JP2003048900A - 高純度アルブミンの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】色素、金属イオン、ヒトタンパク質、宿主タン
パク質、アルブミンの断片、アルブミンの重合体または
凝集物とウイルスをほとんど含まず、本質的にグリケー
ト化されていなくて、遊離チオールが比較的多く、完全
なＣ末端を有した、アルブミンの製造方法を提供する。 【解決手段】ポジティブモードで陽イオン交換に続けて
陰イオン交換クロマトグラフィーに（好ましくは、形質
転換酵母により発現および分泌された）アルブミンを通
すことを特徴とする。他のステップ、例えば限外ロ過、
ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグ
ラフィー（青色色素を用いてアルブミンを結合させる
例、およびアミノフェニルボロン酸樹脂を用いて混入物
質を結合させる例を示す）用いてよい。アルブミンに特
異的親和性のない材料から、アルブミンに親和性のある
化合物によるアルブミンの溶出も、カウンターイオンに
よるアンモニウムイオンの除去の例を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、血清から抽出されたタンパク質
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはヒト血清アルブ
ミンのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドコード配
列で微生物を形質転換することにより製造される組換え
ヒトアルブミン（ｒＨＡ）を精製することに関する。こ
の明細書において、“アルブミン”という用語は一般的
にＨＳＡおよび／またはｒＨＡのことを指す。

【０００２】アルブミンは重篤な熱傷、ショックまたは
失血のある患者を治療するために用いられる。しかも、
それは高等真核細胞を増殖させるために用いられる培地
を補うためと、治療用タンパク質の処方で賦形剤として
用いられる。現在、製品としての要求は、ヒト血液から
抽出されたアルブミンで満たされている。抽出および分
離技術の例には：陽イオン交換剤の使用に関するＪＰ０
３／２５８７２８；陰イオン交換に続いて陽イオン交換
の適用に関するＥＰ４２８７５８；加熱、塩分添加およ
びダイアフィルトレーションの適用に関するＥＰ４５２
７５３で開示されたものがある。

【０００３】微生物によるｒＨＡの生産はＥＰ３３０４
５１およびＥＰ３６１９９１に開示されている。ｒＨＡ
の精製技術は、マトリックス由来色素の除去に関するＷ
Ｏ９２／０４３６７；酵母由来着色の除去に関するＥＰ
４６４５９０；アルカリ沈降の後で、アルブミンに特異
的親和性を有する親油相へのｒＨＡの適用に関するＥＰ
３１９０６７に開示されている。

【０００４】本発明は高度に精製されたアルブミンを提
供する。

【０００５】本発明の一面では、アルブミンを精製する
ための方法であって、アルブミンが特異的親和性を有し
ていないクロマトグラフィー材料に比較的不純なアルブ
ミン溶液を適用してアルブミンがその材料に結合し、ア
ルブミンに特異的親和性を有する化合物の溶液を適用す
ることによりその材料から結合アルブミンを溶出させる
ステップを含む方法を提供する。好ましくは、クロマト
グラフィー物質は、後で例２に示されるようなＳＰ‐Se
pharose ＦＦ、ＳＰ‐Spherosilなどのような陽イオン
交換体である。アルブミンに特異的親和性を有する化合
物は、オクタノエート（例えば、オクタン酸ナトリウ
ム）、他の長鎖（Ｃ_６〜Ｃ_２２）脂肪酸、サリチレー
ト、オクチルスクシネート、Ｎ‐アセチルトリプトファ
ンまたはこれらのうち２種以上の混合物がある。

【０００６】本発明の第二面では、アルブミンを精製す
るための方法であって、アルブミンが陽イオン交換物質
に結合される陽イオン交換クロマトグラフィーと、アル
ブミンが陰イオン交換物質に結合されるその後の陰イオ
ン交換クロマトグラフィーにアルブミン溶液を付すステ
ップを含む方法を提供する。

【０００７】陽イオン交換物質から溶出されたアルブミ
ンは、その後で、上記陰イオン交換クロマトグラフィー
に付される前に、１回以上のアフィニティクロマトグラ
フィー、限外ロ過およびゲル浸透により処理してもよ
い。このため、好ましい態様において、その方法は： （ａ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件
下で、アルブミン溶液を陽イオン交換マトリックスに通
す； （ｂ）アルブミン含有陽イオン交換溶出液を上記マトリ
ックスから溶離させる； （ｃ）アルブミン結合性化合物を含んでなるアフィニテ
ィマトリックスに上記溶出液を通す； （ｄ）上記マトリックスからアルブミン含有アフィニテ
ィマトリックス溶出液を溶離させる； （ｅ）場合により限外ロ過後に、上記溶出液をゲル浸透
マトリックスに通してアルブミンに富むフラクションを
得る； （ｆ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件
下で、上記のアルブミンに富むフラクションを陰イオン
交換マトリックスに通す；および （ｇ）上記陰イオン交換マトリックスから、精製された
アルブミン含有産物を溶離させる、ステップを含む。

【０００８】一方、陽イオン交換物質から溶出されたア
ルブミンは、（希釈以外の）いかなる中間処理もなし
に、上記陰イオン交換物質に適用してもよい。このた
め、第二の好ましい態様では： （ａ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件
下で、アルブミン溶液を陽イオン交換マトリックスに通
す； （ｂ）アルブミン含有陽イオン交換溶出液をそのマトリ
ックスから溶離させる； （ｃ）アルブミンがマトリックスと結合するような条件
下で、陽イオン交換溶出液を陰イオン交換マトリックス
に通す； （ｄ）陰イオン交換マトリックスからアルブミン含有陰
イオン交換溶出液を溶離させる； （ｅ）アルブミン結合性化合物を含んでなるアフィニテ
ィマトリックスに陰イオン交換溶出液を通す； （ｆ）そのアフィニティマトリックスからアルブミン含
有アフィニティマトリックス溶出液を溶離させる； （ｇ）そのアフィニティマトリックス溶出液をゲル浸透
マトリックスに通してアルブミンに富むフラクションを
得る、ステップを含む、アルブミンを精製するための方
法を提供する。

【０００９】好ましくは、陽イオン交換ステップ前に、
アルブミン溶液は、オクタノエートおよび／または他の
アルブミン安定剤（例えば、ナトリウムアセチルトリプ
トファネート）をそれに約１〜１０ｍＭの最終濃度まで
加えて、ｐＨを約４．０〜５．０に調整することにより
調節される（conditioned）。

【００１０】有利には、陽イオン交換ステップに留めら
れたアルブミンは、溶離される前に、高塩溶液（例え
ば、１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜４０ｍＭ、例
えば２７ｍＭ酢酸ナトリウムでｐＨ４．０に緩衝化され
た０．５〜２．０Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄される。

【００１１】好ましくは、陽イオン交換溶出液が陰イオ
ン交換体に直接通されるプロセスにおいて、アルブミン
は、アルブミンに特異的親和性を有した化合物、特に酸
またはその塩、例えばオクタノエートまたはいずれか他
の長鎖（Ｃ_６‐Ｃ_２２）脂肪酸、サリチレート、オクチ
ルスクシネートまたはＮ‐アセチルトリプトファンを含
有した緩衝液を用いて、陽イオン交換ステップで溶離さ
れる。

【００１２】適切には、アルブミンは、高レベル（例え
ば、少くとも５０ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭ、
例えば８０〜１５０ｍＭ）のホウ酸塩、例えばテトラホ
ウ酸ナトリウムまたはカリウムを含有した緩衝液で陰イ
オン交換体から溶離される。次いで、本発明により精製
されたアルブミンは、中間プロセスステップと共にまた
はそれなしで、複合糖質および糖類、例えばアミノフェ
ニルボロン酸（aminophenylboronic acid）（ＰＢＡ）
と選択的に結合する固定された化合物を含有する樹脂で
クロマトグラフィーに付される。

【００１３】アフィニティクロマトグラフィーを伴う本
発明のいかなるプロセスにおいても、アフィニティクロ
マトグラフィーでは、好ましくはα，ω‐ジアミノ置換
を有したスペーサー、例えば１，４‐ジアミノブタン、
またはＣ_１‐８、好ましくはＣ_１‐６、例えば
Ｃ_１‐５、最も好ましくはＣ_４長の別なスペーサーを介
して、好ましくは樹脂に固定化された、Cibacron Blue
タイプの色素のような、固定されたアルブミン特異性色
素を含んでなる樹脂を用いることが好ましい。意外に
も、本発明者らは、このような色素が全長アルブミン分
子よりも、実際にはＨＡ分泌微生物の培養で生産するこ
とができる４５ｋＤアルブミン断片の方に大きな親和性
を有していることを見出した。４５ｋＤ断片は典型的に
は１‐４０３〜１‐４０９領域からなり、Sleep et al
(1990) Bio/Technology 8,42-46 およびＷＯ９５／２３
８５７に開示されている。

【００１４】本発明の方法により調製された精製アルブ
ミン溶液は、その意図した用途に従い更に加工処理して
もよい。例えば、それは少くとも約８０ｇアルブミン／
ｌのアルブミン濃度を有する限外ロ過保留液（retentat
e）を得るために限外ロ過膜で限外ロ過し、限外ロ過保
留液は保留液の少くとも５倍相当の水に対してダイアフ
ィルトレーションしてもよい。あるクロマトグラフィー
ステップ、例えば固定化されたアミノフェニルボロネー
トを使うステップには、アンモニウムイオンを含有させ
ておくことが有利である。意外にも、本発明者らはこの
ようなアンモニウムイオンが比較的強くアルブミンに結
合されることを発見した。このようなアンモニウムイオ
ンはアルブミンから除去されることが好ましく、本発明
者らはこれがカウンターイオン（counter-ion）の使用
により果たせることを発見した。アルブミンをカウンタ
ーイオンに暴露させたいという望みは、従来のプロセス
ではアンモニウムイオンが関与していないことから当業
者に生じるはずがなく、アンモニウムイオンがアルブミ
ンにより結合されると思いつく理由はなかった。

【００１５】したがって、本発明の別な面では、アンモ
ニウムイオンがアルブミンから離されて、溶液から除去
されるように、カウンターイオンの溶液にアルブミン溶
液を暴露させることを含む、アルブミン溶液を精製する
ための方法を提供する。

【００１６】カウンターイオン（好ましくは、ナトリウ
ムイオンのような金属イオン）がアルブミン溶液に加え
られて、アンモニウムイオンは透析により除去される
か、またはアンモニウムイオンはカウンターイオンの溶
液からアルブミンを分離させる半透膜でダイアフィルト
レーションされるか、またはそれらはゲル浸透クロマト
グラフィーにより除去することができる。保留液の少く
とも５倍容量の５０ｍＭ塩化ナトリウムに対するダイア
フィルトレーションが通常適切である。

【００１７】得られたアルブミンは、着色料（coloran
t）、乳酸（lactate）、クエン酸（citrate）、金属、
ヒトタンパク質、例えば免疫グロブリン、プレカリクレ
インアクチベーター、トランスフェリン、α_１‐酸糖タ
ンパク質、ヘモグロビンおよび血液凝固因子、原核性タ
ンパク質、アルブミンの断片、アルブミン凝集物または
ポリマー、内毒素、ビリルビン、ヘム、酵母タンパク質
およびウイルスが極端に低レベルであるか、または本質
的に含まないことがわかった。“本質的に含まない”と
は、検出可能レベル未満を意味する。本明細書で用いら
れる“着色料”という用語は、アルブミンを着色する任
意の化合物を意味する。例えば、色素（pigment）は組
換えアルブミンを製造するために用いられる生物、特に
酵母から生じる着色料であるが、染料（dye）はアルブ
ミンを精製するクロマトグラフィーステップから生じる
着色料である。本発明のプロセスにより精製されたアル
ブミン調製物中において、少くとも９９重量％、好まし
くは少くとも９９．９重量％のタンパク質はアルブミン
である。このような高純度アルブミンが有害な副作用を
引き起こす見込みは少ない。

【００１８】本発明のプロセスにより生産された本発明
アルブミンは、還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによると少くとも
９９．５％モノマー、好ましくは実質的に１００％モノ
マーであることがわかり、下記特徴のうち１または２以
上で特徴付けられる。それは、１５０ｎｇ未満、好まし
くは１００ｎｇ未満のアルミニウムイオン含量；３，０
００ｎｇ未満、好ましくは１，０００ｎｇ未満の鉄イオ
ン含量；１０，０００ｎｇ未満、好ましくは５，０００
ｎｇ未満の銅イオンレベル；３，０００ｎｇ未満、好ま
しくは１，５００ｎｇ未満のマグネシウムイオンレベ
ル；５，０００ｎｇ未満、好ましくは３，０００ｎｇ未
満の亜鉛イオンレベル；５０ｎｇ未満のマンガンイオン
レベル（すべてアルブミン１ｇに対して）；ヘキソース
０．６未満、好ましくは０．１５未満（更に好ましくは
０．０５未満)モル／モルタンパク質のグリケーション
(glycation)レベル；後記例９のように測定すると、２
０Ｖ.sec未満、好ましくは１０Ｖ.sec未満の低分子量混
入物質（contaminants）レベル；キャピラリーゾーン電
気泳動図で単一ピーク；完全な（intact）、即ち同質の
（homogeneous）Ｃ末端およびＮ末端；少くとも０．８
５モルＳＨ／モルタンパク質の遊離チオール含量；およ
び０．３mol/mol以下のＣ１０〜Ｃ２０脂肪酸を有して
いて、実質的にＣ１８またはＣ２０脂肪酸を有しない。

【００１９】出発材料はアルブミン含有発酵培地でもよ
いし、または不純アルブミン溶液はこの５０年間かけて
開発されてきた多数の抽出および精製技術、例えばStol
tz et al (1991) Pharmaceut.Tech.Int.,June 1991, 60
-65 および More & Harvey (1991) "Blood Separation
and Plasma Fractionation" , Ed. Harris, Wiley- Lis
s,261-306に開示された任意のものにより血清から得ら
れた溶液であってもよい。

【００２０】特にアルブミンがプロテアーゼ欠損酵母ま
たは他の生物で生産されたｒＨＡである場合、そのプロ
セスには（ＥＰ４２８７５８およびＥＰ６５８５６９と
は異なり）精製プロセスの一部として熱処理ステップを
通常含んでいない。同様に、それが（ヒトよりむしろ）
微生物から製造されるならば、最終低温殺菌ステップ
（典型的には６０℃で１時間）を通常要しない。

【００２１】最終生成物は、それに安定性を付加するよ
うに処方してもよい。好ましくは、本発明の高純粋アル
ブミン製品は少くとも１００ｇ、更に好ましくは１ｋｇ
または１０ｋｇのアルブミンを含有しており、これは多
数のバイアルに分けてもよい。本発明の方法は血清のよ
うないくつかの供給源による不純アルブミン溶液からも
っと精製されたアルブミンを得るために利用することも
できるが、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）を精製する
上で特に適用しうる。本発明により生産されるアルブミ
ンはラット、ウシまたはヒツジアルブミンのようないか
なる哺乳動物アルブミンであってもよいが、好ましくは
ヒトアルブミンである。アルブミンをコードするＤＮＡ
はアルブミンを生産するために適切な宿主で発現され
る。従って、ＤＮＡが発現ベクターを作るために公知の
技術に従い用いられ、その後でそれがアルブミンの発現
および生産向けに適した宿主細胞を形質転換させるため
に用いられる。このような技術には、ＥＰ‐Ａ‐７３６
４６、ＥＰ‐Ａ‐８８６３２、ＥＰ‐Ａ‐２０１２３９
およびＥＰ‐Ａ‐３８７３１９に開示されたものがあ
る。細菌（例えば、E.coliおよびBacillus subtili
s）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Pichi
a pastoris およびKluyveromyces lactis）、糸状菌
（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞および
昆虫細胞を含めた多くの発現系が知られている。好まし
い微生物は酵母Saccharomyces cerevisiaeである。

