그와 같은 공정 파라미터를 용이하게 적합시킬 수 있다. 이 단계는 약 4-8, 예컨대 6.5-7의 pH에서, 약 0.01 내지 0.5 M, 예컨대 0.05 내지 0.2 M의 염 농도에서 수행할 수 있다.

또한, 위에서 언급한 바와 같이, 본 방법의 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 소량의 불순물을 제거하기 위하여, 특히 저분자량 안료와 같은 원치않는 화합물을 제거하기 위하여 음이온 교환기, 바람직하게는 약 음이온 교환기를 사용한다. 본 발명은 음이온 교환기 물질이 최종 rHSA 생성물에서 바람직하지 않은 음전하의 화합물에 결합할 수 있는 충분한 양의 리간드를 나타내는 한, 어떠한 특정의 음이온 교환기 물질의 사용에 한정되지 않는다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 예를 들면, pH 약 5.0 -8.0, 염 농도 0.01 내지 0.2 M에서 불순물의 제거를 위하여 수행될 수 있다. 매트릭스 물질과 관련하여, 그것은 상기한 바와 같이 임의의 유기 또는 무기 물질일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 매트릭스는 가교 결합 아가로오스의 다공성 비드, 예를 들면 아머샴 바이오사이언스 (스웨덴 웁살라 소재)사의 세파오로스 (등록 상표)로 이루어진다. 여기에 결합된 리간드는 약 음이온 교환기이며, 이의 결합 기는 예를 들면, 1급 또는 2급 아민이다. 이러한 결합 기는 예를 들어, 매트릭스에 가장 가까운 에테르 기와 알킬쇄를 통해, 매트릭스에 부착될 수 있다. 스페이서, 암 등을 통해 매트릭스에 결합 기를 부착시키는 많은 방법들이 문헌에 기재되어 있으며, 상기한 바와 같이 본 발명은 어떠한 특정한 구조에 한정되지 않는다. 한 예시적인 실시양태에서, 식 -O-CH₂CH₂-N⁺(C₂ H₅)₂H에 따른 리간드를 갖는 아가로오스 비드, 예를 들어 아머샴 바이오사이언스사의 DEAE 세파오로스(등록 상표)가 사용된다. 이 실시양태는 일부 응용에서 만족스러운, 컬럼에서 용출된 결합 및 비결합 분획 모두에 rHSA를 초래할 것이다. 그러나, 최종 생성물의 순도에 관한 한 더 유리한 다른 실시양태는 두 개의 에스테르 기 및 바람직하게는 추가로 2 개의 히드록시 기를 포함하는 리간드를 갖는 아가로오스 비드를 사용한다. 이 때 결합 기는 1급 아민이 바람직하다. 이 실시양태의 이점은 rHSA가 매트릭스에 알맞게 결합된 분획에만 존재 하므로 순도가 개선되고 작업이 편리하다는 점이다. 마지막에 언급하는 실시양태에 대한 예시적 일반식이 도 1에 제공되지만, 본 발명에는 유사한 구조들이 단계 (c)에 사용되는 방법도 포함된다는 점이 이해되어야 한다.

그러나, 본 발명이 동일한 일반 리간드 구조에 기초한, 상기한 바와 유사한 매트릭스의 사용도 포괄한다는 점이 이해되어야 한다. 또한 도 1a의 식에서 겔(Gel)이란 표시는 단계 (b)와 관련하여 상기한 바와 같이 임의의 매트릭스를 포함하는 것으로 이해된다. 상기한 리간드를 포함하는 매트릭스의 시판되는 한 예는 부틸세파오로스 (등록 상표) (ButylSeparose™, 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스사 제품)이다. 아래 제시한 실험에서는 160 μmol/ml의 리간드 밀도가 사용되었다. 따라서, 특히 유리한 결과는 매트릭스의 리간드 밀도를 최적화함으로써 달성될 수 있는 것으로 보인다. 또한, 처음 언급된 종류의 음이온 교환기, 즉 DEAE-종류의 매트릭스가 사용되는 경우 마지막 언급된 부틸-세파로오스 매질에 비하여 더 큰 부피, 예컨대 약 3 배의 부피가 필요한 것으로 보인다. 따라서, 본 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (c) 동안 음이온-교환 기로서 2급 아민 및 약 100 μmol/ml의 리간드 밀도를 사용한다.

