CN115279779A - 用于蛋白质纯化的内含肽结合树脂的再使用 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及通过以下的蛋白质纯化方法：将内含肽‑C片段附着至靶蛋白，使含有加上内含肽‑C标签的蛋白质的样品通过携带内含肽‑N片段的层析树脂以便产生内含肽‑N内含肽‑C复合物，从内含肽‑C片段中释放靶蛋白，并且在破坏内含肽‑N内含肽‑C复合物同时保留柱功能性用于多重再使用的条件下使柱再生。

Description

用于蛋白质纯化的内含肽结合树脂的再使用

技术领域

本公开内容涉及通过以下的蛋白质纯化方法：将内含肽-C片段附着至靶蛋白，使含有加上内含肽-C标签的蛋白质的样品通过携带内含肽-N片段的层析树脂以便产生内含肽-N内含肽-C复合物，从内含肽-C片段中释放靶蛋白，并且在破坏内含肽-N内含肽-C复合物同时保留柱功能性用于多重再使用的条件下使柱再生。

背景技术

内含肽是自催化蛋白质，其能够从前体蛋白质自剪接，导致侧翼蛋白质(外显肽)经由肽键的连接。内含肽对于生物技术、化学生物学和合成生物学中的多种应用已变得越来越受欢迎，因为它们耐受外显肽序列的有意交换的能力，以及由两条多肽链重构功能蛋白质的天然存在的断裂内含肽的存在。

在一种应用中，内含肽技术可以被用于纯化靶蛋白。内含肽特异性剪接过程可以通过各种突变进行修饰，所述突变包括N末端内含肽片段中的单个点突变，以导致仅C末端剪接活性，即切割。因此，内含肽-N片段可以作为亲和配体固定在层析支持物上，而内含肽-C充当靶分子(例如蛋白质)上的纯化标签。由于其在给定条件下特异性结合的能力，加上内含肽-C标签的靶分子可以成功地从原料中分离，而所有其它杂质保留在流经物中。靶蛋白的释放随后通过缓冲系统的变化被诱导，所述变化由诸如含硫醇的化合物或还原剂等添加剂、pH或温度驱动。

一旦靶分子已成功地被切割，层析树脂结合的内含肽复合物就可以通过破坏内含肽-N内含肽-C复合物进行再生，以允许多重使用。Guan等人(Biotechnol Bioeng. 2013年9月；110(9):2471-81)描述了通过用高盐和pH > 11的pH缓冲液洗涤的内含肽-C片段解离。然而，高pH环境导致内含肽-N功能性的逐步丧失，因此限制了层析树脂的再使用潜力。在多轮中再使用内含肽-N结合树脂以结合内含肽-C片段而不丧失功能性的能力对于经济上可行的纯化过程是关键参数，其中在每轮柱再生后，共价固定在层析支持物上的内含肽-N片段优选维持其初始功能性或结合容量的>60%。本领域需要有效的方法来再生内含肽-N共价结合的柱，而不破坏柱的功能性。

发明内容

本公开内容涉及通过以下的蛋白质纯化方法：将内含肽-C片段附着至靶蛋白，使含有加上内含肽-C标签的蛋白质的样品通过携带内含肽-N片段的层析树脂以便产生内含肽-N内含肽-C复合物，从内含肽-C片段中释放靶蛋白，并且在破坏内含肽-N内含肽-C复合物同时保留柱功能性用于多重再使用的条件下使柱再生。

目前已惊讶地发现可以有效地破坏内含肽-N内含肽-C复合物，以从固定在层析树脂上的内含肽-N片段中释放内含肽-C片段，而不影响内含肽-N的稳定性和功能性。在一个实施方案中，破坏内含肽-N内含肽-C复合物且再生内含肽-N柱用于进一步再使用的过程使用具有约1至约4、优选约1至约2的pH的酸性缓冲液。由于静电环境的变化，将破坏由于广泛的电荷-电荷相互作用而形成的内含肽-N内含肽-C复合物，引起内含肽-C片段的释放。在其它实施方案中，使用去污剂和/或离液试剂和/或亲液(kosmotropic)试剂以改变内含肽的三级结构，导致内含肽-N内含肽-C复合物的结构破坏。在再其它实施方案中，该方法包括蛋白质纯化和柱生成的多重循环，伴随酸性缓冲液、去污剂和/或离液试剂和/或亲液试剂用于再生步骤的同时或序贯使用。任选地，碱性缓冲液被包括在部分再生循环中。如本文证实的，在这些条件下，通过靶向与层析支持物的多点或单点内含肽-N附着的各种附着化学而固定的内含肽-N片段，在多轮蛋白质纯化后保留了其功能性。

因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了通过以下的用于纯化样品中的靶分子的方法：(a) 提供含有融合蛋白的样品，所述融合蛋白包含通过肽键与靶分子连接的内含肽-C多肽(加上内含肽-C标签的靶分子)；(b) 在其中融合蛋白中的内含肽-C多肽与树脂中的内含肽-N多肽结合以形成内含肽复合物的条件下，使样品与包含共价连接的N末端内含肽多肽的层析树脂接触；(c) 任选地洗涤含有内含肽复合物的树脂，以去除未结合的污染物；(d) 将内含肽复合物暴露于足以从内含肽-C多肽中释放靶分子的条件；(e) 通过使树脂与一种或多种组合物接触，以便破坏内含肽-N内含肽-C复合物并从层析树脂中释放内含肽-C多肽，来再生层析树脂，所述组合物选自：(i) 在水溶液中具有约1至约4的pH的组合物；(ii) 包含至少一种去污剂的组合物；以及(iii) 包含至少一种亲液剂和/或离液剂的组合物；并且(f) 任选地，通过将步骤(a)至(e)重复至少一次来执行至少一个另外的纯化循环。根据本发明的原理，在每个纯化循环后，由步骤(e)或任选的步骤(f)获得的再生的层析树脂保留其C末端内含肽结合容量的至少约60%，优选至少约70%，且更优选至少约80%。

本公开内容的原理以天然片段化的gp41-1内含肽及其变体进行例示，所述gp41-1内含肽与其它的诸如NpuDnaE等断裂内含肽和/或例如NpuDnaB等小内含肽共享高度的结构和功能同源性(Beyer，H.M等人，FEBS Journal，2019)。还观察到gp41-1内含肽-N和内含肽-C结合在提议的“捕获和坍塌(capture and collapse)”模型中起作用，所述模型对于其它天然断裂内含肽如NpuDnaE也是有效的(Beyer，2019)。由于内含肽片段中的结构和功能同源性，对于本领域技术人员显而易见的是，本文描述的方法适用于其它内含肽-C和内含肽-N复合物。

附图说明

本公开内容在附图的图中示出，所述附图意欲是示例性而非限制性的，其中相似的提及预期指相似或对应的部分，并且其中：

图1：描绘了用碱性(NaOH)和酸性(H₃PO₄)溶液的静态结合容量(SBC)测定的方案。

图2：显示了几种内含肽-N配体树脂原型的静态结合容量(SBC)结果，所述树脂原型用0.1 M NaOH (A)或0.15M H₃PO₄ (B)处理0/2/15小时。使预纯化的内含肽-C靶标与平衡的树脂一起温育，并且用处于pH 9的缓冲液洗涤。结合的靶标通过两种再生缓冲液(第一种：0.01M甘氨酸，pH 1，第二种：0.15 M H₃PO₄，pH 1.5)进行触发释放。

图3：携带固定化第三代内含肽-N配体的原型R43-358132在280nm (A280)处测量的吸光度层析图的叠加。柱用加上内含肽-C标签的靶标(20 kDa)装载5个循环。柱用处于pH9的缓冲液进行洗涤，并且通过改变为pH 7来触发所切割靶标的洗脱。在洗脱后，柱在pH 9下进行洗涤，并且用再生缓冲液(0.15M H₃PO₄ pH 1.5)进行清洁，以触发内含肽-C的释放。在清洁后，柱使用处于pH 9的缓冲液进行重新平衡，并且经受下一轮再使用。

图4. 上图(S)显示了纯度为43%的StrepII-标签预纯化靶标(20kDa)和纯度为3%的预切割的无标签靶标的尺寸排阻层析图。将此原料装载到内含肽-N配体原型R43-358132用于柱性能评估。图E1和E2显示了具有内含肽纯化的再使用循环研究的洗脱级分的四个尺寸排阻层析图的叠加。根据所释放靶标的纯度来分析样品。

图5：在StrepII-标签纯化后，加上StrepII标签的预纯化的内含肽-C靶原料的SDS-Page内含肽纯化，所述靶原料用作内含肽-N配体原型R43-358132的装载(S)。装载关于所有4个再使用循环(循环1-5)的洗脱级分(E1和E2)用于SDS-Page分析。

图6携带固定化第三代内含肽-N配体的原型R43-358132在280nm (A280)处测量的吸光度层析图的叠加。将柱用含有加上内含肽-C标签的靶标(20 kDa)的大肠杆菌裂解物装载4个循环。将柱用处于pH 9的缓冲液进行洗涤，并且通过改变为pH 7来触发所切割靶标的洗脱。在洗脱后，柱在pH 9下进行洗涤，并且用再生缓冲液(0.15M H₃PO₄ pH 1.5)进行清洁，以触发内含肽-C的释放。在清洁后，将柱使用处于pH 9的缓冲液进行重新平衡，并且经受下一轮再使用。

图7：上图(S)显示了含有测量纯度为3%的内含肽-C靶蛋白(20kDa)的澄清的细胞裂解物的尺寸排阻层析图。将该原料装载到内含肽-N配体原型R43-358132用于内含肽柱性能评估。图E1和E2显示了具有内含肽纯化的再使用循环研究的洗脱级分的五个尺寸排阻层析图的叠加。根据所释放靶标的纯度来分析样品。

图8：SDS-Page内含肽纯化循环研究样品。凝胶显现了含有内含肽-C靶标的澄清的大肠杆菌裂解物的条带组成，所述澄清的大肠杆菌裂解物用作内含肽-N配体原型R43-358132的装载(S)。装载关于所有4个再使用循环(循环1-5)的洗脱级分(E1和E2)用于SDS-Page分析。