【００２２】本発明の実施にとり有用とする酵母につい
て例示される属は、Pichia（Hansenula）、Saccharomyc
es、Kluyveromyces、Candida、Torulopsis、Torulaspor
a、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、D
ebaromyces、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucos
poridium、Botryoascus、Sporidiobolus、Endomycopsis
などである。好ましい属は、Pichia（Hansenula）、Sac
charomyces、Kluyveromyces、YarrowiaおよびHansenula
からなる群より選択されるものである。Saccharomyces
spp.の例はS.cerevisiae、S.italicusおよびS.rouxiiで
ある。Kluyveromyces spp.の例はK.fragilisおよびK.la
ctisである。Pichia（Hansenula）の例はP.angusta（以
前はH.polymorpha）、P.anomala、P.pastorisおよびP.c
apsulataである。Y.lipolyticaは適切なYarrowia種の例
である。

【００２３】１または２種以上のプロテアーゼに欠く酵
母株を用いることが有利である。このような株には、Wo
olford et al (1993) J.Biol.Chem.268,8990-8998；Cab
ezonet al (1984) P.N.A.S.81,6594-6598；ＥＰ‐Ａ‐
３２７７９７およびJones etal (1982)Genetics 102,66
5-677のように、周知のｐｅｐ４‐３変異体と、ＰＲＡ
１および／またはＰＲＢ１遺伝子に変異を有する株等が
ある。一方、発酵培地中にあるプロテアーゼは加熱によ
り不活化してもよい。プロテアーゼの存在は全プロセス
にわたってアルブミンの収率を減少させる。

【００２４】好ましくは、酵母はＷＯ９５／２３８５７
およびＷＯ９５／３３８３３として各々発行された本発
明者らの特許出願で示されているように、例えば各遺伝
子を分断させた結果として、低（またはゼロ）レベルの
Ｙａｐ３ｐプロテアーゼおよび／またはｈｓｐ１５０熱
ショックタンパク質を有している。Ｙａｐ３ｐは下記の
４５ｋＤアルブミン断片を形成させ、ｈｓｐ１５０は一
部の分離ステップでアルブミンと同時精製されうる。

【００２５】酵母はSaccharomyces cerevisiae２μｍプ
ラスミドをベースにした発現プラスミドで形質転換させ
てもよい。酵母を形質転換させるときに、そのプラスミ
ドは細菌複製および選択配列を含んでいて、これはＥＰ
２８６４２４の開示に従い内部組換え現象により形質転
換後に切り出してもよい。そのプラスミドはＥＰ４３１
８８０で示されたような酵母プロモーター（例えば、Sa
ccharomyces cerevisiae ＰＲＢ１プロモーター）；分
泌リーダーをコードする配列、例えばＷＯ９０／０１０
６３で示されたような天然ＨＳＡ分泌リーダーのほとん
どとS.cerevisiae α‐接合因子分泌リーダーの小さな
部分とを含んだもの；ヒト遺伝子に対応するｃＤＮＡを
単離するための公知方法により得ることができ、例えば
ＥＰ７３６４６およびＥＰ２８６４２４にも開示された
ＨＳＡコード配列；および転写ターミネーター、例えば
ＥＰ６００５７に示されたようなSaccharomyces ＡＤＨ
１からのターミネーターを含む発現カセットも含んでい
てよい。

【００２６】上記プラスミドの様々な要素の選択は、得
られるアルブミン製品の純度に直接関連するとは考えら
れず、それらの要素は生成物の改善された収率に寄与す
るのであろう。

【００２７】本発明の好ましい面は、例と添付図面によ
り記載されており、その場合において：図１はｒＨＡを
生産するために用いられる発酵槽を概略図で示してい
る；図２はＣ１８ＰＴＨ逆相ＨＰＬＣカラム（Applied
Biosystems Inc.）によるＵＶトレースであり、本発明
のアルブミン中で低レベルの低分子量混入物質を示して
いる；図３は図２と同様であるが、従来技術のアルブミ
ン中の低分子量混入物質を示している；図４は市販アル
ブミンの脂肪酸含量を示したガスクロマトグラムであ
る；図５は図４に相当するが、本発明のアルブミンを示
している；および図６ａおよび６ｂは、本発明のアルブ
ミンと従来のアルブミンの各々に関するエレクトロスプ
レー質量スペクトル分析を示している。

【００２８】例１：不純アルブミン溶液の調製 アルブミン生産微生物の構築に関するクローニング戦略
は、ＥＰ４３１８８０に開示されたとおりであった。プ
ラスミドｐＡＹＥ３１６をHinnen et al (1978) P.N.A.
S.75,1929に記載された方法で（ＭＡＴａ、ｌｅｕ２、
ｐｅｐ４‐３、〔ｃｉｒ゜〕）Saccharomyces cerevisi
ae株中に導入した。形質転換体はロイシンを欠く最小培
地（酵母窒素ベース、Difco）上で選択した。形質転換
体を複合（ＹＥＰ、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％
（ｗ／ｖ）バクトペプトンおよび２％（ｗ／ｖ）スクロ
ース）または規定（アミノ酸および硫酸アンモニウムの
ない０．１５％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース、０．５％
（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．１Ｍクエン酸／Ｎａ
_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）
スクロース）液体培地の１０ｍｌを含有した５０ｍｌフ
ラスコ中において３０℃、２００ｒｐｍで７２時間増殖
させたとき、ｒＨＡはＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル
電気泳動および／またはロケットゲル免疫電気泳動によ
り無細胞培養上澄において検出することができた。

【００２９】規定液体培地〔Buffered Minimal Medium
（ＢＭＭ）塩培地：酵母窒素ベース（アミノ酸および
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４なし、Difco）１．７ｇ／ｌ；クエ
ン酸一水和物６．０９ｇ／ｌ；無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４，２
０．１６ｇ／ｌ、ｐＨ６．５±０．２；スクロースは２
０ｇ／ｌまで加える〕中のストックマスター細胞培養物
は、２０％（ｗ／ｖ）トレハロースの存在下で培養物の
アリクウオットを凍結することによる振盪フラスコ培養
物の調製に適したプロセス酵母のランニングストック
（製造業者のワーキングセルバンク）を作るために用い
る。

【００３０】発酵 このセクションはストック培養物から最終発酵に至るま
でのｒＨＡの生産に関するもので、特定の具体的装置ま
たは規模に限定されないｒＨＡ発酵プロセスの一般的規
定である。

【００３１】振盪フラスコ培養．酵母〔ｃｉｒ゜、ｐＡ
ＹＥ３１６〕を種容器(seed vessel）の接種に生理学上
適した純培養物として増殖させる。種容器のタイミング
が再現性があるならば、増殖期（主要炭水化物過剰）お
よび接種物バイオマス（培地１０リットル当たり接種物
１００ｍｌを要する１２±２ｍｇ／ｌ）を規定すること
が必要である。１つのストックバイアルをＢＭＭ＋２％
（ｗ／ｖ）スクロース１００ｍｌを含有した振盪フラス
コ中に接種し、（６００ｎｍの光学密度により調べて）
０．６〜１．２ｇ／ｌの細胞乾燥重量（ｃｄｗ）が得ら
れるまで、フラスコをオービタルシェーカー（２００ｒ
ｐｍ回転／分）にて３０℃でインキュベートする。次い
でこの培養物は１２±２ｍｇ／ｌのレベルまで種発酵容
器（seedfermentation vessel）に接種するために用い
る。

【００３２】種発酵．主生産発酵槽用の接種物は、種発
酵槽（seed fermenter）（この例では、２０Ｌ作業容
量）で、約１００ｇ／ｌの高細胞乾燥重量（ｃｄｗ）ま
で生産生物、好ましくはS.cerevisiae〔ｃｉｒ゜、ｐＡ
ＹＥ３１６〕を増殖させることにより得る。フェッドバ
ッチ（fed-batch）様式は、エタノールおよび酢酸（ace
tate）の蓄積を最少にして、細胞収率を最大にさせるよ
うなものにする。各発酵の全体は、B.Braun（Germany）
から入手できるMulti-Fermenter Computer System（Ｍ
ＦＣＳ）ソフトウェアのようなコンピューターコントロ
ールシステムでモニターおよびコントロールする。

【００３３】B.Braunにより供給されるソフトウェアはS
upervisory Control and Data Acquisition Packageで
ある；同様のパッケージは他の会社からも入手できる。
供給コントロールアルゴリズムはスクロースの添加をコ
ントロールするためのものであり、こうしてCrabtree効
果を避けて、それによりエタノールおよび／または酢酸
の生産を最少にすることにより、最大バイオマスが達成
される。発酵容器に加温ＮａＯＨ洗浄液および無発熱物
質水（ＰＦＷ）すすぎ液（rinse）を入れる。加熱滅菌
容器は約１０Ｌの無菌ＭＷ１０培地（表１）バッチ塩＋
微量元素を含有する。ｒＨＡ生産用培地は、内毒素を除
去するために限外ロ過（１０，０００Mol.Wt.カットオ
フ）することができる。

【００３４】 表１ ＭＷ１０培地 成分 バッチ培地 供給培地 塩 ＫＨ_２ＰＯ_４ ２．７４ｇ／ｌ １０．９ｇ／ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５８ｇ／ｌ ２．３ｇ／ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０６ｇ／ｌ ０．２４ｇ／ｌ Ｈ_３ＰＯ_４（８５％ｗ／ｗ） ０．８８ｍｌ／ｌ １．７６ｍｌ／ｌ ビタミン パントテン酸Ｃａ ２０ｍｇ／ｌ １８０ｍｇ／ｌ ニコチン酸 ３３．３ｍｇ／ｌ ３００ｍｇ／ｌ ｍ‐イノシトール ２０ｍｇ／ｌ １８０ｍｇ／ｌ ｄ‐ビオチン ０．１３３ｍｇ／ｌ ０．８ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ １６ｍｇ／ｌ ３２ｍｇ／ｌ 微量元素ストック １０ｍｌ／ｌ ２０ｍｌ／ｌ スクロース ０^＊ ５００ｇ／ｌ 微量元素ストック成分 ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ３ｇ／ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ／ｌ ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ ３．２ｇ／ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．０７９ｇ／ｌ Ｈ_３ＢＯ_３ １．５ｇ／ｌ ＫＩ ０．２ｇ／ｌ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ／ｌ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．５６ｇ／ｌ 微量元素は、３５ｍｌ／ｌの９８％Ｈ_２ＳＯ_４で酸性化
された脱塩水に加える。

【００３５】^＊スクロース２０ｇ／Ｌを２０Ｌ種発酵槽
（seed fermenter）段階でバッチ培地に加える。滅菌の
いかなる便法も、脱発熱物質法、例えば限外ロ過のよう
に用いてよい。ビタミンは常にフィルター滅菌する。

【００３６】培地を容器に加えた後、３０℃の操作温度
と、最小スターラー速度、典型的には４００〜５００ｒ
ｐｍにセットする。初期ｐＨは５．７±０．２にセット
されたｐＨコントローラーを用いてアンモニア溶液（比
重０．９０１）で調整する。２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４もｐＨ補
正剤として用いる。２０ｇ／ｌまでスクロース、ＭＷ１
０バッチビタミン、および０．０４ｇ／ｌまでBreox Ｆ
ＭＴ３０消泡剤を容器に加える。

【００３７】無菌ロ過空気を０．５ｖ／ｖ／ｍ（即ち、
非圧縮空気０．５Ｌ／培地ｌ／分）で容器中に導入し、
培地を無菌振盪フラスコ培養物から１２±２ｍｇ細胞乾
燥重量／ｌまで接種して、ＭＦＣＳコンピューターシス
テムを始動させる。（３０分で＞１５％の溶解酸素圧
（tention）増加によりシグナルが発せられる）バッチ
増殖期（batch phase of growth）の完了後、供給培地
の添加をＭＦＣＳシステムのコントロール下で始める。
コントロール戦略は、生産発酵に関して以下で記載され
るのと同様であることが有効である。発酵中に、空気流
は約１ｖ／ｖ／ｍの流量を維持するために２ステップで
増加させる。溶解酸素分圧（ＤＯＴ）は、スターラー速
度を変えることにより、２０％空気飽和度でコントロー
ルする。スターラー速度がもう増加しえなくなり、空気
流速度がその最大値に達したら、供給コントロールアル
ゴリズムは発酵産物の形成を最少にするように供給割合
をコントロールする。供給の最後に、培養物は生産容器
に移す。

【００３８】生産発酵．酵母〔ｃｉｒ゜、ｐＡＹＥ３１
６〕の純培養物を細胞外ｒＨＡの生産のため高ｃｄｗ
（＞８０ｇ／ｌ）までフェッドバッチ発酵により生産さ
せる。生産発酵槽、この例では作業容量８０００Ｌの発
酵槽に種発酵槽で増殖させた培養物を接種するが、その
細胞乾燥重量は好ましくは＞８０ｇ／ｌである。種発酵
槽培養物の移送に際する生産発酵槽内の初期細胞乾燥重
量濃度は、好ましくは０．２５〜１．００ｇ／ｌであ
る。１時間以内に供給を始めることが好ましいが、必要
であれば遅らせてもよい。供給期の初期におけるＯＵＲ
およびＣＥＲの非常に低い値と、それらの測定における
必然的な誤差のせいで、ＲＱを用いた供給速度の自動コ
ントロールは最初は不能である。供給様式は、エタノー
ルおよび酢酸の蓄積を最少にして、細胞および産物収率
を最大にさせるようにする。

【００３９】発酵は、最適のガス溶解および容積混合
（bulk mixing）を得るように考えられた、図１に示さ
れたような発酵槽で行う。加温ＮａＯＨ洗浄液およびＰ
ＦＷすすぎ液に付される容器は、約４０００Ｌの無菌Ｍ
Ｗ１０（表１）、バッチ塩および微量元素を含有する。
この培地は、加熱またはフィルター滅菌により、容器と
は別に滅菌させてよい。ＭＷ１０のような発酵培地はエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩または
他の強い金属キレート化剤を含んでいないことが有利で
あり、それらの存在は生産されたアルブミン中に有意に
高度の着色混入物質を生じさせるからである、と本発明
によりわかった。

【００４０】操作温度は３０℃にセットし、スターラー
速度は均一溶液を維持する上で十分な、典型的には約５
０ｒｐｍとなるように調節する。初期ｐＨはアンモニア
溶液（ＳＧ０．９０１）で調整する（コントローラーは
５．７±０．２にセットする）。２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を第
二のｐＨ補正剤として用いてよい。ＭＷ１０バッチビタ
ミンは、適切な消泡剤の場合のように必要なだけ加える
（例えば、Breox ＦＭＴ３０を０．１２５ｇ／ｌま
で）。

