DE2342058A1

DE2342058A1 - Verfahren zur isolierung des reinen serumalbumins aus biologischen fluessigkeiten

Info

Publication number: DE2342058A1
Application number: DE19732342058
Authority: DE
Inventors: Anatolij Alexandrowitsch From; Michail Iwanowitsch Iwanow; Anatolij Jefimowitsch Kiselew; Alexandr Alexandrowi Nikitenko; Walentin Michajlowitsc Rusanow; Leonid Iwanowitsch Skobelew
Original assignee: TS I GEMATOLOGII I PERELIWANIJ
Current assignee: TS I GEMATOLOGII I PERELIWANIJ
Priority date: 1973-08-20
Filing date: 1973-08-20
Publication date: 1975-02-27

Description

VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG DES REINElT AUS BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Fraktionierung von Eiweißstoffen, insbesondere auf ein Verfahren zur Isolierung des reinen Serumalbumins aus biologischen Flüssigkeiten. Das Albumin findet in Form einer 5 bis 20jiigen Lösung eine breite Verwendung in der Medizin als 'fransfusionsmedium bei Verblutungen, traumatischem, Verbrennungs- und Operationsschock, bei Kollaps und anderen hämodynamischen Störungen sowie als Präparat für die parenterale .Ernährung. Das Albumin findet auch Verwendung für laboratoriumsMäßige Zwecke. Das Albumin des tierischen Serums wird in verschiedenen Industriezweigen verwendet. Es sind Verfahren zur Isolierung von Albumin aus biolo-

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gischen Flüssigkeiten, z.B. aus dem Spenderblutplasma und -serum, durch Fraktionieruni; der Eiweißstoffe mit Hilfe
von Äthylalkohol bekannt (E. Cohn, USA-Patent 2 469 193,
Klasse 260-112). Das Verfahren macht es möglich, das Albumin in guter Ausbeute mit einem Reinheitsgrad bis 985S nach der Elektrophorese zu isolieren. Das Verfahren gestattet es, neben dem Albumin auch einige andere wertvolle Eiweißstoffe zu erhalten. Nach diesem Verfahren wird der ganze Prozeß bei einer Temperatur unterhalb O⁰C durchgeführt.

Durch mehrfache Veränderungen des Gehaltes der Lösung an Alkohol, des pH-Wertes des Mediums und der Ionenstärke der Lösung gelingt es, die Präzipitation der einzelnen Eiweißfraktionen hintereinander zu bewirken und diese aus der Lösung abzutrennen.

Ein ITachteil des Verfahrens 1st es, daß es arbeitsintensiv und mehrstufig ist.

Es ist möglich, das Albumin aus dem Blutplasma und
-serum durch Äther zu'isolieren (Kekv/ick K.A., Medical Research Counsil. Special Reports, London 286, 1954). Das Verfahren besitzt keine Vorteile gegenüber dem alkoholischen Verfahren, wobei seine Anwendung durch die Explosionsgefahr und Toxizität des Äthers begrenzt ist.

Es besehen Verfahren zur Isolierung von Albumin mit Hilfe neutraler organischer Salze (E. Cohn, J. Am. Chem. Soc. 62, 3386, I94O). Das Verfahren beruht darauf, daß die einzelnen Ei7/eißfraktionen präzipitiert und unter der Wirkung

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eines Salzes verschiedener Konzentration aus der Lösung isoliert werden. Der Hauptnachteil des Verfahrens ist es, daß es schwierig ist, anschließend größere Mengen des Salzes aus den eiweißstoffhaltigen Lösungen zu entfernen.

Es wurde ein Verfahren zur Isolierung von Albumin aus dem Blutplasma mit Hilfe von Rivanol entwickelt (Hörejsi J., Smetana P., Actamed. scand., 155* 1» 65, 1965). Das Rivanol verbindet sich spezifisch mit den Eiweißstoffen und ruft die Präzipitation des Albumins und eines Teils der Alpha- und Beta-Globuline hervor. Die Herstellung des reinen Albumins nach dem Rivanol-Verfahren stößt auf bedeutende Schwierigkeiten. Außerdem ruft das Ausfällen mit der Rivanollösung eine ungerechtfertigte Vergrößerung der Arbeitsvolu-Eien hervor.