图9：显示了实施例3和4的基于内含肽的纯化的洗脱靶标的量，以mg/mL计。

图10：用于两轮连续纯化、携带固定化内含肽-N配体的被命名为18RSAB007的原型在280nm (A280)处测量的吸光度层析图的叠加。第一轮A280信号以实线显示，第二轮A280以虚线显示。每一轮都用40kDa加上内含肽-C标签的靶标(DNAJ)装载柱，直到达到穿透。柱用处于pH9的缓冲液进行洗涤，并且通过pH至7的改变来触发所切割靶标DNAJ的洗脱。在洗脱后，柱在pH 9下进行洗涤，并且用再生缓冲液(10mM甘氨酸-HCl pH 1.0)进行清洁，以触发内含肽-C的释放。在清洁后，柱使用处于pH 9的缓冲液进行重新平衡，并且经受下一轮再使用。

图11：从原型18RSAB007的功能性测试获取的级分的SDS-Page。两个SDS-Page分析(图11A：循环1；图11B：循环2)二者表示了在使用柱原型18RSAB007和40kDa IC-靶标(DNAJ)的两个循环之间，由级分E1、E2和CIP观察到的可比较的条带模式。

图12A：携带固定化内含肽-N配体的原型R44-358132的层析图。用加上内含肽-C标签的靶标(20kDa)装载柱，直到达到穿透。柱用处于pH 9的盐水缓冲液进行洗涤，并且通过使用切割缓冲液改变pH来触发所切割靶标的洗脱。图12B：来自图12A的再生级分D9-F2的SDS-Page。

图13：将携带内含肽-N配体的层析柱暴露于溶液A (0.1M NaOH)、B (0.15 H₃PO₄)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (1M精氨酸)、E (H₂O)、F (10%十二烷基硫酸钠) 15分钟。在pH 9下将加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)装载并捕获于柱上，然后通过将pH改变为pH7切割该靶蛋白。SDS-Page表示了在室温下的切割反应下20小时内释放的靶标。将凝胶用考马斯蓝染剂进行显现。

图14：再使用来自图1的携带内含肽-N配体的层析柱，并且将其暴露于溶液A(0.1M NaOH)、B (0.15 H₃PO₄)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (1M精氨酸)、E (H₂O)、F (10%十二烷基硫酸钠) 150分钟(图14A：1.再使用)，然后暴露于溶液A、B、C、D、E、F 1500分钟(图14B：2.再使用)。在pH 9下将加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)装载并捕获于柱上，然后通过将pH改变为pH7切割该靶蛋白。SDS-Page表示了在室温下的切割反应下20小时内释放的靶标。将凝胶用考马斯蓝染剂进行显现。

图15：描绘了与溶液A (0.1M NaOH)、B (0.15 H₃PO₄)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (1M精氨酸)、E (H₂O)、F (10%十二烷基硫酸钠)一起温育，在三次内含肽柱使用后释放的靶蛋白的量。由于将条带强度对所用蛋白质标记物的50kD条带的已知质量进行标准化，确定了浓度。

图16：再使用携带内含肽-N配体的层析柱4次，同时将其连续暴露于溶液A (0.1MNaOH)、B (0.1M NaOH + 1M NaCl)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (0.15H₃PO₄)和E (H₂O) 15/150/1500/1620分钟。在pH 9下将加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)装载并捕获于柱上，然后通过将pH改变为pH7切割该靶蛋白。在柱再使用的每个步骤之间，用2CV 10% SDS洗涤柱。SDS-Page表示了在室温下的切割反应下20小时内释放的靶标。将凝胶用考马斯蓝染剂进行显现。

图17：描绘了在与溶液A (0.1M NaOH)、B (0.1M NaOH + 1M NaCl)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (0.15 H₃PO₄)和E (H₂O)一起温育的四次内含肽柱使用后释放的靶蛋白的量。由于将条带强度对所用蛋白质标记物的50kD条带的已知质量进行标准化，确定了浓度。

图18：显示了在暴露于10% SDS 20小时(图18A)或暴露于H₂O 20小时(图18B)后，携带内含肽-N配体的2个层析柱的切割动力学。用处于pH 9的盐水缓冲系统将加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)装载并捕获于柱上，然后通过将pH改变为pH7切割该靶蛋白。基于将C1-C7的条带强度对所使用蛋白质标记物的50kD条带的已知质量进行标准化，确定了切割速率(图18C)。

具体实施方式

本公开内容描述了用于共价固定在层析固体支持物上的内含肽-N配体的再生和再使用的方法。通过在一个或多个纯化循环中，以任何次序同时或序贯地，各自单独地或彼此组合地使用酸性缓冲液、去污剂、离液剂和/或亲液剂破坏内含肽-N内含肽-C复合物来再生内含肽-N柱。任选地，碱性缓冲液被用作再生步骤的部分。本公开内容的方法涉及在每轮纯化后恢复约>60%的柱功能性(即内含肽-C结合容量)，优选约>70%，更优选>90%，以及甚至更优选>90%的柱功能性。

(1) 定义

为了使本公开内容可以更容易地理解，首先定义了某些术语。贯穿具体实施方式中阐述了另外的定义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

如本文使用的，术语“靶分子”指有待例如从混合物(例如澄清的蛋白质混合物)中纯化或取出的生物分子(例如蛋白质)、材料或大分子组装体。示例性靶分子包括例如重组肽和蛋白质，包括抗体(例如单克隆抗体)、疫苗、病毒和其它大分子组装体，例如可以掺入生物分子和合成组分两者的病毒样颗粒和纳米颗粒。例如，靶分子可以包括蛋白质和生物分子组装体(例如通过重组DNA技术产生的)，例如激素(例如胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、组织纤溶酶原激活物)、单克隆抗体(mAb)和mAb衍生物(例如双特异性mAb、Fab、scFv、鲨鱼和骆驼科抗体)、支架衍生的治疗剂(例如DARPin、亲和体(Affibody)、抗运载蛋白(anticalin))、治疗性酶(例如α半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、葡萄糖脑苷脂酶)、毒素(例如肉毒杆菌、CRM 197、蓖麻毒素)、重组疫苗(例如炭疽、白喉、破伤风、肺炎、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒)、病毒样颗粒(例如乙型肝炎、人乳头状瘤病毒、流感病毒、细小病毒、诺沃克病毒)以及工业酶(例如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、BENZONASE^®酶、DENERASE^TM酶、脲酶、胃蛋白酶等等)、诊断试剂(例如葡萄糖和乳酸脱氢酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、限制性酶、杂交瘤衍生抗体等等)和病毒载体(例如慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒1病毒载体(HSV-1)等等)。

如本文使用的，术语“融合蛋白”指天然存在的、合成的、半合成的或重组的单一蛋白质分子，其包含通过肽键连接的两种或更多种异源多肽的全部或一部分。

如本文使用的，术语“肽(peptide)”、“肽(peptidic)”指长度长于两个氨基酸的肽和蛋白质，其也可以掺入非氨基酸分子。

术语“多肽”指氨基酸的聚合物，而不是特定的长度；因此，肽、寡肽和蛋白质被包括在多肽的定义内。

如本文使用的，术语“内含肽”指从自然界中分离或通过重组DNA技术产生的具有自催化活性的蛋白质。内含肽含有内部序列或区段，所述内部序列或区段在其翻译后可以从大分子中剪接出来，留下剩余的区段(“外显子”)以重新连接并形成新的蛋白质。

如本文使用的，术语“断裂内含肽”指从自然界中分离或通过重组DNA技术产生的蛋白质，其具有下述性质：(1) 蛋白质以两半存在，这两半以高亲和力和选择性相互作用；(2) 这两半必须含有催化活性所需的所有内含肽序列，并且也可能含有附加的非内含肽-N肽序列；(3) 蛋白质仅当这两半紧密结合时才具有酶促活性；并且(4) 酶促活性是位点选择性肽切割或连接，其作用于将内含肽序列与非内含肽-N肽序列分开，或将非内含肽-N肽序列连接成邻接的线性或环状蛋白质。

术语“互补内含肽”在本文中用于指断裂内含肽对的内含肽-N和内含肽-C部分。

如本文使用的，术语“内含肽-N”指与单个内含肽多肽的N末端部分具有同源性的内含肽多肽，并且其与互补的内含肽-C结合以形成活性内含肽酶。

如本文使用的，术语“内含肽-C”指与单个内含肽多肽的C末端部分具有同源性的内含肽多肽，并且其与互补的内含肽-N结合，以形成活性内含肽酶。

如本文使用的，术语“外含肽”指在自然界中与N-和内含肽-C融合并且通过断裂内含肽的酶促作用被操纵(例如切割或连接)的N-和C末端肽序列。

如本文使用的，术语“层析”指将目的靶分子与混合物中的其它分子分开并允许其被分离的动态分离技术。通常，在层析方法中，流动相(液体或气体)将含有目的靶分子的样品输送穿过或通过固定相(通常为固体)介质。对固定相的分配或亲和力的差异将不同的分子分开，而流动相在不同的时间将不同的分子带出。

如本文使用的，术语“亲和层析”指一种层析模式，其中待分开的靶分子通过其与分子(例如根据本发明的包含内含肽-N和内含肽-N增溶因子的亲和层析配体)的相互作用进行分离，所述分子与靶分子特异性相互作用。在一个实施方案中，亲和层析涉及将含有靶分子(例如蛋白质)的样品添加到其上携带了基于内含肽-N的配体的固体支持物上，如本文所述。

(2) 本发明的方法的描述

本公开内容提供了通过以下的用于纯化样品中的靶分子的方法：

(a) 提供含有融合蛋白的样品，所述融合蛋白包含通过肽键与靶分子连接的内含肽-C多肽(加上内含肽-C标签的靶分子)；

(b) 在其中融合蛋白中的内含肽-C多肽与树脂中的内含肽-N多肽结合以形成内含肽复合物的条件下，使样品与包含共价连接的N末端内含肽多肽的层析树脂接触；

(c) 任选地洗涤含有内含肽复合物的树脂，以去除未结合的污染物；

(d) 将内含肽复合物暴露于足以从内含肽-C多肽中释放靶分子的条件；

(e) 通过使树脂与一种或多种组合物接触，以便破坏内含肽-N内含肽-C复合物并从层析树脂中释放内含肽-C多肽，来再生层析树脂，所述组合物选自：

(i) 在水溶液中具有约1至约4的pH的组合物；

(ii) 包含至少一种去污剂的组合物；和

(iii) 包含至少一种亲液剂和/或离液剂的组合物；和

(f) 任选地，通过将步骤(a)至(e)重复至少一次来执行至少一个另外的纯化循环。

在一个实施方案中，步骤(e)进一步包括步骤(iv) 通过使树脂与在水溶液中具有约9至约14的pH、优选在水溶液中具有约10-14的pH的组合物接触来再生层析树脂。