【００４１】無菌ロ過空気は、排出ガス分析の感度を最
大にするために、最初は０．５ｖ／ｖ／ｍで容器に加
え、ＭＦＣＳコンピューターシステムを始動させる。排
出ガスは、例えば連続質量スペクトロメーター（例え
ば、 Fisons ＶＧガス分析器）の使用により分析する。
容器にシードベッセル培養物の全体を接種する（最少
０．４％ｖ／ｖ）。ＭＷ１０はバッチ容量に等しい容量
で供給する。供給を開始すると、ＯＵＲおよびＣＥＲ値
がコントロールを有効にする上で十分高くなるまで、Ｒ
Ｑオーバーライド（override）コントロールは不能であ
る。供給速度は、ＲＱが一貫して＞１．２となるなら
ば、ＲＱコントロールなしにその期間中手動で調整す
る。供給速度は、下記アルゴリズムに従い、コンピュー
ターコントロールを介して増加させる： 供給速度（ＦＲ）＝ｋｅ^μｔ 上記において、ｋは初期供給速度であり、μは指数増殖
速度であり、ｔは時間である。ｋ値は、エタノールおよ
び酢酸（acetate）の蓄積を最少にする増殖速度を達成
させる上で必要な初期供給速度として経験的に決定され
る。この例では、ｋはＭＷ１０供給培地０．０８ｍｌ／
分／Ｌ培地の値を有するものとして決定された。μ値
は、十分に呼吸性の生物の最大増殖速度、この例だと
０．１／ｈである。

【００４２】ｔは０（ゼロ）で始まるカウンター変数
（counter variable）であり、ＲＱ＞１．２またはＤＯ
Ｔ＜１５％でないかぎり毎分１ずつ増加する。これらの
場合だと、ｔの値は減少する。

【００４３】容器はＯＴＲを高めるために必要に応じて
過圧してもよい。培養物は供給の最後に下流プロセッシ
ングのために保持しておく。

【００４４】この保持時間は最小に保つべきだが、４８
時間以内で、必要ならばそれを超えて延長することがで
きる。その保持期に、培養物の温度はできるだけ最低
に、典型的には４〜１５℃、好ましくは４℃に下げて、
ＤＯＴを０％に落とさせる。供給を停止し、通気を止
め、過圧を減らす。しかしながら、ｐＨコントロールは
維持する。十分な撹拌を、細胞を懸濁させておき、冷却
およびｐＨ均一性を促進するために、好ましくは約５０
ｐｐｍで維持する。

【００４５】上記操作による予想収率は：バイオマス＞
８０ｇ細胞乾燥重量／Ｌ培養物；ｒＨＡ＞１．５ｇモノ
マー／ｌ培養物（全培養物についてＳＤＳ‐ＰＡＧＥで
調べた）である。

【００４６】アルブミンがｒＨＡであるときに、本発明
による精製処理用の不純アルブミン溶液を調製するため
には、微生物細胞は発酵培地から除去する。細胞は記載
されたように精製プロセスの開始前に除去されることが
好ましいが、例えば第一の精製ステップが流動層（be
d）で行われる場合には、それはある一定の条件下で第
一ステップと同時に行うことができる。保持期中に通気
なしで１５℃未満に発酵槽で冷却された発酵培養物はタ
ンクに移して、そこで１８０〜２１０ｇ／ｋｇのバイオ
マス濃度を示すようにそれを希釈して、必要ならば更に
冷却させる。希釈された培養物は、酵母細胞沈降を防ぐ
ために十分撹拌しながら、低減した温度で通気せずにで
きるだけ短時間保つべきである。

【００４７】細胞および上澄は、一次分離ステップ、例
えば５７００ｒｐｍで運動されるAlfa Laval ＢＴＵＸ
５１０連続放出ノズルのような任意の適切な遠心機でミ
クロフィルトレーションまたは遠心に付す。こうして得
られた遠心物（centrate）は、残留した全体および破壊
酵母細胞と他の粒子を除去するために、例えばCunoによ
り供給の深層フィルター（１μｍ孔径）を用いて、ライ
ン中でロ過してもよい。希釈培養物中に存在するｒＨＡ
の少くとも７５％は、単一通過遠心操作で回収する。場
合により、この操作からの細胞スラリーは、水または緩
衝液に再懸濁して、第二遠心物を得るために再遠心して
もよく、こうして産物回収率を高めさせることができ
る。次いで、得られた溶液は、例２で示されたように、
そこに含有されたアルブミンを精製するために本発明の
プロセスにより処理する。

【００４８】例２：本発明によるアルブミンの精製 （例１に記載されたような）発酵からの遠心物または
（血漿のような）いずれか他の供給源からの不純アルブ
ミン溶液は、（オクタノエートを含有させることによ
り）重合化と、（ダメージを与えるレベルのプロテアー
ゼがないように酵母を選択するかまたは加熱することに
より）プロテアーゼ活性からアルブミンをを保護しなが
ら、陽イオン交換マトリックスでのクロマトグラフィー
用に調製または条件設定する。好ましくは、オクタン酸
ナトリウムを１〜１０ｍＭ、例えば約５ｍＭの最終濃度
まで加えて（クロマトグラフィー溶液１３（ＣＳ１３）
‐表２）、アルブミンを安定化させる。ｐＨを酢酸（Ｃ
Ｓ０９）で４．３〜４．８、好ましくは４．５０±０．
１（最も好ましくは±０．０５）に調整し、導電率は＜
５．５mS/cm となるようにチェックする。

【００４９】一部の宿主株または種からの培養上澄は、
後のプロセス中にｒＨＡを分解できるプロテアーゼを含
有している。このような場合に、このプロテアーゼ活性
はｒＨＡを含有した培養上澄の熱処理により壊すことが
できる。典型的には、１〜１０ｍＭオクタン酸ナトリウ
ムであれば熱変性からｒＨＡを保護する上で十分であ
り、６０〜８０℃の温度で３０秒間から１０分間までで
あればプロテアーゼを不活化する上で十分である。その
後、上澄は前記のように更にコンディショニングするこ
とができる。プロテアーゼによる分解に会わないなら
ば、熱処理は好ましくは省略する。

【００５０】クロマトグラフィー すべての操作は環境温度（２０±５℃）で行える。クロ
マトグラフィーカラム用のアルブミン担持量（load）
（ｇアルブミン／Ｌマトリックス）は、ＳＤＳ‐ＰＡＧ
Ｅ（ＳＰ‐ＦＦカラムの場合）またはＧＰ‐ＨＰＬＣ
（他のすべてのカラムの場合）により、アルブミンの力
価（ｇ／ｌ）から決める。各ステップの進行は、オンラ
インで、例えば２５４または２８０ｎｍでＵＶ吸光度を
測定することによりモニターする。

【００５１】ここで記載されたようなクロマトグラフィ
ーステップの順序には、いくつかの面で新規かつ進歩性
がある。第一精製ステップで陽イオンマトリックスを用
いると、酵母発酵から得られた低分子量着色種の大部分
はカラムを直接通過するが、マトリックスに結合するも
のは弱く結合しており、１Ｍ ＮａＣｌのような高イオ
ン強度塩浄化により除去できる。このため陽イオンマト
リックスは、これらのタイプの分子を不可逆的に吸着さ
せる陰イオンマトリックスとは異なり、再生して、精製
の第一ステップとしてクロマトグラフィーのマルチサイ
クルに使うことができる。こうして、このステップでは
確固たる商業的クロマトグラフィープロセス用の基礎を
形成する。

【００５２】この例で第二ステップとしてCibacron Blu
eタイプのカラムの使用は、その物理化学的性質、例え
ばサイズおよびｐＩがもとの分子と類似しているために
アルブミンから除去することが非常に困難な、アルブミ
ンの４５ｋＤａ断片を除去するために特に用いられると
いう点で新規である。意外にも、その断片は全長アルブ
ミンの場合よりも色素と強く結合するので、それらの分
離を行えるのである。アルブミンの精製中に用いられる
クロマトグラフィー溶液は表２に示されている。アルブ
ミンの非常に大規模な製造と、比較的低コストの製品の
ために、工業規模で高純度形態で利用できて、Ｔｒｉ
ｓ、ＨＥＰＥＳまたはＭＯＰＳのような他の通常用いら
れる緩衝液と比較して低コストであることから、これら
の緩衝塩はそのプロセスに最も適している。別の緩衝
液、例えば類似ｐＫ_ａの緩衝液（例えば、酢酸（acetat
e）の代わりにリンゴ酸（malate））も表２で用いられ
たものの代わりに使用できるが、ほとんどの場合にコス
トと入手性が大規模だとそれらの使用を妨げる。別な塩
形態も、それらが可溶性で、工業規模で入手できて、低
コストであるとするならば、用いることができる。しか
しながら、ＣＳ０６およびＣＳ１０中におけるテトラホ
ウ酸（borate）イオンの含有は、それらが高分子で炭水
化物部分と複合体形成して、それらをマトリックス上の
陰イオン基と強く結合させる上で特別な役割を果たすこ
とから、特に有利である。これは溶出液中におけるアル
ブミンの純度を高める。

【００５３】クロマトグラフィーは、Pharmaciaから入
手できるような軸流（axial flow）カラムを用いるか、
またはSepragenから入手できるような半径流カラムを用
いて行うことができる。この例では、カラムはすべて軸
性である。

【００５４】緩衝溶液は下記の濃度で調製してもよい
し、あるいは濃縮ストック溶液を調製して、すぐの使用
のためにオンラインで混合または希釈してもよい。

【００５５】

【表２】 陽イオン交換クロマトグラフィー．陽イオン交換クロマ
トグラフィーにより少くとも酵母タンパク質（アルブミ
ンが酵母発酵からのｒＨＡであるとき）および他の抗
原、低分子量混入物質と着色化合物についてアルブミン
を濃縮および精製する。その方法ではＳＰ‐Sepharose
ＦＦ、ＳＰ‐Spherosil、ＣＭ‐SepharoseＦＦ、ＣＭ‐
Cellulose、ＳＥ‐CelluloseまたはＳ‐Spherodexのよ
うな市販陽イオン交換マトリックスを用いる。好ましく
は、マトリックスは５〜２５ｃｍ、好ましくは１０〜１
５ｃｍ、この例では１２．５ｃｍの層高で、アルブミン
１０〜５０ｇ／ｌ、好ましくはアルブミン４０±１０ｇ
／ｌマトリックスのカラム担持量（loading）にあるＳ
Ｐ‐Sepharose ＦＦ（Pharmacia）である。そのマトリ
ックスはアルカリ貯蔵溶液を除去するために緩衝液で平
衡化する；好ましくは、緩衝液はｐＨを約ｐＨ６．０に
下げる上で十分な強度とすべきである。ＣＳ０１のよう
な緩衝液はカラムから貯蔵溶液ＣＳ０７を除去するため
に用いる；しかしながら、ｐＨ＜６．０の任意の緩衝液
を用いることができる。平衡化は、カラム流出液のｐＨ
が約ｐＨ６．０であるときに完了と判断される。

【００５６】次いで、コンディショニングされた遠心物
は例えば１．０〜８．０cm/min、好ましくは４．０〜
７．０cm/min、この例では６．３６cm/minの流速でカラ
ム上に担持させ、その後カラムは残留混入物質を除去す
るために溶液で洗浄する。この洗浄溶液は、アルブミン
の溶出を防ぐために、ｐＨ＜６．０および５mS/cm未
満、好ましくは３mS/cm未満の導電率を有しているべき
である。適切な溶液はＣＳ０１である。先行のステップ
はすべて６．３６cm/minで行う；溶出とその後すべての
ステップでは、溶出液の容量を減少させるために、流速
を０．５〜５．０cm/min、好ましくは２．０〜４．０cm
/min、この例では３．１８cm/minまで減少させる。アル
ブミンの溶出はイオン強度を増加させることにより行
う；導電率範囲５〜１０mS/cm、好ましくは６〜８mS/cm
の溶液、例えばＣＳ０２を用いる。アルブミンの収集は
ＵＶシグナルが１．０Ａ_２８０／ｃｍを超えて上昇した
ときに始めて、収集はＵＶシグナルが０．６Ａ_２８０／
ｃｍ未満に下降するまで、または最大容量で６．５倍の
カラム容量が集められるまで続ける。次いで、カラムは
ＣＳ０３および０４を用いて浄化させ、その後ＣＳ０７
中に貯蔵する。

【００５７】アフィニティクロマトグラフィー．このス
テップでは、４５ｋＤａ Ｎ末端アルブミン断片、酵母
抗原（アルブミンが酵母発酵からのｒＨＡであるとき）
および色素についてアルブミンを更に精製する。アフィ
ニティマトリックスは、アルブミンと結合するCibacron
Blueタイプの色素、例えばReactive Blue ２、Procion
Blue ＨＢ、Blue Sepharose、Blue Trisacrylおよび他
のアントラキノンタイプ化合物を含んでいてよい。好ま
しくは、マトリックスは下記の“Delta Blue Agarose”
マトリックスである。これはそのマトリックスにより生
じるBlue浸出液のレベルを減少させ、しかもマトリック
スのアルカリ安定性を高めて浄化と脱発熱物質を促進す
ることがわかった。市販マトリックスと比較したそのマ
トリックスの更なる改良点は、色素（Reactive Blue
２）とマトリックス間に、スペーサー、１，４‐ジアミ
ノブタンの組み込みである。これは溶出液アルブミン純
度の面で最適長のスペーサーであることがわかった。

【００５８】Reactive Blue ２は以下で表される化学構
造を有している。

【００５９】

【化１】 オルト、メタまたはパラ異性体か、あるいはそれらの任
意の混合物が使用できる。好ましい異性体はオルト‐Ｓ
Ｏ^- _３形態であるが、望ましい純度にすることは困難で
あるため、メタ異性体を用いる。アミノブチル‐Reacti
ve Blue ２は、分析ＨＰＬＣにより調べて９８％全ピー
ク面積の最少純度まで調製する。これは、アミノブチル
誘導体色素の精製を要する粗製市販色素を用いるか、ま
たは純粋な合成色素を用いることにより行える。後者の
方法だと、出発色素物質は２８０ｎｍの分析ＨＰＬＣに
よると最低で純度９８％であるべきだ。このような物質
はＡＣＬ．Isle of Manから入手できる。Reactive Blue
２は混合物を６０℃まで加熱することにより水中で
１，４‐ジアミノブタンと反応させ、その後誘導色素を
例えば沈降により混合物から精製する。次いで、アミノ
ブチル‐Reactive Blue２はマトリックス、例えばエピ
クロルヒドリン活性化Sepharose ＣＬ‐６Ｂ（Pharmaci
a,Sweden）と結合させる。Porath et al (1971) J.Chro
matog.60,167-177参照。このようなDelta Blue Agarose
（ＤＢＡ）マトリックスの色素分は、好ましくは５０±
５mmole／ｇ乾燥重量であるべきだ。

【００６０】Blueマトリックスの使用．この方法では１
０〜３０ｃｍ、好ましくは２０〜３０ｃｍ（この例では
２５ｃｍ）の層（bed）高で、ｒＨＡ７〜１４ｇ／ｌマ
トリックス、好ましくは８〜１２ｇ／ｌ（この例ではア
ルブミン１０±１ｇ／ｌマトリックス）のカラム担持量
にあるＤＢＡを用いる；すべてのステップは０．３〜
２．０cm/min、好ましくは１．０〜２．０cm/min、この
例では１．５３cm/minの流速で行う。ＤＢＡはＣＳ０７
からＣＳ０１中で平衡化させる；平衡化はカラム流出液
のｐＨが約ｐＨ９．５となるときに完了である。クロマ
トグラフィー前に、ＳＰ‐ＦＦ溶出液はアンモニアで約
ｐＨ８．５〜９．５、好ましくはｐＨ９．０に調整し、
その後カラム上に担持させる。担持が完了したら、カラ
ムは１〜５倍容量、好ましくは５倍カラム容量の１０〜
３０mS/cm、好ましくは１５〜２５mS/cmの緩衝液、例え
ばＣＳ１２で混入物質を除去するために洗浄する。アル
ブミンは＞１００mS/cm、好ましくは１２５〜１６５mS/
cmの高イオン強度緩衝液、例えばＣＳ０３を用いて溶出
させる。溶出液収集はＵＶシグナル（Ａ_２８０／ｃｍ）
が０．４を超えて上がったとき開始して、シグナルが再
び０．４未満に下がったとき止める。次いでカラムはＣ
Ｓ０４を用いて浄化させ、ＣＳ０７中に貯蔵する。