Die genannten Verfahren sind bestimmt für die Herstellung von Albumin nur aus vollwertigem Spenderblutplasma und -serum. Zu gleicher Zeit gibt es Rohstoffquellen, welche nach dem Volumen das· Spenderblutplasma bedeutend übersteigen, solche wie Plazentablut- und AbortblutserunnijPlazcntaextrakt, aus denen nach dem bekannten Verfahren reines Albumin infolge starker Verunreinigung des Ausgangsrohstoffes durch Gewebeeiweißstoffe sowie durch Beimengungen der Kichteiwoißnatur Steroidhormone ,Hanojjigmente, u.a.m., nicht erhalten werden kann·

Zur Verarbeitung dieser Roli3toffarten wurde ein Verfahren zur Entfernung der Hämopigmente aus der Albuninlösung mit. Hilfe von Zinksalsen vorgeschlagen (Surgenor D., Qu-art.

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Rev. Med., 9, 148, 1952). Das Verfahren fand keine breite Annendung infolge der Schwierigkeit der Entfernung aus der Lösung toxischer Zinkionen, der Kompliziertheit und Mehrstuf igkeit des Prozesses, sowie infolge niedriger Ausbeute an Albumin.

Es ist ein Verfahren zur Isolierung von Albumin aus dem Plasma und Serum und dessen Reinigung von den Hämopigmenten bekannt, welches in der Entfernung der Hämopigmente durchÄthylalkohol in Gegenwart von Salzen der . Zitronensäure, Schwefelsäure und Salzsäure bei einer Temperatur unterhalb O C besteht (Λ.Α. From, Österreichisches Patent Hr. 275038, Klasse 3011/01). Das Verfahren liefert zufriedenstellende Ergebnisse nur bei einem nichthohen Gehalt an Hänopigmenten in dem Ausgangs rohst of f. Ein Nachteil des Verfahrens ist die Notwendigkeit die Dialyse für die Abtrennung der Salze aus der Albuminlösunc durchzuführen.

Die Kompliziertheit der Reinigung des Albumins von einigen Beimengungen der Nichteiweißnatür, wie Ilämopigmente, Gallenfarbstoffe, Steroidhormone. etc., ist durch die Bildung von Komplexverbindungen dieser Stoffe init dem Albumin he dingt. Das Vorliegen solcher Komplexe macht die konventionellen Roingungsverfahren, die bei der Fraktionierung von Eiweißgemischen angewandt werden, wenig v/irksam.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die genannten llachteilo zu vermeiden.

In Übereinstimmung mit dem Ziel wurde die Aufgabe gestellt, solche technologischen Parameter für die Durchfüh-

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rung des Prozesses der Isolierung von Albumin zu finden, welche es möglich machen, die Abtrennung der Begleiteiweißstoffe durchzuführen und gleichzeitig die Komplexe des Albumins mit den Beimengungen der Hichteiweißnatur zu zerstören, die seiner klinischen Verwendung im Wege stehen.

Die genannte Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur Isolierung des reinen Serumalbumins aus biologischen Flüssigkeiten, welches die Behandlung der genannten Flüssigkeiten mit einem niederen aliphatischen Alkohol und einem Karbonsäuresalz vorsieht und in welchem man.erfindungsgemäß die Behandlung mit dem Alkohol bei einer Konzentration desselben von 15 bis 35 Volumprozent in Gegenwart von 0,1 bis O,6joeines aliphatischen Karbonsäuresalz mit nichttoxischem Kation und Anion mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen bei einer Temperatur von 1 bis 30 ⁰C unter einem pH-Wert des Mediums von 2 bis 5 durchführt, wobei die das Albumin begleitenden Eiweißstoffe in Abhängigkeit von dem gewählten pH-Yfert teilweise oder im wesentlichen denaturiert werden; die denaturierten und nativen Begleiteiweißstoffe präzipitiert man bei einem pH-Wert von 4 bis 5 und einer Temperatur von 1 bis 30⁰C, wobei die Beimengungen der ITichteiweißnatur, die mit Albumin Komplexverbindungen bilden, von diesem abgespalten und von dem gebildeten niederschlag adsorbiert werden; die erhaltene Lösung, welche reines Serumalbumin enthält, wird von dem Niederschlag bei einer Temperatur von 1 bis 30 ⁰C und einem pH-Yfert von 4 bis 5 abgetrennt.

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Von den Alkoholen verwendet man zweckmäßig Äthylalkohol in einer Menge von 25 Volumprozent, von den Fettsäuresalzen verwendet man zweckmäßig das ITatriumcaprylat in einer Konzentration von 0,3$; die Behandlung wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3,3 "bis 4,6 und einer Temperatur von 15 bis 22 ⁰C durchgeführt.

Bei der Anwendung einer Alkoholkonzentration unterhalb 15 Volumprozent sinkt der Reinheitsgrad den abgetrennten Albumins, bei der Anwendung einer Alkoholkonzentration oberhalb 35 Volumprozent können irreversible Veränderungen der Konformation des Albuminmolcküls eintreten.