根据本发明的原理，在每个纯化循环后，由步骤(e)或任选的步骤(f)获得的再生的层析树脂保留其C末端内含肽结合容量的至少约60%，优选至少约70%，且更优选至少约80%。

本文所述的方法涉及用于纯化靶生物分子的亲和层析，其利用在层析树脂上共价结合的内含肽-N配体，所述层析树脂优选地附着到固体支持物。在足以在内含肽-N片段和内含肽-C片段之间形成稳定复合物的条件下，使加上内含肽-C标签的蛋白质通过柱。在去除过程污染物的任选洗涤步骤后，靶标的无标签释放由pH的变化触发。最后，柱通过以下进行再生：引入静电环境(用酸性缓冲液)和/或蛋白质三级结构的改变(用离液剂、亲液剂和/或去污剂)，以便破坏内含肽-N和内含肽-C复合物并再生内含肽-N树脂。

本发明的方法可以执行一次，即单个纯化和再生循环，但优选通过使内含肽-N柱经受多重纯化和再生循环来执行多次。在一些实施方案中，再生内含肽-N柱的条件在每个纯化循环中可以是相同的。在一些实施方案中，生成内含肽-N柱的条件使用如下文示例性描述的再生顺序交替每个纯化循环，但所述再生顺序可以基于个别柱并且如本领域技术人员考虑的进行变化。

例如，在一个实施方案中，使用在水溶液中具有约1至约4的pH的组合物(即酸性缓冲液)使柱再生一次或多次。在另一个实施方案中，使用包含离液剂的组合物，将柱生成一次或多次。在另一个实施方案中，使用包含亲液剂的组合物，将柱生成一次或多次。在另一个实施方案中，使用包含去污剂的组合物来生成柱。

在其它实施方案中，使柱再生多次，每次使用选自在水溶液中具有约1至约4的pH的酸性缓冲液、离液剂、亲液剂和去污剂的一种或多种试剂。在一些实施方案中，个别试剂可以彼此独立地用于至少一些纯化循环中，以约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的纯化循环或者约100%的纯化循环的周期性，如通过本领域技术人员确定的。

在一些实施方案中，碱性缓冲液也可以并入纯化步骤的一部分内，其周期性由本领域技术人员确定。碱性缓冲液优选具有约9至约14的pH，更优选约11至约14的pH，或优选约10至约12的pH。因此，碱性缓冲液可以每隔一个循环地用于柱再生(即约50%的纯化循环)，或者可替代地在约10%、约20%、约30%、约40%、约60%、约70%、约80%或约90%的纯化循环中使用。

可以执行再生步骤，持续破坏内含肽-N和内含肽-C复合物所需的任何时间长度。通常的再生时间长达120分钟，但取决于反应可以更长或更短。此外，再生可以在静态温育或代表每柱体积(CV) 0-120分钟的停留时间的恒定流动下执行。

本公开内容的方法优选涉及每个纯化循环约>60%的柱功能性(即内含肽-C结合容量)的恢复。因此，在第一次柱再使用后，柱保留的内含肽-C结合容量为其初始结合容量的至少约60%，例如其初始结合容量的至少约70%，或其初始结合容量的至少约80%，或其初始结合容量的至少约90%，或其初始结合容量的至少约95%，或其初始结合容量的至少约99%。其后，该柱优选在每个纯化循环后保留其内含肽-C结合容量的至少约60%。在一些实施方案中，柱在每个纯化循环后保留其内含肽-C结合容量的至少约70%。在一些实施方案中，柱在每个纯化循环后保留其内含肽-C结合容量的至少约80%。在一些实施方案中，柱在每个纯化循环后保留其内含肽-C结合容量的至少约90%。在一些实施方案中，柱在每个纯化循环后保留其内含肽-C结合容量的至少约95%。在一些实施方案中，柱在每个纯化循环后保留其内含肽-C结合容量的至少约99%。

在一些实施方案中，步骤(e)(i)在至少一个纯化循环中执行，并且步骤(e)(ii)、(e)(iii)和(e)(iv)中的至少一个在至少10%的纯化循环中，优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

在其它实施方案中，步骤(e)(ii)在至少一个纯化循环中执行，并且步骤(e)(i)、(e)(iii)和(e)(iv)中的至少一个在至少10%的纯化循环中，优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

在其它实施方案中，步骤(e)(iii)在至少一个纯化循环中执行，并且步骤(e)(i)、(e)(ii)和(e)(iv)中的至少一个在至少10%的纯化循环中，优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

因此，在示例性实施方案中：

(A) 步骤(e)(i)和(e)(ii)以任何次序同时或序贯执行；或

(B) 步骤(e)(i)和(e)(iii)以任何次序同时或序贯执行；或

(C) 步骤(e)(ii)和(e)(iii)以任何次序同时或序贯执行；或

(D) 步骤(e)(i)和(e)(ii)和(e)(iii)以任何次序同时或序贯执行；

(E) 步骤(e)(i)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯执行；或

(G) 步骤(e)(ii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯执行；或

(G) 步骤(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯执行；或

(H) 步骤(e)(i)、(e)(ii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯执行；或

(I) 步骤(e)(i)、(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯执行；或

(J) 步骤(e)(ii)、(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯执行；或

(K) 步骤(e)(i)、(e)(ii)、(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯执行，

其中当执行步骤(e)(i)、(e)(ii)、(e)(iii)和/或(e)(iv)的任何步骤时，此类一个或多个步骤彼此独立地在至少10%的纯化循环中，优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

(3)实施本发明的替代实施方案

在一个示例性实施方案中，本发明提供了用于纯化样品中的靶分子的方法，其涉及使用酸性缓冲液的内含肽-N柱再生。根据该实施方案，本发明包括以下步骤：(a) 提供含有融合蛋白的样品，所述融合蛋白包含通过肽键与靶分子连接的内含肽-C多肽(加上内含肽-C标签的靶分子)；(b) 在其中融合蛋白中的内含肽-C多肽与树脂中的内含肽-N多肽结合以形成内含肽复合物的条件下，使样品与包含共价连接的N末端内含肽多肽的层析树脂接触；(c) 任选地洗涤含有内含肽复合物的树脂，以去除未结合的污染物；(d) 将内含肽复合物暴露于足以从内含肽-C多肽中释放靶分子的条件；(e) 通过使树脂与在水溶液中具有约1至约4的pH的组合物接触，以便破坏内含肽-N内含肽-C复合物并从层析树脂中释放内含肽-C多肽，来再生层析树脂；并且(f) 任选地，通过将步骤(a)至(e)重复至少一次来执行至少一个另外的纯化循环。根据本发明的原理，在每个纯化循环后，由步骤(e)或任选的步骤(f)获得的再生的层析树脂保留其C末端内含肽结合容量的至少约60%，优选至少约70%，且更优选至少约80%。

在一些实施方案中，在水溶液中具有约1至约4之间的pH的组合物是酸性缓冲液。在其它实施方案中，酸性缓冲液在水溶液中具有约1至约3.5的pH。在其它实施方案中，酸性缓冲液在水溶液中具有约1至约2的pH。

在一些实施方案中，使用酸性缓冲液用于柱再生的上述方法进一步包括在至少一些再生步骤中，用离液试剂、亲液剂、去污剂和/或碱性试剂再生柱的步骤。因此，上述方法可以进一步包括以下步骤：(i) 通过使树脂与包含至少一种离液剂的组合物接触来再生层析树脂；(ii) 通过使树脂与包含至少一种亲液剂的组合物接触来再生层析树脂；(iii) 通过使树脂与包含至少一种去污剂的组合物接触来再生层析树脂；和/或(iv) 通过使树脂与在水溶液中具有约9或更高、优选约10或更高的pH的组合物接触来再生层析树脂。步骤(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)可以在至少1%的纯化循环中，优选在至少约10%的纯化循环中，更优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了用于纯化样品中的靶分子的方法，其涉及使用离液剂的内含肽-N柱再生。根据该实施方案，该方法包括以下步骤：(a) 提供含有融合蛋白的样品，所述融合蛋白包含通过肽键与靶分子连接的内含肽-C多肽(加上内含肽-C标签的靶分子)；(b) 在其中融合蛋白中的内含肽-C多肽与树脂中的内含肽-N多肽结合以形成内含肽复合物的条件下，使样品与包含共价连接的N末端内含肽多肽的层析树脂接触；(c) 任选地洗涤含有内含肽复合物的树脂，以去除未结合的污染物；(d) 将内含肽复合物暴露于足以从内含肽-C多肽中释放靶分子的条件；(e) 通过使树脂与至少一种离液剂接触来再生层析树脂；并且(f) 任选地，通过将步骤(a)至(e)重复至少一次来执行至少一个另外的纯化循环。根据本发明的原理，在每个纯化循环后，由步骤(e)或任选的步骤(f)获得的再生的层析树脂保留其C末端内含肽结合容量的至少约60%，优选至少约70%，且更优选至少约80%。