특정 실시양태에서, 음이온 교환기의 리간드 밀도는 50-300 범위, 예컨대 100-200, 바람직하게는 약 160 μmol/ml이다. 한 가지 이점은 정제된 rHSA가 그 후 단계 (c)로부터의 결합 분획에서만 회수될 수 있다는 점이며, 이는 결합 및 비결합 분획 모두에서 rHSA가 존재할 수 있는 DEAE 등과 비교된다.

도면의 상세한 설명

도 1a 내지 1d는 본 방법에 사용하기에 적합한 가능한 리간드 구조를 도시한다. 더 구체적으로는, 도 1a는 고염 리간드 (HSL) 타입의 양이온 교환기를 보여주며, 도 1b는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매트릭스 즉, 페닐 세파로오스를 보여주며, 도 1c 및 1d는 두 개의 대체 음이온 교환기, 즉 시판되는 DEAE 세파로오스 (n=0일 때 도 1c) 및 후술한 바와 같은 변형된 부틸-세파로오스의 구조 (증가된 리간드 밀도를 포함)를 비롯한 일반화된 식을 보여준다.

도 2는 단계 (a), 즉 도 1a에 도시된 리간드 구조를 갖는 양이온 교환 매트릭스를 포함하는 20 ml의 컬럼 상에서의 147 ml의 미희석된 세포 배양 상층물 (CCS)의 양이온 교환 크로마토그래피 결과를 보여준다. 분획 1B는 rHSA를 함유하며, 이는 분획 2A에 의해 나타나는 불순물로부터 확실하게 분리된다.

도 3은 단계 (b), 즉 도 1b에 도시된 페닐 세파로오스를 포함하는 40 ml 컬럼상에서 도 2로부터의 분획 2B의 소수성 상호작용 크로마토그래피의 결과를 보여준다. 분획 A는 rHSA를 나타낸다.

도 4는 단계 (c), 즉 후술하는 실험 부분에서 설명한 바와 같이 변형된 부틸-세파로오스를 포함하는 40 ml 컬럼 상에서 도 3의 분획 3A의 음이온 크로마토그래피의 결과를 보여준다.

도 5는 본 발명에 따른 3 단계 방법을 사용하여 얻어지는 주요 분획의 본래의 PAGE (8-25 %) 및 SDS-PAGE (10-15 %) 분석을 보여준다. 은 염색으로 가시화한 본래의 PAGE의 경우(도 5의 A), 스팟 당 단백질 약 3.3 ㎍이 도포되어 있었다. 은 염색으로 가시화한 SDS-PAGE의 경우 (도 5의 B), 스팟 당 단백질 약 2 ㎍이 도포되어 있었다. 쿠마지에 염색으로 가시화한 SDS-PAGE (도 5의 C)의 경우 스팟 당 단백질 약 10 ㎍이 도포되어 있었다. 1: CCS, 2: HSL 양이온 교환 (비결합), 3: HSL 양이온 교환 (결합), 4: 페닐 (비결합), 5: 페닐 (결합), 6: HiSub. 부틸, 7: HiSub. 부틸 (결합), 8: HSA (대조구). 화살표는 rHSA의 위치를 보여준다.

