JPH02290899A - タンパク質溶液からの毒素の除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、タンパク質溶液から、とくにリポコルチ”ｙ
　ＰＰ４、ＰＰ４−Ｘ　（　ＰＡＰ　Ｉ［　）、ＰＡＰ
　ｎ［、ｐ６８ナラびにリポコルチン■および■から、
毒素を除去する方法に関する。

鵬ｆ゛ 胎盤組織タンパク質ＰＰ４、タンパク質ＰＰ４−Ｘ，Ｐ
ＡＰＩＩＩおよびｐ６８、ならびにリボコルチンエおよ
び■は、そのアミノ酸配列中にホモロジーを示し、リポ
コルチンと呼ばれるタンパク質群に属する。

これらのタンパク質は抗炎症作用および抗凝固作用を有
する。これらは多くの臓器に検出され、それらから単離
することができる。

組織たとえばヒト胎盤からのプレバレーションまたは遺
伝子操作たとえば大腸菌での発現によって製造されたｒ
ＰＰ４もしくはｒＰＰ４−Ｘのようなタンパク質プレバ
レーションは、これらのタンパク質とともに、ヒトに対
して毒性のある物質たとえば細菌のリポ多糖を伴って単
離されている。高純度（タンパク質含量に基づいて９５
％以上）であっても、単離されたタンパク質はリムルス
テストのような毒性試験において、またはウサギへの治
療用量（体重１７２９あたりタンパク質１　ｍｇ”）の
投与後に、毒性物質による著しい汚染を示した。

これらのタンパク質に会合していると思われる夾雑物質
は、クロマトグラフィー処理もしくは枦過技術たとえば
滅菌枦過によっても、また非イオン性界面活性剤もしく
はキレート試薬の単独もしくは組合せての使用によって
も除去することは不可能であった。

したがって、本発明の目的は、単離されたまたは遺伝子
操作で製造されたリボコルチン族のタンパク質中の、臓
器、組織および培養細胞に由来する毒素を、タンパク質
の生物活性を損うことなくしたがって凝固性および／ま
たは炎症性疾患に対する治療薬として使用できるように
、除去する方法を開発することにあった。

驚くべきことに、毒性物質は、キレート試薬をイオン性
界面活性剤と組合せて存在させてイオン交換クロマトグ
ラフィーを行うことにより、これらのタンパク質からそ
の生物活性に悪影響を与えることなく除去できることが
発見されＩこ　。

すなわち、本発明は、タンパク質を水性緩衝溶液中で、
キレート剤およびイオン性界面活性剤の存在下、イオン
交換クロマトグラフィーに付すことを特徴とするタンパ
ク質溶液からの毒素の際去方法に関する。

この方法は、天然のまたはバイオテクノロジーとくに遺
伝子操作に由来するりポコルチンにとくに適用できる。

使用できるキレート剤の例にはＥＤＴＡ％ＥＧＴＡ，ク
エン酸もしくはシュウ酸の塩、またはこれらの組合せが
ある。

使用できるイオン性界面活性剤の例にはコール酸、タウ
ロコール酸、タウロデヒドロコール酸、デオキシコール
酸、タウロデオキシコール酸もしくはタウロケノデオキ
シコール酸またはこれらの塩、またはこれらの混合物が
ある。

イオン交換樹脂としては陰イオン交換樹脂好ましくはＤ
ＥＡＥ−ＲＳｅｐｈａｒｏｓｅ，　　−”Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌ，−”ＦｒａｃＬｏｇｅｌまたはＱ−ＲＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅ，とくに好ましくはＤＥＡＥ−ＲＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅを用いることができる。

キレート剤および界面活性剤は、本発明による処理後に
タンパク質含有溶液・から、ｐＨ７．４〜９．５、好ま
しくはｐＨ８．０〜９．５、とくに好ましくはｐＨ８．
０〜９．０の緩衝溶液での透析またはクロマトグラフィ
ーにより除去できる。