在一些实施方案中，使用离液试剂用于柱再生的上述方法进一步包括在至少一些再生步骤中，用亲液剂、去污剂、酸性试剂和/或碱性试剂再生柱的步骤。因此，上述方法可以进一步包括以下步骤：(i) 通过使树脂与包含在水溶液中具有至少约1至约4的pH的至少一种酸性试剂的组合物接触来再生层析树脂；(ii) 通过使树脂与包含至少一种亲液剂的组合物接触来再生层析树脂；(iii) 通过使树脂与包含至少一种去污剂的组合物接触来再生层析树脂；和/或(iv) 通过使树脂与在水溶液中具有约9或更高、优选约10或更高的pH的组合物接触来再生层析树脂。步骤(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)可以在至少1%的纯化循环中，优选在至少约10%的纯化循环中，更优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了用于纯化样品中的靶分子的方法，其涉及使用亲液剂的内含肽-N柱再生。根据该实施方案，该方法包括以下步骤：(a) 提供含有融合蛋白的样品，所述融合蛋白包含通过肽键与靶分子连接的内含肽-C多肽(加上内含肽-C标签的靶分子)；(b) 在其中融合蛋白中的内含肽-C多肽与树脂中的内含肽-N多肽结合以形成内含肽复合物的条件下，使样品与包含共价连接的N末端内含肽多肽的层析树脂接触；(c) 任选地洗涤含有内含肽复合物的树脂，以去除未结合的污染物；(d) 将内含肽复合物暴露于足以从内含肽-C多肽中释放靶分子的条件；(e) 通过使树脂与具有至少一种亲液剂的组合物接触，以便破坏内含肽-N内含肽-C复合物并从层析树脂中释放内含肽-C多肽，来再生层析树脂；并且(f) 任选地，通过将步骤(a)至(e)重复至少一次来执行至少一个另外的纯化循环。根据本发明的原理，在每个纯化循环后，由步骤(e)或任选的步骤(f)获得的再生的层析树脂保留其C末端内含肽结合容量的至少约60%，优选至少约70%，且更优选至少约80%。

在一些实施方案中，使用亲液试剂用于柱再生的上述方法进一步包括在至少一些再生步骤中，用离液试剂、去污剂、酸性试剂和/或碱性试剂再生柱的步骤。因此，上述方法可以进一步包括以下步骤：(i) 通过使树脂与包含在水溶液中具有至少约1至约4的pH的至少一种酸性试剂的组合物接触来再生层析树脂；(ii) 通过使树脂与包含至少一种离液剂的组合物接触来再生层析树脂；(iii) 通过使树脂与包含至少一种去污剂的组合物接触来再生层析树脂；和/或(iv) 通过使树脂与在水溶液中具有约9或更高、优选约10或更高的pH的组合物接触来再生层析树脂。步骤(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)可以在至少1%的纯化循环中，优选在至少约10%的纯化循环中，更优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了用于纯化样品中的靶分子的方法，其涉及使用去污剂的内含肽-N柱再生。根据该实施方案，该方法包括以下步骤：(a) 提供含有融合蛋白的样品，所述融合蛋白包含通过肽键与靶分子连接的内含肽-C多肽(加上内含肽-C标签的靶分子)；(b)在其中融合蛋白中的内含肽-C多肽与树脂中的内含肽-N多肽结合以形成内含肽复合物的条件下，使样品与包含共价连接的N末端内含肽多肽的层析树脂接触；(c) 任选地洗涤含有内含肽复合物的树脂，以去除未结合的污染物；(d) 将内含肽复合物暴露于足以从内含肽-C多肽中释放靶分子的条件；(e) 通过使树脂与选自包含至少一种去污剂的组合物的一种或多种组合物接触来再生层析树脂；并且(f) 任选地，通过将步骤(a)至(e)重复至少一次来执行至少一个另外的纯化循环。根据本发明的原理，在每个纯化循环后，由步骤(e)或任选的步骤(f)获得的再生的层析树脂保留其C末端内含肽结合容量的至少约60%，优选至少约70%，且更优选至少约80%。

在一些实施方案中，去污剂选自阴离子型去污剂、阳离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子型去污剂；优选地其中所述去污剂选自聚山梨醇酯、聚乙二醇、糖苷、泊洛沙姆、CHAPS、CHAPSO、烷基苯磺酸盐、季铵盐和胆汁酸。

在一些实施方案中，使用去污剂用于柱再生的上述方法进一步包括在至少一些再生步骤中，用离液试剂、亲液剂、酸性试剂和/或碱性试剂再生柱的步骤。因此，上述方法可以进一步包括以下步骤：(i) 通过使树脂与包含在水溶液中具有至少约1至约4的pH的至少一种酸性试剂的组合物接触来再生层析树脂；(ii) 通过使树脂与包含至少一种离液剂的组合物接触来再生层析树脂；(iii) 通过使树脂与包含至少一种亲液剂的组合物接触来再生层析树脂；和/或(iv) 通过使树脂与在水溶液中具有约9或更高、优选约10或更高的pH的组合物接触来再生层析树脂。步骤(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)可以在至少1%的纯化循环中，优选在至少约10%的纯化循环中，更优选在至少约25%的纯化循环中，且更优选在至少约50%的纯化循环中执行。

在一个替代实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：(a) 提供携带内含肽-N片段的层析树脂；(b) 将内含肽-C片段附着到选择的靶标；(c) 加上内含肽-C标签的靶标在选择的表达系统中的可溶性或不溶性表达；(d) 在足以形成在内含肽-N片段和内含肽-C片段之间的稳定复合物的条件下，将加上内含肽-C标签的靶标从细胞培养物装载到内含肽柱中；(e) 在去除诸如宿主细胞蛋白(HCP)等污染物的条件下，洗涤内含肽柱；(f) 任选地并入中间洗涤，以进一步去除过程污染物；(g) 在其中所切割的内含肽-C片段保持与柱上的内含肽-N片段结合的条件下，触发靶标的无标签释放；并且(h) 通过引入静电环境(用酸性缓冲液)和/或蛋白质三级结构的改变(用离液剂、亲液剂和/或去污剂)，以便破坏内含肽-N和内含肽-C复合物且再生内含肽-N树脂，使柱再生。也可以将碱性缓冲液并入一些再生循环，其周期性由本领域技术人员确定。

酸性缓冲液

在一些实施方案中，再生步骤(e)中的约1至4的pH通过将内含肽-N柱暴露于在水溶液中具有酸性pH的缓冲液来实现。在一些实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约1至约2之间的pH。在其它实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约1的pH。在其它实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约2的pH。在一些实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约1至约3之间的pH。在一些实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约1至约3.5之间的pH。在一些实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约2至约3.5之间的pH。

酸性缓冲液的非限制性实施方案包括磷酸(H₃PO₄)、甘氨酸、盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、柠檬酸、乙酸、甲酸、乳酸、碳酸、琥珀酸、硝酸、苹果酸、草酸、水杨酸、甲酸及其任何组合。

去污剂

在一个实施方案中，本文所述的方法进一步包括在再生步骤之后、在再使用之前，用去污剂和/或用水洗涤层析树脂的步骤。洗涤步骤可以与再生步骤同时发生，或在再生步骤之后、在再使用之前发生。

如本文使用的，术语“去污剂”指具有清洁性质的包含表面活性剂或表面活性剂混合物的组合物。如本文使用的，术语“表面活性剂”指能够减少液体的表面张力的表面活性试剂或润湿剂；通常是具有亲水“头部”和疏水“尾部”的有机化合物。

合适的表面活性剂包括阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂及其混合物。去污剂的非限制性实例选自聚山梨醇酯、聚乙二醇、糖苷、泊洛沙姆、CHAPS、CHAPSO、烷基苯磺酸盐、季铵盐和胆汁酸。

阳离子型表面活性剂包括例如十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵及其混合物。

阴离子型表面活性剂包括例如烷基苯磺酸盐、十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸钠、月桂基硫酸钠、烷基萘磺酸缩合物钠盐、硬脂酸钠及其混合物。

两性表面活性剂包括各种卵磷脂，例如：鸡蛋卵磷脂；大豆卵磷脂；合成的饱和卵磷脂，例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱；以及合成的不饱和卵磷脂，例如二油酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。非离子型表面活性剂包括例如乙氧基化失水山梨醇酯、失水山梨醇酯、聚甘油酯、蔗糖酯、泊洛沙姆、烷基聚葡糖苷、聚环氧烷改性七甲基三硅氧烷、烯丙氧基聚乙二醇甲基醚及其混合物。

目前优选的表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。

离液剂

如本文使用的，“离液剂”是可以破坏水分子之间的氢键合的分子。这通过减弱疏水作用来影响溶液中的其它分子(例如多肽和蛋白质)的天然状态的稳定性。可以用于本发明的上下文中的离液剂的非限制性实例是氯化胍、精氨酸、正丁醇、乙醇、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、尿素及其任何组合。

亲液剂

如本文使用的，“亲液剂”稳定诸如蛋白质等大分子(中的分子内相互作用。亲液剂可以是离子的或非离子的。离子亲液质趋于为小的或具有高电荷密度。一些离子亲液质是CO₃ ²⁻、SO₄ ²⁻、HPO₄ ²⁻及其任何组合。

在一些实施方案中，待用于本发明的方法中的亲液剂是离子亲液剂或非离子亲液剂，其选自碳水化合物、氨基酸和醇及其任何组合。

碱性缓冲液

在一些实施方案中，在任选的再生步骤(e)(iv)中约9或更高的pH通过将内含肽-N柱暴露于在水溶液中具有碱性pH的缓冲液来实现。在一些实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约9至约14之间的pH。在一些实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约10至约14之间的pH。在一些实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约11至约14之间的pH。在其它实施方案中，缓冲液在水溶液中具有约10至约12之间的pH。

用于此类碱性缓冲液中的合适的碱包括但不限于诸如氢氧化钠、氢氧化钾、苛性清洁剂、精氨酸、氢氧化钙或氢氧化钾等碱。

包含内含肽-N的亲和层析基质

本文所述的方法利用内含肽-N多肽作为亲和层析的配体。相应地，在某些实施方案中，本发明提供了包含与固体支持物附着的内含肽-N多肽的亲和层析基质。在特定实施方案中，固体支持物是层析树脂或层析膜。在一个实施方案中，层析树脂包括亲水性聚乙烯醚基质。

优选地，固体支持物包含有机聚合物，如亲水性乙烯醚基聚合物、聚苯乙烯、聚醚砜、聚酰胺(例如尼龙)、多糖(例如琼脂糖和纤维素)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚碳酸酯、碳氟化合物聚合物(例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚)))或其组合或共聚物。

