JP4674317B2 - 疾病の判定および監視 - Google Patents

疾病の判定および監視 Download PDF

Info

Publication number
JP4674317B2
JP4674317B2 JP2005500360A JP2005500360A JP4674317B2 JP 4674317 B2 JP4674317 B2 JP 4674317B2 JP 2005500360 A JP2005500360 A JP 2005500360A JP 2005500360 A JP2005500360 A JP 2005500360A JP 4674317 B2 JP4674317 B2 JP 4674317B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dkp
disease
related protein
amino acids
terminal amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2005500360A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2006502418A (ja
JP2006502418A5 (ja
Inventor
バー−オー、デイビッド
バー−オー、ラファエル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DMI Acquisition Corp
Original Assignee
DMI Acquisition Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DMI Acquisition Corp filed Critical DMI Acquisition Corp
Publication of JP2006502418A publication Critical patent/JP2006502418A/ja
Publication of JP2006502418A5 publication Critical patent/JP2006502418A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4674317B2 publication Critical patent/JP4674317B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Description

本発明は、疾病または医学的な病状に関連する１つ以上の生化学的マーカを定量することによる、疾病および病状の診断および監視に関する。詳細には本発明は、疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つから構成されるジケトピペラジンと、疾病関連タンパク質のＣ末端アミノ酸２つから構成されるジケトピペラジンと、Ｎ末端アミノ酸２つおよびＣ末端アミノ酸２つのうちの少なくとも一方を欠損している短縮疾病関連タンパク質と、そのような疾病および病状における他の生化学的マーカとを検出および測定することに関する。
疾病および医学的な病状を、さらに容易かつ迅速に診断および監視するための試験は常に必要とされている。さらに、多くの難病は診断および監視が困難なままであり、それらの疾病および病状を診断および監視する方法は決定的に必要とされている。
例えば、多発性硬化症（ＭＳ）は、その進行、重篤性、および特異的症状が実に変動的かつ予測不能であるため、診断することが困難である。ある人がＭＳであるか否かを単独で判定することが可能である臨床試験、症状、または身体所見は存在しない。
長期に渡って確立されている、ＭＳを診断する基準は以下である。
１．２つの発作（すなわち、中枢神経系（ＣＮＳ）における脱髄の２つの症状発現）という他覚的証拠が存在すること。臨床的には、発作（再燃、突発（flare ）、または再発としても知られている）は、少なくとも２４時間持続するＭＳ症状の急な発現または悪化として定義される。他覚的証拠は、神経学的検査および追加の試験の所見による。
２．２つの発作が時間的（少なくとも１ヶ月）および空間的（ＣＮＳの異なる領域における炎症および損傷のうちの少なくとも１つの証拠によって示される）に分離していること。
３．その人が経験している発作または症状に対して、他の説明が存在しないこと。ＭＳに共通する症状の多くは、他の疾病によっても引き起こされ得る。したがって、全ての可能性を注意深く除外することによってのみ、ＭＳの診断を下すことが可能である。
この２０年を通じて、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、髄液検査、および誘発反応試験などの試験は、診断プロセスにおいて次第に重要な役割を果たしている。２００１年には、多発性硬化症の診断に関する国際委員会（International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis）によって診断基準の改訂版が発行された（非特許文献１）。改訂基準では、上述の従来の要件に加え、ＭＲＩ、髄液分析、および視覚誘発電位の所見を用いて第２の発作の証拠を与えることによって、より迅速に診断を確定させるための詳細な指針が提供されている。それらの指針によって、明確な発作のないまま着実に障害が進行する患者における診断プロセスも促進される。しかしながら、この改訂基準を用いた場合にもＭＳの診断はなお困難であり、典型的には数ヶ月を必要とし、数年を必要とする場合もある。
