ES2219257T3 - Albumina de elevada pureza producida por un procedimiento que comprende varias etapas. - Google Patents

Abstract

Una preparación de albúmina en la que la albúmina tiene un nivel de glicación de menos de 0, 6 moles de hexosa/moles de proteína y la preparación tiene un único pico en un electroforetograma de la zona capilar.

Description

Albúmina de elevada pureza producida por un procedimiento que comprende varias etapas.

La presente invención se refiere a la purificación de la proteína seralbúmina humana (HSA) extraída de suero o de albúmina humana recombinante (rHA) producida transformando un microorganismo con una secuencia codificadora de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la seralbúmina humana. En esta memoria, el término "albúmina" hace referencia genéricamente a HSA y/o rHA.

La albúmina se utiliza para tratar pacientes con quemaduras graves, choques o pérdida de sangre. Asimismo se utiliza para suplementar medios utilizados para desarrollar células eucariotas superiores y como excipiente en la formulación de proteínas terapéuticas. En la actualidad, la demanda del producto se satisface mediante la albúmina extraída de la sangre humana. Entre los ejemplos de los mecanismos de extracción y separación se incluyen aquellos descritos en: JP 03/258.728 sobre el uso de un intercambiador catiónico; EP 428.758 sobre el uso de intercambio aniónico seguido de intercambio catiónico; y EP 452.753 sobre el uso del calentamiento, la adición de sal y la
diafiltración.

La producción de rHA en microorganismos ha sido descrita en EP 330.451 y en EP 361.991. Las técnicas de purificación para rHA han sido descritas en: WO 92/04367, la eliminación de tinte derivado de una matriz; en EP 464.590, la eliminación de tintes derivados de levadura; y EP 319.067, precipitación alcalina y posterior aplicación de la rHA a una fase lipófila que tiene afinidad específica por la albúmina. En EP 570.916 y en EP 612.761 se describe rHA purificada.

La presente invención proporciona albúmina altamente purificada, que tiene un nivel de glicación de menos de 0,6 moles de hexosa por mol de proteína y manifiesta un único pico en un electroforetograma de una zona de capilaridad. La albúmina puede ser elaborada en un procedimiento que comprende las etapas de aplicar una solución de albúmina relativamente poco pura a un material cromatográfico para el cual la albúmina no tiene afinidad específica de manera que la albúmina se une al material, y hacer eluir la albúmina unida del material aplicando una solución de un compuesto que tiene una afinidad específica hacia la albúmina. Preferiblemente, el material cromatográfico es un intercambiador catiónico, tal como SP-Sepharose FF, SP-Spherosil etc., como se enumera más abajo en el Ejemplo 2. El compuesto con afinidad específica hacia la albúmina puede ser una sal de ácido graso tal como octanoato (v.g. octanoato de sodio), otros ácidos grasos de cadena larga (C_{6} a C_{22}), salicilato, octilsuccinato, N-acetiltriptófano o una mezcla de dos o más de estos.

El procedimiento para purificar la albúmina puede comprender las etapas de someter una solución de albúmina a cromatografía de intercambio catiónico en la que la albúmina se une a un material de intercambio catiónico y después a cromatografía de intercambio aniónico en la que la albúmina se une a un material de intercambio aniónico.

La albúmina que se hace eluir del material de intercambio catiónico se puede tratar con posterioridad mediante una o más entre cromatografía de afinidad, ultrafiltración y penetración en gel antes de ser sometida a dicha cromatografía de intercambio aniónico. Por tanto, en una realización preferida, el procedimiento comprende las etapas
de:

(a)

hacer pasar una solución de albúmina a través de una matriz de intercambio catiónico en condiciones tales que la albúmina se una a la matriz;

(b)

eluir de dicha matriz un producto eluido del intercambio catiónico que contenga la albúmina;

(c)

hacer pasar dicho producto eluido a través de una matriz de afinidad que comprenda un compuesto de unión a la albúmina;

(d)

eluir de dicha matriz un producto eluido de la matriz de afinidad que contenga la albúmina;

(e)

hacer pasar dicho producto eluido, opcionalmente tras la ultrafiltración, a través de una matriz de penetración en gel para obtener una fracción enriquecida en albúmina;

(f)

hacer pasar dicha fracción enriquecida en albúmina a través de una matriz de intercambio aniónico en condiciones tales que la albúmina se una a la matriz; y

(g)

eluir de dicha matriz de intercambio aniónico un producto que contenga la albúmina purificada.

Alternativamente, la albúmina que se hace eluir del material de intercambio catiónico puede ser aplicada a dicho material de intercambio aniónico sin ningún tratamiento intermedio (distinto de la dilución). Por tanto, una segunda realización preferida proporciona un procedimiento para purificar albúmina, que comprende las etapas de:

(a)

hacer pasar la solución de albúmina a través de una matriz de intercambio catiónico en condiciones tales que la albúmina se una a la matriz;

(b)

hacer eluir de la matriz un producto eluido de intercambio catiónico que contenga albúmina;

(c)

hacer pasar el producto eluido del intercambio catiónico a través de una matriz de intercambio aniónico en condiciones tales que la albúmina se una a la matriz;

(d)

hacer eluir de la matriz de intercambio aniónico un producto eluido del intercambio aniónico que contenga albúmina;

(e)

hacer pasar el producto eluido del intercambio aniónico a través de una matriz de afinidad que comprenda un compuesto de unión a la albúmina;

(f)

hacer eluir de la matriz de afinidad un producto eluido de la matriz de afinidad que contenga albúmina;

(g)

hacer pasar el producto eluido de la matriz de afinidad a través de una matriz de penetración en gel para obtener una fracción enriquecida en albúmina.

Preferiblemente, antes de la etapa de intercambio catiónico, la solución de albúmina es acondicionada mediante la adición de octanoato y/o otro estabilizador de albúmina (v.g. acetiltriptofanato de sodio) a esto hasta una concentración final de aproximadamente 1-10 mM y el ajuste del pH a aproximadamente 4,0-5,0.

Ventajosamente, la albúmina retenida en la etapa de intercambio catiónico se lava con una solución con un elevado contenido de sal (v.g. NaCl 0,5-2,0 M tamponado a pH 4,0 con acetato de sodio 10-100 mM, preferiblemente 20-40 mM, por ejemplo 27 mM) antes de hacerse eluir.

Preferiblemente, en los procedimientos en los que el producto eluido del intercambio catiónico se hace pasar directamente al intercambiador aniónico, la albúmina se hace eluir en la etapa de intercambio catiónico utilizando un tampón que contenga un compuesto con una afinidad específica hacia la albúmina, especialmente un ácido o sal del mismo, por ejemplo octanoato o cualquier otro ácido de cadena larga (C_{6}-C_{22}), salicilato, octilsuccinato o N-acetiltriptófano.

Adecuadamente, la albúmina se hace eluir del intercambiador aniónico con un tampón que contiene un nivel elevado (v.g. al menos 50 mM, preferiblemente 50-200 mM, por ejemplo 80-150 mM) de una sal de ácido bórico, por ejemplo tetraborato de sodio o potasio.

La albúmina puede ser sometida después, con o sin etapas de procedimientos intermedios, a cromatografía sobre una resina que contiene un compuesto inmovilizado que se unirá selectivamente a productos glicoconjugados y sacáridos, tales como ácido aminofenilborónico (PBA).

El procedimiento para purificar la albúmina puede comprender la etapa de exponer una solución de albúmina relativamente impura a un material cromatográfico que comprende un ácido borónico o una sal del mismo, y separar el material de la solución de albúmina para rendir albúmina purificada. Adecuadamente, la solución de albúmina contiene los productos glicoconjugados y/o los sacáridos. Preferiblemente, los productos glicoconjugados y/o los sacáridos comprenden glicoproteínas de levadura.

Preferiblemente, el ácido borónico es ácido aminofenilborónico o una sal del mismo. Preferiblemente, el ácido aminofenilborónico es inmovilizado sobre un gel de agarosa.

En una realización, la solución de albúmina es tamponada con uno o más iones acetato, iones cloruro, iones octanoato e iones amonio. Preferiblemente, la solución contiene iones acetato 10-100 mM, iones amonio 10-100 mM, iones cloruro 20-2.000 mM e iones octanoato 1-20 mM y tiene un pH de 9,0-9,5.

En cualquiera de tales procedimientos que implique una cromatografía de afinidad, en la cromatografía de afinidad se utiliza preferiblemente una resina que comprende un tinte específico de la albúmina inmovilizado, tal como un tipo de tinte Cibacron Blue, preferiblemente inmovilizado sobre la resina por medio de un espaciador tal como 1,4-diaminobutano u otro espaciador de longitud C_{1}-C_{8}, preferiblemente C_{1}-C_{6}, v.g. C_{1}-C_{5} y muy preferiblemente C_{4}, que tenga preferiblemente una sustitución \alpha,\omega-diamino. En una realización, el espaciador es un grupo \alpha,\omega-diamino (alquilo de cadena lineal C_{1}-C_{6}).

Sorprendentemente, los autores de la presente invención han descubierto que semejantes tintes tienen una mayor afinidad hacia un fragmento de albúmina de 45 kD que puede ser producido en cultivos de microorganismos secretores de HA, que la que tienen hacia la molécula de albúmina en toda su longitud. El fragmento de 45 kD consta típicamente de la región 1-403 a 1-409 y se describe en Sleep y col. (1.990) Bio/Technology 8, 42-46 y en WO 95/23857.

Por consiguiente, este procedimiento proporciona un método para purificar una solución de albúmina que contiene el fragmento de albúmina de aproximadamente 45 kD (1-403 a 1-409) producido por ciertos microorganismos secretores de albúmina, comprendiendo el método exponer la solución a un tinte inmovilizado que tenga afinidad específica hacia la albúmina, y hacer eluir la albúmina mientras se deja el fragmento de 45 kD sobre el
tinte.

La solución de albúmina purificada puede ser tratada adicionalmente según la utilidad pretendida. Por ejemplo, puede ser ultrafiltrada a través de una membrana de ultrafiltración para obtener un producto retenido de ultrafiltración que tenga una concentración de albúmina de al menos aproximadamente 80 g de albúmina por litro, siendo el producto retenido de ultrafiltración diafiltrado frente a al menos 5 equivalentes respecto al producto retenido de agua. Puede resultar ventajoso incluir iones amonio en ciertas etapas cromatográficas, por ejemplo en la etapa que implica al aminofenilboronato inmovilizado. Sorprendentemente, los autores de la presente invención han descubierto que semejantes iones amonio están unidos a la albúmina de manera relativamente íntima. Es preferible que tales iones amonio sean eliminados de la albúmina y los autores de la presente invención han descubierto que esto se puede lograr mediante el uso de un contraión. A los expertos en esta técnica no se les había ocurrido la conveniencia de exponer la albúmina a un contraión puesto que los procedimientos anteriores no implicaban iones amonio y no había razón para suponer que los iones amonio serían unidos por la albúmina.

Por consiguiente, un procedimiento adicional proporciona un método de purificación de una solución de albúmina que comprende exponer la solución a una solución de un contraión de manera los iones amonio sean desplazados de la albúmina y puedan ser eliminados de la solución.

El contraión (preferiblemente un ión metálico tal como iones sodio) puede ser añadido a la solución de albúmina y los iones amonio separados mediante diálisis, o el ión amonio puede ser separado por diafiltración a través de una membrana semipermeable que separa la albúmina de la solución del contraión, o pueden ser separados mediante cromatografía de penetración en gel. Generalmente es adecuada la diafiltración frente a al menos 5 volúmenes de producto retenido de cloruro de sodio 50 mM.

Por tanto, se puede emplear un método de purificación de una solución de albúmina, comprendiendo el método exponer la solución a un material cromatográfico en un tampón que contenga iones amonio, y separando con posterioridad los iones amonio mediante el método descrito antes, para rendir un producto de albúmina purificada, opcionalmente tras etapas de purificación o formulación adicionales. Preferiblemente, el material cromatográfico comprende iones borato inmovilizados.

En una realización, la solución de albúmina purificada se purifica adicionalmente y/o formula para la administración intravenosa en humanos.

Se ha encontrado que la albúmina obtenida tiene niveles extremadamente bajos, o se encuentra esencialmente libre de, colorantes, lactato, citrato, metales, proteínas humanas tales como inmunoglobulinas, activador de la pre-calicreína, transferrina, glicoproteína ácida-\alpha_{1}, hemoglobina y factores de coagulación de la sangre, proteínas procarióticas, fragmentos de albúmina, productos agregados o polímeros de albúmina, endotoxinas, bilirrubina, hem, proteínas de levadura y virus. Por "esencialmente libre" se quiere significar por debajo de los niveles detectables. El término "colorante" utilizado aquí representa cualquier compuesto que coloree la albúmina. Por ejemplo, un pigmento es un colorante que se origina en un organismo, especialmente levadura, que se utiliza para preparar albúmina recombinante, mientras un tinte es un colorante que se origina en etapas cromatográficas para purificar la albúmina. Al menos el 99%, preferiblemente al menos el 99,9%, en peso de la proteína de las preparaciones de albúmina purificadas mediante el procedimiento de la invención es albúmina. Es menos probable que semejante albúmina altamente pura ocasione efectos secundarios adversos.

Se ha encontrado que la albúmina producida por estos procedimientos es al menos en un 99,5% monomérica, preferiblemente sustancialmente en un 100% monomérica mediante SDS-PAGE reductora, y se caracteriza por una o más de las siguientes características. Tiene un contenido de ión aluminio de menos de 150 ng, preferiblemente menos de 100 ng; un contenido de ión hierro de menos de 3.000 ng, preferiblemente menos de 1.000 ng; un nivel de ión cobre de menos de 10.000 ng, preferiblemente menos de 5.000 ng; un nivel de ión magnesio de menos de 3.000 ng, preferiblemente menos de 1.500 ng; un nivel de ión cinc de menos de 5.000 ng, preferiblemente menos de 3.000 ng, un nivel de ión manganeso de menos de 50 ng, basándose todos en un gramo de albúmina; un nivel de glicación de menos de 0,6, preferiblemente menos de 0,15 (más preferiblemente menos 0,05), moles de hexosa/mol de proteína; un nivel de contaminantes de bajo peso molecular por debajo de 20 V.seg, preferiblemente menos de 10 V.seg, medido como en el siguiente Ejemplo 9; un único pico en un electroforetograma de zona capilar; un extremo C o un extremo N intactos, es decir homogéneos; un contenido de tiol libre de al menos 0,85 moles SH/mol de proteína; y no más de 0,3 moles/mol de ácidos grasos C_{10} a C_{20} y sustancialmente ningún ácido graso C_{18} o C_{20}.