在再其它实施方案中，固体载体包含无机性质的载体，例如二氧化硅、氧化锆、氧化钛及其合金。无机基质的表面经常被修饰，以包括合适的反应基团。在一些实施方案中，固体载体可以例如基于呈可控孔度玻璃形式的氧化锆、二氧化钛或二氧化硅，其可以被修饰为含有反应基团和/或维持苛性浸泡，以与配体偶联。

示例性固体支持物形式包括但不限于珠粒(球形或不规则的)、中空纤维、固体纤维、垫、凝胶、膜、盒、柱、芯片、载玻片、板或单块。

任何合适的技术都可以被用于将本文所述的内含肽-N附着至支持物，例如包括本领域众所周知和本文所述的那些固体支持物。例如，在一些实施方案中，内含肽-N可以经由常规偶联技术附着至支持物，所述常规偶联技术利用例如片段中存在的硫醇、氨基和/或羧基。例如，双环氧化物、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等，1,4-丁二醇二缩水甘油醚是众所周知的偶联试剂，并且促进内含肽-N片段与固体支持物的化学偶联。可以使用如本领域已知的其它偶联剂。关于为此目的使用的偶联方法的综述，参见例如ImmobilizedAffinity Ligand Techniques，Hermanson等人，Greg T. Hermanson，A. Krishna Mallia和Paul K. Smith，Academic Press Inc.，1992，其内容在此以其整体并入。如本领域众所周知的，可以改变诸如配体密度或取代水平、载体的孔径等参数以提供具有所需性质的层析树脂。

选择用于将蛋白质配体偶联至固体支持物的适当条件完全在技术人员的能力内。用于该方法的合适缓冲液包括任何不含胺的缓冲液，例如碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、磷酸盐和乙酸盐缓冲液。缓冲液可以进一步包括可以在5 nM-100 mM的范围内的盐。

在一些实施方案中，反应在范围为0℃至99℃的温度下执行。在某些实施方案中，反应方法在低于60℃、低于40℃、低于20℃或低于10℃的温度下进行实践。在一些实施方案中，本发明的方法在约4℃的温度下进行实践。在其它实施方案中，本发明的方法在20℃的温度下进行实践。

内含肽-C融合蛋白的制备

本发明的方法涉及加上内含肽-C标签的靶分子(例如蛋白质)的制备。加上内含肽-C标签的分子可以通过以下进行制备：将内含肽-C多肽附着到靶分子以获得融合蛋白，以及在表达系统中表达融合蛋白。制备融合蛋白或嵌合蛋白的方法是本领域众所周知的，包括但不限于标准重组DNA技术。例如，编码不同蛋白质序列(例如C-内含肽和靶分子)的DNA片段按照常规技术在框内连接在一起。在另一个实施方案中，融合基因可以通过包括自动化DNA合成仪在内的常规技术进行合成。可替代地，可以使用锚定引物进行核酸片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的核酸片段之间产生互补突出端，其随后可以退火且重新扩增，以生成嵌合核酸序列(参见Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，1992，其内容通过引用以其整体并入)。此外，已经编码融合部分(例如GST部分、Fc部分)的许多表达载体是商购可得的。

优选地，融合蛋白表达自瞬时或稳定转染或转化的原核或真核宿主细胞或生物中的编码核酸。用于表达重组蛋白的常见宿主细胞或生物体包括例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、玉米(Zea maize)、烟草(Nicotinia tabacum)、野胡萝卜(Daucus carota)、SF9细胞、CHO细胞(例如CHO DG44细胞、CHO DXB11细胞)、NS0细胞、HEK 293细胞和完整动物，例如牛和山羊。在实施方案中，C-内含肽-靶融合蛋白在大肠杆菌中表达。然后可以使用常规分离和层析方法，例如通过深度过滤的澄清、通过阴离子和阳离子交换层析的纯化以及通过超滤的浓缩，将表达的融合蛋白从污染的细胞蛋白质中纯化出来。

在一些实施方案中，内含肽多肽(例如C-内含肽)和靶蛋白经由肽键直接连接。在其它实施方案中，融合蛋白包括在内含肽多肽(例如C-内含肽)和靶分子之间的间隔区或接头。合适的间隔区/接头是本领域已知的。

亲和纯化

在一些实施方案中，本发明的方法的步骤(b)包括使层析树脂与包含加上内含肽-C标签的靶分子的细胞培养上清液接触。因此，在一些实施方案中，步骤(b)包括将加上内含肽-C标签的靶分子装载到具有约8至约10的pH的盐水缓冲液中。

可以根据所使用的内含肽改变在其下融合蛋白中的C-内含肽多肽选择性地结合至层析结合的N-内含肽以形成内含肽复合物的条件，并且可以由本领域普通技术人员确定。示例性结合条件包括a) 在约4-25℃范围内的温度，以及包含100 mM Tris-HCl、25 mMNaCl、0.1氯化锌，pH=9的缓冲液；b) 在约4-25℃范围内的温度，以及包含50 mM NaAc、0.5M NaCl，pH=5的缓冲液；c) 在约4-25℃范围内的温度，以及包含0.5 M NaCl、10 mM Tris-HCl，pH=8的缓冲液；d) 在约4-25℃范围内的温度，以及以pH 9的包含100 mM Tris、200 mMNaCl的缓冲液；e) 在约4-25℃范围内的温度，以及以pH 7的包含100 mM Tris和100 mMNaCl的缓冲液；以及f) 在约4-25℃范围内的温度，以及以pH 7的包含100 mM Tris和200mM NaCl的缓冲液。

在任选的步骤(c)中，然后可以使用洗涤缓冲液洗涤装载的柱，以去除未结合的和弱结合的污染物。洗涤缓冲液优选包含去污剂(例如Triton X100、ND40)、盐(例如钠、铵或钾的乙酸盐、磷酸盐、氯化物、硫酸盐)、离液剂(优选尿素或精氨酸)或其组合。

随后，在步骤(d)中，使树脂与具有约6至约8的pH的切割缓冲液(例如100 mMTris、200 mM NaCl，pH=7)接触，以便从内含肽-C多肽中释放靶分子。然后在洗脱物中回收靶分子。

然后柱如上所述在步骤(e)中进行再生，然后任选地在再生步骤的同时或之后以及在再使用之前用水进行洗涤。

本文描述的本主题将通过下述非限制性实施例更具体地进行说明，应理解可以在其中进行改变和变化，而不背离如下文请求保护的本公开内容的范围和精神。还应理解，关于本公开内容为何有效的各种理论并不预期是限制性的。

实施例

下述是说明用于实践本文所述的公开内容的实施方案的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。

实施例1：材料和方法

内含肽融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

内含肽-C靶标在生物反应器批次中进行生产，生长条件：3小时，30℃。内含肽-N配体在以下生长条件下产生：20小时，20℃，烧瓶形式。用100 µl卡那霉素原液(30 mg/ml)和2mL预培养物接种100 mL 2xYT培养基(Merck kGaA)。主要培养物在20-30℃和200-500 rpm下生长。在0.12 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)终浓度下的诱导在OD600值为2时发生。将主要培养物培养3或20小时。通过离心收获细胞，弃去上清液，并且将沉淀物贮存于低于-20℃下。

细胞裂解：

通过化学或机械细胞裂解来裂解生物质。加上内含肽-C标签(IC)的靶标通过机械细胞裂解进行裂解，而化学细胞裂解用于内含肽-N (IN)配体。

通过将细胞悬浮于10 mL机械裂解缓冲液(100 mM Tris、150 mM NaCl、5 mMMgCl₂和25 U/ml Benzonase^®，pH 8-9)中来进行机械细胞破碎。将细胞溶液转移到细胞破碎室内，并且在1 kbar下完成细胞破碎。使上清液(裂解物)在4℃、18000 rcf下离心25分钟。在离心后，将上清液过滤并用作澄清的大肠杆菌细胞裂解物(CL)，用于进一步的纯化步骤(例如下文的内含肽-C靶大肠杆菌裂解物)。

通过将细胞悬浮于10 mL化学裂解缓冲液(50 mM Tris、5 mM MgCl₂、1:10CelLytic B细胞裂解试剂、25 U/mL Benzonase^®，pH 8)中来进行化学细胞裂解。将混合物涡旋且离心。在离心后，将过滤上清液作为澄清的大肠杆菌细胞裂解物，用于进一步的纯化步骤。

基于StrepII-标签的纯化方法

填充有Strep-Tactin^® Superflow HC的亲和柱用2柱体积(CV) Strep-结合缓冲液(100 mM tris、200 mM NaCl，pH 9用于内含肽-C靶标；以及100mM Tris、150 mM NaCl和1mM EDTA，pH 8用于内含肽-N配体)进行平衡。将澄清的进料(上述澄清的大肠杆菌细胞裂解物)装载到柱中，将未结合的蛋白质用Strep-结合缓冲液洗涤通过柱，并且用Strep-洗脱缓冲液(100 mM Tris、200 mM NaCl和2.5 mM d-脱硫生物素，pH 9用于内含肽-C靶标；以及100 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1mM TCEP和2.5 mM d-脱硫生物素，pH 8用于内含肽-N配体)洗脱结合的靶标。通过用Strep-再生缓冲液(50 mM Tris、150 mM NaCl、1mM 4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、1mM EDTA，pH 8)洗脱剩余的蛋白质来再生柱。在用100 mMTris缓冲液的另一次柱洗涤后，将柱在Strep-结合缓冲液中用2CV进行重新平衡。

透析和内含肽-N/树脂偶联反应

将加上StrepII标签且纯化的内含肽-N配体注入透析盒内。将盒转移到含有偶联缓冲液(100 mM Na₂CO₃/NaH₂-CO₃、1mM TCEP，pH 10)的烧杯内。透析在4℃下执行过夜。使用2 mL不含还原剂的偶联缓冲液溶胀干燥的环氧化物-BDM树脂，以达到1 mL的柱尺寸。将溶胀的树脂吸干。然后将透析的内含肽-N配体转移到溶胀的树脂。使树脂与内含肽-N配体原料以1:3的关系(v/v)一起温育2.5小时。

使用如本领域已知的SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS Page)确认了预计大小的蛋白质的产生。通过如本领域已知的BCA测定来确定共价结合配体的量。