ＭＳには悪化または再発の可能性があるため、確定診断を迅速に下すことは非常に有用であろう。多くの患者において疾病の進行を遅延させるまたは防止するようなＭＳの治療薬が現在では利用可能であり、迅速な診断によって早期に介入することで、多くのＭＳ患者の予後を有意に改善することが可能となる。
アルツハイマー病の診断は困難であり、他の原因を除外することによる場合が多い。疾
病を識別し得る種々の認知試験が用いられている。しかしながら、確定的な診断は死後の脳解剖によってのみ可能である。生存するアルツハイマー病患者に対して診断を下すことが可能な診断試験が必要なことは、明らかである。
脳虚血は現在、臨床的に診断されている。エノラーゼ、Ｓ−１００ファミリータンパク質など、ある種の生化学的マーカが説明されているが、臨床医が利用可能な映像化技術は、さらに信頼性が高く、かつ特異的である。脳虚血用の高信頼性かつ特異的である生化学的マーカは、この疾病の診断および監視において有用であろう。
初期の心虚血も診断することが困難である。クレアチンキナーゼイソエンザイム（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、またはトロポニンなど心臓の細胞死のマーカは、一過性の心筋虚血において、詳細には虚血発生後の最初の２〜６時間に測定される時には、信頼性のないマーカである（非特許文献２〜５）。虚血の症状が始まった直後に検査された患者から心筋梗塞または心筋虚血を除外するには、典型的には長期の観察が必要とされる（非特許文献６〜９）。
心筋虚血の患者のヒト血清アルブミンに結合する外因性コバルトの減少を測定する、新規な血液アッセイ方法が説明されている（非特許文献１０）。アルブミン−コバルト結合（ＡＣＢ）アッセイでは、ヒトアルブミンのアミノ末端（Ｎ末端）に対する外因性コバルトの結合能を測定する。通常の条件下では、コバルトを含む遷移金属は、アルブミンの露出されたＮ末端に強固に結合されている（非特許文献１１）。ＡＣＢアッセイは、虚血症状ではアルブミンのＮ末端が変更され、遷移金属に対するその結合能が急速に減少する場合があるという観察に基づいている（非特許文献１２および１３）。異常な濃度のＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、またはトロポニンが検出され得る前の数分または数時間に、虚血によって誘発されたアルブミンに対する変更が発生すると予想されるであろう。しかしながら、ＡＣＢアッセイは心虚血を除外するための試験としてのみ是認されているので、心虚血の除外に加えて心虚血の診断も可能であるアッセイを得ることが非常に望まれるであろう。
低出生体重（ＬＢＷ）は世界的に、胎児および新生児の罹患率および死亡率の主要原因である。ＬＢＷは、出産時の体重が２５００グラム未満であることを示すとして一般に認められており、予定時期（at term ）出産であるが胎齢に対して低体重（small for gestational age ）（ＳＧＡ）の新生児、早産で胎齢に対して適切な体重（ＡＧＡ）の新生児、または早産でＳＧＡの新生児に起こり得る。このように、ＬＢＷの疫学は複雑かつ多因性である。
ＳＧＡは統計的な定義であり、胎齢に対して１０パーセンタイル未満の出生体重を示している。よって定義から、新生児の１０％はＳＧＡである。実際には、それらの新生児のうち幾らかは小柄であるが健康で、遺伝的な成長可能性を実現しており、実質的な危険はない。他方、他のＳＧＡの新生児は実際に成長を阻害され、以下に説明する種々の因子のために、遺伝的な成長可能性を満たさない。これらの新生児は胎児発育不全（fetal growth restriction）（ＦＧＲ）に罹患していると言われる。実際に、幼児の幾らかはＡＧＡと推定されるがＦＧＲに罹患している、すなわち、その体重は、遺伝的には８０パーセンタイルの体重であるようにプログラムされているが、胎齢に対して２０パーセンタイルである場合がある。ある個体がどれくらいの体重であるべきかを知る先験的な手段が存在しないため、実際的な意味で、それらの幼児を識別することは困難である。
ＦＧＲは、胎児の状態の損傷または関連する母体の疾病（例えば、子癇前症）によって、胎児の発育を直接阻害することと、さらに多くの場合には、療法が必要である早産を余儀なくさせることとの両方で、ＬＢＷを誘導する。ＬＢＷおよび早産のうちの少なくとも
一方による罹患率は様々であり、いずれかの場所で重大でかつ詳細に報告されている。さらに、最近のデータにおいては、子宮内環境の損傷が成体の健康に対して深遠な影響を与え得ること、いわゆる「疾病の胎児起源（fetal origins of disease）」すなわちバーカー仮説（Barker hypothesis ）が示唆されている。これらの種々の機構によって、ＦＧＲに帰する疾病の負荷は甚大である。
ＦＧＲを伴う妊娠においては、多くの場合、胎児／新生児が関心の重点であるが、そのような妊娠には母体の健康を直接脅かす病状を伴う場合も多いことを想起することは重要である。最も顕著には子癇前症があり、その正確な病態生理学は依然不明であるが、胎盤虚血に由来すると長期に渡って考えられている。子癇前症およびその合併症は、世界的に母体の死亡率の主要原因である。
ＦＧＲの鑑別診断は多様であり、染色体、毒素、ウイルス、および他の病因が含まれるが、症例の大部分は子宮胎盤機能不全（ＵＰＩ）に由来する。ＵＰＩは、種々の母体の疾病（高血圧症、腎臓病、全身紅斑性狼蒼、抗リン脂質抗体症候群、血栓形成傾向など）、妊娠合併症（胎盤剥離、子癇前症）と関連する場合があり、または突発性の場合もある。病因にかかわらず統一的に潜在すると推定される病態生理学は、母体または胎児循環、または両方の循環における胎盤血流の減少（虚血）に由来する。