Die Erfindung sieht die obligate Verwendung eines Fettsäuresalzes in einer Konzentration von 0,1 bis 0,650 vor.

Bei der Salzkonzentration unterhalb der genannten Grenze ist der Reinigungsgrad des abgetrennten Serumalbumins ungenügend. Die Anwendung des Fettsäuresalzes in einer Konzentration oberhalb der genannten Grenze ist nicht zweckmäßig, weil dies zu einer ungerechtfertigten Vergrößerung der Albuminverluste führen kann.

Die Durchführung der Reaktion in einem Medium, welches einen pH-Wert unterhalb 2 aufweist, steigert den Reinheitsgrad des abgetrennten Albumins nicht, erhöht aber die Gefahr seiner.Denaturierung. Beim Arbeiten in einem Medium, welches eicn pH-V/ert oberhalb 5 aufweist, ist der Reinheitsgrad des Albumins ungenügend hoch. Der Prozeß muß bei einer Temperatur nicht oberhalb 30 ⁰C durchgeführt werden, weil

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eine weitere Temperatursteigerung zum Auftreten irreversibler Denaturierungsveränderung im Albumin führen kann. Bei der Senkung der Temperatur des Reaktionsgemisches wird nach der Maßgabe der Annäherung zu O⁰C die Präzipitation des Albumins stärker. Eine Senkung der Temperatur unterhalb I⁰C ruft außerordentlich große Verluste von Albumins bis zu seiner vollständigen Ausfällung und Entfernung zusammen mit den Verunreinigungen hervor.

Das vorgeschlagene Verfahren beruht auf der Vereinigung der Wirkung des Alkohols und des Anions der Fettsäure unter den Bedingungen der sauren Reaktion des Mediums und der positiven Temperatur. Die gemeinsame Einwirkung der vier genannten Faktoren ist eine notwendige Bedingung für dia Isolierung genügend reinen Albumins. Die Einwirkung der sauren Reaktion des I-Iediums und dee Alkohols führt zur Dissoziation der Komplexe des Albumins mit den Beimengungen der Iiichtuiweißnatur, welche durch das Anion der Fettsäure verdrängt und abgetrennt werden.

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Die von Albumin abgetrennt genannten Beimengungen werden durch den niederschlag der Begleiteiueißstoffe rorbiert und zusammen mit diesen entfernt.

Scrr.it erfolgt die Entfernung der das Albumin begleitenden Eiw(JfUtoffe durch selektive Säure-Alkohol-Denaturierung und deren anschließende Ausfällung bei positiver Tnmperatur unter gleichzeitiger Entfernung der auf diesen adsorbierten Beimengungen der Kichtoiweißnatur.

Die Durchführung des Prozesses bei einer Temperatur

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oberhalb O ⁰C ist für die Verhinderung der Präzipitation des Albumins unter der Wirkung des Alkohols notwendig. Die Rolle der positiven Temperatur besteht auch in der Verstärkung der denaturierenden Wirkung des Alkohols und der sauren Reaktion des MedL-ums auf die aus der Lösung zu entfernenden Eiweißstoffe· Soll der Eiweißstoff in nativem Zustand zur weiteren Verwendung entfernt werden, so kann die Hauptmasse desselben durch Einwirkung von Alkohol und Anion der Fettsäure unter für die Erhaltung der Nativität genügend milden Bedingungen vorher abgetrennt werden.

Das vorgeschlagene Verfahren wird wie folgt, durchgeführt.

Als Ausgangsrohstoff verwendet man Spenderblutplasma, Plazentarblut- oder "Abortblutserum, Plazentaextrakt oder Blutplasma der Säugetiere, aus denen vorher mit Hilfe der konventionellen Methoden andere Fraktionen, solche wie Fibrinogen und Gaminaglobulin, abgetrennt werden können·

Der eiweißstoffhaltigen Lösung gibt man einen niederen aliphatischen Alkohol, vorzugsweise Allylalkohol zu und stellt seine Konzentration in einem Bereich von 15 bis 35 Volumprozent ein und gibt dann ein Salz einer aliphatischen Säure in einer Konzentration von 0,1 bis O,6j£ zu und bringt bei einer Temperatur von 1 bis 30 ⁰C den pH-üiert auf 2 bis 5«

Dabei werden in Abhängigkeit von dem gewählten pH-tfert die das Albumin begleitenden Eiweißstoffe teilweise oder im wesentlichen denaturiert· Danach stellt man den pH - TJert des Mediums auf 4 bis 5 ein, indem man die Temperatur in

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einem Bereich von 1 bis 30 ⁰C hält. Die denaturierten und nativen Eiweißstoffe werden unter diesen Bedingungen vom Albumin abgetrennt und zusammen mit den Beimengungen der Kichteiweißnatur präzipitiert. Die erhaltene Lösung, welche reines Serumalburain enthält, wird von dem Niederschlag bei einem pH-Wert von 4 bi3 5 und einer Temperatur von 1 bis 30 ⁰C abgetrennt.