【００６１】中間限外ロ過．このステップではゲル浸透
クロマトグラフィー用にアルブミンを濃縮する。限外ロ
過装置でセルロースタイプ膜（３０，０００以下、例え
ば１０，０００の公称分子量カットオフ）を用いて、Ｄ
ＢＡ溶出液をアルブミン２０〜１２０ｇ／ｌ、好ましく
は８０〜１１０ｇ／ｌの保留液濃度まで濃縮させる。膜
は、使用後に水か表３のＣＳ０３またはＣＳ０５で残留
タンパク質を洗い出して、０．１Ｍ水酸化ナトリウムで
浄化することにより処理する。次いで、膜は２０ｍＭ水
酸化ナトリウム中に貯蔵してもよい。

【００６２】ゲル浸透クロマトグラフィー．このステッ
プでは酵母抗原（アルブミンが酵母発酵からのｒＨＡで
あるとき）、色素および二量体化アルブミンについてア
ルブミンを精製して、緩衝液交換ステップを行う。その
方法ではSephadex Ｇ１００、Ｇ１５０、Ｇ２５０、Sep
hacryl Ｓ‐１００、Ｓ‐２００またはＳ‐３００、Toy
opearl ＨＷ５０Ｓまたは Superose ６または１２のよ
うな市販ゲル浸透マトリックスを用いる。好ましくは、
マトリックスは６０ｃｍを超える、好ましくは９０±ｃ
ｍ（３×３０ｃｍ）の層高にあるSephacryl Ｓ‐２００
ＨＲ(Pharmacia）である。カラムはＣＳ０５で平衡化さ
せて、０．１〜１．５cm/min、好ましくは０．５〜１．
０cm/min、この例では０．７５cm/minで行う；次いでカ
ラムにはｐＨ９．５に達したとき中間ＵＦステップから
のアルブミンを担持させる。担持容量はカラム容量の約
２〜９％、好ましくは５〜８％、例えばカラム容量の
７．５％に相当する。アルブミンフラクションは３部分
で集める：最初の少量のアルブミンダイマーはＡ_２８０
／ｃｍが立ち上がり時に１０％フルスケールデフレクシ
ョン（ＦＳＤ）に達するまで廃棄する；この時点でリサ
イクルフラクションの収集を開始して９０％ＦＳＤまで
継続させ、その後アルブミンを一次産物フラクションと
して集める。これはＡ_２８０が５％ＦＳＤに落ちるまで
続け、その後流出流は再び廃棄する。リサイクルおよび
一次産物フラクションは別々に集める。このステップ
は、すべての物質がカラム上に担持されるまで繰り返
す。

【００６３】Ｓ‐２００ＨＲリサイクル限外ロ過．３
０，０００以下、またはこの例では１０，０００で用い
られる公称分子量カットオフのセルロースタイプ膜を限
外ロ過装置に用いて、プールされたリサイクルフラクシ
ョンをアルブミン２０〜１２０ｇ／ｌ、好ましくは８０
〜１１０ｇ／ｌの保留液濃度まで濃縮させる。膜は中間
限外ロ過下で上記のように使用後処理する。

【００６４】一方、このプロセスのいかなる限外ロ過ス
テップの場合にも、カットオフ≦３０，０００のポリエ
ーテルスルホンまたはＰＶＤＦ膜をセルロースタイプ膜
の代わりに用いてよい。このような膜はAmiconおよびMi
lliporeから入手できる。膜の貯蔵と浄化に用いられる
ＮａＯＨと適合する膜を用いることが好ましい。

【００６５】Ｓ‐２００ＨＲリサイクル限外ロ過保留液
の精製．リサイクル限外ロ過からの保留液は、各ピーク
から集められた一次Ｓ‐２００精製および産物フラクシ
ョンに用いられたのと同様のカラム上に担持して、それ
から先に集められた一次産物フラクションと混合させ
る。このステップは、すべての物質がカラム上に担持さ
れるまで繰り返す。

【００６６】陰イオン交換クロマトグラフィー．このス
テップの目的は、少くとも酵母抗原（アルブミンが酵母
発酵からのｒＨＡであるとき）および着色アルブミンに
ついてアルブミンを精製することである。その方法では
ＱＭＡ‐Spherosil、ＤＥＡＥ‐Spherodex、Ｑ‐Hyper
Ｄ、ＤＥＡＥ‐セルロース、ＱＡＥ‐セルロース、ある
いはＴＭＡＥ、ＤＭＡＥまたはＤＥＡＥ Fractogelのよ
うな陰イオン交換マトリックスを用いる。好ましくは、
マトリックスは５〜２５ｃｍ、好ましくは１０〜１５ｃ
ｍ、例えば１２．５ｃｍの範囲のいずれか好都合な層高
で、アルブミン１０〜６０ｇ／ｌマトリックス、好まし
くは３５±１５ｇ／ｌマトリックスのカラム担持量にあ
る市販陰イオン交換マトリックスＤＥＡＥ Sepharose‐
ＦＦ（Pharmacia）である。カラムは最初に、ｐＨを作
業範囲まで速やかに下降させる強緩衝液、例えばｐＨ
４．５〜６．０、好ましくは約ｐＨ５．５の酢酸ナトリ
ウム、例えばＣＳ１１で平衡化させる。濃縮緩衝液の後
に、低導電率、即ち１〜４mS/cm、好ましくは２．５〜
３．５mS/cmの範囲の溶液、例えばＣＳ０８を、カラム
にＳ２００溶出液を担持させる前に、カラムを平衡化す
るために用いる。１．０〜８．０cm/min、好ましくは
３．０〜７．０cm/min、この例では４．４cm/minの直線
的流速を用いることができる。担持が完了したら、カラ
ムを５〜３０ｍＭ、好ましくは１５〜２５ｍＭの範囲の
テトラホウ酸ナトリウム溶液、例えばＣＳ１０で洗浄す
る。こうすると、アルブミンフラクションの溶出前に、
炭水化物含有混入物質をカラムにより強く付着させられ
る。溶出は１０〜２０mS/cmの範囲の高イオン強度溶
液、好ましくはＣＳ０６で行うことができる。溶出液は
Ａ_{２８ ０}／ｃｍが０．４に達したときに集め、ピークが
０．８に落ちるまで続ける。

【００６７】このため、この例だと、精製ステップの順
序は陽イオン交換、アフィニティクロマトグラフィー、
限外ロ過、ゲル浸透（リサイクルフラクションの限外ロ
過を含む）および陰イオン交換である。

【００６８】ＤＥ‐ＦＦカラムからの溶出液は、１０．
０mg/mlのアルブミンを含有した溶出液２５．０μｌを
担持させてＴＳＫ ＳＷ３０００ＸＬカラムを用いるＧ
ＰＨＰＬＣにより分析すると、０．１％（ｗ／ｗ）未満
のアルブミン二量体（dimer）と、検出不能レベルのア
ルブミン多量体（polymer）または凝集物であることが
わかった。

【００６９】例３：最終製品への精製アルブミンの処方 この例では、適切な生成物、この場合には２５％（ｗ／
ｖ）アルブミンへの高度精製アルブミンの濃縮、ダイア
フィルトレーションおよび処方（formulation）につい
て説明している。この操作は２段階で、即ち最終限外ロ
過（ＵＦ）および処方で行う。最終ＵＦは最終ＵＦ供給
容器への（リン酸でｐＨ７．０±０．３に調整された）
ＤＥＡＥ溶出液の移送から始めて、保留液と洗液がもし
あれば処方容器に移された後で終える。アルブミン含有
プロセス流は、セルロース膜または、更に好ましくは公
称分子量カットオフ限界１０，０００のポリエーテルス
ルホン膜を装備した限外ロ過系で、一次濃縮、ダイアフ
ィルトレーションおよび二次濃縮に連続的に付す。最初
の濃縮ステップではアルブミン濃度を約１００ｇ／ｌま
で増加させ、直ちに連続的なダイアフィルトレーション
段階を続けて、アルブミンを保留液容量の少くとも５
倍、好ましくは少なくとも７倍相当の注入用水に対して
ダイアフィルトレーションする。

【００７０】本発明の一部の精製プロセス、例えば固定
化アミノフェニルボロネートを用いた例７で記載された
ステップにおいて、アンモニウムイオンはこの段階に存
在していてもよい。意外にも、本発明者らは、これらの
アンモニウムイオンがアルブミンによりかなり強く結合
されて、水に対するダイアフィルトレーションでは完全
には除去できないことを発見した。本発明者らは、塩溶
液に対するダイアフィルトレーションが有効であること
を発見した。０．５対１０％ｗ／ｗ、例えば１．０対
５．０％または約３％の塩化ナトリウム対アルブミン比
が用いられ得る。その塩はアルブミン保留液に加えても
よいし、あるいは更に一般的にはダイアフィルトレーシ
ョン水に加えてもよい。最終５％（ｗ／ｖ）処方の場合
には、約１００ｇ／ｌの溶液をダイアフィルトレーショ
ンステップから直接回収できる。最終２５％（ｗ／ｖ）
処方の場合には、約２７５〜３２５ｇ／ｌの溶液を追加
の濃縮ステップ（ＵＦ）後に得る。最後に、溶液をバル
ク（bulk）製品処方容器に移す。

【００７１】処方ステップでは、適切な化学的環境下に
おいて、バルク生成物無菌ロ過（０．２２μｍ親水性ポ
リビニリデンジフルオリド）と充填に適した適切な濃度
で、アルブミンを製造する。移した溶液は、アルブミ
ン、ナトリウムおよびオクタノエートの濃度を調べるた
めに分析する。これらの量を考慮して、更に必要量のス
トック塩化ナトリウムおよびオクタン酸ナトリウム賦形
剤溶液と適切なグレードの水がバルク処方仕様を満たす
ために加えられる。最終アルブミン濃度は２３５〜２６
５ｇ／ｌ（即ち、約２５％）であり、ナトリウム濃度は
１３０〜１６０ｍＭである。しかしながら、いかなる他
の可能なアルブミン濃度にも、例えば少くとも４％（ｗ
／ｖ）、好ましくは４〜２５％（ｗ／ｖ）の最少濃度で
作ってよい。処方は、ヒトアルブミンに関してＵＳまた
は欧州薬局方に記されたような適切で慣用的な薬学上許
容される賦形剤の添加と水希釈後に完了する。

【００７２】アルブミン１ｇ当たり０．０８mmoleオク
タン酸ナトリウムの最終濃度が望ましい。製品は無菌か
つ無発熱物質である。約１％（ｗ／ｗ）二量体アルブミ
ンはあってもよいが、より大きなポリマーまたは凝集物
はＴＳＫ ＳＷ３０００ＸＬカラムを用いてＧＰ ＨＰ
ＬＣにより分析すると検出しえない。

【００７３】例４：陽イオン交換の後の直接陰イオン交換 例２のプロセスの変法として、ステップの順序を変え
て、一部の変更をプロセス条件において行なった。この
ため、クロマトグラフィー溶液の別表を表３として示し
た。加えて、ゲル浸透ステップ以外のすべてのクロマト
グラフィーカラムは半径流式である。

【００７４】

【表３】 最初の陽イオン交換ステップは本質的に例２の場合と同
様であったが、但し以下の変更を加えた。層流路長は１
１．０±１．０ｃｍであった。次いでクロマトグラフィ
ーを下記のように行った。

【００７５】ＳＰ‐ＦＦ（Pharmacia）カラムをＣＳ２
０中で４倍容量の１０〜１００ｍＭ、好ましくは２０〜
４０ｍＭ、例えば３０ｍＭの酢酸（acetate）で平衡化
させ、アルブミン溶液を０．０７〜０．７５倍層（be
d）容量/min、好ましくは０．３〜０．６、この例では
０．５倍層容量/minの流速で担持させた。カラムを８倍
容量の１０〜１００ｍＭ、好ましくは３０〜７０ｍＭ、
例えば５０ｍＭ酢酸（ＣＳ２１）、その後１０倍容量の
ＣＳ２０で洗浄し、アルブミンは、収集の開始と最後を
マークするために０．６および０．３６のＡ_２５４／ｃ
ｍを用いて、酢酸（acetate）／オクタン酸（octanoat
e）緩衝液（例えば、ＣＳ２３中で４０〜１２０、好ま
しくは６０〜１００、例えば８５ｍＭ酢酸と、２〜５
０、好ましくは２〜２０、例えば５ｍＭオクタン酸）で
溶出および収集させる。カラムを０．２５〜３．０Ｍ塩
および０．０５〜２％界面活性剤（ＣＳ２４）と、その
後で０．１〜１．０Ｍ苛性アルカリ（caustic)（ＣＳ２
５）で浄化し、希（１０〜５０ｍＭ）苛性アルカリ（Ｃ
Ｓ２６）中に貯蔵する。この例において、平衡化、担持
および洗浄ステップの流速は０．５倍層容量/minであ
る。アルブミンの溶出では、０．０４〜０．６倍層容量
/min、好ましくは０．１５〜０．３５倍層容量/min、こ
の例では０．２５倍層容量/minの流速を用いる。ｒＨＡ
モノマーの予想回収率は４６〜６６％である。

【００７６】したがって、アルブミンはオクタノエート
の溶液で陽イオン交換カラムから溶出させて、陽イオン
交換体からｒＨＡの新規なバイオ特異的溶出を行わせ
た。ｐＨはアルブミンのｐＩに近いため、オクタノエー
トの結合は有意の全体的荷電差を生じさせ、例えばｐＨ
は少くとも４．５、好ましくは約ｐＨ５．５である。

【００７７】次いで、陽イオン交換体からの溶出液は、
ｐＨ４．５〜６．５、好ましくは約５．５で、１．５〜
５．０mS/cm、例えば２．５±０．５mS/cm（mS.cm^-1）
の範囲の導電率の陰イオン交換樹脂上に直接（即ち、例
２のようなアフィニティおよびゲル浸透クロマトグラフ
ィー後、好ましくは希釈後の代わりに）担持させる。こ
れにより、陽イオン交換クロマトグラフィー中に形成さ
れた任意の二量体アルブミンが陰イオン交換クロマトグ
ラフィーの条件下でモノマーアルブミンに逆変換される
ことがわかった。アルブミンモノマーについて約１１０
％の収率がこのステップで達成された。

【００７８】更に詳しくは、ＤＥＡＥ‐Sepharose Fast
Flow （Pharmacia）の１１．０±１．０ｃｍ層流路長
カラムを陽イオン交換溶出緩衝液（ＣＳ２３）で前平衡
化させ、その後酢酸緩衝液（例えば、ＣＳ２０）で平衡
化させてから、モノマーアルブミン３０．０±１０．０
ｇ／Ｌマトリックスで担持させる。

【００７９】次いで、カラムを例２の場合（ＣＳ２７）
のようにホウ酸溶液で洗浄し、例２の場合（ＣＳ０６）
のように溶出させて、すべて陽イオン交換カラムの場合
のように塩／界面活性剤（ＣＳ２４）、苛性（ＣＳ２
５）で浄化し、希苛性アルカリ（ＣＳ２６）中で貯蔵す
る。全ステップの流速は０．０７〜０．７５倍層容量／
min、好ましくは０．３〜０．６、この例では０．５倍
層容量／minである。