실험 부분

재료 및 방법

2 주 이상 유전자변형된 P. 파스토리스 세포를 발효시킨 후 여과를 통해 세포를 분리하여 rHSA를 함유하는 세포 배양 상층물 (CCS)을 준비하였다. 색이 녹색인 CCS를 약 200 ml 엘리콧으로 나누어 사용시까지 -20 ℃에서 보관하였다. CCS의 품질은 슈퍼덱스 (등록 상표) (Superdex™) 200 HR 10/30 (스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스사 제품) 분석 컬럼 상에서 겔 여과하여 결정하였다. 이 분석의 결과, CCS 중의 고분자량 (HMW) 및 저분자량 (LMW) 불순물의 상대량 및 rHSA의 단량체 형태의 대략적 함량을 얻었다.

카프릴산나트륨 (옥탄산, Na 염) 및 L-시스테인은 시그마 케미칼사 (Sigma Chemical Co.)로부터 구입하였다. 인간 혈장으로부터 크로마토그래피 정제한 HSA는 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스사의 혈장 가공부의 앤더슨(I. Andersson)이 제공했다. 바이오라드 단백질 분석(BioRad Protein Assay) 키트 (브래드포드 (Bradford)법으로 알려짐)를 사용하여 여러 샘플에서 단백질의 농도를 결정하였다. 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 표준 곡선을 제작하였다. UV/가시광선 흡착 측정치는 시마쯔 (Shimadzu) UV-160A 기록 분광계 (Shimadzu Corporation, 일본)를 사용하여 얻었다. 사용된 그외 화학물질은 전부 분석 또는 시약 등급이었다.

분석 전기영동을 파스트겔 (Phastgel) 전기영동 시스템 및 적절한 파스트겔 매질 및 완충액 스트립 (Strip) (모두 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스 제품)을 사용하여 수행하였다. 전기영동 분석은 제조자의 지시에 따라서 본래의 PAGE (8-25 %) 또는 SDS-PAGE (비환원성, 10-15 %) 겔을 사용하여 수행하였다. 스팟 당 도포된 샘플의 양은, 본래의 샘플의 경우 약 3.3 ㎍이었고, SDS-처리 샘플의 경우 2 ㎍이며, 양자 모두 은 염색 키트 (스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스 제품)로 염색하였고, 쿠마지에 브릴리언트 블루 (CBB)로 염색된 SDS-처리 샘플의 경우 10 ㎍이었다.

질량 분광 분석 (정제된 rHSA 및 혈장 유래 HSA의 질량을 결정하기 위한 것)은 MALDI-TOF 장치를 사용하여 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스의 플렌스부르크 (J. Flensburg) 박사가 수행하였다. 천연 및 재조합 HSA의 트립신분해성 (tryptic) 소화의 펩티드 멥핑(mapping)도 이 장치를 사용하여 수행하였다. 후자의 분석으로부터 얻은 결과는 정제된 HSA로부터 생성된 트립신분해성 펩티드의 공지된 서열을 참조하여 rHSA의 가장 가능성있는 1차적 서열을 확립하도록 기능한다.

매트릭스 및 크로마토그래피 시스템

크로마토그래피 실험은 실온 (약 23 ℃)에서 유니콘 (등록 상표) (UNICORN™) (버전 3.1) 소프트웨어로 제어하는 AEKTA (등록 상표) 익스플로러 100 시스템 (스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스 제품)을 사용하여 수행하였다. 단계 (b)에 사용된 분리 매트릭스는 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스사의 정규 제품인 페닐 세파로오스(등록 상표) 6 패스트 플로우 (high sub)이다. 단계 (c)의 경우 시판되는 DEAE 세파로오스 (등록 상표) 패스트 플로우 (스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스 제품) 또는 변형된 매트릭스를 사용하며, 즉 부틸 세파로오스 (등록 상표) 6 패스트 플로우 (스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스 제품)를 시판되는 제품 (20-40 μmol/ml 겔)보다 증가된 리간드 밀도(배치 (batch) U238025:160 μmol/ml)를 갖도록 제조하였다. 이 변형된 매트릭스는 본 명세서에서 "변형된 부틸-세파로오스"로 정의될 것이다. 더욱이, 단계 (a)는 HSL-타입의 양이온 교환기 (도 1a 참조)의 프로토타입 매트릭스를 사용하였다. 이 매질을 층 부피 40 ml가 얻어지도록 20 % 에탄올 중의 진한 현탁액으로서 XK26/20 유리 컬럼에 충전시켰다. 300 cm/h의 선형 유속을 사용하였다. 충전된 컬럼을 탈이온수 약 2 층 부피로 세척하여, 대부분의 에탄올을 용출한 후 샘플을 적용하기 전에 적절한 완충액으로 평형화하였다. 다양한 매질을 사용하는 각 크로마토그래피 단계에 필요한 완충액의 양을 하기 표 1에 제시한다.