Das vorgeschlagene Verfahren macht es möglich, für medizinische und laboratoriumsmäßige Zwecke geeignetes Albumin zu isolieren, dessen Reinheitsgrad nach dem Eiweißstoff lOOji (Elektrophorese-Methode) erreicht, wobei der Gehalt des Albumins an Hämopigmenten und an anderen schädlichen Beimengungen in solchen Grenzen liegt, die seiner klinischen Verwendung nicht im Wege stehen.

Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden folgende Beispiele für die Durchführung des Verfahrens zur Isolierung des reinen Serumalbumins angeführt.

Beispiel 1

Man nimmt 50 1 eines Gemisches von Biazentar« und Abortblutserum, llach der Entfernung des Gammaglobulins aus dem Gemisch nach einem beliebigen bekannten Verfahren, s.B. nach einem der Verfahren von Kohn_f stellt man die Äthylalkoholkonzentration der Lösung auf 25 Volumprozent ein« Die leiaperatur stellt man auf 20 ⁰C ein. Unter ständigem Rüiirsn gibt man Natriumcaprylat bis zum Erz-ieien einer Konzentration desselben von 0,35*. Dann stellt man den pH-Wert des Gemisches

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bei der genannten Temperatur auf 3,3 durch Zugabe von In-Salzsäure ein und hält bei diesem pH-Wert während 30 Minuten zur möglichst vollständigen Denaturierung der das Albumin begleitenden Eiweißstoffe. Danach bringt man den pH-Wert des MecU-iums auf 4,5 und präxipitiert die denaturierten Eiweißstoffe zusammen mit den von dem Albumin abgespaltenen Beimengungen der !lichteiweißnatür. Die Abtrennung der Lösung, welche reines Albumin enthält, von dem gebildeten Niederschlag wird "bei einer Temperatur von 20 C und einem pH-Wert, γόη 4,5 (pH wird mit In-Ätznatronlösung eingestellt) durch Zentrifugieren durchgeführt. Die erhaltene Flüssigkeit wird zusätzlich duroh Filtration gereinigt· Aus der Flüssigkeit -kann das Albumin nach einem beliebigen bekannten Verfahren, z.B „ durch Ausfällen mit Äthylalkohol bei einer Konzentration desselben von 20 bis 40 Volumprozent bei einer Temperatur von -6⁰C bis -8 ⁰C konzentriert werden unter anschließender Auflösung des gebildeten ITIe d-erschlags in Wasser und Lyophilisierung« Das abgetrennte Albumin enthält nach den Angaben der Elektrophorese praktisch keine anderen Eiweißstoffe, was einen Reinheitsgrad von 100?» bedeutend. Die Ausbeute an Albumin beträgt IB bis 22 g pro Liter Serum.

Beispiel 2

Als Aus^angsrohstoff dient Spcnderblutplasaa· Aus 50 1 Plasma trennt man nach einem beliebigen bekannten Verfahren Fibrinogen, Prothrombin, Fibranolysin und Gamma-

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globulin ab und stellt den Gehalt des Alkohols auf 20$ ein, führt Natriumcaprylat bis zum Erzielen einer Konzentration von 0,3 5» ein, stellt den pH-Wert auf 4,5 ein und hält während 20 Minuten bei einer Temperatur von 10 ⁰C. Den gebildeten Niederschlag trennt man durch Zentrifugieren ab. Es kann zum Abtrennen von Alpha- und Beta-Globulinen und zur zusätzlichen Isolierung von Albumin verwendet werden. Die erhaltene Flüssigkeit enthält ein ungenügend reines Albumin, weshalb der Prozeß wiederholt wird, wozu man den pH-Wert der Flüssigkeit auf 3,3 senkt. Im v/eiteren v/ird der Prozeß analog zu Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 3

Als Rohstoff dient Plazentaextrakt, welcher 2,5$ Eiweißstoff enthält. Der Prozeß wird analog zu Beispiel 1 durchgeführt die Natriumcaprylatmenge wird dabei verändert. Das Natriumcaprylat gibt man bis zur Erzielung einer Konzentration desselben von 0,2# zu.