粗測定として、胎盤の重量と胎児の体重の間には直接的な関係が存在する事が知られており、胎盤の資源によって胎児の成長がある程度まで制御され得ることが示唆されている。ＦＧＲに関連する胎盤の病変は多数存在する。一般に、それらの病変によって、母体および胎児のうちの少なくとも一方の血流が損なわれていると考えられるであろう。母体および胎児のうちの少なくとも一方の血流の減少（虚血）とＦＧＲとの間の関連も、妊娠障害における多量のドップラー血流（Doppler flow）データによって補強されている。多くの症例において、これらの異常なドップラー血流の波形は、異常な胎盤の病理学とよく相関している。
ＦＧＲの病態生理学については多くが知られているが、理解されるべき事も多く残されている。臨床的な状況においては、ＦＧＲに対する種々の危険因子が認識されているが、その陽性予測値および感度は限定されたものである。ＦＧＲの胎児を「ＳＧＡだが順調」である胎児から鑑別することには困難があり得る。この差異を認識することは、順調な妊娠に対する不必要な介入を回避するために重要である。ＦＧＲに罹患することになる妊娠を早期に識別することは、養い手（foster）の適切な追跡治療（follow-up ）の援助となり得るであろう。出産の時期も重大な関心事であり、妊娠を進行させることと、虚血環境において継続させることとの利点が考量される。最後に、より基本的な水準では、胎盤虚血を識別し、その重篤性を定量する臨床的試験を入手することによって、最終的には養い手の適切な治療または予防さえも援助され得るであろう。
上述のように、虚血を除外するためのＡＣＢアッセイは、虚血の病状によってヒト血清アルブミンのＮ末端が変更され、遷移金属に対するその結合能が急速に減少され得るという観察に基づいている。ヒト血清アルブミンのＮ末端の変更による金属結合能の減少を説明し得る性質は識別されていないが、幾つかの可能性の１つとして、１〜４個のアミノ酸の開裂が提案されている（特許文献１を参照）。詳細には、ヒト血清アルブミンからＮ末端ジペプチド（Ａｓｐ−ＡｌａすなわちＤＡ）が開裂し、このジペプチドが環化してジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）を形成することによって、虚血にて観察されるヒト血清アルブミンのＮ末端に対する金属結合の減少が部分的に説明され得る、という仮説である（非特許文献１４）。しかしながらこの論文では、ＤＡ−ＤＫＰが虚血のマーカとして使用され得ることは、教示または示唆されていない。
特許文献２では、フリーラジカル損傷のマーカが開示されている。このマーカは、フリーラジカル損傷によってＮ末端の金属結合部位が修飾されているヒト血清アルブミンである。変更されたＮ末端に対する金属結合の減少が、フリーラジカル損傷の検出および測定に用いられる。金属結合の減少を説明し得るような、ヒト血清アルブミンのＮ末端の修飾の可能性が幾つか提案されており、それには、Ｎ末端のジペプチド（ＤＡ）がフリーラジカルによって開裂し、続いてこのジペプチドが環化してＤＡ−ＤＫＰを形成する可能性も含まれている。しかしながら、フリーラジカル損傷を検出および測定する方法として、ヒト血清アルブミンの変更Ｎ末端を直接検出することは示唆されているが、仮説上のＤＡ−ＤＫＰを測定することは、その目的で教示または示唆されていない。
投薬されていない精神分裂病患者および筋萎縮性側索硬化症に罹患している患者を含む神経疾患の患者（非特許文献１５）、および腎機能不全の患者（非特許文献１６）においては、ヒスチジン−プロリン・ジケトピペラジン（ＨＰ−ＤＫＰ）濃度の増大が検出される。ＨＰ−ＤＫＰは、未知のメカニズムによる甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）またはその前駆体（プレプロＴＲＨ）と、他の供給源とのうちの少なくとも一方に由来し得る（非特許文献１５）。
（発明の概要）
本発明は、種々の疾病および病状の診断および監視に有用である他覚的な生化学的マーカの発見に基づいている。このマーカには、疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つまたはＣ末端アミノ酸２つから構成される、ジケトピペラジンが含まれる。本明細書では「タンパク質」の語は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを意味して用いられ、「疾病関連タンパク質」の語は、疾病または病状に罹患した器官または組織由来のタンパク質（「器官特異的」または「組織特異的」タンパク質）を含む、特異的な疾病または病状に関連するタンパク質を意味して用いられる。マーカには、Ｎ末端アミノ酸２つおよびＣ末端アミノ酸２つのうちの少なくとも一方を欠損している、短縮疾病関連タンパク質も含まれる。本明細書では、これらのマーカを集合的に「ターゲットマーカ」と称する。
したがって本発明は、生体試料中の１つ以上のターゲットマーカの量を測定するステップと、そのターゲットマーカの量が疾病または病状の存在、欠如、または状態を示すか否かを判定するステップとから成る、疾病または病状を診断または監視する方法を提供する。このターゲットマーカは迅速かつ簡便に測定可能であり、その測定値によって、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、および虚血、詳細には胎盤虚血などの疾病および病状に対して、容易かつ迅速に高信頼性の診断を下すことが可能となる他覚的証拠が提供される。この方法は、現在可能であるよりも相当早い時期に、多くの疾病および病状の治療を開始することを可能とするため、非常に有用であろう。さらに、ターゲットマーカの測定によって疾病または病状の状態を監視することが可能となり、多くの疾病、病状、および疾患の効果的な治療と、新薬および他の治療の評価とが可能となるであろう。
