PT93704B

PT93704B - Processo para a separacao de toxinas contidas em solucoes de proteinas

Info

Publication number: PT93704B
Application number: PT93704A
Authority: PT
Inventors: Norbert Heimburger; Jurgen Romisch
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1989-04-10
Filing date: 1990-04-09
Publication date: 1997-12-31
Also published as: KR900015783A; DE3911629A1; EP0395896B1; JP2833824B2; IE901271L; AU641916B2; DK0395896T3; PT93704A; CA2014222C; GR3015579T3; EP0395896A3; CA2014222A1; ES2068270T3; JPH02290899A; DE59008392D1; ATE118014T1; IE65260B1; EP0395896A2; AU5299290A

Description

DESCRIÇÃO

A invenção refere-se a um processo para a separação de toxinas contidas em soluções de proteínas, em especial das lipocortinas PP4, PP4 - X (PAP II), PAP III, p68, bem como da lipocortina I e II.

A proteína do tecido da placenta PP4, as proteínas PP4 - X, PAP III e p68, bem como a lipocor tina I e II, apresentam homologia das sequências de aminoáci dos e pertencem a uma família de proteínas que se designam por lipocortinas.

Estas proteínas têm uma acção anti-inflamatória e anti-coagulante. Foram identificadas em vários orgãos e podem isolar-se a partir deles.

Na preparação a partir de tecidos, por exemplo a partir de placenta humana, ou de proteínas pre paradas por engenharia genética, por exemplo por expressão em E. Coli, como rPP4 ou rPP4 - X, obtêm-se, juntamente com estas proteínas, substâncias tóxicas para o ser humano, como lipopolissacáridos bacterianos. Apesar da elevada pureza (maior do que 95%, em relação à componente proteica) as proteínas isoladas mostraram, em testes de toxicidade como o teste Limulus, ou após aplicação de doses terapêuticas (1 mg de proteína/kg de peso corporal) em coelhos, uma elevada impureza com substâncias tóxicas.

Estas impurezas naturalmente associadas às proteínas não se conseguiram remover nem por processos cromatográficos ou por técnicas de filtração como a filtração estéril, nem por adição de detergentes não iónicos ou de reagentes quelantes, isoladamente ou em combinação.

objectivo da invenção foi por isso o de desenvolver processos para a remoção de toxinas originárias de orgãos, tecidos e culturas celulares de proteínas isoladas e ainda de proteínas preparadas por engenharia genética da família das lipocortinas, que não prejudiquem a actividade biológica das proteínas, possibilitando desse modo a sua utilização potencial como agentes terapêuticos na coagulação e em inflamações.

Descobriu-se surpreendentemente que na presença de reagentes quelantes em combinação com detergentes iónicos, se podem libertar estas proteínas, por meio- de cromatografia de permuta iónica, das substâncias tõxi-cas, sem prejudicar a sua actividade biológica.

O objectivo da invenção é por isso um processo para a separação de toxinas de uma solução de proteínas, caracterizado por se submeter uma proteína numa solução tampão aquosa, ou na presença de um agente quelante e de um detergente iónico, a uma cromatografia de permuta iónica.

Este processo é sobretudo aplicável a lipocortinas, que podem ser de origem natural ou obtidas por engenharia genética, de preferência obtidas por engenharia genética.

Como agente quelante pode utilizar-se por exemplo EDTA, EGTA,um sal do ácido cítrico ou do ácido oxálico ou uma combinação destas substâncias.

Como detergente iónico pode utilizar-se por exemplo ácido eólico, ácido taurocólico, ácido tauro-desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido tauro-desoxicólico ou ácido tauroceno-desoxicólico, ou um sal destes ácidos ou uma mistura destes.

Como permutador iónico pode utili• D zar-se um permutador aniónico, de preferência DEAE - SephaPP p rose, - Sephacel, - Fractogel ou Q - Sepharose, muito em especial DEAG - ^RSepharose.

agente quelante e o detergente podem, de acordo com o processo da invenção, remover-se a partir da solução proteica por meio de diálise ou de cromatografia numa solução tampão de pH 7,4 a 9,5, de preferência a pH 8,0 a 9,5, muito em especial a pH 8,0 a 9,0.

Numa das versões do processo põe-se uma solução da proteína, que contém uma substância tampão, como Tris, glicina, hepes ou PBS, com um valor de pH de 7,0 a 10,0, e pelo menos 0,1 mmol/1 de um reagente quelante, como EDTA, EGTA, um sal do ácido cítrico ou do ácido oxálico ou uma combinação destes e pelo menos 0,05g/l de um detergente iónico, como Na - chol., Na - Doc., Na - Tdoc., Na - Tchol., Tcheno - Doc ou Tdcho ou uma mistura destes, em contacto com um permutador aniónico, lava-se o permutador com uma solução tampão e elui-se a proteína adsorvida com um gradiante salino, por exemplo com Licl, KC1 ou NaCl.