内含肽-N树脂的静态结合容量。

根据图1的方案测量树脂的静态结合容量。因此，将50%批量的固定化内含肽-N树脂转移到离心过滤器内。用双蒸H₂O (ddH₂O)洗涤树脂。对于NaOH或H₃PO₄稳定性筛选，将10%树脂浆料离心，弃去上清液，并且用0.14或0.7 M NaOH (用于分析0.1或0.5 M NaOH中的稳定性)或0.21 M H₃PO₄ (用于分析0.15 M H₃PO₄中的稳定性)替换。将树脂振荡并再次离心，并且用处于pH 7的盐水缓冲液洗涤沉淀物。

将10 µl固定化树脂转移到96孔过滤板的孔中。树脂在捕获缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH 9)中平衡两次，持续5分钟。弃去上清液。使200 µl 1 mg/mL的内含肽-C靶溶液与树脂一起温育1小时。然后使用真空将上清液收集在96孔UV板中。使树脂与捕获缓冲液一起温育15分钟，然后与切割缓冲液(100 mM Tris、200 mM NaCl，pH7)一起温育。在洗涤后，将树脂用CIP 1 (10 mM甘氨酸)或CIP 2 (150 mM H₃PO₄)缓冲液(各自具有1-2的pH)再生至少15分钟。对于所有收集的级分，测量在280 nm处的吸光度，并且使用内含肽-C靶标或切割靶标的消光系数来计算静态结合容量。除了非固定化树脂对照外，A280吸光度通过不同过程缓冲液的特定吸光度和内含肽-C靶标在树脂处的非特异性结合进行归一化。

通过SDS-Page分析所使用的内含肽-C靶原料(S)和CIP级分的示例性样品。因此，使40 µl样品与20 µl变性溶液在95℃下一起温育10分钟。使用本领域已知的SDS-Page和BCA测定技术，通过SDS-Page分析样品，用于确定纯化产率、偶联产率和配体密度。

功能性Tet：动态结合容量

为了测试在动态柱过程中携带内含肽-N配体的树脂，下文描述的内含肽纯化方法用填充的1mL内含肽-N树脂原型柱进行。

纯化方法：树脂用10 CL捕获缓冲液进行平衡。将样品大小为5-10 CV的1 mg/mL内含肽-C靶溶液(其如上所述使用StrepII-标签纯化进行预纯化)或含有内含肽-C靶标的澄清的大肠杆菌进料(机械细胞裂解，如上所述)装载到柱中。用捕获缓冲液(pH 9)洗涤柱，并且通过用切割缓冲液(pH 7)的pH减少来触发释放结合的内含肽-C靶标。然后使用处于pH1-2的CIP 1溶液(10 mM甘氨酸)和CIP 2溶液(150 mM H₃PO₄)从柱中清除剩余的内含肽-C片段。然后用捕获缓冲液重新平衡柱。在纯化步骤后，用层析软件对于所有级分计算A280吸光度，以检查每个级分中的洗脱蛋白质的量。考虑到靶标的A280吸光度和消光系数的，确定了洗脱物和CIP级分的浓度。使用本领域已知的SDS-Page和BCA测定技术，通过SDS-Page分析样品，用于确定纯化产率、偶联产率和配体密度。示例性进料(S)、洗脱(E1或E2)和CIP样品根据其纯度使用尺寸排阻层析进行分析。

实施例2：在0.1 M NaOH和0.15 H₃PO₄中的内含肽-N固定化树脂的SBC稳定性

使用几种不同的内含肽-N配体层析树脂(R28-358132、R30-336562、R31-336562、R32-358132、R34-372229)用于呈高通量形式的静态结合容量测定。确定了在过程缓冲液中温育后剩余的静态结合容量。在室温(RT)下于振荡条件下，使10%树脂批量在0.1 M NaOH和0.15 M H₃PO₄中温育0/2/15小时。将树脂用切割缓冲液(100 mM Tris、200 mM NaCl，pH 7)进行洗涤，并且将其转移到96孔过滤板中。在捕获缓冲液(100 mM Tris、200 mM NaCl，pH9)中平衡样品大小为10 µl的树脂。将如实施例1中所述进行制备的具有1 mg/mL蛋白质的预纯化的加上StrepII-标签的内含肽-C靶标(20kDa)溶液在振荡条件下装载到树脂中，持续1小时。用捕获缓冲液(100 mM Tris、200 mM NaCl，pH 9)洗掉未结合的内含肽-C靶标，并且使用含有H₃PO₄或甘氨酸的pH在1-2之间的酸性溶液来再生树脂。将穿透和CIP级分收集在96孔UV板中，并且使用靶标在280 nm处的吸光度和消光系数来计算级分的蛋白质的量和几种内含肽-N配体固定化树脂的结合容量。计算在不同溶液中温育不同时间段的树脂的剩余静态结合容量，并且将其显示于图2中。示例性结果在表1中进行量化。

表1：用含有固定化第三代内含肽-N配体的几种层析树脂的静态结合容量(SBC)研究。

SBC值以在时间(t=0)的总体和SBC (t=x)/SBC (t=0)的百分比显示。如所见的，与在0.15M H₃PO₄贮存中的恒定容量相比，存在与在0.1 M NaOH中的温育成比例的容量的急剧降低。对照(17RSDZ063)是未偶联的树脂珠粒。

图2显示了几种内含肽-N配体树脂原型(R28-358132、R30-336562、R31-336562、R32-358132、R34-372229)的归一化的SBC结果，所述树脂原型用0.1 M NaOH (A)或0.15MH₃PO₄ (B)处理0/2/15小时。树脂的SBC至少一式三份地进行测量。将200 µl预纯化的内含肽-C靶标(20 kDa)与平衡的树脂一起温育，并且用捕获缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl，pH9)洗涤。结合的靶标通过两种再生缓冲液(第一种：0.01M甘氨酸，pH 1，第二种：0.15 MH₃PO₄，pH 1.5)进行触发释放。对于0.1M NaOH处理的树脂，2-3 mg/mL的SBC降低到60% (2小时)或20% (15小时)。相比之下，0.15 M H₃PO₄处理的树脂的SBC值持续15小时稳定于100%下。

实施例3：动态容量的稳定性 - 用于预纯化的IC-靶标的靶标纯化的内含肽树脂再使用

含有第三代内含肽-N配体(R43-358132)的示例性层析原型柱在对于在动态结合和洗脱条件下的靶标释放的4x循环再使用研究中进行再使用。用处于pH 9的捕获缓冲液平衡内含肽-N树脂。如实施例1中所述，从澄清的大肠杆菌裂解物中纯化加上StrepII标签的内含肽-C靶标。将Strep-洗脱缓冲液(100 mM Tris、200 mM NaCl，pH 9)中的预纯化的内含肽-C靶标装载到内含肽柱上。将未结合的蛋白质用10 CV捕获缓冲液(100 mM Tris、200 mMNaCl，pH9)洗掉，并且通过将pH值改变为pH 7来触发导致加上标签的靶标释放的切割过程。层析柱使用含有例如0.15 M H₃PO₄的pH在1-2之间的酸性溶液进行再生。

关于每轮柱再使用的A280吸光度层析图将创建叠加(图3)。图3描绘了携带固定化第三代内含肽-N配体的原型(R43-358132)在280nm (A280)处测量的吸光度层析图的叠加。将柱用5CV的c=1mg/mL的加上内含肽-C标签的靶标(20 kDa)装载4个循环。将柱用捕获缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH9)进行洗涤，并且通过使用1种切割缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH7)改变pH来触发所切割靶标的洗脱。在洗脱后，将柱用平衡缓冲液(100mMTris、200mM NaCl pH 9)进行洗涤，并且用再生缓冲液(0.15M H₃PO₄ pH 1.5)进行清洁，以触发内含肽-C的释放。在清洁后，将柱使用捕获缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH9)进行重新平衡，并且使柱经受下一轮再使用。如所示的，动态结合容量(DBC)对于每轮柱使用保持一致，在1-1.3 mg/mL之间。使用20kD测试分子，在每个洗脱阶段过程中切割的靶标的量保持一致，在0.5-1.2 mg之间。使用A280吸光度记录来自洗脱级分的纯度，显示了95-98%的一致的靶标纯度(图4)。

表2显示了洗脱级分(E1和E2)的计算纯度，所述洗脱级分使用内含肽-N原型(R43-358132)柱，在基于内含肽的纯化的四个再使用循环过程中进行收集。纯度通过尺寸排阻层析(SEC)进行确定。

表2：通过尺寸排阻层析确定的，使用内含肽-N原型树脂柱(R43-358132)和预纯化的内含肽-C靶标的两次连续内含肽纯化运行的洗脱靶标的纯度。

将预纯化的内含肽-C靶原料、洗脱(E1、E2)和清洁(CIP)级分的样品大小进行混合，并且通过SDS-Page层析进行分析。结果显示于图5中。图5描绘了SDS-Page内含肽纯化，其显现了在StrepII-标签纯化后，加上StrepII标签的预纯化的内含肽-C靶原料的条带组成，所述靶原料被用作内含肽-N配体原型R43-358132 (S)的装载。装载关于所有4个再使用循环(循环1-4)的洗脱级分(E1和E2)的样品用于SDS-Page分析。如所示的，洗脱级分中的蛋白质的量，内含肽-C靶标(20kDa)、无标签靶标(11 kDa)和内含肽-C的浓度分离可以在每一个循环中以相似的量被观察到，因此确认了在这些条件下，0.15M H₃PO₄ pH 1.5在再生内含肽柱中的效用。