【００８０】陰イオン交換樹脂（例えば、ＤＥ‐ＦＦ）
からの溶出液は、不純物をなお含有しているため、その
後でアフィニティマトリックス（例えば、例２に記載さ
れたようなDelta Blue Agarose）に直接適用する。層高
を例２の２５ｃｍから１１．０±１．０ｃｍに下げて、
標準操作圧力内で高い流速にさせた。したがって、１
１．０ｃｍの層高が好ましく、アルブミンの回収率また
はアルブミン純度に悪影響を与えない。カラムを酢酸ア
ンモニウム（ＣＳ２９中でのように１００〜３００ｍ
Ｍ、好ましくは２００〜２７５、例えば２５０ｍＭ）で
平衡化させ、アルブミンを７．０〜１４．０ｇ／ｌ、好
ましくは８．０〜１２．０ｇ／ｌ、この例では１０．０
±〜１．０ｇ／ｌマトリックスで適用した。平衡化、担
持および洗浄ステップは、０．０５〜０．３０倍層容量
/min、好ましくは０．１５〜０．２７、この例では０．
２５倍層容量/minの流速で行った。他のすべてのステッ
プは、０．０４〜０．３０、好ましくは０．１〜０．２
５、この例では０．２０倍層容量/minで行った。層高の
減少で促進される流速の増加は大規模プラントデザイン
にとり有利な４倍まで処理量を改善して、ＤＢＡの最大
操作能力に近かった。この増加した流速はアルブミンの
回収率またはアルブミン純度に悪影響を与えないようで
あったため、このようにより高い流速を利用することが
好ましい。

【００８１】カラムを５倍カラム容量の酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ＣＳ２９）で洗浄し、アルブミンを強塩およ
びリン酸溶液（ＣＳ３０中でのように１．０〜３．０Ｍ
ＮａＣｌ、例えば１．５〜２．５Ｍまたは２．０Ｍ
ＮａＣｌと、５〜１００ｍＭ、例えば５０ｍＭリン酸
（phosphate））で溶出させた。

【００８２】プロセスのこの変法における溶離液のｐＨ
は、ｐＨ９．２からｐＨ７．０に変化させた。そのた
め、緩衝液を５０ｍＭ酢酸アンモニウムから５０ｍＭリ
ン酸ナトリウムに変えたが、これはｐＨ７．０でのその
緩衝化とその相対的コストのために好ましかった。低ｐ
Ｈ溶離液は、ＤＢＡ溶出液アルブミンモノマー回収率の
増加に寄与していた。７．０未満のｐＨは断片のレベル
を増加させ、ｐＨ７．０を超えるとアルブミンモノマー
回収率は減少した。したがって、ｐＨは５．５〜９．０
範囲で可能だが、好ましくはｐＨ７．０である。カラム
を浄化し、上記のように苛性アルカリ（ＣＳ２５、ＣＳ
２６）中で貯蔵した。

【００８３】次いで、（８０〜１１０ｇ／ｌのアルブミ
ンを得るために、場合によりセルロースタイプ膜（公称
カットオフＭＷ３０，０００）で限外ロ過後の）ＤＢＡ
溶出液をゲル浸透樹脂、例えばＳ‐２００（ＨＲ）に適
用した。Ｓ‐２００ランニング緩衝液は４０ｍＭリン酸
ナトリウムｐＨ７．０に変えた。オクタン酸ナトリウム
はコストの理由でこの緩衝液から省略し、その代わりダ
イアフィルトレーション前に溶液に加えた（１〜２０ｍ
Ｍ、好ましくは５ｍＭの濃度まで加えた）。リン酸は純
度を改善するランニング緩衝液に高い導電率を付与し
た。高塩濃度は導電率を増加させるために用い得るが、
溶液を緩衝化させておくことがなお好ましい。ｐＨ７．
０が処方上望ましいｐＨであることから好ましかった。

【００８４】このため、この例だと、精製ステップの順
序は陽イオン交換（アルブミンにより特異的に結合され
た分子と共に溶出する）、陰イオン交換、アフィニティ
クロマトグラフィーおよびゲル浸透である。

【００８５】処方前のダイアフィルトレーションステッ
プは、ｐＨ７．０でアルブミンから出発することにより
助けてもよい。アルブミンは例２のプロセスでよりも最
終溶出液でもっと濃縮させて、処方（例３）前に最終限
外ロ過ステップを助けた。

【００８６】例５：陽イオン交換体での高塩洗浄 プロセスの別な変法において、例２または４のプロセス
を下記のように変更して行う。陽イオン交換カラム（例
えば、ＳＰ‐Sepharose ＦＦ、Pharmacia）へのアルブ
ミンの担持後に、カラムをＣＳ２１（５０ｍＭ酢酸ナト
リウム、ｐＨ３．９〜４．１、０．６〜０．８mS/cm）
で洗浄してから、ＣＳ２０での最終洗浄前に、酢酸ナト
リウム緩衝液（例えば、１０〜５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、好ましくは約２７ｍＭ、ｐＨ３．５〜４．５、好ま
しくはｐＨ４．０）中に１〜３ＭＮａＣｌ、好ましくは
２Ｍ ＮａＣｌを含有した高塩緩衝液で更に洗浄した。
この一層厳密な洗浄操作が低レベルの非アルブミンタン
パク質を含有した溶出液にしており、アルブミンが酵母
発酵からのｒＨＡであるならば特に有用と思われる。ア
ルブミンは例４に記載されたように溶出させた。高塩洗
浄前にｐＨを低下させるとその洗浄中にカラムにアルブ
ミンを留める上で役立ち、最終洗浄もアルブミン回収率
を最大にする。どのステップも、回収されたアルブミン
の純度に大きな影響を有しないと思われる。

【００８７】例６：陰イオン交換体からの濃ホウ酸（borate）溶出 この例では、例２または４のプロセス（例５の変更と共
にまたはなしに）を下記のように変更した。陽イオン交
換カラムからの溶出液を１０mS/cm未満、好ましくは５m
S/cm未満に希釈し、その後陰イオン交換マトリックス
（例えば、ＤＥＡＥ Sepharose ＦＦ、Pharmacia ）に
担持させた。次いで陰イオン交換マトリックスは約９．
２までｐＨを上げる効果を有する希テトラホウ酸緩衝液
（例えば、１５〜２５ｍＭテトラホウ酸カリウムまたは
テトラホウ酸ナトリウム）で洗浄し、その後アルブミン
を更に濃縮テトラホウ酸緩衝液（例えば、８０〜１５０
ｍＭテトラホウ酸カリウム、好ましくは１１０ｍＭテト
ラホウ酸カリウム）で溶出させた。例２および４では、
アルブミンを２０ｍＭテトラホウ酸（borate）、１００
ｍＭ ＮａＣｌで溶出させた；８０〜１５０ｍＭテトラ
ホウ酸（例えば、３３．６ｇ／ｌ）での溶出は、これら
の条件下で陰イオン交換マトリックスに対するこれら種
の親和性増加のために、炭水化物含有混入物質、例えば
酵母糖タンパク質の含有率がより低い溶出液を生じる。
テトラホウ酸カリウムは、室温でその高い溶解度のため
に、テトラホウ酸ナトリウムよりも優先して用いられ
る。陰イオン交換マトリックスからの溶出液は例２また
は４のように処理した。例えば、例４プロセスにおい
て、それはアフィニティマトリックス、例えばDelta Bl
ue Agarose（ＤＢＡ）に直接担持させて、例４に記載さ
れたように行った。

【００８８】次いで、ゲル浸透ステップを例２または４
のように行う。

【００８９】例７：固定化アミノフェニルボロネート ＤＢＡマトリックスからの溶出液は、塩化ナトリウム
（２０〜２０００ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭ）およ
びオクタノエート（１〜２０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ
オクタノエート、ｐＨ９．０〜９．５、好ましくは９．
２）を含有した酢酸アンモニウム緩衝液（例えば１０〜
１００ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ）で平衡化されたゲ
ル浸透媒体、例えばSephacryl Ｓ‐２００（ＨＲ）（Ph
armacia）に適用してもよい。この緩衝液は、以下で更
に詳細に記された、最終クロマトグラフィーステップに
適した溶液中にアルブミンを効果的に交換する。

【００９０】Ｓ‐２００ステップは次のように行なう。
Ｓ‐２００は９０．０±３ｃｍ（例えば、直列で３×３
０ｃｍ）の最小層高で行なう。（ａ）中間限外ロ過から
の保留液をカラム上に担持させる。リサイクルおよび産
物フラクションを集める。このステップはすべての物質
がカラム上に担持されるまで繰り返す。（ｂ）プールさ
れたリサイクルフラクションを上記のように限外ロ過で
ｒＨＡ８０〜１１０ｇ／ｌまで濃縮させる。（ｃ）リサ
イクル限外ロ過からの保留液を同様のカラム上に担持さ
せ、産物フラクションを各ピークから集める。このステ
ップはすべての物質がカラム上に担持されるまで繰り返
す。（ｄ）一次および二次ゲル浸透クロマトグラフィー
ステップ（（ａ）および（ｃ））からの産物フラクショ
ンはＳ‐２００溶出液としてプールする。

【００９１】最終ステップは、糖タンパク質および糖脂
質と多、オリゴおよび単糖のような複合糖質を除去する
アフィニティステップからなる。このステップでは、リ
ガンドとして固定されたアミノフェニルボロン酸（boro
nic acid）（ＰＢＡ）を用いる。ＵＳ特許第４，５６
２，２５１号（引用により本明細書に包含される）では
ジボロトリアジンアガロースまたはモノボロトリアジン
アガロースを作る上で適した方法について記載してい
る：（１）トリアジンは最初にアガロースにＯ結合さ
せ、その後第二反応で３‐アミノフェニルボロン酸（Ａ
ＰＢＡ）と結合させる。トリアジン上のＸが塩素に代え
られると、二置換樹脂が得られる。（２）トリアジン
は、モノまたはジボロトリアジンを作るために、まずＡ
ＰＢＡと反応させる。次いでこれらは、一または二置換
アガロースを作るために、トリアジン上の遊離塩素を介
して‐ＯＮａ活性化アガロースにＯ結合させる。この特
許におけるすべての例および記載では、Ｏ‐結合を生じ
る‐ＯＮａ活性化アガロースを用いる。それより先のＵ
Ｓ特許第４，２６９，６０５号では、本発明で好まし
い、アガロースのエピクロロヒドリン活性化を含めた様
々なマトリックス活性化法について考えられている。市
販マトリックスには、Amicon's ＰＢＡ３０およびSigm
a'sアクリルビーズ化アミノフェニルボロネートなどが
ある。

【００９２】Ｓ‐２００カラムから集められたアルブミ
ンは、Ｓ‐２００ランニング緩衝液（前記参照）で前平
衡化されたＰＢＡマトリックスでクロマトグラフィーに
付した；これらの条件下で、アルブミンはマトリックス
にあまり結合しないが、炭水化物ベースの混入物質はカ
ラムを通過するときにアルブミンから分離させうるよう
に十分に遅れてくる。このため、クロマトグラフィーは
アルブミンに関してネガティブモードにある。それ以上
の詳細は下記のとおりであった。フェニルボロネートマ
トリックスは１１．０±１．０ｃｍの流路長を有してお
り、アンモニウムイオン（１０〜５０ｍＭ）、酢酸（１
０〜５０ｍＭ）および１．０〜１０．０ｍＭオクタン酸
（例えば、ＣＳ３６‐後記表参照）を含有した緩衝液で
平衡化させた。次いで、カラムを３５±１５ｇ／Ｌマト
リックスのｒＨＡで担持させた。ＰＢＡはネガティブス
テップとして行ない、したがって集められた産物は、担
持とその後の平衡緩衝液での洗浄中におけるフロースル
ー（flow through）である。すべてのクロマトグラフィ
ーステップは０．００５〜０．３倍層容量/min範囲の流
速で行える。好ましくは、カラムの平衡化および浄化は
アルブミン溶液の担持および収集よりも高い流速、例え
ば０．１９倍層容量/minで行い、好ましくは０．０１〜
０．０５、好ましくは０．０２５倍層容量/minで行う。
次いで、カラムはホウ酸緩衝液（ＣＳ３７でのよう
に）、塩（ＣＳ３８）および苛性アルカリ（ＣＳ２５）
で浄化し、その後ホウ酸緩衝液（ＣＳ３７）に貯蔵す
る。

【００９３】集められたフロースルーおよび洗液のｐＨ
は、リン酸溶液（ＣＳ３５）で７．０±０．１に調整す
る。

【００９４】用いられる緩衝液は下記のとおりである。

【００９５】 表４：例７のクロマトグラフィー溶液 溶 液 成 分 濃度（g/l） ｐＨ 導電率(mS/cm) No. 名称 CS36 PBA CH₃COONH₄ 2.31 平衡/洗液 NaOH(27%(w/w)) 2.55 9.0‐9.4 12.0‐15.0 NaCl 5.84オクタン酸 0.721 CS37 ホウ酸浄化 K ₂ B ₄ O ₇ ・4H ₂ O 33.6 9.2‐9.5 15.0‐18.0 CS38 塩浄化 CH₃COOH 1.62 NaOH(27%(w/w)) 1.19 3.9‐4.1 125.0‐165.0 NaCl 117.0 ＰＢＡ緩衝液中におけるアンモニウムイオンの使用のた
めに、上記例３に記されたような最終限外ロ過ステップ
では塩を用いることが有利である。

【００９６】特に好ましいプロセスにおいて、ステップ
の順序は下記のとおりである： （１）例１のような酵母発酵 （２）例２のような遠心物コンディショニング （３）例５のような高塩洗浄での陽イオン交換（ＳＰ‐
ＦＦ）と、例４のようなアルブミン特異性化合物での溶
出 （４）例６のような、希釈と濃テトラホウ酸（tetrabor
ate）溶出での陰イオン交換 （５）例４のようなアフィニティクロマトグラフィー
（ＤＢＡ） （６）例７のような、中間限外ロ過、その後ゲル浸透
（Ｓ‐２００）、およびリサイクル限外ロ過 （７）例７のような固定ホウ酸（immobilised borate）
上でのクロマトグラフィー （８）例３のような最終限外ロ過および処方例８：固定化フェニルボロネートの早期使用 固定フェニルボロネートを使うステップは、そのプロセ
スで、例えばステップの順序が陽イオン交換体‐陰イオ
ン交換体‐アフィニティ物質‐限外ロ過／ダイアフィル
トレーション‐固定フェニルボロネート‐ゲル浸透であ
るプロセスで早期に用いることができる。

【００９７】各ステップの条件は例４〜７のとおりであ
るが、但し下記のようにする。ＤＢＡ溶出液をアルブミ
ン８０〜１１０ｇ／ｌに濃縮し、ｐＨを例７で用いられ
た種類の酢酸アンモニウムに対してダイアフィルトレー
ション（５倍容量）することにより９．２に調整する。
次いで濃縮ＤＢＡ溶出液をＰＢＡでクロマトグラフィー
に付し、フロースルーを集めて、ゲル浸透（例えば、Ｓ
２００）カラムに直接適用する。ゲル浸透ステップがこ
こでは最後のステップであるため、処方ステップに適し
た緩衝液、例えば２０〜１３０ｍＭ（好ましくは、５０
〜１００ｍＭ）ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で行なってもよ
い。

【００９８】例９：本発明により生産されたアルブミンの特徴 この例では、本発明に従い精製されたアルブミンの純度
を確認するために行われる分析について示している。他
で指摘されないかぎり、すべてのアッセイは、最終産物
を得るために例３に記載されたように処方されたアルブ
ミンで行う。