El material de partida puede ser un medio de fermentación que contenga albúmina, o la solución de albúmina impura puede ser una solución obtenida del suero mediante cualquiera de la plétora de mecanismos de extracción y purificación desarrollados en los últimos 50 años, por ejemplo los descritos por Stoltz y col. (1.991) en Pharmaceut. Tech. Int., Junio de 1.991, 60-65 y More & Harvey (1.991) en "Blood Separation and Plasma Fractionation" Ed. Harris, Wiley-Liss, 261-306.

Especialmente cuando la albúmina es rHA producida en levaduras deficientes en proteasa u otros organismos, el procedimiento no comprende normalmente una etapa de tratamiento con calor como parte del procedimiento de purificación (en contraste con EP 428.758 y EP 658.569). De un modo similar, si se prepara a partir de microorganismos (en lugar de a partir de humanos) no requiere normalmente una etapa de pasteurización final (típicamente 60ºC durante una hora).

Se puede formular el producto final para proporcionarle una estabilidad añadida. Preferiblemente, el producto de albúmina altamente puro de la invención contiene al menos 100 g, más preferiblemente 1 kg o 10 kg de albúmina, que pueden ser divididos en una pluralidad de viales.

Aunque semejantes procedimientos pueden ser utilizados para obtener albúmina más purificada de una solución de albúmina impura de diversas fuentes, tal como suero, éstos son particularmente aplicables a la purificación de albúmina humana recombinante (rHA). La albúmina producida según la invención puede ser cualquier albúmina de mamífero, tal como albúmina de rata, bovina u ovina, pero es preferiblemente albúmina humana. El ADN que codifica la albúmina puede ser expresado en un huésped adecuado para producir albúmina. Así, el ADN puede ser utilizado según los mecanismos conocidos para construir un vector de expresión, que se utiliza después para transformar una célula huésped apropiada para la expresión y producción de albúmina. Entre semejantes mecanismos se incluyen aquellos descritos en EP-A-73.646, EP-A-88.632, EP-A-201.239 y EP-A-387.319.

Se conocen muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Kluyveromyces lactis), hongos filamentosos (por ejemplo Aspergillus), células vegetales, células animales y células de insectos. El microorganismo preferido es la levadura Saccharomyces cerevisiae.

En una realización de la presente invención la solución de albúmina inicial es un medio de cultivo de levadura obtenido cultivando levadura transformada con una secuencia de nucleótidos que contiene albúmina en un medio de fermentación, por medio de lo cual dicha levadura expresa y secreta albúmina.

Los géneros ejemplares de levadura que se contempla que son útiles en la práctica de la presente invención son Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y similares. Los géneros preferidos son aquellos seleccionados del grupo formado por Pichia(Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia y Hansenula. los ejemplos de Saccharomyces spp. son S. cerevisiae, S.italicus y S. rouxii. Los ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis y K. lactis. Los ejemplos de Pichia (Hansenula) son P. angusta (antes H. polymorpha), P. anomala, P. pastoris y P. capsulata. Y. lipolytica es un ejemplo de especie de Yarrowia adecuada.

Resulta ventajoso utilizar una cepa de levadura que sea deficiente en una o más proteasas. Entre semejantes cepas se incluyen los mutantes pep4-3 bien conocidos y las cepas con mutaciones en los genes PRA1 y/o PRB1, como describen Woolford y col. (1.993) en J. Biol. Chem. 268, 8990-8998, Cabezón y col. (1.984) P.N.A.S. 81, 6594-6598, EP-A-327.797 y Jones y col. (1.982) Genetics 102, 665-677. Alternativamente, las proteasas del medio de fermentación pueden ser inactivadas calentando. La existencia de proteasas reduce el rendimiento de albúmina durante el procedimiento global.

Preferiblemente, la levadura tiene un nivel bajo (o cero) de la proteasa Yap3p y/o de la proteína de choque térmico hsp150, por ejemplo como resultado de haber desorganizado los respectivos genes, como se ilustra en las solicitudes de patente de los autores de la presente invención WO 95/23857 y WO 95/33833, respectivamente. Yap3p puede ocasionar la formación del fragmento de albúmina de 45 kD referido más abajo, y hsp150 se purifica simultáneamente con la albúmina en algunas etapas de separación.

La levadura puede ser transformada con un plásmido de expresión basado en el plásmido de 2 \mum de Saccharomyces cerevisiae. En el momento de transformar la levadura, el plásmido contiene secuencias de replicación y selección bacterianas, que pueden ser separadas cortando, tras la transformación, mediante un evento de recombinación interna según las enseñanzas de EP 286.424. El plásmido también puede contener un casete de expresión que comprende: un promotor de levadura (tal como el promotor PRB1 de Saccharomyces cerevisiae), como se ilustra en EP 431.880; una secuencia que codifica un líder de secreción, por ejemplo una que comprende la mayor parte del líder de secreción de HSA natural, más una pequeña porción del líder de secreción del factor de emparejamiento \alpha de Saccharomyces cerevisiae, como se ilustra en WO 90/01063; la secuencia codificadora de HSA, obtenible mediante métodos conocidos para el aislamiento de ADNc correspondiente a genes humanos, y también descritos, por ejemplo, en EP 73.646 y EP 286.424; y un terminador de la transcripción, por ejemplo el terminador de Saccharomyces ADH1, como se ilustra en EP 60.057.

Se cree que la elección de los diversos elementos del plásmido descritos antes no es directamente relevante para la pureza del producto de albúmina obtenido, aunque los elementos pueden contribuir a un rendimiento mejorado del producto.

Los aspectos preferidos de la invención se describirán ahora por medio de ejemplos y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra esquemáticamente un fermentador utilizado para producir rHA;

La Figura 2 es un trazado de UV de una columna de HPLC en Fase Reversa C18 PTH (Applied Biosystems Inc.), que muestra el bajo nivel de contaminantes de bajo peso molecular de la albúmina de la invención;

La Figura 3 es similar a la Figura 2 pero muestra contaminantes de bajo peso molecular en la albúmina de la técnica anterior;

La Figura 4 es un cromatograma de gases que muestra el contenido de ácidos grasos de la albúmina asequible comercialmente;

La Figura 5 corresponde a la Figura 4 pero muestra la albúmina de la invención; y

Las Figuras 6a y 6b muestran la espectrometría de masas por electropulverización para la albúmina de la invención y la albúmina de la técnica anterior, respectivamente.

Ejemplo 1 Preparación de la solución de albúmina impura

La estrategia de clonación para la construcción del microorganismo productor de albúmina fue la descrita en EP 431.880. El plásmido pAYE316 fue introducido en una cepa de Saccharomyces cerevisiae (MATa, leu2,pep4-3, [cirº]) mediante el método descrito por Hinnen y col., (1.978) P.N.A.S. 75, 1.929. Los transformantes fueron seleccionados sobre un medio mínimo que carecía de leucina (Base nitrogenada de levadura, Difco). Cuando los transformantes se habían hecho crecer durante 72 horas a 30ºC, 200 rpm en matraces de 50 ml que contenían 10 ml de complejo (YEP, extracto de levadura al 1% (p/v), bactopeptona al 2% (p/v) y sacarosa al 2% (p/v)) o medio líquido definido (base nitrogenada de levadura al 0,15% (p/v) sin aminoácidos y sulfato de amonio, sulfato de amonio al 0,5% (p/v), ácido cítrico 0,1 M/Na_{2}HPO_{4} \cdot 12 H_{2}O pH 6,5, sacarosa al 2% (p/v)), se pudo detectar rHA en el sobrenadante de cultivo libre de células mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y/o inmunoelectroforesis en gel "rocket".

Se utiliza un cultivo celular maestro de partida en un medio líquido definido (Medio Mínimo Tamponado (BMM), medio de sales: Base Nitrogenada de Levadura [sin aminoácidos y (NH_{4})_{2}SO_{4}, Difco], 1,7 g/litro; ácido cítrico monohidratado 6,09 g/litro; Na_{2}HPO_{4} anhidro, 20,16 g/litro, pH 6,5\pm0,2, se añade sacarosa a 20 g/litro) para preparar soluciones de partida para los recorridos (banco celular de trabajo del fabricante) de la levadura del procedimiento adecuada para la preparación de cultivos en matraces con sacudimiento congelando alícuotas del cultivo en presencia de trehalosa al 20% (p/v).

Fermentación

Esta sección hace referencia a la producción de rHA desde el cultivo de partida a la fermentación final y es una definición general de un procedimiento de fermentación de rHA que no está limitado al detalle específico del equipo o la escala particulares.

Cultivo en Matraz con Sacudimiento. La levadura [cirº, pAYE316] se hace crecer en forma de un cultivo axénico fisiológicamente adecuado para la inoculación en el recipiente de siembra. Si la programación del recipiente de siembra es repetible, es necesario definir la fase de crecimiento (exceso de carbohidratos primarios) e inocular biomasa (12 \pm 2 mg/litro que requiere un inóculo de 100 ml por 10 litros de medio). Un vial de partida es inoculado en un matraz con sacudimiento conteniendo 100 ml de BMM + 2% (p/v) de sacarosa y el matraz es incubado a 30ºC en un agitador orbital (200 rpm revoluciones por minuto) hasta que se obtiene un peso celular seco (cdw en sus siglas en inglés) de 0,6-1,2 g/litro (evaluado mediante la densidad óptica a 600 nm). Este cultivo se utiliza después para la inoculación en un recipiente de fermentación de siembra a un nivel de 12 \pm 2 mg/litro.

Fermentación de Siembra. El inóculo para el fermentador de producción principal es proporcionado haciendo crecer el organismo de producción, preferiblemente S. cerevisiae [cirº, pAYE316], en un fermentador de siembra (en este ejemplo, 20 litros de volumen de trabajo) hasta un peso seco celular (cdw) de aproximadamente 100 g.litro^{-1}. Se sigue un régimen de alimentación por lotes con el fin de minimizar la acumulación de etanol y acetato y de ese modo maximizar el rendimiento celular. La totalidad de cada fermentación es verificada y controlada por medio de un sistema de control por ordenador, tal como el soporte lógico Multi-Fermenter Computer System (MFCS) asequible de B. Braun (Alemania). El soporte lógico suministrado por B. Braun es un Supervisory Control and Data Acquisition Package; se encuentran disponibles otros paquetes similares de otras compañías. Se pretende que el algoritmo de control de la alimentación controle la adición de sacarosa de manera que se logre la máxima biomasa evitando el efecto de Crabtree, minimizando de ese modo la producción de etanol y/o acetato. El recipiente de fermentación es sometido a un lavado con NaOH caliente y un enjuagado con agua libre de pirógeno (PFW en sus siglas en inglés). El recipiente esterilizado con calor contendrá aproximadamente 10 litros de medio MW10 estéril (Tabla 1), sales del lote más elementos traza. El medio para la producción de rHA puede ser ultrafiltrado (corte a peso molecular 10.000) para eliminar las endotoxinas.

TABLA 1 Medio MW10

1

Los elementos traza se añaden a agua desmineralizada, se acidulan con 35 ml/litro de H_{2}SO_{4} al 98%.

\text{*} Se añaden 20 g de sacarosa/litro al medio del lote en la fase del fermentador de siembra de 20 litros. Se puede utilizar cualquier método de esterilización conveniente, como cualquier método de eliminación de pirógeno, por ejemplo ultrafiltración. Las vitaminas siempre son esterilizadas por filtración.

Una vez añadido el medio al recipiente, se ajusta a la temperatura de funcionamiento de 30ºC, así como a la mínima velocidad del agitador, típicamente 400-500 rpm. El pH inicial se ajusta con solución de amoníaco (gravedad específica 0,901) utilizando un controlador de pH ajustado a 5,7 \pm 0,2. Asimismo se utiliza H_{2}SO_{4} 2M como agente corrector del pH. Se añaden al recipiente sacarosa hasta 20 g.litro^{-1}, vitaminas del lote MW10, y antiespumante Breox FMT30 hasta 0,04 g.litro^{-1}.

Se introduce aire filtrado estéril en el recipiente a 0,5 v/v/m (es decir 0,5 litros de aire no comprimido por litro de medio por minuto), el medio es inoculado a 12 \pm 2 mg de peso seco celular.litro^{-1} del cultivo del matraz con sacudimiento axénico y se inicia el sistema computarizado MFCS. Una vez completada la fase de crecimiento por lotes (indicada por un incremento de la tensión de oxígeno disuelto >15% en 30 minutos), se inicia la adición del medio de alimentación, bajo el control del sistema MFCS. La estrategia de control es eficazmente la misma descrita más abajo para la fermentación de producción. Durante la fermentación el flujo de aire aumenta en dos etapas con el fin de mantener un flujo de aproximadamente 1 v/v/m. La tensión de oxígeno disuelto (DOT) se controla a un 20% de saturación de aire cambiando la velocidad del agitador. Una vez que la velocidad del agitador no puede ser incrementada más y que la velocidad de flujo de aire ha alcanzado su valor máximo, el algoritmo de control de la alimentación controla el ritmo de alimentación para minimizar la formación de productos de la fermentación. Al final de la alimentación, el cultivo es transferido a un recipiente de producción.