ひとつの操作では、ｐＨ７．０　〜１０．０のｔｒｉｓ
，グリシン、ｌｆＥ　Ｐ　Ｅ　ＳまたはＰＢＳのような
緩衝物質ならびにＥＤＴＡ，　ＥＧＴＡ，クエン酸もし
くはシュウ酸の塩またはこれらの組合せのようなキレー
ト試薬少なくとも０　．　ｌｍｍｏＱ／　ＱおよびＮａ
　ｃｈ’ｏｌ．，Ｎａ　Ｄｏｃ．，Ｎａ　Ｔｄｏｃ．，
Ｎａ　Ｔｃｈｏ＋．，Ｔｃｈｅｎｏ−ＤｏｃもしくはＴ
ｄｃｈｏ　．またはこれらの混合物のようなイオン性界
面活性剤少なくとも０．０５９／　Ｑを含有するタンパ
ク質溶液を陰イオン交換樹脂に接触させ、この交換樹脂
を緩衝溶液で洗浄し、ついで吸着したタンパ・ク質をた
とえばＬｉＣＱ，ＫＣＱまたはＮａＣＩ２を用いた塩勾
配で溶出する。

好ま、しい操作では、濃度２　−８０ｍｍｏ（１／（１
，　ｐＨ７．０〜９．５のｔｒｉｓとくに好ましくは２
　０　ｒａ　ｒｎ　ｏ　Ｑ　／　（１　，ｐ　Ｈ　８　
．　０　−　９　．　０のＬｒｉｓ／ＨＣＩ２，ならび
に１−１００ｍ＋ｎｏＱ／ａのキレート試薬とくに好ま
しくは５〜２０ｍ＋ｉｏｌ２／ｌのＥＤＴＡ，および０
．２〜５ｇ／ｌとくに好ましくは０．８　〜１．５９／
　ＱのＮａ　ｃｈｏｌ．もしくはＮａ　Ｄｏｃ．または
混合物を含有する、濃度０．Ｏｌ〜３０ｍｇ／ｍＱとく
に好ましくは０．２〜５ｍｇ／ｔｅａのタンパク質溶液
を、ＤＥＡＥ−ＲＳｅｐｈａｒｏｓｅ，　−”Ｓｅｐｈ
ａｃｅｌ，　−”ＦｒａｃＬｏｇｅｌまたはＱ−”Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓａとくに好ましくはＤＥＡＥ−ＲＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅと接触させる。交換樹脂を緩衝溶液で洗浄し
たのち、吸着したタンパク質を直線増加ＮａＣＱ勾配で
溶出する。

キレート試薬および界面活性剤はタンパク質含有力ラム
の素通り液または溶出液から、ｔｒｉｓｓＨＥＰＥＳ，
グリシンまたはＰＢＳからなる緩衝溶液に対して、とく
に好ましくはｐＨ８．０〜９．０の緩衝溶液に対して透
析するか、あるいはさらにＡｃＡ２０２またはＡｃＡ５
４を用いるゲル浸透クロマトグラフィーのようなクロマ
トグラフィー工程に付すことによって除去できる。

この方法で処理されたプレパレーションは必要に応じて
さらに精製することができる。説明には以下の略号を使
用した。

ＤＥＡＥ　：ジエチルアミノエチル ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ＨＥＰＥＳ　：　Ｎ　−　２−ヒドロキシエチルビペラ
ジンーＮ−２−エタンスルホン酸 Ｎａ　Ｃｈｏｌ　：コール酸ナトリウムＮａＤｏｃ：デ
オキシコール酸ナトリウムＮａ　Ｔｃｈｏｌ　：タウロ
コール酸ナトリウムＮａ　Ｔｄｏｃ　：タウロデオキシ
コール酸ナトリウム ＰＢＳ　：リン酸ナトリウムまたはカリウム緩衝液 ｒＰＰ４　：大腸菌内で遺伝子工学的発現によって製造
されたＰＰ４ ｒＰＰ４−Ｘ　：大腸菌内で遺伝子工学的発現によって
製造されたＰＰ４−Ｘ ＰＡＰＩ［［　：胎盤抗凝固タンパク質ｍＰＡＧＥ　：
ポリアクリルアミドゲル電気泳動Ｑ：四級アミン ＳＯＳ　：ドデシル硫酸ナトリウム Ｔｃｈｅｎｏ−Ｄｏｃ　：タウロケノデオキシコール酸
Ｔｄｃｈｏｌ　：タウロデヒドロコール酸ｔｒｉｓ：　
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 本発明を以下の実施例によって例示する。