【００９９】ｒＨＡのグリケーション（glycation） グリケートされたタンパク質のマイクロアッセイでは、
本発明により精製された（ｒＨＡ）が非酵素グリコシル
化（グリケーション）により修飾されていないことを示
した。マイクロアッセイでは、過ヨウ素酸（periodat
e）によるＡＰのＣ‐１ヒドロキシル基の酸化により、
安定なアマドリ産物（ＡＰ）形のグリケート化タンパク
質を測定する。過ヨウ素酸酸化により放出されたホルム
アルデヒドは、アンモニア中でアセチルアセトンとの反
応による、発色団ジアセチルジヒドロルチジン（ＤＤ
Ｌ）への変換により定量する。次いで、ＤＤＬは４０５
ｎｍで比色分析により検出する。

【０１００】 アルブミンバッチ モルヘキソース／モルタンパク質 Ａ ０．０９２ Ｂ ０．１１６ Ｃ ０．０９０ Ｄ ０．１３２ Ｅ ０．０６０ Ｇ ０．０４ Ｈ ０．０１ Ｉ ０．０７ Ｊ ０．０７ Ｋ ０．０５ Ｌ ０．７４０ Ｍ ０．７０ Ｎ ０．９６ Ｏ ０．７８ バッチＡ〜Ｋは例２により精製されたｒＨＡであった。
バッチＬ〜Ｏは異なる供給元からの市販ヒト血清アルブ
ミンのサンプルであった。例７により精製されたｒＨＡ
の８バッチは、ＨＳＡ（０．３８７±０．０１２）と比
較して、無視しうるグリケーションレベル（０．０４２
±０．０１８モル／モル）であった。

【０１０１】低分子量混入物質アッセイ 原理 ‐このアッセイの目的は、酸性有機溶媒を用いてｒ
ＨＡおよびＨＳＡから非共有結合低分子量混入物質（Ｌ
ＭＣ）を除去することである。その後ＨＰＬＣ“指紋”
クロマトグラムが、サンプルの比較のために生成されう
る。

【０１０２】方法‐１００μｌの最終産物（２０ｍｇ；
ｒＨＡまたはＨＳＡ）にギ酸（９８％ｖ／ｖ）５０μ
ｌ、クロロホルム１００μｌおよびエタノール５０μｌ
を順次加えて、各添加後に撹拌する。サンプルを規則的
に混合しながら室温で５分間保つ。次いでタンパク質を
アセトン１ｍｌの添加により沈降させる（３０分間、−
２０℃）。タンパク質サンプルを遠心によりペレット化
し、上澄をデカントし、真空下でロータリーエバポレー
ションにより乾燥させる。乾燥サンプルを２５％アセト
ニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸に再懸濁する。次
いで、ＬＭＣは０．１％トリフルオロ酢酸中直線１０％
〜９０％アセトニトリル勾配を用いてＡＢＩ ＰＴＨ
Ｃ１８逆相カラム（２２０×２．１ｍｍ）で分離させる
（流速＝３００μｌ/min）。サンプルは ShimadzuＵＶ
モニターを用いて２１４ｎｍでモニターした。

【０１０３】結果‐ヒト血清アルブミンの市販バッチと
本発明に従い精製されたｒＨＡのバッチとの比較を行っ
た。２つの主な有意のＡ_{２１４ｎｍ}ピークが本発明のサ
ンプルでみられる（Ｒ_ｔ＝各々３１．１および４２．８
min‐図２および表９参照）。２．１５minのピークはカ
ラムを通過する不溶性または部分可溶性物質のためであ
ると思われ、５６．５minの大きなピークは水ブランク
のトレース中にも存在しているため、人工産物と思われ
る。

【０１０４】 表５：ピーク結果 ＃ 保持時間 面 積 高 さ (min) (uV.sec) (uV) １ ０．８００ ３４５９６８６ ２１９１２２ ２ １．６６７ ４１８６０６ ３３５６９ ３ ２．１５０ ７７８８３３３５ １９６３６３０ ４ ３．０００ ６２９３２５８ １２２２９５ ５ ２０．４３３ ２９７６０８ １４４２４ ６ ２２．９００ ２０５８２２ １４６０１ ７ ２７．５６７ １５０８５１ １０８３５ ８ ３１．１１７ ２２１３８８３ １７０９３８ ９ ３７．９８３ １６４７１０ １５０８８ １０ ３９．２６７ ３４７９４６ ２９８７９ １１ ４１．７５０ １０７５１５ ８４０２ １２ ４２．７８３ ２３０３０２４ １９２９１１ １３ ４３．２１７ １３９７４４ １４１４１ １４ ４３．４５７ ２５４５２１ ２３９７９ １５ ５０．４６７ １５２８０５ １３２２６ １６ ５０．９５０ １６２３６４ １２５７７ １７ ５６．５３３ ５７５３７９６ ８３６７４ 他方、市販ＨＳＡは更に多くのピークを有している（図
３および表６参照）。

【０１０５】 表６：ピーク結果 ＃ 保持時間 面積 高さ (min) (uV.sec) (uV) １ ０．３５０ ２４４３８５ ２３９５７ ２ ０．６３３ ６０７８８０ ４５３１０ ３ ０．７８３ ３２３９７３０ ２４３４７７ ４ ０．９８３ １０７２０３３ １５８１４６ ５ ２．２３３ ７６７７３５６９ ２０３８０２８ ６ ２．９３３ ６６３４０８９ １８２３６３ ７ ３．７３３ ２８１２６８８ ９５４５９ ８ １２．４８３ ８１８５４０ ２０１８５ ９ １２．６５０ ２１８７４８ ２２７５０ １０ １４．１５０ ５４２３７１５ ９８３３６ １１ １６．３３３ ４２３４０３ １７４６０ １２ １６．６３３ ６８８５２５ ２４５３８ １３ １７．５５０ ２３０１３０９ ８４７８１ １４ １８．０３３ １１４５０４５ ４７８０６ １５ １９．７５０ ６７２７２１ ２１５６２ １６ ２０．２３３ ８７７９９ ９７６０ １７ ２０．７００ ２７２１７１ １３００３ １８ ２１．１００ ８６２１４６ ５５７９２ １９ ２１．９６７ １６６４７１ ８９２８ ２０ ２２．８８３ １３８１４４５ ９７６６０ ２１ ２３．５８３ １１１２６３２ ８９８５１ ２２ ２４．０００ ４７４０３４７ ４１９７８０ ２３ ２４．４１７ ３５２４８６ ２６３７４ ２４ ２４．９１７ １７１２７９ １４６２５ ２５ ２５．１３３ ９９７３４ １１４７３ ２６ ２５．２６７ １３３９１１ １０５１５ ２７ ２５．６６７ ２２３５５６ １１８５４ ２８ ２５．９６７ ２５７２９５ １７３５１ ２９ ２６．６００ ９３９０６ ７６５７ ３０ ２６．８１７ ２２３１１３ １８３２６ ３１ ２７．２５０ ３０３８３１ ２９４６１ ３２ ２７．５３３ １２４２１８ １２７１０ ３３ ２７．７８３ ５７４７０９１ ５６１６２９ ３４ ２８．５５０ １３８３７６１ １１９７７２ ３５ ２９．０３３ ３９０９８６ ３３４５５ ３６ ２９．４１７ １８２１３１ １２７１３ ３７ ２９．８３３ １８１３３３ １２５８４ ３８ ３０．１８３ ４７８３２０ ３０１５５ ３９ ３０．５８３ １０４８９４５ ５８４６５ ４０ ３１．０６７ ３４５４４２５ ２１４４８９ ４１ ３１．９８３ １６８２７５ ８６６３ ４２ ３２．７１７ ６５１４０６ ４３１６１ ４３ ３３．１５０ １１４２２２１ １０２５８８ ４４ ３４．０１７ ４２０７５６ ２３８８３ ４５ ３５．１００ １１５７０４ １０００８ ４６ ３７．０３３ １６６５８８ ９４６８ ４７ ３８．２６７ １４５７３１ ８０７８ ４８ ３８．９８３ ７８１２０９ ５４０２９ ４９ ４１．８００ ８６９６７ ８８６８ ５０ ４８．８８３ ９５４１６ ８５２２ ５１ ５０．２６７ １７４１５９ １６７３７ ５２ ５０．４８３ １７６１１５ １５５７３ ５３ ５１．２６７ １５８７２７ １３７０１ ５４ ５２．１８３ ２９７２７８ ２５７９５ ５５ ５６．５３３ ５８４６６４５ ８５７１０ 非共有結合ＬＭＣに関する本発明のアルブミンの品質
は、臨床用ＨＳＡの場合よりも明らかに優れている。数
値で表すと、本発明のアルブミンについて１０分と５５
分の間の全ピーク面積は約６．４Ｖ.secであり、市販物
質について同じ２つの時間の間における全ピーク面積は
約３９．７Ｖ.secであった。

【０１０６】同様の分析は２８０ｎｍでの検出により行
い、そこでは本発明に従い精製されたアルブミンのピー
ク面積は０．５６Ｖ.secであり、ＨＳＡの場合は１４．
９Ｖ.secであった。

【０１０７】蛍光低分子量混入物質の分析（２８０ｎｍ
で励起、３５０ｎｍで検出）でも、本発明の方法により
精製されたアルブミンについて、ＨＳＡの場合の１０％
未満の全ピーク面積を表す。

【０１０８】ｒＨＡおよびＨＳＡのキャピラリーゾーン電気泳動 キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、本発明の精製ｒＨＡ
と市販ＨＳＡを定性的に比較するために、標準ＳＤＳ‐
ＰＡＧＥの代わりとして用いる。ＣＥは高分解能電気泳
動技術であり、ほんの小さな差異がみられると、同様の
タンパク質のサブ集団（sub-populations）を分離する
ことができる。

【０１０９】方法‐ＨＳＡ（Armour）および本発明に従
い精製されたｒＨＡのサンプルを２０ＫｅＶおよび３０
℃で２０ｍＭ ＰＯ_４／Ｂ_４Ｏ_７緩衝液、ｐＨ＝７．４
により分離し、ＡＢＩ２７０ＣＥで電気泳動に付した。
本発明のｒＨＡは電気泳動図で単一ピークを与え、その
均一性を示した。逆に、他のピークが市販ＨＳＡサンプ
ルで観察された。これらのピークは、例えば遊離チオー
ル基がブロックされたかまたはアミノ末端が分解したア
ルブミン分子の存在を示すと考えられる。

【０１１０】Ｃ末端の分析 組換えタンパク質の質的コントロールの重要な面は、予
備決定される一次構造の確立と安定性である。

【０１１１】材料および方法 トリプシン消化：ＨＳＡ（市販源から‐１つのサンプル
は−２０℃で貯蔵し、１つは３０℃で１２週間貯蔵す
る）、本発明に従い精製されたｒＨＡ（４℃および３０
℃で６月間貯蔵する）およびＤｅｓ‐Ｌｅｕ ｒＨＡ
（Ｃ末端ロイシンのないｒＨＡの切欠形）（各１ｍｇ）
を３７℃で１２０分間かけて５ｍＭジチオトレイトール
（Calbiochem）により還元させ、その後０．５Ｍ Tris
ＨＣｌ ｐＨ８．０中６ＭグアニジンＨＣｌ中３７℃で
９０分間かけて１０ｍＭヨードアセトアミド（Sigma）
でアルキル化した。

【０１１２】次いで、サンプルをＨ_２Ｏで１対３希釈
し、３７℃で４８時間かけてトリプシンで消化した（Si
gmaのＴＰＣＫ処理トリプシン、１mg/ml溶液の３×１０
μｌアリコットを４８時間にわたって加える）。

【０１１３】ペプチドマッピング：トリプシン消化物
は、２５ｃｍ Pharmacia SuperPac Pep-Sカラム（５μ
ｍ Ｃ_２／Ｃ_１８）を用いて、Gilson ＨＰＬＣ系によ
る逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣでマッピングした。用いられた
溶離剤は、Ａ．水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（ＡＢ
Ｉ）；Ｂ．７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（Fisons S
cientific）中０．０９％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ‐６０分
間、０．５ml/minの直線勾配であった。２１４ｎｍおよ
び２８０ｎｍでのＵＶ検出。

【０１１４】Ｎ末端配列決定：ＡＢＩ４７７Ａタンパク
質シーケンサーで行う 高速原子衝突‐質量スペクトル分析：ＦＡＢ‐ＭＳをＭ
‐Scan Limited，Ascot，ＵＫによりＶＧ Autospecで行
った。

【０１１５】ペプチド合成：全長Ｃ末端トリプシン処理
ペプチドＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（質量１０１２）をＡ
ＢＩ，Warrington，ＵＫにより合成した；切欠き体ＬＶ
ＡＡＳＱＡＡＬＧ（質量８９９）をDepartment of Bioc
hemistry，University ofNottingham，Nottingham，Ｕ
Ｋにより合成した。

【０１１６】結果 全長Ｃ末端トリプシン処理ペプチド（質量１０１２）
は、合成マーカーペプチドを用いると、ＲＰ‐ＨＰＬＣ
で３７．５minで溶出することが示された。このピーク
を集め、ＨＳＡおよびｒＨＡからＮ末端配列決定および
ＦＡＢ‐ＭＳにより同定した。

【０１１７】Ｃ末端ロイシンの除去は切欠きＣ末端ペプ
チド（質量８９９）を生じ、これは２８．５分で溶出す
ることが示され、合成マーカーペプチドを用いて確認し
た。このピークはＤｅｓ‐Ｌｅｕ ｒＨＡのトリプシン
消化物から単離して、Ｎ末端配列決定およびＦＡＢ‐Ｍ
Ｓにより同定した。他の２つのペプチドは２８．５分ピ
ーク、ＡＷＡＶＡＲ（質量６７３）およびＤＬＧＥＥＮ
ＦＫ（質量９５０）に存在することが示された。

【０１１８】２８．５分ピークをＨＳＡのトリプシン消
化物、３０℃で１２週間貯蔵されたＨＳＡ、Ｄｅｓ‐Ｌ
ｅｕ ｒＨＡ、４℃で６月間貯蔵された本発明のｒＨＡ
および３０℃で６月間貯蔵された本発明のｒＨＡからＲ
Ｐ‐ＨＰＬＣで集めた。

【０１１９】各消化物からのピークは、その後で合成マ
ーカーペプチドと一緒に、Ｎ末端配列決定およびＦＡＢ
‐ＭＳにより分析した。

【０１２０】表７．Ｎ末端配列決定により２８．５min ピークに存在するペプチド サンプル 配列 Ｄｅｓ‐Ｌｅｕ ｒＨＡ ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ ＡＷＡＶＡＲ ＤＬＧＥＥＮＦＫ ＨＳＡ標準 ＡＷＡＶＡＲ ＤＬＧＥＥＮＦＫ ＋約５％ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ ３０℃で１２週間のＨＳＡ ＡＷＡＶＡＲ ＤＬＧＥＥＮＦＫ ４℃で６月間のｒＨＡ ＡＷＡＶＡＲ ＤＬＧＥＥＮＦＫ ３０℃で６月間のｒＨＡ ＡＷＡＶＡＲ ＤＬＧＥＥＮＦＫ ＦＡＢ‐ＭＳによると、２８．５分ピークに存在する主
シグナル（（Ｍ＋Ｈ） ^＋分子イオン）は表８に示された
とおりであった。