さらに本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）診断化合物を用いてＭＳを診断または監視する方法を提供する。この方法は、患者から生体試料を採取するステップと、その生体試料中の１つ以上のＭＳ診断化合物の量を測定するステップとから成る。ＭＳ診断化合物は以下を含む。（ｉ）液体クロマトグラフィーおよび質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）によって約１７５と測定される質量を有する化合物、（ii）ＬＣ−ＭＳによって約１４５と測定される質量を有する化合物、（iii ）Ａｓｐ−Ａｌａ ジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）、および（iv）Ｎ−アセチル−アラニン−セリン ジケトピペラジン（ＮＡＳ−ＤＫＰ）。生体試料における化合物（ｉ）および（ii）のうちの少なくとも１つの欠如、または、ＤＡ−ＤＫＰおよびＮＡＳ−ＤＫＰのうちの少なくとも１つの濃度の増大は、ＭＳであることを示す。同じく、生体試料におけるＤＡ−ＤＫＰおよびＮＡＳ−ＤＫＰのうちの少なくとも１つの濃度の増大は、活動性のＭＳであることを示す。他のＭＳ診断化合物を以下の表１
および２に記載する。
さらなる実施態様では、本発明は、種々の疾病マーカを用いてアルツハイマー病を診断または監視する方法を提供する。詳細には、この方法は、診断または監視される患者から生体試料を採取するステップと、その生体試料中の１つ以上のアルツハイマー病診断化合物の量を測定するステップとから成る。アルツハイマー病診断化合物は以下を含む。（ｉ）液体クロマトグラフィーおよび質量分析計によって約１７５と測定される質量を有する化合物、（ii）ＤＡ−ＤＫＰ。アルツハイマー病患者の血漿においては、両方のアルツハイマー病診断化合物が増大していることが見出されている。他のアルツハイマー病診断化合物を表１および２に記載する。
さらに別の実施態様では、本発明は、妊娠患者の胎盤虚血を診断または監視する方法を提供する。この方法は、妊娠患者から生体試料を採取するステップと、その生体試料中の１つ以上の胎盤虚血診断化合物の量を測定するステップとから成る。胎盤虚血診断化合物は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ ジケトピペラジン（ＧＬ−ＤＫＰ）およびＡｌａ−Ｐｒｏ ジケトピペラジン（ＡＰ−ＤＫＰ）を含む。他の胎盤虚血診断化合物を以下の表１および２に記載する。
また本発明は、ジケトピペラジンに対する特異性を有する新規な結合パートナーを提供する。結合パートナーは、好適には、本発明のジケトピペラジンを特異的に認識する抗体およびアプタマーのうちの少なくとも１つである。そのような結合パートナーは、本発明の方法にて使用されることが可能である。この新規な結合パートナーを含む組成物およびキットも提供される。
国際公開第００／２０８４０号パンフレット 国際公開第００／２０４５４号パンフレット アナルズ・オブ・ニューロロジー（Annals of Neurology ）、２００１年、第５０巻、ｐ．１２１−１２７ コントス，エム．シー．（Kontos, M. C. ）およびアール．エル．ジェシー（R. L. Jesse ）、アメリカン・ジャーナル・オブ・カーディオロジー（Am J Cardiol）、２０００年、第８５巻、５Ａ、ｐ．３２Ｂ−３９Ｂ イシカワ，ワイ．（Ishikawa, Y.）ほか、クリニカル・ケミストリー（Clin Chem ）、１９９７年、第４３巻、第３号、ｐ．４６７−７５ ブローガン，ジー．エクス．，ジュニア（Brogan, G. X. , Jr. ）ほか、アカデミック・エマージェンシー・メディシン（Acad Emerg Med）、１９９７年、第４巻、第１号、ｐ．６−１２ ヘッジズ，ジェイ．アール．（Hedges, J. R. ）ほか、アカデミック・エマージェンシー・メディシン（Acad Emerg Med）、１９９６年、第３巻、第１号、ｐ．２７−３３ ゴメス，エム．エイ．（Gomez, M. A.）ほか、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・カレッジ・オブ・カーディオロジー（J Am Coll Cardiol ）、１９９６年、第２８号、第１巻、ｐ．２５−３３ ザレンスキー，アール．ジェイ．（Zalenski, R. J. ）ほか、アーカイブズ・オブ・インターナル・メディシン（Arch Intern Med ）、１９９７年、第１５７巻、第１０号、ｐ．１０８５−９１ デ・ウィンター，アール．ジェイ．（de Winter, R. J.）ほか、アナルズ・オブ・エマージェンシー・メディシン（Ann Emerg Med ）、２０００年、第３５巻、第２号、ｐ．１１３−２０ ピーコック，ダブリュ．アイ．（Peacock, W. I.）ほか、アナルズ・オブ・エマージェンシー・メディシン（Ann Emerg Med ）、２０００年、第３５巻、第３号、ｐ．２１３−２０ バー−オー（Bar-Or）ほか、ジャーナル・オブ・エマージェンシー・メディシン（J. Emerg. Med.）、２０００年、第１９巻、第４号、ｐ．３１１−５ クバル，ジー．（Kubal, G. ）、ピイ．ジェイ．サドラー（P. J. Sadler）、およびエイ．タッカー（A. Tucker ）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur J Biochem ）、１９９４年、第２２０巻、第３号、ｐ．