완충액

완충액 A: 25 mM 아세트산나트륨, pH 4.5

1 M 아세트산나트륨 25 ml를 1 M 아세트산 40 ml와 혼합하고 탈이온수를 사용하여 1 L로 희석한다. 전도도는 실온 (RT)에서 약 2 mS/cm.

완충액 B: 50 mM 인산나트륨, 0.1 M NaCl, 10 mM 카프릴산나트륨, pH 7.0

0.2 M Na₂HPO₄ 155 ml + 0.2 M NaH₂PO₄ 95 ml + NaCl 5.8 g + 카프릴산나트륨 1.66 g을 혼합하고 탈이온수를 사용하여 1 L로 희석한다. 전도도는 실온에서 약 16 mS/cm.

완충액 C: 50 mM 인산나트륨, 0.1 M NaCl, pH 6.0

0.2 M Na₂HPO₄ 212 ml + 0.2 M NaH₂PO₄ 38 ml + NaCl 5.8 g을 혼합하고 탈이온수를 사용하여 1 L로 희석한다. 전도도는 실온에서 약 14 mS/cm.

완충액 D: 50 mM 인산나트륨, 0.2 M NaCl, pH 6.0

0.2 M Na₂HPO₄ 212 ml + 0.2 M NaH₂PO₄ 38 ml + NaCl 11.7 g을 혼합하고 탈이온수를 사용하여 1 L로 희석한다. 전도도는 실온에서 약 22 mS/cm.

완충액 E: 클리닝-인-플레이스 (CIP) 용액

1 M NaOH 용액 중에 30 % 이소프로판올을 용해시킴.

rHSA의 정제

세포 배양 상층물 (CCS)의 열처리

양이온 교환 크로마토그래피에 앞서, CCS를 열처리하여, 우선적으로, P. 파스토리스의 발효 동안 생성된 단백질분해 효소를 불활성화하였다. 이는 다음과 같이 수행되었다:

CCS의 냉동 샘플을 해동하고 10 mM 카프릴산나트륨을 용해시켰다. pH를 6.0으로 조절하고 수조 (항온기로 68 ℃로 유지됨)에서 30 분 동안 가열하였다. 샘플을 실온으로 냉각시키고 그 pH를 4.5로 조절하였다. SP 세파로오스 BB와 같은 통상적인 양이온 교환 매질이 단계 (a)에 사용되어야 한다면, 용액의 본래 전도도에 따라서 CCS를 탈이온수를 사용하여 2-8 배로 희석시켜서 전도도가 약 5-10 mS/cm (대략 0.1 M 염 농도)에 이르게 할 필요가 있을 것이다.

그러나, 본 발명에 따라 사용되는 HSL-타입 매트릭스는 증가된 염 농도에 대해 훨씬 내성이 크기 때문에 CCS의 전도도가 약 30 mS/cm 미만인 한 일반적으로 어떠한 추가의 희석없이도 열처리된 CCS를 단계 (a)에 적용할 수 있다.