【０１２１】表８． ２８．５min ピーク中の（Ｍ＋Ｈ） ^＋ イオン 合成全長および切欠Ｃ末端 １０１３‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬペプチドの混合物 ９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ Ｄｅｓ‐Ｌｅｕ ｒＨＡ ６７３‐ＡＷＡＶＡＲ ９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ ９５１‐ＤＬＧＥＥＮＦＫ １０２８‐ ？ １１４０‐ ？ ＨＳＡ標準 ６７３‐ＡＷＡＶＡＲ ９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ ９５１‐ＤＬＧＥＥＮＦＫ １０２８‐ ？ １１４０‐ ？ ３０℃で６月間のｒＨＡ ６７３‐ＡＷＡＶＡＲ ９００‐ＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧ １０２８‐ ？ １１４０‐ ？ ９５１‐シグナルなし １０２８および１１４０でのシグナルは断片イオンと思
われる；それらは配列分析により検出できるペプチドで
はなかった。

【０１２２】結論 Ｄｅｓ‐Ｌｅｕ Ｃ末端トリプシン処理ペプチドは約５
〜１０％（定量ではない）で市販ＨＳＡに検出された
が、本発明のｒＨＡでは３０℃で６月間後であっても検
出できなかった。Ｄｅｓ‐Ｌｅｕペプチドは３０℃で１
２週目にＨＳＡで検出できず、全長Ｃ末端ペプチドで３
７．５分のピーク（単離されないが）は他のサンプルと
比較して非常に減少しており、おそらくこれがＣ末端分
解を更に受けたことを示している。

【０１２３】これらの結果は、本発明に従い精製された
ｒＨＡが安定な完全長カルボキシ末端を有しているが、
市販源から既に入手できるＨＳＡは比較してみると不均
質（heterogeneous）と思われることを示している。

【０１２４】精製ヒトアルブミン中の遊離チオールに関
する比色分析アッセイ 序文 ‐エルマン試薬、５，５′‐ジチオビス（２‐ニト
ロベンゾエート）（ＤＴＮＢ）はＣｙｓ‐ＳＨのような
遊離チオール基を検出する特異的な高感度手段である。
その反応の後で４１２ｎｍの吸光度をモニターでき、そ
の値を用いてｒＨＡの分子当たり１残基未満のレベルま
で遊離Ｃｙｓ‐ＳＨを計算することができる。下記の溶
液、試薬をアッセイで利用する： ５，５′‐ジチオビス（２‐ニトロ安息香酸）ＤＴＮ
Ｂ，Sigma Product ＮｏＤ８１３０ TRIS PRE-SET pH結晶ｐＨ８．０，Sigma Product Ｎｏ
Ｔ４７５３ ＥＤＴＡ・二ナトリウム，Sigma Product Ｎｏ ＥＤ２
ＳＳ リン酸二水素ナトリウム・二水和物，Analarグレード リン酸水素二ナトリウム・二水和物，Analarグレード緩衝液１ ：０．１Ｍ（１２．１ｇ）Tris‐ＨＣｌ：０．
０１Ｍ（３．７２ｇ）ＥＤＴＡ Ｎａ_２・２Ｈ_２Ｏ，ｐ
Ｈ８．０。PRE-SET pH結晶。水５００ｍｌに溶解して、
正確に１リットル容量に調整する。室温で１月間安定。

【０１２５】緩衝液２：０．０５Ｍリン酸ナトリウムｐ
Ｈ７．０、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ（５．４５ｇ）、
３．０４ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ。水５００ｍｌ
に溶解して、正確に１リットル容量に調整する。室温で
１月間安定。

【０１２６】試薬：リン酸緩衝液中０．０１Ｍ（３９．
４ｍｇ）ＤＴＮＢ。緩衝液２の１０ｍｌに溶解する。各
々の日に新たに調製する。

【０１２７】サンプル：アルブミンを緩衝液１で約１
０．３μＭ（０．６６mg/ml）まで希釈する。

【０１２８】操作 １）分光光度計セルホルダーサーモスタットを２５℃に
セットする。２）１つのキュベット中のサンプル１．２
５ｍｌと、他の１０ｍｍ減容量キュベット中の緩衝液の
１．２５ｍｌとをサンプルおよびレファレンス位置に各
々入れる。３）４１２ｎｍで計器をゼロ調整する。吸光
度を０．１ＡＵフルスケールにセットする。４）ＤＴＮ
Ｂ試薬５０μｌをレファレンスキュベットに加え、きれ
いなプラスチックスターラーを用いてしばらく混合す
る。５）ＤＴＮＢ試薬５０μｌをサンプルキュベットに
加え、上記のように混合する。６）直ちにデータ捕捉を
始める（またはチャートレコーダーを始動させて、１０
分まで反応を追跡する）。７）値を同じく３回にわたり
得るために、各サンプルについて繰り返す。８）安定し
た吸光度減衰からゼロ時間に逆外挿して、４１２ｎｍで
吸光度（δＡ_４１２）を読み取る（図１）。９）モル吸
光係数ε_４１２＝１３．９cm²/mMを用いてスルフヒドリ
ル含有量を計算する。

【０１２９】結果 いくつかの市販ＨＳＡサンプルを遊離チオール含有量に
ついてアッセイし、結果は以下にまとめた：ＨＳＡ 遊離チオール（モルＳＨ／モルＨＳＡ） １ ０．２９ ２ ０．２２ ３ ０．３５ ４ ０．０５ ５ ０．０８ ６ ０．４６ ７ ０．３６ これらの値は、０．８５〜０．９モルＳＨ／モルｒＨＡ
でルーチンに分析された、上記例に従い作られたアルブ
ミンの値よりも有意に低い。

【０１３０】グラファイトファーネス(furnace)スペク
トル分析によるヒトアルブミン中の金属イオン混入の測
定 標準およびサンプルをパイロコート（pyrocoat）された
グラファイト管から原子化する。サンプルの原子吸光は
下記条件を用いて検出する： 金属イオン 波長ｎｍ 原子化温度℃ Ｚｎ ２１３．９ １８００ Ｃｕ ３２７．４ ２３００ Ｆｅ ２４８．８ ２４００ Ａｌ ３０９．８ ２５００ Ｍｎ ２７９．８ ２２００ アルミニウムはPerkin Elmer Ｍ２１００原子吸収スペ
クトル分析器、PerkinElmer ＨＧＡ‐７００グラファイ
トファーネス、サンプルカップ付きPerkin Elmer ＡＳ
‐７０オートサンプラーおよびアルミニウム中空カソー
ドランプを用いて測定した。試薬はＡＲグレード硝酸マ
グネシウム、アルミニウム標準溶液（１０００ｐｐｍ）
およびＡＲグレード濃硝酸であった。１．００％ｗ／ｖ
硝酸マグネシウム溶液はMilli-Ｑ水で調製した。アルミ
ニウム標準溶液１５μｌをピペットでオートサンプラー
に入れ、０．２０％硝酸溶液で１５００μｌまで希釈し
た。操作は、得られた溶液１５μｌと、その後に得られ
た溶液１５０μｌで繰返して、１０ｐｐｂ（μｇ／ｌ）
アルミニウム溶液を得る。

【０１３１】アルブミンサンプルを０．２０％硝酸溶液
で希釈して、検量線図の限界内でアルミニウム濃度を得
る。１：２希釈で通常十分である。

【０１３２】マグネシウムも同様にPerkin Elmer ＡＳ
‐５１フレームオートサンプラーおよびマグネシウム中
空カソードランプを用いて測定する。１０００ｐｐｍの
マグネシウム標準溶液をMilli-Ｑ水で希釈して、０．
１、０．２、０．５および１．０ｐｐｍ標準溶液を得
る。サンプルの原子吸光は２８５．２ｎｍで検出する。

【０１３３】銅、鉄、マンガンおよび亜鉛もアルミニウ
ムと同様に測定するが、亜鉛の場合は１．０ｐｐｂ（μ
ｇ／ｌ）標準溶液を１０ｐｐｂ溶液の代わりに用いる。
金属イオンの濃度はｎｇ／Ｌで測定し、その後アルブミ
ンの濃度に関連させる（金属イオンｎｇ／ｇアルブミ
ン）。これらのデータは表９に掲載している。

【０１３４】

【表９】 すべての結果は全金属イオン濃度として表示してある。

【０１３５】表１０は市販ＨＳＡ中における金属イオン
の対応レベルを示している。

【０１３６】

【表１０】 本発明の製品中におけるアルミニウムの平均レベルは約
６０ｎｇ／ｇであり、市販品は１５５〜３１９０ｎｇ／
ｇであることがわかる。同様に、本発明の製品は平均約
９４８ｎｇ／ｇの鉄（比較従来物質では１８５０〜４
１，２００ｎｇ／ｇ）、平均２９９０ｎｇ／ｇの銅（従
来物質では５８０〜２３，８４０ｎｇ／ｇ）、平均１１
２０ｎｇ／ｇのマグネシウム（従来物質では５００〜５
４，０００ｎｇ／ｇ）、平均２３９０ｎｇ／ｇの亜鉛
（従来物質では９３０〜７２３０ｎｇ／ｇ）および平均
４８ｎｇ／ｇのマンガン（従来物質では６５〜９４０ｎ
ｇ／ｇ）を有していた。

【０１３７】中および長鎖脂肪酸の分析 本発明によるアルブミンと市販ＨＳＡの脂肪酸プロフィ
ールは、Ｃ１７：０内部標準を用いて、遊離脂肪酸の酸
性溶媒抽出とガスクロマトグラフィーにより分析した。

【０１３８】装置：フレームイオン化検出器装備のガス
クロマトグラフ（例えば、ShimadzuＧＣ９Ａ）；オート
インジェクター（例えば、Shimadzu ＡＯＣ１４）；イ
ンテグレーター／プリンター（例えば、Shimadzu ＣＲ
４Ａ）；ＨＰ‐ＦＦＡ３０×０．５３ｍｍ、１．０μｍ
相カラム（Hewlett Packard Ltd.）；直接注入ライナー
装備Megabore Installationキット（ＧＣ９Ａ用のＪ＆
Ｗ Scientific ２２０‐１１５０）試薬 ：水（Milli-Ｑ）；ジクロロメタン超純粋溶媒（Ro
mil Chemicals,Loughborough,Leics.）；酢酸ナトリウ
ム・三水和物Analar（ＢＤＨ Ltd.Poole）；氷酢酸Anal
ar（ＢＤＨ Ltd.Poole）；ヒト血清アルブミン溶液（Ze
nalb^TM２０，BioProducts Laboratory ，Elstree,Hert
s.）；無水硫酸ナトリウム（分析試薬）；Sigmaからの
標準脂肪酸溶液 ：０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５；酢酸
ナトリウム６．１３ｇおよび酢酸３．３０ｇ／１００ｍ
ｌ 遊離脂肪酸標準混合物．各脂肪酸５ｍｇを別々のガラス
バイアル中に秤量する。各脂肪酸をジクロロメタン１ｍ
ｌに溶解し、短鎖（Ｃ６‐Ｃ１４）、中鎖（Ｃ１６‐Ｃ
１８）および長鎖（Ｃ２０‐Ｃ２２：１）脂肪酸につい
て３つの１２ｍｌ Pyrex培養管に各々移す。窒素流下で
混合物を乾燥させ、ジクロロメタン１ｍｌに溶解する。
混合物を５０μｌずつ、ラベルしたガラスバイアルに移
し、窒素下で乾燥させ、キャップを付して、−２０℃で
貯蔵する。

【０１３９】内部標準溶液１mg/mlヘプタデカン酸（ヘ
プタデカン酸２５．０ｍｇ／ジクロロメタン２５ｍｌ）操作 １． ６つのラベルした４０ｍｌ Pyrex管に内部標準溶
液５０μｌを加える。 ２． ５％ｒＨＡの場合にはサンプル５ｍｌを加える。
２５％ｒＨＡの場合にはサンプル１ｍｌおよび水４ｍｌ
を用いる。ブランク（水５ｍｌ）および血清アルブミン
サンプル（Zenalb^TM２０の１．２５ｍｌおよび水３．７
５ｍｌ）を含める。すべてのサンプルを二重に調製す
る。 ３． 酢酸ナトリウム緩衝液２．５ｍｌ、その後ジクロ
ロメタン１０ｍｌをすべての管に加える。 ４． 室温で２時間にわたり機械ローラー上にキャップ
付きの管をおく。 ５． Sorvall ＲＴ６０００Ｂ遠心機中、２０℃、３０
００ｒｐｍで５分間にわたりすべての管を遠心する。 ６． 上方の水相を除去し、その後管の底から作業し
て、ラベルした１２ｍｌPyrex管中に下方のジクロロメ
タン相を慎重に移す。球状タンパク質はすべてのジクロ
ロメタン相の除去を妨げることがある。これが生じるな
らば、１スパチュラ分の無水硫酸ナトリウムを加え、キ
ャップを付して、振盪する。 ７． 窒素流下でジクロロメタン相を乾燥させ、分析す
るまで窒素下−２０℃で貯蔵する。 ８． キャピラリーカラムを取り付けて、製造業者の説
明に従いガスクロマトグラフを下記条件にセットする。 検出器：フレームイオン化；キャリアガス：窒素３０ml
/min；注入容量：０．５μｌ；カラム初期温度：７０
℃；保持：１．５min；勾配１：１５０℃まで２０℃/mi
n；勾配２：２４０℃まで４℃/min；保持：７min；検出
器温度：２８０℃；Shimadzu ＧＣ９Ａに特有のセッテ
ィングは：検出器レンジ（range）：１０゜；水素圧：
０．５kg/cm²；空気圧：０．５kg/cm²；停止時間：５０
minである。 ９． 製造業者の説明に従いガスクロマトグラフからデ
ータを集めるために、インテグレーターを調整する。 １０． オーブン温度を２４５℃に上げ、定常ベースラ
インに達するまでそのままにしておく。 １１． オーブン温度を７０℃に下げて、平衡化させ
る。 １２． 長、中および短鎖脂肪酸標準のアリクウオット
を解凍させる。長鎖脂肪酸をジクロロメタン１ｍｌに溶
解する。その溶液を中鎖脂肪酸に移して、溶解させる。
短脂肪酸についても繰り返す。 １３． 脂肪酸保持時間を調べるために標準混合物を注
入する。得られたクロマトグラムは非常に小さなピーク
テーリングを有し、平坦でゆっくり立ち上がるベースラ
インを有して、正確な数のよく分割されたピークを持っ
ているべきである。カプロン酸（Ｃ６：０）は約６min
の保持時間で、エルカ酸（Ｃ２２：１）は約３３minの
保持時間で溶出するはずだ。例の標準クロマトグラムと
比較してすべてのピークを同定する。 １４． サンプルを注入して、データを集める。

【０１４０】計算 １． ブランクサンプルから内部標準ピークを同定す
る。これは保持時間約２３．５minの主ピークである。 ２． 下記式を用いて、すべてのサンプルで、すべての
積分ピークについてピーク面積比を計算する。 ３． 標準との比較により、保持時間に基づきｒＨＡお
よびＨＳＡサンプルで脂肪酸ピークを同定する。 ４． 下記ファクターを用いて、ｒＨＡおよびＨＳＡ双
方のサンプルについて、すべてのピーク面積比を大体の
濃度（μｇ／ｇアルブミン）に変換する： 濃度（μｇ／ｇ）＝ピーク面積比×２００ ５． 脂肪酸として同定されたピークの場合には、脂肪
酸の分子量と下記式を用いて、濃度をμｇ／ｇアルブミ
ンからモル／モルアルブミンに変換する：