Fermentación de Producción. Se produce un cultivo axénico de la levadura [cirº, pAYE316] mediante alimentación por lotes a un cdw elevado (>80g.litro^{-1}) para la producción de rHA extracelular. Al fermentador de producción, en este ejemplo un fermentador con un volumen de trabajo de 8.000 litros, se inocula el cultivo desarrollado en el fermentador de siembra, cuyo peso celular seco es preferiblemente >80 g.litro^{-1}. La concentración de peso celular seco inicial en el fermentador de producción en la transferencia del cultivo de siembra del fermentador es preferiblemente 0,25-1,00 g.litro^{-1}. Aunque se prefiere iniciar la alimentación en una hora, se puede retrasar si es necesario. Debido a los valores muy bajos de OUR y CER durante la parte inicial de la fase de siembra y los consiguientes errores en su medida, inicialmente se inhabilita el control automático del ritmo de siembra utilizando RQ. Se pretende que el régimen de alimentación minimice la acumulación de etanol y acetato, con el fin de maximizar el rendimiento celular y del producto.

La fermentación se lleva a cabo en un fermentador tal como se muestra en la Fig. 1, diseñado con el fin de producir una disolución de gas y una mezcla en masa óptimas. El recipiente, que es sometido a lavado con NaOH caliente y enjuagado con PFW, contendrá aproximadamente 4.000 litros de MW10 estéril (Tabla 1), sales del lote y elementos traza. Este medio puede ser esterilizado independientemente del recipiente o bien con calor o bien mediante esterilización por filtración. Se ha descubierto según la presente invención que resulta ventajoso que el medio de fermentación, tal como MW10, esté libre de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), o una sal del mismo u otros agentes quelantes metálicos fuertes, puesto que su presencia produce un grado de contaminantes coloreados significativamente mayor en la albúmina producida.

La temperatura de funcionamiento se ajusta a 30ºC, y la velocidad del agitador se regula para que sea suficiente para mantener una solución homogénea, típicamente aproximadamente 50 rpm. El pH inicial se ajusta con solución de amoníaco (SG 0,901) (controlador ajustado a 5,7 \pm 0,2). Se puede utilizar H_{2}SO_{4} 2M como segundo agente corrector del pH. Las vitaminas del lote de MW10 se añaden, como el antiespumante adecuado, según se requiera (v.g. Breox FMT30 a 0,125 g.litro^{-1}).

El aire filtrado estéril es añadido al recipiente a 0,5 v/v/m inicialmente para maximizar la sensibilidad del análisis del gas consumido, y se inicia el sistema computarizado MFCS. El gas consumido es analizado, por ejemplo mediante el uso de un espectrómetro de masas continuo (v.g. un analizador de gas Fisons VG). En el recipiente se inocula la totalidad del cultivo del recipiente de siembra (mínimo 0,4% v/v). Se alimenta MW10 en un volumen igual al volumen del lote. La alimentación se inicia y el control anulado de RQ es incapacitado hasta que los valores de OUR y CER son suficientemente elevados para hacer eficaz el control. El ritmo de alimentación se ajusta manualmente durante el período sin control de RQ si RQ es consecuentemente > 1,2. El ritmo de alimentación se incrementa, vía control computarizado, según el siguiente algoritmo:

Ritmo de alimentación (FR) = ke^{\mu t}

donde k es el ritmo de alimentación inicial, \mu es la tasa de crecimiento exponencial, y t es el tiempo. El valor k es determinado empíricamente como el ritmo de alimentación inicial que es necesario para lograr un ritmo de crecimiento que minimice la acumulación de etanol y acetato. Para este ejemplo, se ha determinado que k tiene un valor de 0,08 ml de medio de alimentación MW10 por minuto por litro de cultivo. El valor \mu hace referencia a la tasa de crecimiento máximo de un organismo completamente respirador, en este ejemplo 0,1 h^{-1}.

t es una contravariable que comienza en 0 (cero) y después aumenta en 1 cada minuto, a menos que RQ >1,2 o DOT <15%. En estos casos, el valor de t se reduce.

El recipiente puede ser sobrepresurizado según sea necesario para intensificar OTR. El cultivo se mantiene durante el tratamiento aguas abajo al final de la alimentación.

Este tiempo de retención se debe mantener en el mínimo, pero se puede prolongar hasta 48 horas y más si fuera necesario. Durante la fase de retención, la temperatura del cultivo es reducida al mínimo posible, típicamente entre 4 y 15ºC, preferiblemente 4ºC, y se deja que DOT caiga al 0%. La alimentación se detiene, la aireación se apaga y la sobrepresión se reduce. El control del pH, sin embargo, se mantiene. Se mantiene una agitación suficiente para conservar las células en suspensión y facilitar la refrigeración y la homogeneidad del pH, preferiblemente a aproximadamente 50 rpm.

Los rendimientos esperados según el procedimiento anterior son: biomasa > 80 g de peso celular seco/litro de cultivo; rHA >1,5 g de monómero/litro de cultivo (determinado mediante SDS-PAGE en relación con el cultivo completo).

Con el fin de preparar una solución de albúmina impura para el tratamiento de purificación según la presente invención cuando la albúmina es rHA, las células del microorganismo se separan del medio de cultivo de fermentación. Si bien se prefiere que las células sean separadas antes de empezar el procedimiento de purificación descrito, esto se puede llevar a cabo simultáneamente a la primera etapa en ciertas condiciones, v.g. en las que la primera etapa de purificación se lleva a cabo en un lecho fluidificado. El cultivo de fermentación, que ha sido enfriado en el fermentador durante la fase de retención a menos de 15ºC sin aireación, es transferido a un tanque en el que es diluido para dar una concentración de biomasa de 180-210 g/kg y enfriado adicionalmente si fuera necesario. El cultivo diluido debe ser retenido durante un período de tiempo tan corto como sea posible sin aireación a temperatura reducida con agitación suficiente para evitar el depósito de células de levadura.

Las células y el sobrenadante se someten a una etapa de separación primaria, por ejemplo microfiltración o centrifugación en cualquier centrífuga apropiada tal como una Alfa Laval BTUX510 con boquilla de descarga continua accionada a 5.700 rpm. El producto centrifugado así producido puede ser filtrado en línea, por ejemplo utilizando un filtro ancho (tamaño de poro 1 \mum), suministrado por Cuno, para separar las células de levadura completas y rotas y otras partículas. Al menos el 75% de la rHA presente en el cultivo diluido es recuperada en una única operación de centrifugación de una sola pasada. Opcionalmente, la suspensión celular de esta operación puede ser resuspendida en agua o tampón y centrifugada de nuevo para proporcionar un segundo producto centrifugado, intensificando de este modo la recuperación de producto. La solución resultante es tratada después mediante el procedimiento de la invención para purificar la albúmina contenida allí como se muestra en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2 Purificación de albúmina según la invención

El producto centrifugado de una fermentación (tal como se describe en el Ejemplo 1), o una solución de albúmina impura de cualquier otra fuente (tal como plasma), se prepara, o acondiciona, para la cromatografía sobre una matriz de intercambio catiónico a la vez que se protege la albúmina de la polimerización (incluyendo octanoato) y de la actividad proteasa (calentando o eligiendo levadura sin niveles perjudiciales de proteasas). Preferiblemente, se añade octanoato de sodio (Solución de Cromatografía 13 (CS13) - Tabla 2) a una concentración final 1-10 mM, por ejemplo aproximadamente 5 mM, para estabilizar la albúmina. El pH es ajustado con ácido acético (CS09) a 4,3-4,8, preferiblemente 4,50 \pm 0,1 (muy preferiblemente \pm 0,05), y se verifica que la conductividad sea <5,5 mS cm^{-1}.

El sobrenadante de cultivo de algunas células o especies huésped contiene proteasas que pueden degradar rHA durante el tratamiento subsiguiente. En tales casos, esta actividad proteasa puede ser destruida mediante tratamiento con calor del sobrenadante de cultivo que contiene rHA. Típicamente es suficiente octanoato de sodio 1-10 mM para proteger la rHA de la desnaturalización por calor, y son adecuados de 30 segundos a 10 minutos a temperaturas de 60-80ºC para inactivar las proteasas. Con posterioridad el sobrenadante puede ser acondicionado adicionalmente como se ha descrito previamente. Si no se encuentra degradación por proteasas, se omite preferiblemente el tratamiento con calor.

Cromatografía

Todas las operaciones se pueden llevar a la temperatura ambiente (20 \pm 5ºC). Las cargas de albúmina (g albúmina/litros de matriz) para las columnas de cromatografía se determinan a partir de títulos de albúmina (g/litro) o bien mediante SDS-PAGE (en el caso de la columna SP-FF) o bien mediante GP-HPLC (para todas las demás columnas). El progreso de cada etapa es controlado midiendo la absorbancia UV en línea, por ejemplo a 254 ó 280 nm.

La secuencia de etapas cromatográficas descrita aquí es novedosa y de la invención en varios aspectos. El uso de una matriz catiónica para la primera etapa de purificación permite que la mayoría de las especies pigmentadas de bajo peso molecular derivadas de la fermentación de la levadura pasen directamente a través de la columna, mientras aquellas que se unen a la matriz se unen débilmente y pueden ser separadas mediante una limpieza con sal de alta fuerza iónica tal como NaCl 1M. De este modo, la matriz catiónica, a diferencia de la matriz aniónica que adsorbe estos tipos de moléculas irreversiblemente, puede ser regenerada y utilizada para múltiples ciclos de cromatografía como la primera etapa de la purificación. Así, esta etapa forma la base de un procedimiento cromatográfico comercial robusto.

El uso de un tipo de columna Cibacron Blue como segunda etapa de este ejemplo es novedoso ya que se utiliza específicamente para separar un fragmento de albúmina de 45 kDa que es muy difícil de separar de la albúmina ya que sus propiedades fisicoquímicas, v.g. tamaño y pI, son similares a los de la molécula intacta. Sorprendentemente, el fragmento se une más fuertemente al tinte que la albúmina en toda su longitud, permitiendo así su separación.

Las soluciones de cromatografía utilizadas durante la purificación de albúmina se detallan en la Tabla 2. Debido a la fabricación a muy gran escala de albúmina, y al coste relativamente bajo del producto, estas sales tampón son las más adecuadas para el procedimiento ya que son asequibles en una forma muy pura a escala industrial y tienen un bajo coste en comparación con otros tampones comúnmente utilizados tales como Tris, HEPES o MOPS. Se podrían utilizar tampones alternativos en lugar de los utilizados en la Tabla 2, por ejemplo tampones de pK_{a} similar (v.g. malato o acetato), pero en la mayoría de los casos el coste y la disponibilidad a gran escala descartan su uso. Se pueden utilizar formas salinas alternativas siempre que sean solubles, asequibles a escala industrial y de bajo coste. Sin embargo, la inclusión de iones tetraborato en CS06 y CS10 es particularmente ventajosa puesto que realiza un papel específico al formar complejos con radicales carbohidrato en macromoléculas y unir a ellos íntimamente grupos aniónicos sobre la matriz. Esto produce un incremento de la pureza de la albúmina en el producto eluido.

La cromatografía se puede realizar utilizando o bien columnas de flujo axial, tales como las asequibles de Pharmacia, o bien utilizando columnas de flujo radial, tales como las asequibles de Sepragen. En este ejemplo, todas las columnas son axiales.

Las soluciones tampón pueden ser preparadas a las concentraciones descritas más abajo, o se pueden preparar soluciones de partida concentradas y mezclarlas o diluirlas en línea para su uso inmediato.

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(Tabla pasa a página siguente)

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Cromatografía de Intercambio Catiónico. Se concentra albúmina y se purifica por lo menos en cuanto a las proteínas de levadura (si la albúmina es rHA de una fermentación de levadura) y otros antígenos, contaminantes de bajo peso molecular y compuestos pigmentados mediante cromatografía de intercambio catiónico. En el método se utiliza una matriz de intercambio catiónico comercial tal como SP-Sepharose FF, SP-Spherosil, CM-Sepharose FF, CM-Cellulose, SE-Cellulose o S-Spherodex. Preferiblemente la matriz es SP-Sepharose FF (Pharmacia) con una altura del lecho de 5 a 25 cm, preferiblemente 10 a 15 cm y en este ejemplo 12,5 cm, con una carga de columna de 10 a 50 g albúmina/litro, preferiblemente 40 \pm 10 g de albúmina/litro de matriz. La matriz se equilibra con un tampón para separar la solución de almacenamiento alcalina; preferiblemente el tampón debe ser suficientemente fuerte para reducir el pH a aproximadamente pH 6,0. Se utiliza un tampón tal como CS10 para separar la solución de almacenamiento CS07 de la columna; no obstante, se puede utilizar cualquier tampón con un pH < 6,0. Se evalúa que el equilibrado se ha completado cuando el pH del eluyente de la columna es aproximadamente pH 6,0.

El producto centrifugado acondicionado se carga después en la columna a una velocidad de flujo, por ejemplo, de 1,0-8,0 cm/minuto, preferiblemente 4,0-7,0 cm/minuto, en este ejemplo, 6,36 cm/minuto, y después la columna se lava con una solución para separar los contaminantes residuales. Esta solución de lavado deberá tener un pH < 6,0 y una conductividad menor de 5 mS cm^{-1}, preferiblemente menos de 3 mS cm^{-1}, para evitar la elución de la albúmina. Una solución adecuada es CS01. Las etapas precedentes se llevan a cabo todas a 6,36 cm/minuto; para la elución y todas las etapas posteriores la velocidad de flujo se reduce a 0,5-5,0 cm/minuto, preferiblemente 2,0-4,0 cm/minuto, en este ejemplo 3,18 cm/minuto, con el fin de reducir el volumen del producto eluido. La elución de la albúmina se efectúa incrementando la fuerza iónica; se utiliza una solución con una conductividad en el intervalo de 5-10 mS cm^{-1}, preferiblemente 6-8 mS cm^{-1}, por ejemplo CS02. La recogida de la albúmina comienza cuando la señal de UV supera 1,0 A_{280}/cm, y la recogida continúa hasta que la señal de UV cae por debajo de 0,6 A_{280}/cm o hasta que se ha recogido un volumen máximo 6,5 veces el volumen de la columna. Después la columna se limpia utilizando CS03 y 04, y después se almacena en CS07.