Numa das versões preferidas do processo põe-se uma solução da proteíma, com uma concentração de 0,01 a 30 mg/1 , em especial de 0,2 a 5 mg/1, que contém Tris numa concentração de 2 a 80 mmol/1 e a um valor de pH de 7,0 a 9,5, em especial de 20 mmol/1 de Tris/HCl e a um valor de pH de 8,0 a 9,0, bem como 1 a 100 mmol/1 de um reagente guelante, em especial 5 a 20 mmol/1 de EDTA e 0,2 a 5g/l, em especial 0,8 a l,5g/l de Na - chol. ou Na - Doc. ou uma mistura destes, com DEAE - ^RSepharose, ^RSephacel, - ^RFractogel

D , p ou Q - Sepharose, em especial DEAE - Sepharose. Apos lava3 «iiiiiiíx

gem do permutador com uma solução tampão elui-se a proteína adsorvida com um gradiante linear crescente de NaCl.

Os eluídos da coluna contendo proteína podem libertar-se dos reagentes quelantes e dos detergentes por meio de diálise contra uma solução tampão de Tris, Hepes, glicina ou PBS, em especial contra uma solução tampão de pH 8,0 a 9,0, ou por meio de um novo passo cromatográfico como cromatografia de permeação de gel com AcA 202 ou AcA 54.

Em certos casos podem ainda continuar a purificar-se as preparações assim obtidas.

Na descrição anterior utilizaram-se as seguintes abreviaturas:

DEAE: Dietilaminoetilo

EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético

HEPES: ácido N - 2 - hidroxietilpiperazina - N Na - Chol:

Na - Doc:

Na - Tchol

Na - Tdoc:

PBS:

rPP4:

rPP4 - X:

PAP III:

PAGE:

Q:

SDS:

Tcheno-Doc

Tdchol: Tris:

- 2 -etanossulfónico Colato de sódio Desoxicolato de sódio Taurocolato de sódio Taurodesoxicolato de sódio Tampão de fosfato de sódio ou de potássio PP4 preparada por engenharia genética,expressa em E.coli PP4-4 preparada por engenharia genética,expressa em E.coli Proteína III anticoagolatória de placenta Electroforese de gel de poliacrilamida Amina quaternária Dodecilsulfato de sódio ácido tauroceno desoxicólico ácido taurodesidrocólico Tris(hidroximetil)aminometano

Os exemplos seguintes destinam-se a esclarecer a invenção:

Como substâncias de partida para a destoxificação utilizaram-se preparações das proteínas PP4, PP4-X, PAP III, p68, lipocortina I e II, da placenta humana, e das proteínas rPP4 e rPP4-X, de culturas de E. coli transformadas, com uma pureza, em relação à componente proteica, superior a 95%, numa solução tampão de 0,02 mol/1 de Tri/HCl, pH 8,5, com uma concentração de proteínas de 2,5 mg/ml. Estas preparações apresentavam um considerável teor em substâncias tóxicas (Tabela 1), tal como se determinou por meio dos testes Limulus (executado em soluções a pH 7,2 ) e do teste do modelo animal.

Testes de toxicidade

1. Teste Limulus

Este teste executou-se como descrito pela firma Concept GmbH(Heidelberg, R.F. Alemã): misturou-se cautelosamente 0,1 ml da solução proteica a testar com 0,1 ml de lisato de amibócitos Limulus, num tubo isento de agentes pirogénicos e incubou-se o tubo, sem agitação durante 60 minutos a 37^0. Terminado o tempo de incubação verificou-se visualmente se no tubo se tinha formado um gel sólido. A pirogenidade da substância testada expressa em EU(unidades de endotoxina),determinou-se por meio de uma curva da calibração, traçada a partir de uma endotoxína de referência (EC-5).

2. Teste pirogénico em coelhos

A toxicidade das amostras de proteína determinou-se através da medição do aumento de temperatura corporal (rectal) de coelhos em relação à temperatura corporal determinada 90 minutos antes. Aplicaram-se amostras de proteína aos coelhos por injecção i.v. na veia da orelha (1 mg/kg de peso corporal) e registaram-se as temperaturas corporais durante um período de tempo de 180 minutos. Tomou-se o valor mais alto como base para o calculo. Consideraram-se isentos de pirogénicos as amostras para as quais a soma das diferenças de temperatura de 6 ani5

mais foi menor ou igual a 2,22C.