【０１４１】例の結果は、例２に従い得られたアルブミ
ンのバッチ（図４）と市販ＨＳＡ（図５）について示し
ている。異常な脂肪酸はこの方法により前者で検出され
なかったが、２つのタンパク質のプロフィールは有意差
を示した。予想されたように、双方とも多量の添加安定
剤オクタノエート（Ｃ８：０）を示した。これとは別
に、市販ＨＳＡは主にＣ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１
８：０、Ｃ１８：１およびＣ１８：２で特徴付けられ、
本発明のアルブミンは主にＣ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ
１６：１で、時々Ｃ１４：０を含有していた。更なる実
験では、ｒＨＡ最終製品中におけるＣ１０：０およびＣ
１２：０のレベルが、精製プロセスで後の方の段階に用
いられるオクタノエート中におけるこれら混入物質のレ
ベルと相関していることを示した。

【０１４２】例７に従い製造されたｒＨＡに関するデー
タは下記のとおりである：表１１．本発明の製造法に従い精製されたｒＨＡと市販ＨＳＡとの脂肪酸組成の 比較 脂肪酸含量（ mol／mol タンパク質） 脂肪酸 ｒＨＡ ＨＳＡ Ｃ１０：０ ０．１００ ０．００５ Ｃ１２：０ ０．０２０ ０．０１１ Ｃ１４：０ ０．００５ ０．０１７ Ｃ１６：０ ０．０１３ ０．１５２ Ｃ１６：１ ０．０６４ ０．０２３ Ｃ１８：０ ０．００２ ０．０２４ Ｃ１８：１ ０．０１２ ０．１４５ Ｃ１８：２ ＮＤ ０．０８９ Ｃ１８：３ ＮＤ ０．００６ Ｃ２０：０ ＮＤ ０．００１ Ｃ２０：１ ＮＤ ０．００１ Ｃ２０：２ ＮＤ ＮＤ Ｃ２０：４ ＮＤ ０．００６ 合計 ０．２１６ ０．４８０ ＮＤ＝検出されず 好ましくは、Ｃ１８脂肪酸の全レベルはオクタノエート
のレベルの１．０％（モル／モル）を超えず、好ましく
はそのレベルの０．５％を超えない。更に、本発明のア
ルブミンにおいて、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３およびＣ２
０脂肪酸のレベルは通常検出不能である。市販ＨＳＡの
場合だと、典型的にはアルブミン１モル当たりＣ１０〜
Ｃ２０脂肪酸約０．４モルである。本発明の生成物で
は、典型的にはＣ２０脂肪酸について検出不能であり、
アルブミン１モル当たりＣ１８脂肪酸約０．０１〜０．
０２モルにすぎない。

【０１４３】色の分析‐１ｃｍキュベット中にある最終
産物の５％（ｗ／ｖ）溶液の吸光度を３５０ｎｍ、４０
３ｎｍおよび５００ｎｍで測定し、路長ｃｍ当りアルブ
ミンｇ／ｌ当りの吸光度（即ち、ＡＬ．ｇ^-1．ｃｍ^-1）
で計算した。本発明のアルブミンは下記値を有してい
る： 波長 平均吸光度（ｎ＝１０バッチ） （ｎｍ） （Ｌ・ｇ^-1・ｃｍ^-1） ３５０ ４．７４×１０^−３ ４０３ ２．１２×１０^−３ ５００ ０．５８×１０^−３ 通常、本発明のアルブミンは上記３つの波長で６．０×
１０^−３、２．５×１０^−３および０．７５×１０^−３
の各吸光度を超えない。

【０１４４】いくつかの市販ＨＳＡ製剤のアッセイで
は、これらの波長でもっと高い吸光度を示した（表１２
参照）。

【０１４５】表１２：従来のＨＳＡ製剤の吸光度（Ｌ．ｇ ^-1 ．ｃｍ ^-1 ） サンプル Ａ _３５０ Ａ _４０３ Ａ _５００ １ ９．９５ ４．１０ ０．８ ２ ９．２５ ５．３６ １．１ ３ ７．４０ ３．２６ ０．６ ４ ７．２０ ３．６０ ０．６ ５ ８．６８ ４．０８ ０．８ ６ １１．４５ ６．２６ １．２ ７ ７．２０ ３．７０ ０．８ ８ ６．８２ ４．７８ １．８ ＳＤＳ還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ‐このアッ
セイは、ｒＨＡが、還元剤（β‐メルカプトエタノー
ル）で処理されたときに、ＳＤＳ還元ポリアクリルアミ
ド電気泳動（ＰＡＧＥ）で単一バンド（モノマー）とし
て移動する単一ポリペプチド鎖からなることを示すため
に行う。

【０１４６】アルブミンのサンプルをＳＤＳ還元緩衝液
（アルブミン１mg/mlと共に２ｍＭＥＤＴＡ、５％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳおよび１０％（ｖ／ｖ）β‐メルカプトエ
タノールを含有した２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ ｐＨ８．
０）中で煮沸し、その後溶液１μｌの担持量を用いて、
ＳＤＳ均質（homogeneous）（１２．５％）Phastgels
（Pharmacia）で分離させた。タンパク質バンドをCooma
ssie Blue Ｒ２５０染色により検出し、Shimadzu ＣＳ
９０００デンシトメーターで走査した。アルブミンの分
離ではCoomassie染色の単一バンドを示して、モノマー
として存在するアルブミンの割合が少くとも９９．９％
であることを示した。

【０１４７】ゲル浸透高圧液体クロマトグラフィー 本発明のプロセスの主態様（即ち、陰イオン交換ステッ
プが限外ロ過および処方前の最終ステップである）にお
ける陰イオン交換マトリックスからの溶出液中でアルブ
ミンの１０mg/ml溶液２５μｌをShimadzu ＬＣ６Ａ Ｈ
ＰＬＣでＴＳＫ３０００ＳＷＸＬカラムに注入する。製
品は少くとも９９．９％モノマーであることがわかっ
た。

【０１４８】２５％ｗ／ｖに処方された、本発明に従い
精製されたアルブミンの第二の１０mg/ml溶液２５μｌ
を同様に分析したところ、０．１％未満のポリマーアル
ブミンの含有であることがわかった。この結果は、ここ
に記載されたような処方が精製アルブミンのポリマー／
凝集物含有率に影響を与えないことを示している。

【０１４９】二次元ゲル電気泳動 本発明のプロセスにより得られたアルブミンのｒＨＡ２
μｇを、Millipore Investigatorシステムを用いて二次
元電気泳動に付した。第一の次元での分離はｐＨ３〜１
０等電点電気泳動ゲルであり、その後第二の次元で１０
％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルを行った。Coomassi
e Blueによるゲルの染色では１つだけのスポットが見
え、１つだけのタンパク質種の存在を示した。

【０１５０】電気スプレー質量スペクトル分析 電気スプレー質量スペクトル分析（ＥＳＭＳ）はＶＧ Q
uattro電気スプレー質量スペクトル分析器を用いて行
い、ｍ／ｚ範囲９５０〜１７５０Ｄａ／ｅでウマ心臓ミ
オグロビン（１６９５１Ｄａ、Sigmaから入手）で較正
した。市販ＨＳＡのサンプルおよび本発明に従い精製さ
れたｒＨＡのサンプルは、トリフルオロ酢酸を含有した
アセトニトリル勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣによる分析
前に脱塩させた。図６ａおよびｂは、本発明のアルブミ
ンおよび従来技術のＨＳＡに関するスペクトルを各々示
している。後者はブロックされた遊離チオールおよびＮ
末端分解を表したピークを示す。

【０１５１】本発明のアルブミンはこのアッセイで実質
的に均質であることがわかり、換言すればそれは約６６
４４１Ｄａの質量で生じる単一の明確なピークを示す。

【０１５２】長期安定性 ２年以上、アルブミンの分解は電気泳動法で検出でき
ず、このことはプロテアーゼ活性が存在しないことを示
している。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｒＨＡを生産するために用いられる発酵槽を概
略図で示している。

【図２】Ｃ１８ＰＴＨ逆相ＨＰＬＣカラム（Applied Bi
osystems Inc.）によるＵＶトレースであり、本発明の
アルブミン中で低レベルの低分子量混入物質を示してい
る。

【図３】図２と同様であるが、従来技術のアルブミン中
の低分子量混入物質を示している。

【図４】市販アルブミンの脂肪酸含量を示したガスクロ
マトグラムである。

【図５】図４に相当するが、本発明のアルブミンを示し
ている。

【図６ａ】本発明のアルブミンに関するエレクトロスプ
レー質量スペクトル分析を示している。

【図６ｂ】従来のアルブミンに関するエレクトロスプレ
ー質量スペクトル分析を示している。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年９月１２日（２００２．９．１
２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (72)発明者 グッディー，アンドリュー ロバート イギリス国ノッティンガム、キャッスル、 ブールバード、キャッスル、コート、デル タ、バイオテクノロジー、リミテッド内 (72)発明者 スリープ，ダレル イギリス国ノッティンガム、キャッスル、 ブールバード、キャッスル、コート デル タ、バイオテクノロジー、リミテッド内 (72)発明者 バン ウルク、ヘンドリク イギリス国ノッティンガム、キャッスル、 ブールバード、キャッスル、コート デル タ、バイオテクノロジー、リミテッド内 (72)発明者 バレゼンコ，スティーブン イギリス国ノッティンガム、キャッスル、 ブールバード、キャッスル、コート デル タ、バイオテクノロジー、リミテッド内 (72)発明者 ウッドロー，ジョン ロドニー イギリス国ノッティンガム、キャッスル、 ブールバード、キャッスル、コート デル タ、バイオテクノロジー、リミテッド内 (72)発明者 ジョンソン，リチャード アラン イギリス国ノッティンガム、ウェスト、ブ リッジフォード、ケンブリッジ、ロード、 15 (72)発明者 ウッド，パトリシア キャロル イギリス国ノッティンガム、キャッスル、 ブールバード、キャッスル、コート デル タ、バイオテクノロジー、リミテッド内 (72)発明者 バートン、スティーブン ジェームズ イギリス国ノッティンガム、キャッスル、 ブールバード、キャッスル、コート デル タ、バイオテクノロジー、リミテッド内 (72)発明者 カーク，アラン ビクター イギリス国レスターシャー、コストック、 マナー、クローズ、19 Ｆターム(参考） 4B064 AG24 BA15 BH06 BH07 BH09 BH10 BH20 CA06 CA19 CC06 CC07 CC09 CC12 CC22 CC24 CE06 CE07 CE10 CE11 CE12 DA01 4B065 AA80X AA93Y AB01 AC14 AC15 BA02 BB38 BC02 BC03 BC05 BC12 BC18 BD15 BD17 BD29 CA24 CA44 4C076 AA12 CC18 CC19 EE41A FF04 4H045 AA10 AA20 AA30 BA05 CA42 DA70 EA34 FA74 GA10 GA15 GA22 GA23 GA25 GA26 GA45 HA06

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】高度に精製されたアルブミンであって、少
   なくとも９９．５％モノマーであり、かつ、１５０ｎｇ
   未満のアルミニウムイオン含量；３，０００ｎｇ未満の
   鉄イオン含量；１０，０００ｎｇ未満の銅イオンレベ
   ル；３，０００ｎｇ未満のマグネシウムイオンレベル；
   ５，０００ｎｇ未満の亜鉛イオンレベル；５０ｎｇ未満
   のマンガンイオンレベル（全てアルブミン１ｇに対し
   て）；０．６モル未満のヘキソース／モルタンパク質の
   グリケーションレベル；２０V. sec未満の低分子量混入
   物質のレベル；キャピラリーゾーン電気泳動図での単一
   ピーク；完全なＣ−末端；少なくとも０．８５モルＳＨ
   ／モルタンパク質の遊離チオール含量、および実質的に
   含まれないＣ−１８またはＣ−２０脂肪酸、からなる群
   から選択される少なくとも一つの純度特性を有する（た
   だし、アルブミンの鉄が３０００ｎｇ未満／ｇアルブミ
   ンであるとき、少なくとも一つの他の上記純度特性をさ
   らに有する）ことを特徴とする、高度に精製されたアル
   ブミン。
2. 【請求項２】マンガンイオンレベルが５０ｎｇ未満／ｇ
   アルブミンである、請求項１に記載のアルブミン。
3. 【請求項３】キャピラリーゾーン電気泳動図において単
   一ピークを有する、請求項１に記載のアルブミン。
4. 【請求項４】遊離のチオール含量が少なくとも０．８５
   モルＳＨ／モルアルブミンである、請求項１に記載のア
   ルブミン。
5. 【請求項５】検出可能なＣ−２０脂肪酸を実質的に含ま
   ず、かつＣ−１８脂肪酸が０．１モル以下／モルタンパ
   ク質である、請求項１に記載のアルブミン。
6. 【請求項６】完全なＣ−末端を有する、請求項１に記載
   のアルブミン。
7. 【請求項７】アルミニウムイオンの含量が１５０ｎｇ未
   満／ｇアルブミンである、請求項１に記載のアルブミ
   ン。
8. 【請求項８】アルミニウムイオンの含量が１００ｎｇ未
   満／ｇアルブミンである、請求項７に記載のアルブミ
   ン。
9. 【請求項９】鉄イオンのレベルが３，０００ｎｇ未満／
   ｇアルブミンである、請求項１に記載のアルブミン。
10. 【請求項１０】鉄イオンの含量が１，０００ｎｇ未満／
    ｇアルブミンである、請求項９に記載のアルブミン。
11. 【請求項１１】(i) 銅イオンのレベルが１０，０００ｎ
    ｇ未満、(ii) マグネシウムイオンのレベルが３，００
    ０ｎｇ未満、および(iii) 亜鉛イオンのレベルが５００
    ０ｎｇ未満（すべてアルブミンのグラム当たり）であ
    る、請求項１に記載のアルブミン。
12. 【請求項１２】(i) 銅イオンのレベルが５，０００ｎｇ
    未満、(ii) マグネシウムイオンのレベルが１，５００
    ｎｇ未満の、および、(iii) 亜鉛イオンのレベルが３，
    ０００ｎｇ未満（すべてアルブミンのグラム当たり）で
    ある、請求項１１に記載のアルブミン。
13. 【請求項１３】グリケーションを受けたタンパク質のア
    マドリ生成物のＣ−１ ヒドロキシル基の酸化を測定す
    る方法により決定されるとき、０．６モル未満のヘキソ
    ース／モルタンパク質のグリケーションレベルを有す
    る、請求項１に記載のアルブミン。
14. 【請求項１４】グリケーションレベルが、０．１５モル
    未満のヘキソース／モルタンパク質である、請求項１３
    に記載のアルブミン。
15. 【請求項１５】１０分と５５分の保持時間の間の全ピー
    ク面積が２０V. sec未満である、低分子量混入物質が低
    レベルの請求項１に記載のアルブミン。
16. 【請求項１６】全ピーク面積が１０V.sec未満である、
    請求項１５に記載のアルブミン。
17. 【請求項１７】１ｍｇ／ｍｌの担持濃度の還元ＳＤＳ−
    ＰＡＧＥで分析したとき、タンパク質の少なくとも９９
    ％がアルブミンである、請求項１に記載のアルブミン含
    有処方物。
18. 【請求項１８】タンパク質の少なくとも９９．９％がア
    ルブミンである、請求項１７に記載のアルブミン含有処
    方物。
19. 【請求項１９】アルブミンの多量体が０．１％以下であ
    る、請求項１に記載のアルブミン含有処方物。
20. 【請求項２０】処方物が、少なくとも４％（ｗ／ｖ）の
    アルブミン濃度を有する、無菌、非発熱性水溶液であ
    る、請求項１９に記載のアルブミン含有処方物。
21. 【請求項２１】処方物が、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）
    のアルブミン濃度を有する、無菌、非発熱性水溶液であ
    る、請求項２０に記載のアルブミン含有処方物。