Cromatografía de Afinidad. En esta etapa se purifica adicionalmente la albúmina con respecto a un fragmento de albúmina N-terminal de 45 kDa, antígenos de levadura (si la albúmina es rHA de una fermentación de levadura) y pigmento. La matriz de afinidad puede comprender cualquier tipo de tinte Cibacron Blue que se una a la albúmina, por ejemplo Reactive Blue 2, Procion Blue HB, Blue Sepharose, Blue Trisacryl y otros compuestos de tipo antraquinona. Preferiblemente, la matriz es la matriz "Delta Blue Agarose®" descrita más abajo. Se ha descubierto que ésta reduce los niveles de lixiviados de Blue generados por la matriz e intensifica la estabilidad alcalina de la matriz para facilitar la limpieza y la separación de los pirógenos. Una mejora adicional de la matriz en comparación con las matrices asequibles comercialmente es la incorporación de un espaciador, 1,4-diaminobutano, entre el tinte (Reactive Blue 2) y la matriz. Se descubrió que ésta era la longitud óptima del espaciador con respecto a la pureza de la albúmina del producto eluido.

Reactive Blue 2 tiene la estructura química representada más abajo.

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Se pueden utilizar el isómero orto, meta o para, o cualquier mezcla de los mismos. El isómero preferido es la forma orto-SO_{3}^{-} pero, como resulta difícil elaborarlo con la pureza deseada, se utiliza el isómero meta. El Reactive Blue 2 aminobutilado se prepara hasta una pureza mínima del 98% del área del pico total según se determina mediante HPLC analítica. Esto se puede lograr o bien utilizando un tinte asequible comercialmente bruto, que necesitará purificación del tinte derivado aminobutilado, o bien utilizando un tinte sintetizado puro. En el último método, la sustancia tinte de partida deberá tener una pureza mínima del 98% mediante HPLC analítica a 280 nm. Semejante sustancia es asequible de ACL, Isle of Man. Reactive Blue 2 se hace reaccionar con 1,4-diaminobutano en agua calentando la mezcla a 60ºC, después de lo cual el tinte transformado es purificado a partir de la mezcla, por ejemplo mediante precipitación. El Reactive Blue 2 aminobutilado es acoplado después a la matriz, por ejemplo a Sepharose CL-6B activada con epiclorhidrina (Pharmacia, Suecia). Ver Porath y col. (1.971) J. Chromatog. 60, 167-177. El contenido en tinte de semejante matriz Delta Blue Agarose (DBA) deberá ser, preferiblemente, de 50 \pm 5 mmoles/g de peso
seco.

Utilización de Blue Matrix. En el método se utiliza DBA a una altura de lecho de 10-30 cm, preferiblemente 20-30 cm (en este ejemplo 25 cm), con una carga de la columna de 7-14 g rHA/litro de matriz, preferiblemente 8-12 g/litro (en este ejemplo 10 \pm 1 g albúmina/litro de matriz); todas las etapas se llevan a cabo a una velocidad de flujo de 0,3-2,0 cm/minuto, preferiblemente 1,0-2,0 cm/minuto, en este ejemplo 1,53 cm/minuto. El DBA es equilibrado en CS01 a partir de CS07; el equilibrado se completa cuando el pH del eluyente de la columna es de aproximadamente pH 9,5. Antes de la cromatografía, el producto eluido SP-FF se ajusta a aproximadamente pH 8,5-9,5, preferiblemente pH 9,0, con amoníaco, y después se carga sobre la columna. Una vez completada la carga, la columna se lava para separar los contaminantes con 1-5 volúmenes de tampón 10-30 mS cm^{-1}, preferiblemente 15-25 mS cm^{-1}, por ejemplo CS12, preferiblemente 5 veces el volumen de la columna. La albúmina se hace eluir utilizando un tampón de elevada fuerza iónica de >100 mS cm^{-1}, preferiblemente 125-165 cm^{-1}, por ejemplo CS03. La recogida el producto eluido se inicia cuando la señal de UV (A_{280}/cm) supera 0,4, y se detiene cuando la señal cae por debajo de 0,4 de nuevo. La columna se limpia después utilizando CS04 y se almacena en CS07.

Ultrafiltración Intermedia. En esta etapa se concentra la albúmina para la cromatografía de penetración en gel. Se utiliza una membrana de tipo celulosa (corte de peso molecular nominal menor de o equivalente a 30.000, por ejemplo 10.000) en un aparato de ultrafiltración para concentrar el producto eluido de DBA hasta una concentración de producto retenido de 20-120 g/litro de albúmina, preferiblemente 80-110 g/litro. Las membranas se tratan, tras el uso, enjuagando la proteína residual con agua, o CS03 o CS05 de la Tabla 3, y lavando con hidróxido de sodio 0,1M. Las membranas pueden ser almacenadas después en hidróxido de sodio 20 mM.

Cromatografía de Penetración en Gel. En esta etapa se purifica la albúmina con respecto a los antígenos de levadura (si la albúmina es rHA de una fermentación de levadura), pigmento y albúmina dimerizada y se realiza una etapa de intercambio del tampón. En el método se utiliza una matriz de penetración en gel comercial tal como Sephadex G100, G150, G250, Sephacryl S-100, S-200 o S-300, Toyopearl HW50S o Superose 6 ó 12. Preferiblemente, la matriz es Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) a una altura del lecho mayor de 60 cm, preferiblemente 90 \pm cm (3 x 30 cm). La columna es equilibrada en CS05 y se hace funcionar a 0,1-1,5 cm/minuto, preferiblemente 0,5-1,0 cm/minuto, en este ejemplo 0,75 cm/minuto; después la columna se carga con albúmina de la etapa de UF intermedia cuando se alcanza un pH 9,5. El volumen de la carga es equivalente a aproximadamente un 2-9% del volumen de la columna, preferiblemente 5-8%, por ejemplo 7,5% del volumen de la columna. La fracción de albúmina se recoge en tres partes: una pequeña cantidad inicial de dímero de albúmina va a los desechos hasta que A_{280}/cm alcanza el 10% de la separación a escala total (FSD) en el tramo de subida; en este punto comienza la recogida de la fracción reciclada y continúa hasta el 90% de FSD y después se recoge la albúmina como la fracción producto primario. Esto continúa hasta que la A_{280} cae directamente al 5% de FSD, después de lo cual la corriente de efluente es dirigida de nuevo a los desechos. Las fracciones reciclada y de producto primario se recogen por separado. Esta etapa se repite hasta que todo el material ha sido cargado en la columna.

Ultrafiltración del Producto Reciclado de S-200 HR. Se utiliza una membrana de tipo celulósico, corte de peso molecular nominal igual a 30.000 o menor, o como se utiliza en este ejemplo de 10.000, en un aparato de ultrafiltración, para concentrar la fracción reciclada reunida hasta una concentración de producto retenido de 20-120 g/litro de albúmina, preferiblemente 80-110 g/litro. Las membranas se tratan, tras el uso como se ha descrito entes en Ultrafiltración Intermedia.

Alternativamente, como en cualquiera de las etapas de ultrafiltración de este procedimiento, se pueden utilizar membranas de polietersulfona o PVDF con un corte de \leq 30.000 en lugar de las membranas de tipo celulosa. Tales membranas son asequibles de Amicon and Millipore. Es preferible utilizar membranas que sean compatibles con NaOH, utilizado para almacenar y enjuagar las membranas.

Purificación del Producto Retenido de la Ultrafiltración de Reciclado de S-200 HR. El producto retenido de la ultrafiltración de reciclado se carga sobre la misma columna utilizada para la purificación primaria con S-200 y una fracción producto recogida de cada pico, que después se mezcla con las fracciones producto primarias en masa recogidas previamente. Esta etapa se repite hasta que todo el material ha sido cargado en la columna.

Cromatografía de Intercambio Aniónico. El propósito de esta etapa es purificar la albúmina al menos con respecto a los antígenos de levadura (si la albúmina es rHA de una fermentación de levadura) y albúmina pigmentada. En el método se utiliza una matriz de intercambio aniónico tal como QMA-Spherosil, DEAE-Spherodex, Q-Hyper D, DEAE-celulosa, QAE-celulosa, o TMAE, DMAE, o DEAE Fractogel. Preferiblemente, la matriz es la matriz de intercambio aniónico comercial DEAE Sepharose-FF (Pharmacia) a cualquier altura de lecho conveniente en el intervalo de 5-25 cm, preferiblemente 10-15 cm, por ejemplo 12,5 cm, con una carga de la columna de 10-60 g de albúmina por litro de matriz, preferiblemente 35 \pm 15 g/litro de matriz. La columna se equilibra primero en un tampón fuerte para bajar el pH al intervalo de trabajo rápidamente, v.g. acetato de sodio pH 4,5-6,0, preferiblemente aproximadamente pH 5,5, por ejemplo CS11. Tras el tampón concentrado, se utiliza una solución de conductividad inferior, esto es, en el intervalo de 1-4 mS.cm^{-1}, preferiblemente 2,5-3,5 mS.cm^{-1}, por ejemplo CS08, para equilibrar la columna antes de cargar la columna con el producto eluido de S200. Se puede utilizar una velocidad de flujo lineal de 1,0-8,0 cm/minuto, preferiblemente 3,0-7,0 cm/minuto, en este ejemplo 4,4 cm minuto^{-1}. Cuando se ha completado la carga, la columna se lava con una solución de tetraborato de sodio en el intervalo de 5-30 mM, preferiblemente 15-25 mM, por ejemplo CS10. Esto hace que cualquier contaminante que contenga carbohidrato se adhiera a la columna más fuertemente antes de la elución de la fracción de albúmina. La elución puede ser efectuada mediante cualquier solución de elevada fuerza iónica en el intervalo de 10-20 mS.cm^{-1}, preferiblemente con CS06. El producto eluido se recoge cuando la A_{280}/cm alcanza 0,4, y continúa hasta que el pico cae a 0,8.

Por tanto, en este ejemplo, la secuencia de las etapas de purificación es: intercambio catiónico, cromatografía de afinidad, ultrafiltración, penetración en gel (con ultrafiltración de la fracción reciclada) e intercambio aniónico.

Se ha descubierto que el producto eluido de la columna DE-FF tiene menos del 0,1% (p/p) de dímero de albúmina y un nivel no detectable de polímeros de albúmina o productos agregados como se analiza mediante GP HPLC utilizando una columna TSK SW3000XL, cargada con 25,0 \mul de producto eluido que contiene 10,0 mg/ml de albúmina.

Ejemplo 3 Formulación de albúmina purificada en un producto final

En este ejemplo se ilustra la concentración, diafiltración y formulación de la albúmina altamente purificada en un producto adecuado, en este caso albúmina al 25% (p/v). Este procedimiento se lleva a cabo en dos fases, esto es ultrafiltración final (UF) y formulación. La UF final comienza con la transferencia del producto eluido de DEAE (ajustado a pH 7,0 \pm 0,3 con ácido fosfórico) al recipiente de alimentación de UF Final y termina una vez que el producto retenido y los lavados, si los hubiera, son transferidos al recipiente de formulación. El flujo del procedimiento que contiene albúmina es sometido sucesivamente a concentración primaria, diafiltración y concentración secundaria en un sistema de ultrafiltración equipado con membranas celulósicas o, más preferiblemente, de polietersulfona con un corte de peso molecular nominal límite de 10.000. La etapa de concentración inicial aumenta la concentración de albúmina aproximadamente a 100 g.litro^{-1} y está inmediatamente seguida de la fase de diafiltración continua en la que la albúmina es diafiltrada frente a al menos 5, preferiblemente al menos 7 equivalentes en volumen del producto retenido de agua para inyectables.

En algunos procedimientos de purificación de la invención, por ejemplo la etapa expuesta en el Ejemplo 7 en la que se utiliza el aminofenilboronato inmovilizado, se pueden encontrar presentes iones amonio en esta fase. Sorprendentemente, los autores de la presente invención han descubierto que estos iones amonio son unidos bastante íntimamente por la albúmina y no pueden ser completamente separados mediante diafiltración frente a agua. Los autores de la presente invención han descubierto que la diafiltración frente a una solución salina es eficaz. Una proporción del 0,5 al 10% p/p de cloruro de sodio con respecto a la albúmina, por ejemplo se puede utilizar del 1,0 al 5,0% o aproximadamente el 3%. La sal se puede añadir al producto retenido de albúmina o, más normalmente, se añadirá al agua de diafiltración. Para una última formulación al 5% (p/v), se puede recuperar una solución de aproximadamente 100 g/litro directamente a partir de la etapa de diafiltración. Para una última formulación al 25% (p/v), se obtiene una solución de aproximadamente 275-325 g/litro tras una etapa de concentración adicional (UF). Finalmente, la solución es transferida al recipiente de formulación del producto a granel.

La etapa de formulación produce albúmina en un entorno químico apropiado y a una concentración apropiada adecuada para la filtración estéril del producto a granel (polivinilideno hidrófilo-difluoruro 0,22 \mum) y la carga. La solución transferida es analizada para determinar las concentraciones de albúmina, sodio y octanoato. Estas cantidades se toman en consideración y se añade cualquier cantidad necesaria adicional de soluciones excipiente de cloruro de sodio y octanoato de sodio de partida y agua de calidad apropiada para lograr la especificación de la formulación a granel. La concentración de albúmina final puede ser de 235-265 g.litro^{-1} (es decir, aproximadamente 25%), con una concentración de sodio de 130-160 mM. Se puede elaborar cualquier otra concentración de albúmina factible, sin embargo, con una concentración mínima de al menos el 4% (p/v), preferiblemente el 4-25% (p/v) por ejemplo. La formulación se completa tras la adición de excipientes farmacéuticamente aceptables convencionales, tales como los especificados en las Farmacopeas de Los Estados Unidos y Europeas para la albúmina humana, y agua de dilución.