단계 (a)에 따른 양이온 교환 후에 얻어진 부분적으로 정제된 rHSA (즉, HSL-타입 매트릭스에 결합된 분획)를 다음과 같이 단계 (b) 전에 다시 열처리하였다. 1 M NaOH를 사용하여 샘플의 pH를 6.0으로 조절하고 시스테인을 5 mM의 농도로 샘플 내에 용해시켜 환원제로서 작용하게 하였다. 이 용액을 그 후 60 ℃로 유지된 수조에서 60 분 동안 가열하였다. 이 작업의 주된 목적은 HIC 매트릭스에 의한 착색 물질의 제거를 용이하게 하는 것이다.

단계 (a): 양이온 교환 크로마토그래피를 사용한 포획

양이온-교환 매질을 XK 16/20 컬럼 (충전층 부피 20 ml)에 채우고 평형화를 위하여 2 컬럼 부피 (CV)의 완충액 A로 세척하였다. 열처리된 CCS를 유속 300 mL/h (150 cm/h)으로 150 ml 슈퍼루프 (등록 상표) (Superloop™, 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언스 제품)를 통하여 컬럼에 적용하였다. 적용된 rHSA의 양은 약 1 g (즉, 충전겔 1 ml 당 rHSA 50 mg)이었다. 샘플 적용 후에, 비결합된 물질을 완충액 A의 3 CV를 사용하여 용출한 후, 완충액 B 5 CV를 사용하여 결합된 rHSA를 용출하였다. 두 분획을 따로따로 모으고, 1 M NaOH 용액을 사용하여 결합 분획의 pH를 6.0으로 조절하였다. 그 다음 이 용액을 상기한 바와 같이 가열하고, 실온으로 냉각한 후 후술한 바와 같이 HIC 컬럼 상에서 추가로 정제하였다. 각각의 모은 분획으로부터 1 ml 엘리콧을 분석 목적 (즉, 단백질 함량, A₃₅₀/A₂₈₀ 비 및 전기영동 분석 측정을 위해)으로 보관하였다.

재생: 컬럼을 2 CV의 완충액 E로 세척하여 가장 강력하게 결합된 물질을 용출하고 겔의 기능을 복원하였다. 이 컬럼을 동일한 용액 중에 밤새 방치하여 둔 후 4 CV의 탈이온수로 세척하여 NaOH 및 이소프로판올 대부분을 용출하였다. 재생된 컬럼을 다음 흡착/탈착 공정 사이클 전에 4 CV의 완충액 A로 재평형화하였다.

단계 (b): HIC를 사용한 정제 단계

이전 단계로부터 rHSA-함유 분획을 150 ml 슈퍼루프 (등록 상표)로 옮기고 페닐 세파로오스 (등록 상표) 패스트 플로우 (high sub), 충전층 부피 40 ml로 채운 XK26/20 컬럼에 적용하였다. 이 컬럼은 3 CV의 완충액 C로 예비평형화하였다. 샘플을 적용한 후, 컬럼을 2 CV의 완충액 C로 세척하여 rHSA를 함유하는 비결합된 물질을 용출하였다. 결합된 물질 (주로 rHSA의 45 kDa 분해 형태를 함유)을 2 CV의 탈이온수로 용출하였다.

재생: 상기한 방법과 같음.