Beispiel 4

Als Ausgangsrohstoff dient Ochsenblutserum. Zu 50 1 eines solchen Serums gibt man 96j£igen Alkohol bis zur Erzielung einer Konzentration desselben in der Lösung von 25 Volumprozent zu. Kan gibt Natriumcaprylat bis zu einer Konzentration desselben in der Lösung von 0_f3ji bu. Nach der Auflösung des Natriumcaprylats bringt man den pH-Wert der Lösung durch die Zugabe von In-Salzsäure auf 3,3. Unter diesen Bedingungen hält man die Lösung bei einer Temperatur von

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20 ⁰C während 4-0 Minuten, wonach der pH-Wert durch Zugabe von ln-Ätznatronlösung auf 4,5 bringt. Den gebildeten niederschlag trennt man bei dem genannten pH-Wert und der genannter Temperatur durch Zentrifugieren ab. Nach dem Abtrennen des Niederschlages senkt man die Temperatur der Flüssigkeit auf -8 ⁰C und hält die Lösung während 48 Stunden bis zur Bildung des Niederschlags. Der abgetrennte Niederschlag enthält reines Albumin und Spuren von Globulinen.

Beispiel 5

Man nimmt 1 Liter Plazentarblutserum und gibt Methylalkohol bis zur Erzielung einer Konzentration desselben von 30$ und ITatriumcaprylat bis zu einer Konzentration desselben von 0,3$ zu, stellt den pH-Wert auf 2,5 ein und hält das Gemisch bei diesem pH-Wert während 20 Minuten. Dann erhöht man den pH-Wert auf 4,6 und fällt die das Albumin begleitenden Eiweißstoffe und die Beimengungen der Nichteiweißnatür aus. Die Lösung, welche reines Albumin enthält, wird durch Zentrifugieren abgetrennt·

Beispiel 6

Man nimmtil Liter Plazentarblutserum, gibt Äthylalkohol bis zur Erzielung einer Konzentration desselben von 20$ und llatriumcaptonat bis zu einer Konzentration desselben von 0,45$ zu, stellt den pH-Uert auf 3,3 ein und führt den Prozeß im weiteren analog zu Beispiel 1 durch.

Beispiel 7

Man nimmt 1 Liter Plazentarblutserum und gibt diesem

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Äthylalkohol bis zur Erzielung einer Konzentration desselben von 25$ und Natriumcaprinat bis zur Erzielung einer Konzentration desselben von 0,3 ^aß> zu, stelltflen pH-Wert auf 3,3 ein und führt im weiteren den Prozeß analog zu Beispiel 1 durch.

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Claims

PATEITTAITSPRTJCHE:

1. Verfahren zur Isolierung von reinem Serumalbumin aus "biologischen Flüssigkeiten durch deren Behandlung mit einem niederen aliphatischen Alkohol und einem Karbonsäuresalz, dad urch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit dem Alkohol bei einer Konzentration desselben von 15 bis 35 Volumprozent in Gegenwart von 0,1 Ms 0,6 $ des aliphatischen Karbonsäuresalzes mit nichttoxischem Kation und Anion mit 6 "bis 12 Kohlenstoffatomen bei einer Temperatur von 1 bis 30 ⁰C und einem pH-Wert von 2 "bis 5 durchführt, wobei in Abhängigkeit von dem gewählten pH-üert die das Albumin begleitenden Eiweißstoffe zum Teil oder im wesentlichen denaturiert werden, die denaturierten und nativen Begleiteiweißstoffe präzipitiert-dann bei einem pH-Wert von bis 5 und einer Temperatur von 1 "bis 30 ⁰Cfwobei aie Beimengungen der Nichteiweißnatur, welche mit dem Albumin Komplexverbindungen bilden, von diesem abgespalten und durch den gebildeten Niederschlag adsorbiert werden, von dem die reines Serumalbumin enthaltende Lösung bei einer Temperatur von 1 bis 30 ⁰C und einem pH-I7ert von 4 bis 5 isoliert wird .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e ken nzeichnet, daß man als aliphatische Karbonsäuresala llatriumcaprylat, llatriumcapronat oder Uatriunicaprinat verwendet.

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3- Verfahren nach Anspruch 1, 2, dadurch g e k e η nzeichnet, daß man den Prozeß bei einer Temperatur von 15 bis 22 ⁰C durchführt,

4· Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch g e k e η nzei chnet, daß die Behandlung der biologischen Flüssigkeiten ait dem genannten Alkohol und dem Salz bei einem pH-Wert von 3,3 bis 3»5 durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch g e ken nzeichnet, daß die reines Albumin enthaltende Lösung von dem Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt wird.

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