Puede ser deseable una concentración final de 0,08 mmoles de octanoato de sodio por gramo de albúmina. El producto es estéril y no pirógeno. Puede haber aproximadamente un 1% (p/p) de albúmina dimérica pero no son detectables polímeros mayores o productos agregados como se analiza mediante GP HPLC utilizando una columna TSK SW3000XL.

Ejemplo 4 Intercambio Catiónico seguido directamente por un intercambio aniónico

En una variación del procedimiento del Ejemplo 2, el orden de las etapas se alteró y se realizaron algunos cambios en las condiciones del procedimiento. Por lo tanto se proporciona una tabla adicional de soluciones cromatográficas, como Tabla 3. Además, todas las columnas cromatográficas excepto la etapa de penetración en gel son de flujo radial.

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La etapa de intercambio catiónico inicial era esencialmente la misma que en el Ejemplo 2, pero con las siguientes variaciones. La longitud del recorrido del flujo en el lecho era de 11,0 \pm 1,0 cm. La cromatografía se llevó a cabo después como sigue.

Se equilibró una columna SP-FF (Pharmacia) con cuatro volúmenes de acetato 10-100 mM, preferiblemente 20-40 mM, por ejemplo 30 mM como en CS20, y la solución de albúmina se cargó a una velocidad de flujo de 0,07 a 0,75 veces el volumen del lecho por minuto, preferiblemente 0,3-0,6, en este ejemplo 0,5 veces el volumen del lecho por minuto. La columna se lavó con ochos volúmenes de acetato 10-100 mM, preferiblemente 30-70, por ejemplo 50 mM (CS21) y después diez volúmenes de CS20 y la albúmina se hizo eluir, y se recogió en tampón acetato/octanoato (por ejemplo acetato 40-120, preferiblemente 60-100 g, v.g. 85 mM, y octanoato 2-50, preferiblemente 2-20, v.g. 5 mM, como en CS23) utilizando una A_{254}/cm de 0,6 y 0,36 para marcar el inicio y el fin de la recogida. La columna se limpia con sal 0,25-3,0 mM y detergente al 0,05-2% (CS24) y después sosa cáustica 0,1-1,0 M (CS25) y se almacena en sosa cáustica diluida (10-50 mM) (CS26). En este ejemplo, la velocidad de flujo para las etapas de equilibrado, carga y lavado es de 0,5 veces el volumen del lecho por minuto. Para la elución de la albúmina, se utiliza una velocidad de flujo de 0,04-0,6 vol. del lecho/ minuto, preferiblemente 0,15-0,35, en este ejemplo 0,25 vol. lecho/minuto. La recuperación anticipada del monómero rHA es entre el 46 y el 66%.

La albúmina se hizo eluir por lo tanto de la columna de intercambio catiónico con una solución de octanoato, logrando una elución bioespecífica novedosa de rHA a partir de un intercambiador catiónico. El pH está próximo al pI de la albúmina de manera que la unión del octanoato ocasiona una diferencia de carga global significativa; por ejemplo, el pH es de al menos 4,5, preferiblemente aproximadamente un pH de 5,5.

El producto eluido del intercambiador catiónico es cargado después directamente (es decir en lugar de después de una cromatografía de penetración en gel como en el Ejemplo 2, pero preferiblemente tras la dilución) en la resina de intercambio aniónico a un pH de 4,5-6,5, preferiblemente a aproximadamente 5,5, y una conductividad en el intervalo de 1,5 a 5,0 mS.cm^{-1}, por ejemplo 2,5 \pm 0,5 mS.cm^{-1}. Se ha descubierto que esto ocasiona que cualquier albúmina dimérica que se haya formado durante la cromatografía de intercambio catiónico se convierta de nuevo en albúmina monomérica en las condiciones de la cromatografía de intercambio aniónico. Se ha logrado un rendimiento de aproximadamente el 110% para el monómero de albúmina a lo largo de esta etapa.

Con más detalle, se pre-equilibra una columna con una longitud de recorrido del flujo del lecho de 11,00 \pm 1,0 cm de DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) con el tampón de elución de intercambio catiónico (CS23) y después se equilibra con un tampón acetato (por ejemplo CS20) antes de ser cargada con 30,0 \pm 10,0 g de albúmina monomérica por litro de matriz.

La columna se lava después con una solución de borato como en el Ejemplo 2 (CS27), se hace eluir como en el Ejemplo 2 (CS06), y se limpia con sal/detergente (CS24), sosa cáustica (CS25) y se almacena en sosa cáustica diluida (CS26) todo como para la columna de intercambio catiónico. La velocidad de flujo para todas las etapas es de 0,07 a 0,75 veces el volumen del lecho/minuto, preferiblemente 0,3-0,6, en este ejemplo 0,5 veces el volumen del lecho por minuto.

El producto eluido de la resina de intercambio aniónico (v.g. DE-FF) todavía contiene impurezas y después se aplica directamente a la matriz de afinidad (v.g. Delta Blue Agarose como se describe en el Ejemplo 2). La altura del lecho se reducía de los 25 cm del Ejemplo 2 a 11,0 \pm 1,0 cm que permitía una velocidad de flujo superior a una presión de funcionamiento normal. Por lo tanto, se prefería una altura del lecho de 11,0 y no afectaba adversamente a la recuperación de la albúmina o la pureza de la albúmina. La columna fue equilibrada en acetato de amonio (100-300 mM, preferiblemente 200-275, por ejemplo 250 mM como en CS29) y la albúmina se aplicaba a 7,0-14,0 g/litro, preferiblemente 8,0-12,0 g/litro, en este ejemplo 10,0 \pm 1,0 g por litro de matriz. Las etapas de equilibrado, carga y lavado se realizaron a velocidades de flujo de 0,05-0,30 veces el volumen del lecho/minuto, preferiblemente 0,15-0,27, en este ejemplo 0,25 veces el volumen del lecho. Todas las demás etapas se realizaron a 0,04-0,30, preferiblemente 0,1-0,25, y en este ejemplo, 0,20 veces el volumen del lecho. El incremento de la velocidad de flujo, facilitado por la reducción de la altura del lecho, mejoraba el rendimiento en un factor de cuatro que es ventajoso para el diseño de una planta a gran escala y está próximo a la capacidad de funcionamiento máxima del DBA. Puesto que este incremento de la velocidad de flujo no parecía afectar adversamente a la recuperación de albúmina o a la pureza de la albúmina, se prefiere utilizar semejante velocidad de flujo superior.

La columna fue lavada con 5 veces el volumen de la columna del tampón acetato de amonio (CS29), y la albúmina se hizo eluir con una solución de sal fuerte y fosfato (NaCl 1,0-3,0 M, por ejemplo 1,5-2,5 M o NaCl 2,0 M, y fosfato 5-100 mM, v.g. 50 mM, como en CS30).

El pH de eluyente en esta variante del procedimiento se cambió de pH 9,2 a pH 7,0. El tampón fue cambiado por consiguiente de acetato de amonio 50 mM a fosfato de sodio 50 mM que era preferido debido a que tamponaba a pH 7,0, y a su coste relativo. El eluyente de pH inferior era responsable de un incremento en la recuperación de monómero de albúmina del producto eluido de DBA. Un pH inferior a 7,0 aumentaba los niveles del fragmento, y por encima de pH 7,0 la recuperación de monómero de albúmina se reducía. El pH, que puede estar en el intervalo de 5,5-9,0, es por lo tanto preferiblemente pH 7,0. La columna se limpió y se almacenó en sosa cáustica (CS25, CS26) como antes.

El producto eluido de DBA (opcionalmente tras la ultrafiltración con una membrana de tipo celulósico (corte de PM nominal 30.000) para dar 80-110 g/litro de albúmina) fue aplicado después a una resina de penetración en gel, por ejemplo S-200 (HR). El tampón de elución S-200 se cambió a fosfato de sodio 40 mM pH 7,0. El octanoato de sodio se omitió de este tampón por razones de coste, y en vez de eso se añadió a la solución antes de la diafiltración (añadido a una concentración 1-20 mM, preferiblemente 5 mM). El fosfato confería una conductividad superior al tampón de elución que mejoraba la pureza. Se puede utilizar una elevada concentración de sal para incrementar la conductividad pero es todavía preferible tamponar la solución. El pH 7,0 era preferible puesto que era el pH deseado para la formulación.

Por tanto, en este ejemplo, la secuencia de las etapas de purificación es: intercambio catiónico (eluyendo con una molécula específicamente unida por la albúmina), intercambio aniónico, cromatografía de afinidad y penetración

\hbox{en
gel.}

La etapa de diafiltración anterior a la formulación puede ser ayudada empezando con la albúmina a pH 7,0. La albúmina estaba más concentrada en el producto eluido final que con el procedimiento del Ejemplo 2, ayudando a la etapa de ultrafiltración final antes de la formulación (Ejemplo 3).

Ejemplo 5 Lavado con alto contenido de sales en el intercambiador catiónico

En una variación adicional del procedimiento, se siguió el procedimiento del Ejemplo 2 ó 4 excepto en lo que sigue. Tras cargar la albúmina sobre la columna de intercambio catiónico (por ejemplo SP-Sepharose FF, Pharmacia), la columna se lavó con CS21 (acetato de sodio 50 mM, pH 3,9-4,1, 0,6-0,8 mS.cm^{-1}), después se lavó adicionalmente con un tampón con elevado contenido de sal conteniendo NaCl 1-3 M, preferiblemente NaCl 2 M, en tampón acetato de sodio (por ejemplo acetato de sodio 10-50 mM, preferiblemente aproximadamente 27 mM, pH 3,5-4,5, preferiblemente pH 4,0) antes del lavado final en CS20. Este procedimiento de lavado más riguroso da como resultado un producto eluido que contiene un nivel más bajo de proteínas distintas de la albúmina y puede ser especialmente útil si la albúmina es rHA de una fermentación de lavadura. La albúmina se hizo eluir como se describe en el Ejemplo 4. La disminución del pH antes del lavado con elevado contenido de sal ayuda a mantener la albúmina en la columna durante el lavado, y el lavado final también maximiza la recuperación de albúmina. Es probable que ninguna etapa tenga un efecto mayor sobre la pureza de la albúmina recuperada.

Ejemplo 6 Elución de borato concentrado del intercambiador aniónico

En este ejemplo, se varió el procedimiento del Ejemplo 2 ó 4 (con o sin la variación del Ejemplo 5) como sigue. El producto eluido de la columna de intercambio catiónico fue diluido a menos de 10 mS.cm^{-1}, preferiblemente menos de 5 mS.cm^{-1}, y después fue cargado sobre una matriz de intercambio aniónico (por ejemplo DEAE Sepharose FF, Pharmacia). La matriz de intercambio aniónico fue lavada después con tampón tetraborato diluido (por ejemplo tetraborato de potasio o tetraborato de sodio 15-25 mM), que tiene el efecto de elevar el pH a aproximadamente 9,2, y después se hizo eluir la albúmina con un tampón tetraborato más concentrado (por ejemplo tetraborato de potasio 80-150 mM, preferiblemente tetraborato de potasio 110 mM). En los Ejemplos 2 y 4, se hizo eluir la albúmina con tetraborato 20 mM, NaCl 100 mM; la elución con tetraborato 80-110 mM (v.g. 33,6 g/litro) da como resultado un producto eluido con un contenido de contaminantes que contienen carbohidratos inferior, por ejemplo glicoproteínas de levadura, debido a un incremento de la afinidad de estas especies por la matriz de intercambio aniónico en estas condiciones.

El tetraborato de potasio se utiliza con preferencia con respecto al tetraborato de sodio debido a su mayor solubilidad a la temperatura ambiente. El producto eluido de la matriz de intercambio aniónico fue tratado como en el Ejemplo 2 ó 4. Por ejemplo, en el procedimiento del Ejemplo 4, era cargado directamente sobre la matriz de afinidad, v.g. Delta Blue Agarose (DBA), que después se hizo mover como en el Ejemplo 4.

Después se llevó a cabo una etapa de penetración en gel como en el Ejemplo 2 ó 4.

Ejemplo 7 Aminofenilboronato inmovilizado

El producto eluido de la matriz de DBA se puede aplicar a un medio de penetración en gel, por ejemplo Sephacryl S-200 (HR) (Pharmacia), equilibrado en tampón acetato de amonio (por ejemplo 10-100 mM, preferiblemente alrededor de 30 mM), conteniendo cloruro de sodio (20-2000 mM, preferiblemente alrededor de 100 mM) y octanoato (octanoato 1-20 mM, preferiblemente alrededor de 5 mM a pH 9,0-9,5, preferiblemente 9,2). Este tampón intercambia eficazmente la albúmina en una solución adecuada para la etapa cromatográfica final, expuesta con más detalle más abajo.

La etapa de S-200 se realiza como sigue. Se hace correr S-200 a una altura del lecho mínima de 90 \pm 3 cm (v.g. 3 x 30 cm en serie). (a) El producto retenido de la ultrafiltración intermedia se carga sobre la columna. Se recogen las fracciones recicladas y producto. Esta etapa se repite hasta que todo el material ha sido cargado en la columna. (b) Las fracciones recicladas reunidas se concentran a 80-110 g de rHA/litro mediante ultrafiltración como antes. (c) El producto retenido de la ultrafiltración del reciclado se carga en la misma columna y se recoge una fracción producto de cada pico. Esta etapa se repite hasta que el material ha sido cargado en la columna. (d) Las fracciones producto de las etapas de cromatografía de penetración en gel primaria y secundaria ((a) y (c)) se reúnen como producto eluido

\hbox{S-200.}

La etapa final consta de una etapa de afinidad para separar los productos glicoconjugados, tales como glicoproteínas y glicolípidos, y poli-, oligo- y monosacáridos. En esta etapa se utiliza ácido aminofenilborónico (PBA) inmovilizado como ligando. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.562.251 (incorporada aquí como referencia) se describen métodos adecuados para elaborar diborotriazin-agarosa y monoborotriazin-agarosa: (1) La triazina es conectada a través del oxígeno a agarosa primero y después conectada con ácido 3-aminofenilborónico (APBA) en una segunda reacción. Si la X de la triazina es remplazada por cloro se produce en ese caso la resina disustituida. (2) La triazina se hace reaccionar con APBA primero para producir o bien mono- o bien diborotriazina. Estas son conectadas a través del O por medio del cloro libre de la triazina a agarosa activada con -ONa para producir agarosa o bien mono- o bien disustituida. En todos los ejemplos y descripciones de esta patente se utiliza agarosa activada con ONa lo que da como resultado enlaces con O.