解毒に使用された出発物質は、ヒト胎盤から１７）　Ｐ
Ｐ４、ＰＰ４−Ｘ，　ＰＡＰＩ［Ｉ、ｐ６８、リボコル
チンＩおよび■タンパク質、ならびに形質転換された犬
膓菌培養体からのタンパク質（タンパク貿含量に基づく
純度９５％以上）の、０．０２ｍｏＱ／　Ｑ　ｔｒｉｓ
／ＨＣＱ，　ｐＨ８．５からなる緩衝溶液中タンパク質
濃度２．５ｍｇ／＋ｍｆｆのプレパレーションであった
。これ・らのプレパレーションはリムルステスト（ｐＨ
７．２の溶液中で実施）および動物モデルを用いて測定
されたように毒性物質の含有が明らかであった（第■表
）。

毒性試験 ｌ．　リムルステスト この試験はＣｏｎｃｅｐｔ　ＧｍｂＨ　（Ｈｅｉｄｅｌ
ｂｅｒｇ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）によって記述されたよう
にして実施した。

すなわち、試験すべきタンパク質含有溶液０．１ｍＱを
、パイロジエンを含まない試験管中カブトガニ血球溶解
物０．１ｍＱと穏やかに混合し、試験管を振盪すること
な＜３７°Ｃで６０分間インキユベートした。インキュ
ベーション時間が経過したのち、試験管を肉眼で検査し
て固体ゲルが生成したかどうか調べた。ＥＵ　（内毒素
単位）で表される試験物質の発熱性は、対照内毒素（Ｅ
Ｃ−５）を用いて作成した検量プロットを使用して測定
しｔ二。

２．　ウサギでのパイロジエン試験 タンパク質サンプルの毒性は、ウサギ体温（直腸温度の
、試験前９０分内に測定した体温に比較した上昇を測定
することによって決定した。

夕冫パク質サンプルはウサギの耳介静脈中に一度に（体
重１ｋｇあたりｌ　ｍｇ）ｉ．ｖ．投与し、体温を１８
０分間にわたって記録した。最高値を評価の基準として
使用した。６匹の動物の温度差の合計が２．２゜Ｃ以下
の場合、サンプルはパイロジエンを含まないと判定され
た。

実施例　ｌ ｐＨをチェックしながら最終濃度０．０１　　ｍｏＱ／
ｌのＥＤＴＡ１　および０．１％Ｎａ　Ｄｏｃを添加し
たのち、ＰＰ４−，　ｒＰＰ４−，　ＰＰ４−Ｘ−，　
ｒＰＰ４−Ｘ−，　ＰＡＰＩＩ［−．　ｐ６８−または
りポコルチンＩ−もしくは■一含有溶液を、カラム中０
．０２Ｍ　ｔｒｉｓ／　ＨＣＱ．　ｐＨ８．５，　０．
０１ＭＥＤＴＡおよび０．１％Ｎａ　Ｄｏｃ（カラム緩
衝液）テ平衡化したＤＥＡＥ−ＲＳｅｐｈａｒｏｓｅ　
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｓｗｅｄｅｎより）と接触さ
せ、このゲル物質をカラム緩衝液で洗浄し、ついで吸着
しＩ；タンパク質を直線的上昇ＮａＣ１２勾配で溶出し
た。