７８１−７ ベレンシュタイン（Berenshtein ）ほか、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー・カーディオロジー（J. Mol. Cell. Cardiol.）、１９９７年、第２９巻、第１１号、ｐ．３０２５−３４ バー−オー（Bar-Or）ほか、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、２００１年、第２６８巻、第１号、ｐ．４２−４７ バー−オー（Bar-Or）ほか、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、２００１年、６月１５日、第８４巻、ｐ．８５６−８６２ プラサド（Prasad）、ペプチドズ（Peptides）、１９９５年、第１６巻、第１号、ｐ．１５１−１６４ タカハラ（Takahara）ほか、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（J. Clinical Endocrinol. Metab.）、１９８３年、第５６巻、第２号、ｐ．３１２−３１９
本発明は一般に、疾病および病状に対するマーカを定量することによって、疾病、病状、および疾患を診断および監視する方法を提供する。
一実施態様では、本発明は、疾病関連タンパク質の分解によって特徴付けられる疾病または病状を診断および監視する方法を提供する。この分解生成物には、Ｎ末端アミノ酸２つまたはＣ末端アミノ酸２つから構成されるジケトピペラジンおよび、そのような末端アミノ酸を欠落している、対応する短縮疾病関連タンパク質が含まれる。したがって本発明は、これらの分解生成物が疾病、病状、および疾患を診断および監視するための有用なマーカであるという発見に基づいている。
上述のように、本明細書では「疾病関連タンパク質」の語は、疾病、病状、または疾患に罹患した器官または組織由来のタンパク質（「器官特異的」または「組織特異的」タンパク質）を含む、特異的な疾病、病状、または疾患に関連するタンパク質を意味して用いられる。疾病関連タンパク質および対応する疾病および病状の例を、表１および２に記載する。当業者らは、本明細書に与えられている手引きに基づいて、過度な実験を行うことなく、他の疾病関連タンパク質、対応する疾病または病状、および有用なマーカを容易に決定することが可能である。
この実施態様の方法にて定量されるターゲットマーカは、疾病関連タンパク質の分解によって形成される。この分解は、アシドーシスと、活性酸素種（ＲＯＳ）と、炎症と、Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸に対する一定のリガンドの結合など、疾病関連タンパク質のＮ末端またはＣ末端アミノ酸のプロトン化を引き起こす病状とのうちの、少なくとも１つに伴うまたは引き起こされる疾病または病状において起こると考えられる。ジケトピペラジンは一定の酵素（例えば、ジペプチジル・ペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼ）の作用のため生体内でも形成され得るが、それらの酵素の活性は一定の疾病、病状、および疾患によって変更される場合がある。ジペプチジル・ペプチダーゼは、幾らか特異的にタンパク質のＮ末端のアミノ酸２つを開裂させるアミノ・ペプチダーゼであり、カルボキシペプチダーゼは、タンパク質のＣ末端からアミノ酸を開裂させる。例えば、胎盤は、ジペプチジル・ペプチダーゼIVに富む。開裂後、または特定条件下では、これらの酵素はア
ミノ酸の開裂に加え、環化の原因ともなり得る。この代わりに、第２のステップ（環化）が非酵素的であり、Ｎ末端またはＣ末端のプロトン化を必要とする場合もある。したがって、本発明で有用なマーカには、疾病関連タンパク質のいずれかの末端から２つのアミノ酸から構成されるジケトピペラジンと、Ｎ末端アミノ酸２つおよびＣ末端アミノ酸２つとのうちの少なくとも一方を欠いている短縮疾病関連タンパク質とが含まれる。
本明細書では、「Ｘ−Ｙ ＤＫＰ」または「Ｘ−Ｙ−ＤＫＰ」は、２つのアミノ酸ＸおよびＹから構成されるジケトピペラジン（環状ジペプチド）を意味して用いられる。ここでＸおよびＹは、疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つまたはＣ末端アミノ酸２つである。ＸおよびＹは同一であっても異なっていてもよく、各々が任意の翻訳後修飾されたアミノ酸を含む任意のアミノ酸であってよい。上述にもかかわらず、単一のジケトピペラジンが測定される唯一のマーカである時は、Ｘ−Ｙ ＤＫＰはＨｉｓ−Ｐｒｏ ＤＫＰであってはならない。表３に、各アミノ酸に対する慣習的な３文字および１文字略記号を記載する。アミノ酸の翻訳後修飾は周知であり、リン酸化、アシル化、システイン化、ニトロソ化、およびグリコシル化を含む。
本発明におけるマーカとして有用なＤＫＰの例を、対応する疾病および疾病関連タンパク質にしたがって表１および２に記載する。当業者らは、疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つまたはＣ末端アミノ酸２つに由来し、種々の疾病および病状のターゲットマーカとして使用可能である他のＤＫＰを、過度な実験を行うことなく、容易に識別することが可能である。
Figure 0004674317
Figure 0004674317
＊ＡＲＤＳは、急性呼吸窮迫症候群である。
＊＊循環するタンパク質であるアルブミンに由来する、Ａｓｐ−Ａｌａ ジケトピペラジ