En una patente anterior de los Estados Unidos 4.269.605 se contempla una variedad de métodos de activación de la matriz, incluyendo la activación de agarosa con epiclorhidrina, preferida aquí. Entre las matrices asequibles comercialmente se incluyen PBA30 de Amicon y aminofenilboronato con borde acrílico de Sigma.

La albúmina recogida de la columna de S-200 fue cromatografiada a través de la matriz de PBA, que había sido pre-equilibrada en tampón de elución S-200 (ver arriba); en estas condiciones, la albúmina no se une apreciablemente a la matriz, mientras los contaminantes con una base carbohidratada se retrasan lo suficiente para separarlos de la albúmina a medida que esta pasa a través de la columna. La cromatografía está por lo tanto en modo negativo con respecto a la albúmina. Los detalles adicionales eran los siguientes:

La matriz de fenilboronato tenía una longitud de recorrido del flujo de 11,0 \pm 1,0 cm y era equilibrada con un tampón que contenía iones amonio (10-50 mM), acetato (10-50 mM) y octanoato 1,0-10,0 mM (v.g. CS36 - ver la tabla más abajo). La columna se cargó después a 35 \pm 15 g de rHA/litro de matriz. El PBA se hace correr como una etapa negativa y por lo tanto el producto recogido es el flujo directo durante la carga y el posterior lavado con el tampón de equilibrado. Todas las etapas cromatográficas se pueden realizar a velocidades de flujo en el intervalo de 0,005-0,3 veces el volumen del lecho/minuto. Preferiblemente el equilibrado y la limpieza de la columna se llevan a cabo a una velocidad de flujo superior, v.g. 0,19 veces el volumen del lecho/minuto, que la carga y la recogida de la solución de albúmina, que se lleva a cabo preferiblemente a una velocidad de flujo de 0,01-0,05, preferiblemente 0,025 veces el volumen del lecho/minuto. Después la columna se limpia con un tampón borato (como en CS37), sal (CS38) y sosa caústica (CS25) y después se almacena en el tampón borato (CS37).

El pH del flujo directo y el lavado recogidos se ajusta a 7,0 \pm 0,1 con una solución de ácido fosfórico (CS35).

Los tampones utilizados son los siguientes:

TABLA 4 Soluciones cromatográficas para el Ejemplo 7

7

Debido al uso de iones amonio en el tampón PBA, es ventajoso utilizar sal en la etapa de ultrafiltración final, como se explica en el Ejemplo 3 anterior.

En un procedimiento particularmente preferido, la secuencia de etapas es la siguiente:

(1)

Fermentación de levadura como en el Ejemplo 1.

(2)

Acondicionamiento del producto centrifugado como en el Ejemplo 2.

(3)

Intercambio catiónico (SP-FF) con elevado contenido de sal, como en el Ejemplo 5, y elución con un compuesto específico para la albúmina, como en el Ejemplo 4.

(4)

Dilución e intercambio aniónico con una elución con tetraborato concentrado como en el Ejemplo 6.

(5)

Cromatografía de afinidad (DBA) como en el Ejemplo 4.

(6)

Ultrafiltración intermedia y después penetración en gel (S-200), con ultrafiltración del producto reciclado, como en el Ejemplo 7.

(7)

Cromatografía en el borato inmovilizado como en el Ejemplo 7.

(8)

Ultrafiltración final y formulación como en el Ejemplo 3.

Ejemplo 8 Uso temprano del fenilboronato inmovilizado

La etapa que implica al fenilboronato inmovilizado puede ser utilizada antes en el procedimiento, por ejemplo en un procedimiento en el que las etapas se ordenan: intercambiador catiónico - intercambiador aniónico - material de afinidad - ultrafiltración/ diafiltración - fenilboronato inmovilizado - penetración en gel.

Las condiciones para cada etapa son como las de los Ejemplos 4 a 7, excepto las siguientes. El producto eluido de DBA se concentra a 80-110 g/litro de albúmina y el pH se ajusta a 9,2 mediante diafiltración (5 volúmenes) frente a un acetato de amonio de la clase utilizada en el Ejemplo 7. El producto eluido de DBA concentrado se somete después a cromatografía sobre PBA y el flujo directo se recoge y se aplica directamente a la columna de penetración en gel (v.g. S200). Como la etapa de penetración en gel es ahora la última etapa, se puede realizar en un tampón que sea adecuado para la etapa de formulación, por ejemplo NaCl 20-130 mM (preferiblemente 50-100 mM), a pH 7,0.

Ejemplo 9 Caracterización de la albúmina producida según la invención

En este ejemplo se ilustra el análisis que se lleva a cabo para establecer la pureza de la albúmina purificada según la presente invención. A menos que se establezca de otro modo, todos los análisis se realizan sobre albúmina que ha sido formulada como se describe en el Ejemplo 3 para rendir el producto final.

Glicación de rHA

En un microanálisis para proteína glicada se ha demostrado que la (rHA) purificada según la invención no es modificada por la glicosilación no enzimática (glicación). En el microanálisis se mide la forma del producto de Amadori (AP) estable de una proteína glicada, mediante oxidación de los grupos hidroxilo C-1 de AP con peryodato. El formaldehído liberado por la oxidación con peryodato se cuantifica mediante conversión en un cromóforo, diacetildihidrolutidina (DDL), mediante reacción con acetilacetona en amoníaco. La DDL es detectada después colorimétricamente a 405 nm.

\newpage

Lote de albúmina	Moles de hexosa/moles de proteína
A		0,092
B		0,116
C		0,090
D		0,132
E		0,060
G		0,04
H		0,01
I		0,07
J		0,07
K		0,05
L		0,740
M		0,70
N		0,96
O		0,78

Los lotes A-K fueron purificados en cuanto a rHA según el Ejemplo 2. Los lotes L-O eran muestras de seralbúmina humana asequible comercialmente de diferentes fuentes. Ocho lotes de rHA purificada según el Ejemplo 7 tenían un nivel insignificante de glicación (0,042 \pm 0,018 moles/mol) en comparación con HSA (0,387 \pm 0,012).

Análisis de los contaminantes de bajo peso molecular

Base lógica - El propósito de este análisis es separar los contaminantes de bajo peso molecular unidos no covalentemente (LMC) de rHA y HSA utilizando disolventes orgánicos ácidos. Se puede producir un cromatograma "de huella dactilar" HPLC para comparar las muestras.

Método - A 100 \mul de producto final (20 mg; rHA o HSA) se añaden sucesivamente 50 \mul de ácido fórmico (98% v/v), 100 \mul de cloroformo y 50 \mul de etanol sometiendo a vórtice después de cada adición. Las muestras se mantienen a la temperatura ambiente durante 5 minutos mezclando regularmente. Después la proteína se hace precipitar mediante la adición de 1 ml de acetona (30 minutos, -20ºC). Las muestras de proteína fueron sedimentadas mediante centrifugación y los sobrenadantes fueron separados por decantación y secados mediante evaporación rotatoria a vacío. Las muestras secas se resuspenden en acetonitrilo al 25%/ácido trifluoroacético al 0,1%. Los LMC se separan después en una columna en fase reversa ABI PTH C18 (220 x 2,1 mm) utilizando un gradiente de acetonitrilo al 10%-90% lineal en ácido trifluoroacético al 0,1% (velocidad de flujo = 300 \mul/minuto). Las muestras fueron verificadas a 214 nm utilizando un monitor Shimadzu UV.

Resultados - Se realizó una comparación entre un lote asequible comercialmente de seralbúmina humana y un lote de rHA purificada según la invención. Se observan dos picos significativos de A_{214 \ nm} en la muestra de la invención (R_{t} = 31,1 y 42,8 minutos respectivamente - ver la Fig. 2 y la Tabla 9). Se piensa que el pico a 2,15 minutos se debe a una sustancia insoluble o parcialmente soluble que pasa a través de la columna, y el pico grande a 56,5 minutos también está presente en el vestigio del blanco de agua y por tanto se considera un artefacto.

TABLA 5 Resultados de los picos

#	Tiempo de Ret. (min)	Area (uV.seg)	Altura (uV)
1	0,800	3459686	219122
2	1,667	418606	33569
3	2,150	77883335	1963630
4	3,000	6293258	122295
5	20,433	297608	14424
6	22,900	205822	14601
7	27,567	150851	10835
8	31,117	2213883	170938

TABLA 5 (continuación)

#	Tiempo de Ret. (min)	Area (uV.seg)	Altura (uV)
9	37,983	164710	15088
10	39,267	347946	29879
11	41,750	107515	8402
12	42,783	2303024	192911
13	43,217	139744	14141
14	43,457	254521	23979
15	50,467	152805	13226
16	50,950	162364	12577
17	56,533	5753796	83674

La HSA asequible comercialmente, por otra parte, tienen muchos más picos (ver Fig. 3 y Tabla 6).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Resultados de los picos

8

9

La calidad de la albúmina de la invención en términos de LMC unidos no covalentemente es claramente superior a la de la HSA clínica. Expresado numéricamente, el área del pico total entre los 10 minutos y los 55 minutos para la albúmina de la invención era de aproximadamente 6,4 V.seg. mientras el área del pico total entre los dos mismos tiempos para el material asequible comercialmente era de aproximadamente 39,7 V.seg.

Se llevó a cabo un análisis similar con la detección a 280 nm, en cuyo caso el área del pico para la albúmina purificada según la invención era de 0,56 V.seg., mientras para la HSA era de 14,9 V.seg.

El análisis de los contaminantes de bajo peso molecular fluorescentes (excitación a 280 nm, detección a 350 nm) revelaba de nuevo un área del pico total para la albúmina purificada mediante el procedimiento de la invención de menos del 10% de la de HSA.

Electroforesis de la zona capilar de rHA y HSA

Se utiliza la electroforesis capilar (CE) como alternativa a la SDS-PAGE normalizada con el fin de comparar cualitativamente la rHA purificada de la invención y la HSA asequible comercialmente. La CE es una técnica electroforética de alta resolución y es capaz de separar sub-poblaciones de la misma proteína cuando sólo se encuentran diferencias minoritarias.

Método - Se separaron muestras de HSA (Armour) y RHA purificada según la invención en tampón PO_{4}/B_{4}O_{7} 20 mM, pH = 7,4 a 20 KeV y 30ºC y fueron sometidas a electroforesis en un ABI 270 CE. La rHA de la invención daba un único pico en el electroforetograma indicativo de su homogeneidad. En contraste, se observaban otros picos en las muestras de HSA asequibles comercialmente. Se cree que estos picos son indicativos de la presencia de moléculas de albúmina por ejemplo, con grupos tiol libres bloqueados o degradación del amino terminal.

Análisis del extremo C

Un importante aspecto del control de calidad de las proteínas recombinantes es la confirmación y la estabilidad de la estructura primaria pre-determinada.

Materiales y métodos

Digestión con tripsina: HSA (de una fuente comercial - una muestra almacenada a -20ºC y una almacenada a 30ºC durante 12 semanas), rHA purificada según la invención (almacenada a 4ºC y 30ºC durante 6 meses) y Des-Leu rHA (una forma truncada de rHA menos la leucina C-terminal) (1 mg de cada una) fueron reducidas con ditiotreitol 5 mM (Calbiochem) durante 120 minutos a 37ºC, después alquiladas con yodoacetamida 10 mM (Sigma) durante 90 minutos a 37ºC en guanidina-HCl 6M en Tris 0,5 M a pH 8,0.

Después las muestras se diluyeron 1 en 3 con H_{2}O y se sometieron a digestión con tripsina durante 48 horas a 37ºC (TPCK tratada con tripsina de Sigma, alícuotas de 3 x 10 \mul de 1 mg/ml de solución añadida a lo largo de 48 horas).

Mapeo Peptídico: Los productos digeridos con tripsina fueron mapeados en una HPLC en fase reversa (RP) en un sistema Gilson HPLC utilizando una columna de 25 cm de Pharmacia SuperPac Pep-S (5 \mum C_{2}/C_{18}). Los eluyentes utilizados fueron A, TFA (ABI) al 0,1% (v/v) en agua; B, TFA en acetonitrilo al 70% (v/v) (Fisons Scientific) - gradiente lineal a lo largo de 60 minutos, 0,5 ml/minuto. Detección UV a 214 nm y 280 nm.

Secuenciación N-terminal: Realizado en un secuenciador de proteínas ABI 477A.

Bombardeo de Átomos Rápidos - Espectrometría de masas: Se realizó la FAB-MS en un VG Autospec mediante M-Scan Limited, Ascot, UK.

Síntesis peptídica: Se sintetizó el péptido tratado con tripsina en el extremo C-terminal en toda su longitud LVAASQAALGL (masa 1012) por medio de ABI, Warrington, UK; y se sintetizó la versión truncada LVAASQAALG (masa 899) por el Department of Biochemistry, University of Nottingham, Nottingham, UK.

Resultados

Se demostró, utilizando el péptido marcador sintético, que el péptido tratado con tripsina en el extremo C-terminal en toda su longitud (masa 1012) eluía a 37,5 minutos en una RP-HPLC. Este pico se recogió y se identificó mediante Secuenciación N-terminal y FAB-MS de HSA y rHA.

La separación de la leucina C-terminal da como resultado un péptido C-terminal truncado (masa 899) que se demostró que eluía a 28,5 minutos, confirmado utilizando el péptido marcador sintético. Este pico fue aislado del producto digerido con tripsina de Des-Leu rHA e identificado mediante Secuenciación N-terminal y FAB-MS. Se demostró que otros dos péptidos estaban presentes en este pico del minuto 28,5, AWAVAR (masa 673) y DLGEENFK (masa 950).