溶出液を０．０２ｍｏｆｆ／（２　ｔｒｉｓ／Ｈ（Ｊ，
　　ｐＨ８．５からなる緩衝溶液に対して、ついで０．
０２＋ｎｏ（２／（２ｔｒｉｓ／ＨＣＩ２、ｐＨ７．２
に対して強力に透析し、透析物についてリムルステスト
およびウサギでのパイロジエン試験の両者で毒性を調べ
た。この方法で処理したタンパク質は、パイロジエン試
験ではきわめてわずかな温度上昇を示すのみであるかも
しくは温度上昇を全く示さず、またリムルス試験でも測
定可能な内毒素含量はほとんど認められず（第Ｉ表）、
パイロジエンを含まないと判定することが可能であった
。

タンパク質ＰＰ４−ＸおよびｒＰＰ４−Ｘは上記条件下
ではゲル物質に吸着されず、カラムの素通り液中に見出
されたが、上述の処理を実施したのちには同様にパイロ
ジエンを含まなかった（第Ｉ表）。

タンパク質濃度に基づく、改良プロトロンビン時間を用
いて調べた生物活性は、出発原料との比較により、この
処理工程を通じて完全に維持されていることが示された
。タンパク質の毒性出発原料に基づく収率は６４〜８５
％であった。

実施例　２ ＰＰ４．　　　ｒＰＰ４，　　　ＰＰ４−Ｘ，　　　ｒ
ＰＰ４−Ｘ，　　　ＰＡＰｎｌ　　．　　　ｐ６８　ま
　ｔこはりポコルチンＩもしくは■含有緩衝溶液を、最
終濃度それぞれ０．５ｙ／ｌのＮａ　ＣｈｏｌまたはＮ
ａ丁ｃｈｏｌならびに０　．　０　１　ｍ　ｏ　（１　
／　（ｌのＥＤＴＡと混合し、これをカラム中０．０２
ｍｏｌ２／ｌＰＢＳ．　ｐＨ８．５．　Ｑ．０１ｍｏＱ
／　ｎ　ＥＤＴＡ．　０．０５９／　Ｑ　Ｎａ　Ｃｈｏ
ｌおよび０．５９／　Ｑ　ＮａＴｃｈｏｌ　（カラム緩
衝液）で平衡化したＱ−”Ｓｅｐｈａ−ｒｏｓｅ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，　Ｓｗｅｄｅｎより）と接触させ、ゲ
ル物質を洗浄し、吸着したタンパク質を直線的に上昇さ
せたＮａＣＱ勾配で溶出した。

タンパク質溶液のその後の処理操作およびその毒性試験
は実施例ｌに記載したと同様に行った。これらの検査結
果は実施例ｌの場合と同様で、第Ｉ表に示すとおりであ
る。

−１１５５一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）タンパク質を水性緩衝溶液中で、キレート剤および
   イオン性界面活性剤の存在下にイオン交換クロマトグラ
   フィーに付すことを特徴とするタンパク質溶液からの毒
   素の除去方 法。 ２）タンパク質はリポコルチンである請求項１記載の方
   法。 ３）ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸もしくはシユウ酸の
   塩またはこれらの組合せをキレート剤として使用する請
   求項１記載の方法。 ４）キレート剤は１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用
   する請求項３記載の方法。 ５）コール酸、タウロコール酸、タウロデヒドロコール
   酸、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸もしく
   はタウロケノデオキシコール酸またはこれらの塩、また
   はこれらの混合物を界面活性剤として使用する請求項１
   記載の方法。 ６）界面活性剤は０．０２〜５ｇ／ｌの濃度で使用する
   請求項５記載の方法。 ７）ＤＥＡＥ−＾ＲＳｅｐｈａｒｏｓｅ、−＾ＲＳｅｐ
   ｈａｃｅｌ、−＾ＲＦｒａｃｔｏｇｅｌまたはＱ−＾Ｒ
   Ｓｅｐｈａｒｏｓｅをイオン交換樹脂として使用する請
   求項５記載の方法。 ８）ＤＥＡＥ−＾ＲＳｅｐｈａｒｏｓｅをイオン交換樹
   脂として使用する請求項１記載の方法。 ９）キレート剤および界面活性剤はタンパク質含有溶液
   から、ｐＨ７．５〜９．５の緩衝液での透析またはクロ
   マトグラフィーによって除去する請求項１記載の方法。