ン（ＤＡ−ＤＫＰ）およびＧｌｙ−Ｌｅｕ ジケトピペラジン（ＧＬ−ＤＫＰ）のうちの少なくとも１つは、炎症の一般的なマーカであろう。疾病関連タンパク質に由来する他のジケトピペラジンは、器官または組織に特異的に見出されるものを含めて、それらの器官および組織における炎症のマーカまたはそれらの疾病および病状に関連するマーカとなるであろう。
Figure 0004674317
疾病関連タンパク質の分解によって形成される他の有用なターゲットマーカを、「短縮疾病関連タンパク質」と称する。前述のように、これらの短縮疾病関連タンパク質は、Ｎ末端アミノ酸２つおよびＣ末端アミノ酸２つのうちの少なくとも一方を欠落しており、したがって、本発明の方法におけるターゲットマーカとして利用可能である。しかしながら、短縮疾病関連タンパク質は、Ｎ末端アミノ酸２つを欠落するヒト血清アルブミンであってはならない。短縮疾病関連タンパク質には、例えば、Ｎ末端からＮ−アセチル−Ａｌａおよびセリンであるアミノ酸を欠損しているミエリン塩基性タンパク質と、Ｎ末端からＡｓｐおよびＡｌａであるアミノ酸を欠損しているベータ−アミロイドとが含まれ、その両方が多発性硬化症の有用なターゲットマーカである。ＡｓｐおよびＡｌａであるＮ末端アミノ酸２つを欠損している短縮ベータ−アミロイドと、ＧｌｙおよびＬｅｕであるＣ末端アミノ酸２つを欠損している短縮タウタンパク質とは、アルツハイマー病のターゲットマーカの例である。当業者らは、種々の疾病および病状のターゲットマーカとして有用な他の短縮疾病関連タンパク質を容易に識別することが可能である。
本発明の第１の実施態様では、本発明の方法は、
（ａ） 診断または監視される患者から生体試料を採取するステップと、
（ｂ） 疾病または病状の１つ以上のターゲットマーカの量を測定するステップと、
（ｃ） ターゲットマーカの量が、疾病または病状の存在、欠如、または状態を示すか否かを判定するステップとから成る。
本発明の方法では、診断または監視される患者に由来する任意の適切な生体試料において、ターゲットマーカを定量することが可能である。生体試料には、血清、血漿、血液、尿、唾液、髄液、涙、精液、膣分泌液、羊水、および臍帯血など、適切な体液が含まれる。同じく、洗浄液、組織ホモジネート、および細胞溶解物も利用可能であり、本明細書では、生体試料にはそのような調製物も含まれる。
生体試料を患者から採取することが可能である。「患者」の語には、任意の動物、好適には哺乳動物、および最も好適にはヒトが含まれる。当業者らは、特定の患者に対する適切な疾病または病状と、対応するターゲットマーカとを容易に決定することが可能である。
ターゲットマーカの量は、例えば、質量分析計、イムノアッセイ、化学的アッセイ、質量分析計を伴わない高感度液体クロマトグラフィー、および種々の直接および間接測光技術を含む、当業者に公知である任意の手段によって測定可能である。例えば、種々の分析方法を用いて、質量分析計によってターゲットマーカを定量することが可能である。一般に、液体クロマトグラフィーまたは二次元ゲル電気泳動などの適切な技術によって、生体試料から関心のマーカを単離することが可能である。続いて、エレクトロスプレーイオン化法質量分析計、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）など、任意の質量分析計検出方法によって、ターゲットマーカを定量することが可能である（例えば、「リム（Lim ）ほか、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、２００１年、第２９５巻、ｐ．４５−５６」を参照）。既知量の純粋なマーカ標準物質を用いて、または、通常の対照に由来する同一種類の生体試料における同一のターゲットマーカと比較することによって、ターゲットマーカを定量することが可能である。
好適には、イムノアッセイを用いてターゲットマーカを定量する。イムノアッセイには、１つ以上の結合パートナーが用いられる。「結合パートナー」は、ターゲットマーカに特異的に結合することが可能な化合物または分子である。本明細書では「特異的に」の語は、他の化合物が存在する場合に、結合パートナーがターゲットマーカに選択的に結合することを意味して用いられる。結合パートナーは、好適には、抗体、アプタマー、レクチン、およびターゲットマーカに特異的に結合することが可能な他の分子である。そのような結合パートナーを、単独でまたは組合わせて用いることが可能である（例えば、抗体をアプタマーと組合わせて用いることが可能である）。適切な結合パートナーを、本発明のさらなる実施態様として以下に記載する。
当業者らは、本発明の方法における使用に適切であるイムノアッセイ方式を容易に決定することが可能である。そのようなイムノアッセイには、均一系アッセイ、不均一系アッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ、イムノメトリック（サンドイッチ）アッセイ、濁度アッセイ、比濁法アッセイなどが含まれる。手動で、または自動化された分析装置を用いて、これらのイムノアッセイを行うことが可能である。
好適な酵素イムノアッセイにおいては、ターゲットマーカに対して特異的な結合パートナーが、固体の支持体に固定化されている。適切な固体支持体は公知であり、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、およびアガロースを含む。生体試料を固定化された結合パートナーと接触させる。洗浄後、結合した結合パートナーによって固体支持体に結合されたターゲットマーカを、ターゲ
ットマーカ上の公知のエピトープに対して特異的な第２の結合パートナー（例えば、第２の抗体または抗体の混合物）と反応させる。第２の結合パートナーを標識してターゲットマーカを定量すること、または、標識された第３の結合パートナーまたは他の化合物（例えば、タンパク質Ａまたはストレプトアビジン）を用いてターゲットマーカを定量することが可能である。