实施例4：动态容量的稳定性 - 用于澄清的大肠杆菌裂解物的靶标纯化的内含肽树脂再使用

转移含有第三代内含肽-N配体的示例性层析柱原型(R43-358132)的可再用性，以使用含有加上内含肽-C标签的靶蛋白(20 kDa)的澄清的大肠杆菌裂解物来评估内含肽-N柱性能。对于裂解物装载、靶标释放以及用处于pH 1-2的酸性溶液的树脂再生的至少4个循环，显示了柱的可再用性。内含肽-N树脂在处于pH 9的盐水缓冲液中进行平衡。如实施例1中所述制备了表达内含肽-C靶标的大肠杆菌(机械细胞裂解)。在使用0.22µm PVDF膜澄清后，将含有~2mg/mL内含肽-C靶标的澄清的大肠杆菌裂解物装载到柱中。用捕获缓冲液(100mM Tris、200 mM NaCl，pH 9)洗掉剩余的裂解物内容物，并且通过将pH值减少至pH 7来释放无标签的靶蛋白。洗脱相用另外的缓冲液在直接流经洗脱中进行分离。柱用至少5 CV的含有例如0.15 M H₃PO₄的酸性溶液进行再生。

在两个循环研究中均显示了原型R43-358132的恒定水平的洗脱的靶标量和动态结合容量。每一个单次再使用循环的总洗脱量通过A280吸光度进行确定并且显示于图6中，图6描绘了携带固定化第三代内含肽-N配体的被命名为R43-358132的原型树脂在280nm(A280)处测量的吸光度层析图的叠加。将柱用含有~2 mg/mL加上内含肽-C标签的靶标(20kDa)的5CV大肠杆菌裂解物装载4个循环，用于树脂的完全饱和。将柱用捕获缓冲液(100mMTris、200mM NaCl pH9)进行洗涤，并且通过使用切割缓冲液(100mM Tris、200mM NaClpH7)改变pH来触发切割靶标的洗脱。在洗脱后，将柱用捕获缓冲液进行洗涤，并且用再生缓冲液(0.15M H₃PO₄ pH 1.5)进行清洁，以触发内含肽-C的释放。在清洁后，将柱使用10CV的捕获缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH9)进行重新平衡，并且使柱经受下一轮再使用。

所释放靶标的纯度达到70-93%。表3显示了洗脱级分(E1和E2)的计算纯度，所述洗脱级分使用内含肽-N原型柱(R43-358132)，在基于内含肽的纯化的四个再使用循环过程中进行收集。纯度通过尺寸排阻层析进行确定(图7)。

表3 通过尺寸排阻层析确定的，使用内含肽-N原型柱(R43-358132)和澄清的大肠杆菌裂解物的两次连续内含肽纯化运行的洗脱靶标的纯度。

将含有内含肽-C靶标的细胞裂解物、洗脱(E1、E2)和清洁(CIP)级分的样品大小进行混合，并且通过SDS-Page层析进行分析。图8描绘了SDS-Page内含肽纯化循环研究样品。凝胶显现了含有内含肽-C靶标的澄清的大肠杆菌裂解物的条带组成，所述澄清的大肠杆菌裂解物被用作内含肽-N配体原型柱R43-358132 (S)的装载。装载关于所有4个再使用循环(循环1-5)的样品大小的洗脱级分(E1和E2)用于SDS-Page分析。根据代表洗脱级分中的蛋白质量的条带方案，内含肽-C靶标(20kDa)、无标签靶标(11 kDa)和内含肽-C的浓度分离可以在每一个循环中以相似的量被观察到，因此确认了在这些条件下，0.15M H₃PO₄ pH 1.5在再生内含肽柱中的效用。

图9显示了实施例3和4的基于内含肽的纯化以mg/mL计的洗脱靶标的量。表示了使用预纯化的内含肽-C靶标的再使用研究(实施例3)以及使用澄清的细胞裂解物的再使用研究(实施例4)两者，在两个系列中都包括4个再使用循环(循环1-4)。

实施例5：用几种酸性溶液(如0.01M甘氨酸)再生内含肽-N层析树脂

该实施例证实了携带固定化第二代内含肽-N配体的层析支持物(18RSAB007)的再使用。将柱用预纯化的内含肽-C靶标(40 kDa)进行装载，如实施例3和4中所述用捕获缓冲液进行洗涤，并且在再生过程中用10mM甘氨酸HCl pH1进行清洁。根据在280nm (A280)处记录的两个吸收光谱的叠加(图10)和两个序贯柱运行的SDS-Page分析(图11)，在第一轮和第二轮柱使用之间不存在功能性差异。这充当另一个实例，即这确认了成功的柱再生过程可以用诸如含甘氨酸的缓冲液等低pH溶液来完成。

图10是用于连续两轮的被命名为18RSAB007的原型(携带固定化内含肽-N配体)在280nm (A280)处测量的吸光度层析图的叠加。第一轮A280信号以实线显示，第二轮A280以虚线显示。每一轮，用加上内含肽-C标签的靶标(DNAJ)装载柱，直到达到穿透。将柱用捕获缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH9)进行洗涤，并且通过用切割缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH7)改变pH来触发所切割靶标DNAJ的洗脱。在洗脱后，将柱用平衡缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH 9)进行洗涤，并且用再生缓冲液(10mM甘氨酸-HCl pH 1.0)进行清洁，以触发内含肽-C的释放。在清洁后，将柱使用捕获缓冲液(100mM Tris、200mMNaCl pH9)进行重新平衡，并且使柱经受另一轮再使用。

通过SDS-Page来分析装载、洗脱(E1、E2)和清洁(CIP)的样品(图11)。图11显示了从原型18RSAB007的功能性测试获取的级分的SDS-Page分析。两个SDS-Page分析(图11A：循环1；图11B：循环2)均表示了在使用柱原型18RSAB007的两个循环之间，从级分E1、E2和CIP观察到的可比较的条带模式。使用10CV再生缓冲液(10mM甘氨酸-HCl pH 1.0)的柱清洁导致了任何柱结合的内含肽-C的释放。在清洁用含有甘氨酸的缓冲液来完成的同时，柱保留其初始功能性。

实施例6：内含肽-N层析树脂的再生将用pH 4 - pH 1的pH范围来实现

检查了第三代内含肽-N配体偶联的树脂原型柱(R44-358132)用pH 7- pH 1.5之间的酸性溶液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液)的再生。柱在处于pH 9的盐水缓冲液中进行平衡，并且用1 mg/ml加上内含肽-C标签的靶蛋白溶液(20kDa)进行装载，所述靶蛋白溶液通过Strep-II标签纯化进行预纯化。将剩余的内含肽-C靶标用处于pH 9的盐水缓冲液(捕获缓冲液)进行洗涤，并且通过将pH值减少至pH 7来释放无标签的靶蛋白。洗脱相在直接流经洗脱中进行分离。然后将柱在处于pH 7的另一个缓冲系统(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液)中重新缓冲，并且将柱材料通过pH梯度再生进行逐步再生，所述pH梯度再生从pH 7开始，且以CIP条件pH 1.5 (0.15 M H₃PO₄)结束。对于柱材料的再生以及未切割的内含肽-C靶标和切割的内含肽-C的释放，优选pH 3.8的pH值。该设定点通过图11A-B中所示的SDS-Page分析和A280吸光度进行确定。

图12A显示了携带固定化内含肽-N配体的原型柱R44-358132的层析图。用加上内含肽-C标签的靶标(20kDa)装载柱，直到达到穿透。将柱用处于pH 9的盐水缓冲液(捕获缓冲液)进行洗涤，并且通过使用切割缓冲液改变pH来触发切割靶标的洗脱。所示的层析图截取(cutout)证实了在洗脱阶段后柱的再生步骤。在20 CV内将磷酸再生缓冲液的pH永久地减少直到pH 2，并且添加用0.15 M H₃PO₄的另一个5 CV CIP步骤。获取再生级分D9-F2的样品用于随后的SDS-Page，其显示于图12B中。柱的再生从pH 3.8开始。

实施例7：携带第一代内含肽-N配体的层析树脂用酸性剂、碱性剂、离液剂或亲液剂的再使用

将携带内含肽-N配体的柱暴露于溶液A (0.1M NaOH)、B (0.15 H₃PO₄)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (1M精氨酸)、E (H₂O)、F (10%十二烷基硫酸钠) 15分钟，所述溶液代表不同类别的酸性、碱性、离液、亲液变性缓冲系统和添加剂(图13)。用捕获缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl pH 9)将亚连续2柱体积(CV)的裂解大肠杆菌进料的上清液装载并捕获于柱上，所述进料包括加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)靶标。通过将pH改变为pH7来触发切割反应。SDS-Page表示了在室温下的切割反应下20小时内释放的靶标。

柱再使用

再使用来自图1的携带内含肽-N配体的层析柱，并且将其暴露于溶液A、B、C、D、E、F150分钟(图14A：1.再使用)，随后将其暴露于溶液A、B、C、D、E、F 1500分钟 (图14B：2.再使用)。用处于pH9的盐水缓冲系统将每次2CV的裂解大肠杆菌进料的上清液装载并捕获于柱上，所述进料包括加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)靶标。通过将pH改变为pH7来触发切割反应。SDS-Page表示了在室温下于切割反应下20小时内释放的靶标。

结果显示了，将内含肽-N柱暴露于碱性溶液使得能够再使用内含肽-N柱，同时诱导内含肽-C从内含肽-N柱中的解离。然而，这以非优化的内含肽配体的柱容量和功能性为代价来完成。将柱暴露于0.1M NaOH超过150分钟导致内含肽-N柱功能性的几乎完全丧失，导致在2.再使用研究中未观察到靶标的进一步释放(比较图14A柱A和142B柱A)。

相比之下，将内含肽-N柱暴露于溶液B (0.15 H₃PO₄)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (1M精氨酸)、E (H₂O)、F (10%十二烷基硫酸钠)，使得能够再使用内含肽-N柱和有效解离内含肽-C片段，而不影响柱的功能性和内含肽-N的稳定性(图14A、14B，柱B、C、D、E、F)。

图15显示了如上所述与溶液A、B、C、D、E和F一起温育，在3次内含肽柱使用后释放的靶标的量。如所见的，在内含肽柱与0.1M NaOH一起温育1,500分钟后，没有观察到进一步的切割活性。然而，在用溶液B、C、D、E、F的不同温育时间下释放的靶标的量在3次柱再使用运行内保持恒定。值得注意的是，与具有在0.1M NaOH相同pH范围的pH 12.2的1M精氨酸一起温育并不导致功能性丧失。对于所有测试的溶液，在暴露1500分钟和3次再使用后，内含肽-N柱的功能性维持其初始容量的>90%。由于将条带强度对所用蛋白质标记物的50kD条带的已知质量进行标准化，确定了浓度。