Exemplo 1

Após adição de EDTA até uma concentração final de 0,01 mol/1, sob controle de valor de pH, e 0,1% de Na - Doc, puseram-se as soluções contendo PP4, rPP4, PP4- X, rPP4 - X, PAP III, p68 ou lipocortina I ou II, em contacto com DEAE - ^RSepharose (Firma Pharmacia, Suécia), equilibrada com 0,02 M Tris/HCl, pH 8,5, 0,01 M EDTA e 0,1%

Na -Doc (tampão da coluna) numa coluna, lavou—se o gel com tampão da coluna e eluiram-se as proteínas adsorvidas com um gradiante linear crescente de NaCl.

Dialisaram-se os eluídos extensivamente contra uma solução tampão de 0,02 mol/1 de Tris-/HCl,pH 8,5, e em seguida contra uma solução tampão de 0,02 mol/1 de Tris/HCl, pH 7,2, e testaram-se os dialisados tanto no teste Limulus como no teste pirogénico em coelhos, com vista à determinação da toxicidade.

As proteínas tratadas desta maneira não provocaram, ou provocaram apenas muito pouco, aumentos de temperatura em testes pirogénicos e apresentaram baixos teores de endotoxínas no teste Limulus (Tabela 1) e consideraram-se isentas de pirogénicos.

As proteínas PP4-X e rPP4-X não ficaram adsorvidas no gel nas condições mencionadas, mas encontravam-se no eluido da coluna, sendo no entanto apirogénicas após completado o processo descrito (Tabela 1).

A actividade biológica, testada por meio do tempo de tromboplastina modificado, em relação à concentração de proteína, manteve-se completamente inalterada após o processo de purificação, em relação ao material de partida.

Os rendimentos das proteínas situaram-se entre 64 e 85%, em relação aos materiais de partida tóxicos.

Exemplo 2

Misturaram-se soluções tampão contendo PP4, rPP4, PP4-X, rPP4-X, PAP III, p 68 ou lipocortina I ou II com Na-Chol ou Na-Tchol, até uma concentração final de 0,5 g/1, bem como 0,01 mol/1 de EDTA, este equilibrado com Q-^RSepharose (Firma Pharmacia, Suécia), e puseram-se em contacto com 0,02 mol/1 de PBS, pH 8,5, 0,02 mol/1 de EDTA, 0,05g/l de Na-Chol e 0,5 g/1 de Na-Tchol (tampão da coluna) numa coluna, lavou-se o gel e eluiram-se as proteínas adsorvidas com um gradiante linear crescente de NaCl.

Para o posterior tratamento das soluções de proteína e respectivos testes de toxicidade utilizaram-se os processos descritos no exemplo 1. Os resultados destas pesquisas corresponderam aos do exemplo 1 e apresentam-se na Tabela 1.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

- iãProcesso para a separação de toxinas contidas em soluções de proteínas, caracterizado por se submeter uma proteína, numa solução tampão aquosa, a uma cromatografia de permuta iónica, na presença de um agente quelante e de um detergente iónico.

- 2ã Processo para a separação de toxinas, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por a proteína ser uma lipocortina.

_ ₃a _

Processo para a separação de toxinas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se empregar como agente guelante EDTA, EGTA, um sal do ácido cítrico ou do ácido oxálico, ou uma combinação destes.

_ ₄a _

Processo para a separação de toxinas, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se empregar o agente quelante numa concentração de 1 - 100 mmol/1.

_ ₅a _

Processo para a separação de toxinas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se uilizar como detergente ácido eólico, ácido taurocólico, ácido taurodesidrocólico, ácido desoxicólico ácido tauro- desoxicólico ou ácido taurocenodesoxicólico, ou um sal ou uma mistura destes.

- 6ã Processo para a separação de toxi nas, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se empregar o detergente numa concentração de 0,05-5 g/1.

- 72 Processo para a separação de toxinas, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se • · P P empregar como permutador íonico DEAE- Sepharose, DEAE- SeP P phacel, DEAE- Fractogel ou Q- Sepharose.

- 82 Processo para a separação de toxinas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se empregar como permutador iónico DEAE-^RSepharose.

- 92Processo para a separação de toxinas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se separarem o agente quelante e o detergente da solução proteica por meio de diálise ou de cromatografia numa solução tampão a pH 7,5-9,5.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 10 de Abril de 1989, sob o ns. P 39 11 629 8.