代わりに、例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって、ターゲットマーカを生体試料の他の構成要素から最初に分離することも可能である。アフィニティクロマトグラフィーにおいては、ターゲットマーカに対して特異的な抗体は固体表面（例えば、カラム内のビーズ）に付着され、試料中のターゲットマーカを結合するために用いられる。固体表面の洗浄後、ターゲットマーカを溶出させて測定する（例えば、上述の方法のうちの１つ、２８０ｎｍでの吸光度測定、または当業者に公知の任意の別の方法によって）。
任意の結合パートナー（例えば、一次、二次、または三次抗体）に適切な標識は、当業者には周知である。そのような標識には、以下が含まれる。（ｉ）酵素（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒロゲナーゼ（dehyrogenase）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド・イソメラーゼ、酵母由来アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラトシダーゼ（galatosidase）、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ）、（ii）蛍光発色団（fluorophores）（例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（o-phtaldehyde ）、およびフルオレスカミン）、（iii ）放射性ヌクレオチド（例えば、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２５、ガリウム−６７、およびガリウム−６８）、（iv）生物発光標識（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリン）、（ｖ）化学発光標識（例えば、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イマダゾール（imadazole ）、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステル）、（vi）比色標識、（vii ）金属コロイド標識、（viii）色素を包括したラテックスおよびシリカ粒子、（ix）色素、および（ｘ）アフィニティ標識（例えば、ビオチン）。これらの標識の結合および検出には、当業者に公知の技術を用いることが可能である。
続いて、生体試料中のターゲットマーカの量が、疾病または病状の存在、欠如、または状態を示すか否かが判定される。これは、統計解析において周知の種々の任意の方法を用いて行われる。例えば、実施例２に示されているようなクラスタリング手法を用いることが可能である。代わりに、生体試料中のターゲットマーカの量を正常な患者のターゲットマーカの量と比較することによって、判定を行うことが可能である。「正常な患者」とは、診断または監視される特定の疾病または病状に罹患していない患者のことである。例えば、ターゲットマーカの量を正常範囲と比較することが可能である。正常範囲は、患者の生体試料のアッセイに用いるのと同一の方法（例えば、同一種類の生体試料、同一のステップ、同一の試薬、同一の条件）で、正常な個体に由来する多数の試料におけるマーカ量を測定することによって見出される。ターゲットマーカの量が正常範囲の外にある場合に、疾病または病状の存在が示される。代わりに、ターゲットマーカの量を、疾病または病状を示すカットオフ値と比較することも可能である。カットオフ値は、正常な個体と、問題の特定の疾病または病状に罹患していることが既知である患者とに由来する、多数の試料を試験することによって、決定可能である。ターゲットマーカの量がカットオフ値を超える場合に、疾病または病状が示される。さらに、１つのターゲットマーカの量と、２つ以上のターゲットマーカの存在とのうちの少なくとも一方が、正常範囲の外にあるかまたはカットオフ値を超える場合にも、疾病または病状の状態が示され得る。正常範囲または
カットオフ値の決定を含むデータの解析には、当業者に公知である標準的な統計学的方法を使用することが可能である。最後に、認められ得るように、相関を簡便かつ容易に行う理由から、正常範囲およびカットオフ値を検出単位（例えば、吸光度または蛍光度）で表現することが可能である。
例えば、上述のように、ＤＡ−ＤＫＰの測定をＭＳの診断または監視に用いることが可能である。正常なヒト患者のＤＡ−ＫＤＰ濃度は、約５０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲にある。当業者は、本明細書に開示されている任意の方法または他の公知の統計学的方法を用いて、ＤＡ−ＤＫＰの濃度が有意に増大して多発性硬化症を示す時を、容易に決定することが可能であろう。
本発明における上述の方法を用いて、幾つかの疾病および病状を診断または監視することが可能である。これらの疾病および病状には表１および２に識別されるものを含むが、それらに限定されない。
さらなる実施態様では、本発明は、患者の多発性硬化症（ＭＳ）の診断および監視に有用である他覚的な生化学的マーカを提供する。詳細には、液体クロマトグラフィーおよびそれに続く質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）によって、血漿試料中で以下のマーカが同定されている。