El pico del minuto 28,5 fue recogido mediante RP-HPLC de los productos digeridos con tripsina de HSA, HSA almacenada a 30ºC durante 12 semanas, Des-Leu rHA, rHA de la invención almacenada a 4ºC durante 6 meses y rHA de la invención almacenada a 30ºC durante 6 meses.

El pico de cada producto digerido fue analizado con posterioridad mediante Secuenciación N-terminal y FAB-MS junto con los péptidos marcadores sintéticos.

TABLA 7 Péptidos presentes en el pico de 28,5 minutos mediante Secuenciación N-terminal

Muestra	Secuencia
Des-Leu rHA	LVAASQAALG
	AWAVAR
	DLGEENFK

TABLA 7 (continuación)

Muestra	Secuencia
Patrón HSA	AWAVAR
	DLGEENFK
	+aprox.5% de LVAASQAALG
HSA 30ºC 12 semanas	AWAVAR
	DLGEENFK
rHA 4ºC 6 meses	AWAVAR
	DLGEENFK
rHA 30ºC 6 meses	AWAVAR
	DLGEENFK

Mediante el FAB-MS, las señales principales (iones moleculares (M+H^{+})) presentes en el pico de 28,5 minutos eran las mostradas en la Tabla 8.

TABLA 8 Iones (M+H)^{+} en el Pico de 28,5 minutos

Mezcla de Péptidos C-terminales en	1013-LVAASQAALGL
toda su longitud y truncados	900-LVAASQAALG
Sintéticos
Des-Leu rHA	673- AWAVAR
	900- LVAASQAALG
	951- DLGEENFK
	1028- ?
	1140- ?
Patrón HSA	673- AWAVAR
	900- LVAASQAALG
	951- DLGEENFK
	1028- ?
	1140- ?
rHA 30ºC 6 meses	673- AWAVAR
	900- LVAASQAALG
	1028- ?
	1140- ?
	951- Sin señal

Las señales en 1028 y 1140 pueden ser fragmentos de iones; no había péptidos que pudieran ser detectados por el análisis de la secuencia.

Conclusión

El péptido Des-Leu tratado con tripsina en el extremo C-terminal fue detectado en la HSA comercial a aproximadamente un 5-10% (no cuantitativo), pero no pudo ser detectado en la rHA de la invención, ni siquiera después de 6 meses a 30ºC. El péptido Des-Leu no pudo ser detectado en la HSA de 12 semanas a 30ºC, y el pico para el péptido C-terminal en toda su longitud a 37,5 minutos (aunque no se aislaba) estaba muy disminuido en comparación con las otras muestras, indicando que quizás éste había experimentado una degradación adicional en el extremo C-terminal.

Estos resultados indican que la rHA, purificada según la invención, tiene un extremo carboxi completo y estable, mientras la HSA asequible anteriormente de fuentes comerciales parece ser heterogénea en comparación.

Análisis colorimétrico para tioles libres en albúmina humana purificada

Introducción - El reactivo de Ellman, 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoato) (DTNB), es un medio específico y sensible de detectar los grupos tiol libres tales como Cys-SH. La reacción se puede seguir controlando la absorbancia a 412 nm, cuyo valor puede ser utilizado para calcular el Cys-SH libre, para niveles de menos de un resto por molécula de rHA. En el análisis se utilizan los siguientes reactivos en solución:

5,5'-Ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) DTNB, Producto de Sigma Núm. D8130.

TRIS PRE-SET pH cristales de pH 8,0, Producto de Sigma Núm. T4753.

EDTA, disodio, Producto de Sigma Núm. ED2SS.

Dihidrogenofosfato de sodio dihidratado, calidad Analar.

Hidrogenofosfato de disodio dihidratado, calidad Analar.

Tampón 1: Tris-HCl 0,1M (12,1 g); EDTA Na_{2}.2H_{2}O 0,01M (3,72 g), pH 8,0. Cristales PRE-SET pH. Disolver en 500 ml de agua y llevar a un volumen exacto de 1 litro. Estable durante un mes a la temperatura ambiente.

Tampón 2: Fosfato de sodio 0,05M pH 7,0, Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O (5,45 g), 3,04 g de NaH_{2}PO_{4}.2H_{2}O. Disolver en 500 ml de agua, y llevar a un volumen exacto de 1 litro. Estable durante 1 mes a la temperatura ambiente.

Reactivo: DTNB 0,01M (39,4 mg) en tampón fosfato. Disolver en 10 ml de tampón 2. Preparar fresco cada día.

Muestra: Albúmina diluida a aproximadamente 10,3 \muM en tampón 1 (0,66 mg/ml).

Procedimiento

1) Ajustar el termostato del contenedor celular del espectrofotómetro a 25ºC. 2) Colocar 1,25 ml de muestra en una cubeta y 1,25 ml de tampón 1 en otra cubeta de volumen reducido de 10 mm en las posiciones de la muestra y la referencia respectivamente. 3) Instrumento cero a 412 nm. Ajustar la absorbancia a una Escala Total AU de 0,1. 4) Añadir 50 \mul de reactivo DTNB a la cubeta de referencia, y mezclar brevemente utilizando un agitador de plástico limpio. 5) Añadir 50 \mul de reactivo DTNB a la cubeta de la muestra, y mezclar como antes. 6) Iniciar inmediatamente los datos de adquisición (o encender el registrador gráfico, y seguir la reacción durante 10 minutos). 7) Repetir para cada muestra, para obtener valores por triplicado. 8) Extrapolar de nuevo a partir del debilitamiento de la absorbancia estacionaria a tiempo cero, y leer la absorbancia a 412 nm (\deltaA_{412})(FIG. 1). 9) Calcular el contenido de sulfhidrilo utilizando el coeficiente de extinción molar \varepsilon_{412} = 13,9 cm^{2}mM^{-1}.

Resultados

Un número de muestras de HSA comerciales fue sometido a ensayo en cuanto al contenido en tiol libre, los resultados se resumen más abajo:

HSA	Tiol Libre (moles SH/moles HSA)
1	0,29
2	0,22
3	0,35
4	0,05
5	0,08
6	0,46
7	0,36

Estos valores eran significativamente inferiores que el valor para la albúmina preparada según el ejemplo anterior que es sometido a ensayo rutinariamente a 0,85-0,9 moles de SH/moles de rHA.

Determinación de la contaminación con iones metálicos en albúmina humana mediante espectroscopia en horno de grafito

Los patrones y las muestras son atomizados desde un tubo de grafito pirorrevestido. La absorción atómica de la muestra se detecta utilizando las siguientes condiciones:

\newpage

Ión Metálico	Longitud de Onda nm	Temperatura de atomización ºC
Zn	213,9	1800
Cu	327,4	2300
Fe	248,8	2400
Al	309,8	2500
Mn	279,8	2200

El aluminio fue medido utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer M2100, un horno de grafito Perkin Elmer HGA-700, un aparato automático para la toma de muestras de Perkin Elmer AS-70 con tazas para muestras y una lámpara catódica hueca de aluminio. Los reactivos eran nitrato de magnesio de calidad AR, y una solución patrón de aluminio (1.000 ppm) y ácido nítrico concentrado de calidad AR. Se elaboró una solución de nitrato de magnesio al 1,00% p/v con agua Milli-Q. Se pipetearon 15 \mul de solución patrón de aluminio en el aparato para la toma de muestras automática y se diluyeron hasta 1.500 \mul con solución de ácido nítrico al 0,20%. El procedimiento se repite con 15 \mul de la solución obtenida y después con 150 \mul de la solución obtenida con posterioridad, para dar 10 ppb (\mug/litro) de solución de aluminio.

Una muestra de aluminio se diluye con solución de ácido nítrico al 0,20% para dar una concentración de aluminio dentro de los límites del gráfico de calibración. Normalmente es suficiente una dilución de 1:2.

El magnesio se mide de un modo similar, utilizando un aparato para la toma de muestras automático a la llama de Perkin Elmer AS-51 y una lámpara catódica hueca de magnesio. Una Solución Patrón de Magnesio de 1.000 ppm se diluye con agua Milli-Q para dar soluciones patrón de 0,1, 0,2, 0,5 y 1,0 ppm. La absorción atómica de la muestra se detecta a 285,2 nm.

El cobre, el hierro, el manganeso y el cinc se miden de la misma manera que el aluminio excepto que para el cinc, se utiliza una solución patrón de 1,0 ppb (\mug/litro) en lugar de una solución de 10 ppb. La concentración de iones metálicos fue determinada en ng/litro y después relacionada con la concentración de albúmina (ng de ión metálico/g de albúmina). Estos datos se presentan en la Tabla 9.

TABLA 9 Perfiles de contaminación de la albúmina producida según la invención

Química	Lote A	Lote B	Lote C
Aluminio	-	85	-
Cobre	3720	9080	1780
Hierro	460	810	440
Magnesio	1200	850	800
Cinc	4510	1490	1790
Manganeso	20	191	16

\vskip1.000000\baselineskip

Química	Lote D	Lote E	Lote F	Lote G
Aluminio	-	-	-	-
Cobre	660	2690	440	530
Hierro	930	380	2720	1880
Magnesio	-	-	-	-
Cinc	1580	680	3520	2130
Manganeso	42	14	58	27

Química	Lote H	Lote I	Lote J	Lote K
Aluminio	9	22	86	96
Cobre	520	590	9920	8820
Hierro	1010	670	1030	100
Magnesio	600	<400	2000	2000
Cinc	1740	1040	4280	3520
Manganeso	35	20	46	60

Todos los resultados se expresan como concentración de ión metálico total.

En la Tabla 10 se muestran los niveles correspondientes de iones metálicos en la HSA comercial.

TABLA 10 Concentraciones en ng de metal/g de albúmina

Química	Fuente A (UK)	Fuente B (UK)	Fuente C (Japón)	Fuente D (Japón)
Aluminio	790	970	915	420
Cobre	2020	4510	23840	580
Hierro	41220	15200	23550	15240
Magnesio	4500	500	15000	54000
Cinc	7230	1650	930	4580
Manganeso	940	190	135	240

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\vskip1.000000\baselineskip

Química	Fuente E (UK)	Fuente F (USA)	Fuente G (Francia)
Aluminio	350	3190	155
Cobre	4830	1180	7910
Hierro	7910	25920	1850
Magnesio	1500	500	500
Cinc	1520	3940	2130
Manganeso	160	65	80

Se puede observar que el nivel medio de aluminio en el producto de la invención era de aproximadamente 60 ng/g mientras las fuentes comerciales tenían 155-3190 ng/g. Del mismo modo, el producto de la invención tenía una media de aproximadamente 948 ng/g de hierro (compárese con 1850-41.200 ng/g en el material de la técnica anterior), una media de 2.990 ng/g de cobre (compárese con 580-23.840 ng/g en el material de la técnica anterior), una media de 1.120 ng/g de magnesio (compárese con 500-54.000 ng/g en el material de la técnica anterior), una media de 2.390 ng/g de cinc (compárese con 930-7.230 ng/g en el material de la técnica anterior), y una media de 48 ng/g de manganeso (compárese con 65 a 490 ng/g en el material de la técnica anterior).

Análisis de los ácidos grasos de cadena media y larga

Los perfiles de ácidos grasos de la albúmina según la invención y la HSA asequible comercialmente fueron analizados mediante extracción con disolvente ácido y cromatografía de gases de los ácidos grasos libres utilizando un patrón interno C17:0.

Equipo: Cromatografía de gases (v.g. Shimadzu GC 9A) con detector de ionización a la llama; Autoinyector (v.g. Shimadzu AOC 14); Integrador/Impresora (v.g. Shimadzu CR4A); HP-FFA 30 x 0,53 mm, columna en fase de 1,0 \mum (Hewlett Packard Ltd); estuche Megabore Installation (J & W Scientific 220-1150 para GC 9A) con línea de inyección directa.

Reactivos: Agua (Milli-Q); Dichloromethane Super Purity Solvent (Romil Chemicals, Loughborough, Leics.); Acetato de Sodio Trihidratado Analar (BDH Ltd. Poole); Acido Acético Glacial Analar (BDH Ltd. Poole); Solución de Seralbúmina Humana (Zenalb® 20, Bio Products Laboratory, Elstree, Herts.); Sulfato de Sodio Anhidro (Analytical Reagent); ácidos grasos normalizados de Sigma.

Soluciones

Tampón Acetato de Sodio 0,5 M pH 4,5; Acetato de Sodio 6,13 g y Acido Acético 3,30 g por 100 ml.

Mezclas normalizadas de Acido Graso Libre. Pesar 5 mg de cada ácido graso en viales de vidrio separados. Disolver cada ácido graso en 1 ml de Diclorometano y transferir a tres tubos de cultivo Pyrex de 12 ml respectivamente para los ácidos grasos de cadena corta (C6-C14), de cadena media (C16-C18) y de cadena larga (C20-C22:1). Secar la mezcla en una corriente de nitrógeno y disolver en 1 ml de Diclorometano. Transferir alícuotas de 50 \mul de mezcla a viales de vidrio marcados, secar en nitrógeno, tapar y almacenar a -20ºC.

Solución de Patrón Interno 1 mg/ml de Acido Heptadecanóico (25,0 mg de Acido Heptadecanóico/25 ml de Diclorometano).

Procedimiento

1.

Añadir 50 \mul de Solución Patrón Interna a 6 tubos Pyrex de 40 ml marcados.

2.

Para la rHA al 5% añadir 5 ml de muestra. Para la rHA al 25% utilizar 1 ml de muestra y 4 ml de agua.

Incluir un blanco (5 ml de agua) y muestra de seralbúmina (1,25 ml de Zenalb® 20 y 3,75 ml de agua). Preparar todas las muestras por duplicado.

3.

Añadir 2,5 ml de Tampón Acetato de Sodio, después 10 ml de Diclorometano a todos los tubos.