단계 (c): 약 음이온 교환을 사용하는 마무리 단계

앞선 HIC 단계로부터 얻어진 2 개의 분획을 모으고, 각각으로부터 1 ml 엘리콧을 분석적 측정용으로 보관하였다 (상기 참조). 컬럼 (XK26/20)을 DEAE 세파로오스 (등록 상표) 패스트 플로우 또는 상기한 변형된 부틸-세파로오스로 채워서 충전층 부피 40 ml를 얻었다. 충전 매질 각각을 2 CV의 탈이온수로 세척한 후 약 5 CV의 완충액 C로 세척하여 이들을 평형화하였다. HIC 단계로부터 얻어진 비결합된 분획을 150 ml 슈퍼루프로 옮기고 상기 두 개의 컬럼 중 하나 또는 다른 하나에 적용하였다. 비결합된 분획을 6 CV의 완충액 C로 용출하거나 (DEAE 세파로오스 패스트 플로우 컬럼) 2 CV를 사용하여 변형된 부틸-세파로오스 컬럼으로부터 용출하였다. 결합된 분획을 2 CV의 2 M NaCl 용액 (DEAE 컬럼의 경우) 또는 5 CV의 완충액 D (변형된 부틸-세파로오스 컬럼의 경우)로 용출하였다. 유속은 90 cm/h 통과로 유지되었다.

재생: 상기한 방법과 같음.

사용된 각 매질에 대해 본 발명에 따라 최적화된 용출 프로토콜을 표 1에 요약하였다. 이 분야에 숙련자라면 상기 방법을 중간시험 (pilot) 규모 또는 생산 규모 작업으로 용이하게 대규모화할 수 있을 것이다.

각 크로마토그래피 단계에 필요한 평형, 용출 및 재생 용액의 컬럼 부피 (CV)수

매트릭스	평형	세척 (완충액)	용출	재생	세척 (탈이온수)
HSL-타입 양이온 교환	4 [A]	3 [A]	5 [B]	2 [E]	4
phe-세파로오스	3 [C]	2 [C]	2 [*]	2 [E]	4
DEAE-세파로오스	5 [C]	6 [C]	2 [**]	2 [E]	4
변형된 부틸-세파로오스	6 [C]	2 [C]	5 [D]		4
* 탈이온수
** 2 M NaCl

결과

3 단계 정제 공정이 단계식 용출에 기초하고 있으므로, 대규모 작업으로 용이하게 적합시킬 수 있다. 단계 (c)에 고 리간드-부틸세파로오스를 사용하면 비결합 분획 중에 그룹으로서 용출되는 LMW 불순물이 효율적으로 제거된다. 또한, 고 리간드-부틸세파로오스를 사용하는 경우에는, 단계 (c)에 DEAE-타입을 사용하는 경우보다 우수한 A₃₅₀/A₂₈₀ 비가 얻어진다.

Claims (10)

1. 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)을 포함하는 세포 배양 상층물 (CCS)을

   (a) 이종형 (biomodal) 고염 내성 매트릭스 상의 양이온 교환 단계,

   (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계, 및

   (c) 음이온 교환 단계

   의 크로마토그래피 단계로 처리하는 것을 포함하는, 용액으로부터 재조합 인간 혈청 알부민 (rHSA)의 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 CCS의 전도도가 단계 (a)에 적용시 약 10 mS/cm 이상, 예컨대 약 15 mS/cm 이상, 바람직하게는 약 20 mS/cm 이상, 예를 들면 약 25-50 mS/cm인 방법.
3. 제1 또는 2항에 있어서, 상기 이종형 양이온 교환 매트릭스가 전하 상호작용 및 수소 결합 및(또는) 소수성 상호작용에 의해 rHSA와 상호작용할 수 있는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에 CCS를 열처리하는 것을 더 포함하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제의 존재 하에서 단계 (b) 전에 CCS를 열처리하는 것을 더 포함하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)가 페닐, 지방족 및(또는) 헤테로시클릭 리간드를 포함하는 HIC 매트릭스를 사용하는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에 사용된 양이온 교환 매트릭스의 양이 단계 (b)에 사용된 HIC 매트릭스 양의 약 절반인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)가 약 음이온 교환 단계인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약 음이온 교환기의 리간드 밀도가 > 50 μmol/ml 겔/매트릭스, 바람직하게는 > 100 μmol/ml 겔/매트릭스, 가장 바람직하게는 약 160 μmol/ml 겔/매트릭스인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 정제된 rHSA가 단계 (c)로부터의 결합된 분획에서만 회수되는 것인 방법.