实施例8：去污剂对用环氧化学制备的携带内含肽-N配体的层析树脂的再使用的作用。

将携带内含肽-N配体的层析柱再使用4次，同时将其连续暴露于溶液A (0.1MNaOH)、B (0.1M NaOH + 1M NaCl)、C (6M胍-HCl、20 mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (0.15H₃PO₄)和E (H₂O) 15/150/1500/1620分钟，所述溶液代表不同类别的碱性、酸性、离液、亲液缓冲系统和添加剂。用处于pH 9的盐水缓冲系统将亚连续2CV的裂解大肠杆菌进料的上清液装载并捕获于柱上，所述进料包括加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)。通过将pH改变为pH7来触发切割反应。在柱再使用的每个步骤之间，用2CV 10% SDS洗涤柱。图16显示了表示在室温下于切割反应下20小时内释放的靶标的SDS-Page。

图17描绘了与溶液A (0.1M NaOH)、B (0.1M NaOH + 1M NaCl)、C (6M胍-HCl、20mM Tris-HCl、0.5M NaCl)、D (0.15 H₃PO₄)和E (H₂O)一起温育，在四次内含肽柱使用后释放的靶蛋白的量。如所见的，在内含肽柱与0.1M NaOH和0.1M NaOH + 1M NaCl一起温育1,500分钟后，没有观察到进一步的切割活性。对于所有其它测试的溶液，在暴露1620分钟和4次再使用后，内含肽-N柱的功能性维持其初始容量的>90%。由于将条带强度对所用蛋白质标记物的50kD条带的已知质量进行标准化，确定了浓度。

因此，图15 (实施例7)显示了在20小时的切割反应后释放的靶标的浓度。在每次再使用之间用10CV H₂0清洁每个柱，而图17 (实施例8)显示了在每次再使用之间用2CV的10% SDS洗涤每个柱的同时，在20小时的切割反应后释放的靶标的浓度。比较这两个图证实了，在两种洗涤条件下，柱容量分别在3次或4次柱再使用后均维持在>90%。因此，如本文证实的，两种程序均可以用于再生柱，同时在发生切割反应后破坏INTC-INTN复合物。

图18显示了在暴露于10% SDS 20小时(图18A)和暴露于H₂O 20小时(图18B)后，携带内含肽-N配体的2个层析柱的切割动力学。用处于pH 9的盐水缓冲系统将2CV的裂解大肠杆菌进料的上清液装载并捕获于每个柱上，所述进料包括加上内含肽-C标签的靶蛋白(INTC-靶标)。通过将pH改变为pH7来触发切割反应。基于将C1-C7的条带强度对所使用蛋白质标记物的50kD条带的已知质量进行标准化，确定了切割速率。如所见的，与暴露于20小时的10% SDS的柱相比，暴露于20小时H₂O的柱显示了相同的切割速率。在这两种情况下，靶标释放在300分钟(5小时)的反应时间框架内均>90%。

具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示了本公开内容的一般性质，使得其它人可以通过应用在相关的一个或多个领域的技术内的知识(包括引用且通过引用并入本文的文件的内容)，无需过度实验而容易地对于修改和/或适应此类具体实施方案的各种应用，而不背离本公开内容的一般概念。因此，基于本文呈现的教导和指导，此类适应和修改预期在所公开的实施方案的等价方案的含义和范围内。应理解，本文的措辞或术语是用于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞由技术人员按照本文呈现的教导和指导与相关的一个或多个领域的技术人员的知识组合地进行解释。

本文使用的术语仅是用于描述特定实施方案的目的，并不预期是本发明的限制。如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”预期还包括复数形式，除非上下文另有明确指示。应进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”指定了所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组分的存在，但不排除一种或多种其它特征、整数、步骤、操作、元素、组分和/或其组的存在或添加。

尽管上文已描述了本公开内容的各个实施方案，但应该理解它们已呈现作为示例而非限制。对于相关的一个或多个领域的技术人员显而易见的是，可以在其中进行在形式和细节方面的各种改变，而不背离本公开内容的精神和范围。因此，本公开内容不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅按照下述权利要求及其等价物进行限定。

Claims (19)

1.用于纯化样品中的靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 提供含有融合蛋白的样品，所述融合蛋白包含通过肽键与靶分子连接的内含肽-C多肽(加上内含肽-C标签的靶分子)；

(b) 在其中所述融合蛋白中的内含肽-C多肽与树脂中的内含肽-N多肽结合以形成内含肽复合物的条件下，使所述样品与包含共价连接的N末端内含肽多肽的层析树脂接触；

(c) 任选地洗涤含有所述内含肽复合物的所述树脂，以去除未结合的污染物；

(d) 将所述内含肽复合物暴露于足以从所述内含肽-C多肽中释放所述靶分子的条件；

(e) 通过使所述树脂与一种或多种组合物接触，以便破坏所述内含肽-N内含肽-C复合物并从所述层析树脂中释放所述内含肽-C多肽，来再生所述层析树脂，所述组合物选自：

(i) 在水溶液中具有约1至约4的pH的组合物；

(ii) 包含至少一种去污剂的组合物；和

(iii) 包含至少一种亲液剂和/或离液剂的组合物；

和

(f)任选地，通过将步骤(a)至(e)重复至少一次来执行至少一个另外的纯化循环，

其中在每个纯化循环后，由步骤(e)或任选的步骤(f)获得的再生的层析树脂保留其C末端内含肽结合容量的至少约60%，优选至少约70%，且更优选至少约80%。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(e)包括通过使所述树脂与在水溶液中具有约1至约4的pH的组合物接触来再生所述层析树脂，优选地其中所述组合物在水溶液中具有约1至约3.5之间、更优选约1至约2之间的pH。

3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(e)包括通过使所述树脂与至少一种去污剂接触来再生所述层析树脂。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(e)包括通过使所述树脂与包含至少一种亲液剂的组合物接触来再生所述层析树脂。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(e)包括通过使所述树脂与包含至少一种离液剂的组合物接触来再生所述层析树脂。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括执行其中步骤(e)被步骤(e)(iv)代替的至少一个纯化循环或者执行进一步包括步骤(e)(iv)的至少一个纯化循环的步骤：

(e)(iv) 通过在至少一个所述纯化循环中，使所述树脂与在水溶液中具有约9或更高的pH的碱性组合物接触来再生所述层析树脂。

7.根据权利要求6的方法，其中步骤(e)(i)、(e)(ii)、(e)(iii)和/或(e)(iv)各自彼此独立地在至少10%的所述纯化循环中，优选在至少约25%的所述纯化循环中，且更优选在至少约50%的所述纯化循环中执行。

8.根据权利要求6或7的方法，其包括多个纯化循环，其中

(A) 步骤(e)(i)和(e)(ii)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(B) 步骤(e)(i)和(e)(iii)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(C) 步骤(e)(ii)和(e)(iii)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(D) 步骤(e)(i)和(e)(ii)和(e)(iii)以任何次序同时或序贯地独立执行；

(E) 步骤(e)(i)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(F) 步骤(e)(ii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(G) 步骤(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(H) 步骤(e)(i)、(e)(ii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(I) 步骤(e)(i)、(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(J) 步骤(e)(ii)、(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯地独立执行；或

(K) 步骤(e)(i)、(e)(ii)、(e)(iii)和(e)(iv)以任何次序同时或序贯地独立执行；

其中当执行步骤(e)(i)、(e)(ii)、(e)(iii)和/或(e)(iv)的任何步骤时，此类一个或多个步骤在至少10%的所述纯化循环中，优选在至少约25%的所述纯化循环中，且更优选在至少约50%的所述纯化循环中执行。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述加上内含肽-C标签的靶分子通过以下进行制备：将内含肽-C多肽附着到靶分子以获得融合蛋白，并且在表达系统中表达融合蛋白。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)包括使所述层析树脂与包含所述加上内含肽-C标签的靶分子的细胞培养上清液接触；或

其中步骤(b)包括将所述加上内含肽-C标签的靶分子装载到具有约8至约10的pH的盐水缓冲液中。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中执行步骤(c)，并且所述步骤(c)包括在从所述内含肽-C多肽中释放所述靶分子之前，用洗涤缓冲液洗涤所述层析树脂；优选地其中所述洗涤缓冲液包含去污剂、盐、离液剂或其组合，所述离液剂优选尿素或精氨酸。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(d)包括使所述树脂与具有约6至约8的pH的切割缓冲液接触，以便从所述内含肽-C多肽中释放所述靶分子。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在水溶液中具有约1至约4的pH的所述组合物包含酸性缓冲液，其包含选自磷酸、甘氨酸、盐酸、氢溴酸、柠檬酸、乙酸、甲酸、乳酸、碳酸、琥珀酸、硝酸、苹果酸、草酸、水杨酸、甲酸及其任何组合的酸。

14.根据前述权利要求中任一项的方法，

其中所述离液剂选自氯化胍、精氨酸、正丁醇、乙醇、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、尿素及其任何组合；或

其中所述亲液剂是选自碳水化合物、氨基酸和醇的离子亲液剂或非离子亲液剂；或

其中所述碱性组合物包含氢氧化钠、苛性试剂、精氨酸、氢氧化钙或氢氧化钾中的至少一种；或

其中所述去污剂选自阴离子型去污剂、阳离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子型去污剂；优选地其中所述去污剂选自聚山梨醇酯、聚乙二醇、糖苷、泊洛沙姆、CHAPS、CHAPSO、烷基苯磺酸盐、季铵盐和胆汁酸。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括分离从步骤(d)获得的靶分子的步骤。

16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述层析树脂是基于聚合物的或包括聚合物，优选地其中所述层析树脂包括亲水性聚乙烯醚基质或聚甲基丙烯酸酯。

17.权利要求16的方法，其中所述层析树脂被配制在固体支持物上，其中所述固体支持物是珠粒或膜。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述靶分子是蛋白质，优选地其中所述样品是澄清的蛋白质制剂。

19.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述内含肽-N多肽通过选自羟基、硫醇、环氧化物、氨基、羰基环氧化物和羧酸的官能团附着至所述层析树脂。

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