4.

Colocar los tubos tapados sobre un rodillo mecánico durante 2 horas a la temperatura ambiente.

5.

Centrifugar todos los tubos durante 5 minutos a 3.000 rpm en una centrífuga Sorvall RT6000B a 20ºC.

6.

Separar la fase acuosa superior, después trabajando desde la parte inferior del tubo transferir cuidadosamente la fase de Diclorometano inferior a un tubo Pyrex de 12 ml. Los glóbulos de proteína pueden estorbar la separación de toda la fase de Diclorometano. Si esto ocurre añadir una espátula llena de Sulfato de Sodio Anhidro, tapar y sacudir.

7.

Secar la fase de Diclorometano en una corriente de nitrógeno y almacenar en nitrógeno a -20ºC hasta su análisis.

8.

Instalar la columna capilar y ajustar la cromatografía de gases a las siguientes condiciones según las instrucciones del fabricante:

Detector: Ionización a la llama; Gas Portador:

Nitrógeno a 30 ml.min^{-1}; Volumen de Inyección: 0,5

\mul; Temperatura Inicial de la Columna: 70ºC;

Mantener: 1,5 min.; Gradiente 1: 20ºC min^{-1} a 150ºC;

Gradiente 2: 4ºC min^{-1} a 240ºC; Mantener: 7 min;

Temperatura del Detector: 280ºC; Los Ajustes

Específicos para Shimadzu GC9A son: Intervalo del

Detector: 10º; Presión de Hidrógeno: 0,5 kg/cm^{2};

Presión de Aire: 0,5 kg/cm^{2}; Tiempo de Parada: 50 min.

9.

Ajustar el integrador para recoger los datos de la cromatografía de gases a las instrucciones del fabricante.

10.

Elevar la temperatura del horno a 245ºC y dejarla hasta alcanzar una línea base estacionaria.

11.

Disminuir la temperatura del horno a 70ºC y permitir que se equilibre.

12.

Descongelar una alícuota de los patrones de Acidos Grasos de Cadena Larga, Media y Corta. Disolver los Acidos Grasos de cadena Larga en 1 ml de Diclorometano. Transferir la solución a los Acidos Grasos de Cadena Media y disolver. Repetir para los Acidos Grasos de Cadena Corta.

13.

Inyectar la mezcla normalizada para determinar los tiempos de retención de los ácidos grasos. El cromatograma producido deberá tener colas con picos muy pequeños y deberá tener una línea base suavemente creciente con el número correcto de picos bien resueltos. El Acido Capróico (C6:0) debe eluir con un tiempo de retención de aprox. 6 minutos y el Acido Erúcico (C22:1) con un tiempo de retención de aprox. 33 minutos. Identificar todos los picos mediante comparación con el cromatograma normalizado del ejemplo.

14.

Inyectar las muestras y recoger los datos.

Cálculos

1.

Identificar el pico del patrón interno a partir de las muestras blanco. Este será el pico mayor con un tiempo de retención de aproximadamente 23,5 min.

2.

Calcular las Razones del Area del Pico para todos los picos integrados en todas las muestras utilizando la siguiente fórmula.

Razón del Area del Pico = \frac{Area \ del \ Pico}{Area \ del \ Pico \ del \ Patrón \ Interno}

3.

Identificar los picos de los ácidos grasos en las muestras de rHA y HSA basándose en el tiempo de retención mediante la comparación con los patrones.

4.

Convertir todas las Razones del Area de los Picos en concentraciones aproximadas (\mug/g de albúmina) tanto para las muestras de rHA como de HSA utilizando el siguiente factor:

Concentración (\mug/g) = Razón del Area del Pico x 200

5.

Para los picos identificados como ácidos grasos convertir la Concentración de \mug/g de albúmina en moles/mol de albúmina utilizando el peso molecular del ácido graso y la siguiente fórmula:

Concentración (moles/moles) = \frac{Concentración \ (\mu \ g/g) \ x \ 0,0665}{Peso \ Molecular \ Acido \ Graso}

Los resultados de los ejemplos se presentan para un lote de albúmina preparado según el Ejemplo 2 (Fig. 4) y HSA comercial (Fig. 5). No se han detectado ácidos grasos anómalos en la primera mediante este método aunque los perfiles para las dos proteínas mostraban diferencias significativas. Como se esperaba, ambas mostraban grandes cantidades del estabilizador añadido, octanoato (C8:0). Aparte de esto, la HSA comercial se caracterizaba en su mayor parte por C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 y C18:2 predominantemente mientras la albúmina de la invención contenía principalmente C10:0, C12:0, C16:1 y ocasionalmente C14:0. Experimentos adicionales mostraban que los niveles de C10:0 y C12:0 en el producto final de rHA se correspondían con los niveles de estos contaminantes en el octanoato utilizado para las fases tardías del procedimiento de purificación.

Los datos para la rHA producida según el Ejemplo 7 son los siguientes:

TABLA 11 Comparación de la composición de ácidos grasos de rHA purificada según el procedimiento de la invención y la HSA comercial

Contenido de ácidos grasos (moles/moles de proteína)
Ácido graso	rHA	HSA
C10:0	0,100	0,005
C12:0	0,020	0,011
C14:0	0,005	0,017
C16:0	0,013	0,152
C16:1	0,064	0,023
C18:0	0,002	0,024
C18:1	0,012	0,145
C18:2	ND	0,089
C18:3	ND	0,006
C20:0	ND	0,001
C20:1	ND	0,001
C20:2	ND	ND
C20:4	ND	0,006
Total	0,216	0,480
ND = No detectado.

Preferiblemente, el nivel total de ácidos grasos no excede el 1,0% (moles/moles) del nivel de octanoato, y preferiblemente no excede el 0,5% de ese nivel. Por otra parte, en la albúmina de la invención, el nivel de ácidos grasos C18:2, C18:3 y C20 es generalmente indetectable. En la HSA comercial, puede haber típicamente alrededor de 0,4 moles de ácidos grasos C10 a C20 por mol de albúmina. En el producto de la invención, no hay típicamente ácidos grasos C20 detectables y sólo alrededor de 0,01 a 0,02 moles de ácidos grasos C18 por mol de albúmina.

Análisis de Color - Se midió la absorbancia de una solución al 5% (p/v) del producto final en una cubeta de 1 cm a 350 nm, 403 nm y 500 nm y se calculó en términos de la absorbancia por gramo de albúmina/litro por cm de longitud del recorrido (es decir A litro.g^{-1}.cm^{-1}). La albúmina de la invención tiene los siguientes valores:

Longitud de Onda (nm)	Absorbancia media (n=10 lotes) (litro.g^{-1}.cm^{-1})
350	4,74 x 10^{-3}
403	2,12 x 10^{-3}
500	0,58 x 10^{-3}

Generalmente, la albúmina de la invención no excede de absorbancias respectivas de 6,0 x 10^{-3}, 2,5 x 10^{-3} y 0,75 x 10^{-3} a las tres longitudes de onda mencionadas.

Los análisis de numerosas preparaciones de HSA asequibles comercialmente revelaron absorbancias superiores a estas longitudes de onda (ver la Tabla 12).

TABLA 12 Absorbancia (litro-g^{-1}.cm^{-1}) de preparaciones de HSA de la técnica anterior

Muestra	A_{350}	A_{403}	A_{500}
1	9,95	4,10	0,8
2	9,25	5,36	1,1
3	7,40	3,26	0,6
4	7,20	3,60	0,6
5	8,68	4,08	0,8
6	11,45	6,26	1,2
7	7,20	3,70	0,8
8	6,82	4,78	1,8

Electroforesis en gel de poliacrilamida reductora con SDS- Este análisis se realizó para demostrar que rHA consta de una única cadena polipeptídica que cuando es tratada con un agente reductor (\beta-mercaptoetanol) migra en forma de una única banda (monómero) en la electroforesis en poliacrilamida reductora con SDS (PAGE).

Las muestras de albúmina fueron hervidas en tampón reductor con SDS (Tris-HCl 20 mM pH 8,0 conteniendo EDTA 2 mM, SDS al 5% (p/v) y \beta-mercaptoetanol al 10% (v/v) con la albúmina a 1 mg/ml, y después separadas sobre Phastgels (12,5%) homogéneos de SDS (Pharmacia), utilizando una carga de 1 \mul de la solución. Las bandas de proteína fueron detectadas por medio de tinción con Azul de Coomassie R250, barridas en un densitómetro Shimadzu CS9000. La separación de la albúmina mostró una única banda de tinción de Coomassie que es indicativa de que la proporción de albúmina presente en el monómero es del al menos el 99,9%.

Cromatografía de líquidos a alta presión de penetración en gel

Se inyectan 25 \mul de una solución de 10 mg/ml de la albúmina del producto eluido de la matriz de intercambio aniónico en la realización principal del procedimiento de la invención (es decir donde la etapa de intercambio aniónico es la etapa final antes de la ultrafiltración y la formulación) en una columna TSK3000SWXL en una Shimadzu LC6A HPLC. Se encontró que el producto era monomérico al menos en un 99,9%.

Se sometieron a análisis 25 \mul de una segunda solución de 10 mg/ml de albúmina purificada según la invención que había sido formulada al 25% p/v de la misma manera y se encontró que contenía menos del 0,1% de albúmina polimérica. Este resultado indica que la formulación descrita aquí no tiene efecto sobre el contenido de polímero/producto agregado de la albúmina purificada.

Electroforesis en gel bidimensional

Se sometieron 2 \mug de albúmina rHA preparada mediante el procedimiento de la invención a electroforesis bidimensional utilizando un sistema Millipore Investigator. La separación en la primera dimensión era en un gel de enfoque isoeléctrico de pH 3-10 y estaba seguido de un gel de poliacrilamida/SDS al 10% en la segunda dimensión. Al teñir el gel con Azul de Coomassie, sólo era visible una mancha, indicando la presencia de una sola especie de proteína.

Espectrometría de masas por electropulverización

Se realizó una espectrometría de masas por electropulverización (ESMS) utilizando un espectrómetro de masas por electropulverización VG Quattro, calibrado con mioglobina de corazón de caballo (1695 Da, obtenida de Sigma) a lo largo de un intervalo de 950-1750 Da/e. Las muestras de HSA asequible comercialmente y de rHA purificada según la invención fueron sometidas a eliminación de las sales antes del análisis mediante HPLC en fase reversa utilizando un gradiente de acetonitrilo conteniendo ácido trifluoroacético. Las Figuras 6a y 6b muestran los espectros para la albúmina de la invención y la HSA de la técnica anterior, respectivamente. El último muestra picos que representan la degradación del tiol libre y el extremo N-terminal.

Se puede observar que la albúmina de la invención es homogénea en este análisis, en otras palabras muestra un único pico definido, que se presenta a una masa de aproximadamente 66.441 Da.

Estabilidad a largo plazo

A lo largo de dos años, no es detectable degradación de la albúmina mediante métodos electroforéticos, lo que muestra que no se encuentra presente actividad proteasa.

Claims (12)

1. Una preparación de albúmina en la que la albúmina tiene un nivel de glicación de menos de 0,6 moles de hexosa/moles de proteína y la preparación tiene un único pico en un electroforetograma de la zona capilar.

2. Una preparación de albúmina según la Reivindicación 1, donde la albúmina tiene una o más de las siguientes características:

(a)

un contenido de iones aluminio de menos de 150 ng; un contenido de iones hierro de menos de 3.000 ng; un nivel de iones cobre de menos de 10.000 ng; un nivel de iones magnesio de menos de 3.000 ng; un nivel de iones cinc de menos de 5.000 ng; o un nivel de iones manganeso de menos de 50 ng (todos basándose es un gramo de albúmina);

(b)

al menos un 99,5% de la albúmina es monomérica mediante el método de PAGE reductora con SDS;

(c)

un nivel de contaminantes de bajo peso molecular por debajo de 20 V.seg.;

(d)

un extremo C-terminal y N-terminal intactos, es decir homogéneos;

(e)

un contenido de tiol libre de al menos 0,85 moles SH/moles de proteína;

(f)

y no más de 0,3 moles/mol de ácidos grasos C10 a C20 y sustancialmente sin ácidos grasos C18 o C20; o

(g)

una absorbancia de no más de 6,0 x 10^{-3}, 2,5 x 10^{-3}, 0,75 x 10^{-3} por gramo de albúmina/litro por cm de longitud de recorrido (A L.g^{-1}.cm^{-1}) cuando se mide a 350 nm, 403 nm y 500 nm, respectivamente.

3. Una preparación de albúmina según la reivindicación 1 ó 2 donde la albúmina tiene una o más de las siguientes características:

(a)

un contenido de iones aluminio de menos de 100 ng; un contenido de iones hierro de menos de 1.000 ng; un nivel de iones cobre de menos de 5.000 ng; un nivel de iones magnesio de menos de 1.500 ng; un nivel de iones cinc de menos de 3.000 ng (todos basándose es un gramo de albúmina);

(b)

un nivel de glicación de menos de 0,15 moles de hexosa/moles de proteína; o

(c)

un nivel de contaminantes de bajo peso molecular por debajo de 10 V.seg.

4. Una preparación de albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la albúmina tiene un nivel de menos de 0,05 moles de hexosa/moles de proteína.

5. Una preparación de albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el 99,9% de la proteína de la preparación es albúmina.

6. Una preparación de albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la albúmina es albúmina recombinante.

7. Una preparación de albúmina según la reivindicación 6 donde la albúmina es producida por levadura.

8. Una preparación de albúmina según la reivindicación 7 donde la levadura pertenece a uno cualquiera de los siguientes géneros: Saccharomyces, Pichia o Kluyveromyces.

9. Una preparación de albúmina según la reivindicación 8 donde la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

10. Un vial que contiene una solución al 4-25% p/v de una preparación de albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es estéril y no pirógena y está formulada para la administración intravenosa.

11. Una formulación de una proteína terapéutica y una preparación de albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

12. Un medio para desarrollar células eucariotas superiores, que comprende una preparación de albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.