１．最初に、正常なヒト由来の血漿試料と比較して、ＭＳ患者の血漿では質量１７５（実際の質量は１７６）の化合物が欠損していることが見出されている。
２．また、正常なヒト由来の血漿試料と比較して、ＭＳ患者の血漿では質量１４５（実際の質量は１４６）の化合物も欠損していることが見出されている。
３．正常なヒトおよび疾病が活動性でないＭＳ患者由来の血漿試料と比較して、活動性疾病のＭＳ患者の血漿では質量１８５（実際の質量は１８６）の化合物が有意に増加していることが見出されている。この化合物は、環状ジペプチドであるアスパラギン酸−アラニン・ジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）と同定されている。この化合物が、血小板活性化因子の阻害と、インターロイキン−８の生産および放出のうちの少なくとも１つの阻害とを示していることは興味深い（ＰＣＴ出願である国際公開第０２／１１６７６号パンフレットを参照）。
４．正常なヒトおよび疾病が活動性でないＭＳ患者由来の血漿試料と比較して、活動性疾病のＭＳ患者の血漿では質量１９９（実際の質量は２００）の化合物が有意に増加していることが見出されている。この化合物は、Ｎ−アセチル−アラニン−セリン・ジケトピペラジン（ＮＡＳ−ＤＫＰ）と同定されている。
このように、血液試料から質量１７５および１４５の化合物の一方または両方が欠如していることは、患者がＭＳであることを示す。質量１８５および１９９のジケトピペラジンの一方または両方の濃度が有意に増大していることは、患者が活動性ＭＳに罹患していることを示す。ＭＳ診断化合物には、これらの化合物全てと、表１および２のジケトピペラジンおよび短縮疾病関連タンパク質とを含むが、それらに限定されない。
「活動性ＭＳ」は、新たな、追加の、または悪化している臨床的発現が生じる（発作、再燃、突発、または再発）段階を意味して用いられる。これは通常では、ミエリン／ニューロン破壊の増大、髄液中の白血球増大（＞４／ｈｐｆ）およびＩｇＧ合成速度増大（＞９）、ＭＲＩの脱髄班、およびニューロンの欠損を表す「ブラック・ホール（black hole）」と関連している。
さらに別の実施態様では、本発明は、アルツハイマー病の診断または監視に有用である他覚的な生化学的マーカを提供する。本発明は、アルツハイマー病診断化合物を用いてアルツハイマー病を診断または監視する方法を提供する。この方法は、診断または監視され
る患者から生体試料を採取するステップと、その生体試料中のアルツハイマー病診断化合物の量を測定するステップとによって行われる。アルツハイマー病診断化合物には、例えば、（ｉ）液体クロマトグラフィーおよび質量分析計によって約１７５と測定される質量を有する化合物、および（ii）ベータ−アミロイド由来のＡｓｐ−Ａｌａ−ＤＫＰ（分子量 １８６．１５）であるジケトピペラジン、が含まれる。両方の診断化合物は、アルツハイマー病患者の血漿中で増大していることが見出されており、この疾病の特徴症状（diagnostic）であると考えられる。他のアルツハイマー病診断化合物には、表１および２のジケトピペラジンおよび短縮疾病関連タンパク質が含まれる。
さらなる実施態様では、本発明は、妊娠患者の胎盤虚血の診断および監視のための方法を提供する。この方法は、妊娠患者から生体試料を採取するステップと、妊娠関連タンパク質に由来するものを含む、生体試料中の胎盤虚血診断化合物の量を測定するステップとから成る。この方法に有用な胎盤虚血診断化合物の例には、例えば、（ｉ）ベータ−ヒトクロリオニック（chlorionic）性腺刺激ホルモン由来のＧｌｙ−Ｌｅｕ ジケトピペラジン（ＧＬ−ＤＫＰ）、および（ii）胎児性エリスロポエチン由来のＡｌａ−Ｐｒｏ ジケトピペラジン（ＡＰ−ＤＫＰ）が含まれる。他の胎盤虚血診断化合物には、表１および２のジケトピペラジンおよび短縮疾病関連タンパク質が含まれる。
当業者は、上述ではその質量によってのみ同定されている化合物を、容易に単離して化学組成を決定することが可能であろう。その化学組成が既知となれば、上述の方法を含む質量分析計以外の方法、好適にはイムノアッセイによって、それらの化合物のアッセイが可能である。
さらに別の実施態様では、本発明は、上述のイムノアッセイに有用である結合パートナーを提供する。結合パートナーには、抗体、抗血清またはその精製画分、アプタマー、およびターゲットマーカに対して特異的に結合することが可能な他の化合物が含まれる。適切な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産されるフラグメント、エピトープ結合性である上述のものの任意のフラグメント、および相補性決定部位（ＣＤＲｓ）が含まれる。本発明における使用に適切な抗体は、公知の方法によって調製可能である。特に適切な抗体は、本発明のジケトピペラジンに対する特異性を有するモノクローナル抗体である。ジケトピペラジンは小さな化合物なので、それらに対する特異的な抗体を調製するために、好適には、免疫源として用いられる免疫性の担体分子に付着されるであろう。適切な担体分子（例えば、ＫＬＨ）およびそれに分子を付着させる方法は、当業者には公知である。コーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）の融合法（ネイチャー（Nature）、１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５−４９７）を当業者に公知である改良と共に用いて、免疫源を用いてモノクローナル抗体を生産することが可能である。本明細書では、結合パートナーに関連して用いられる「単離された」の語は、天然に見出される結合パートナーの場合、その結合パートナーがその天然環境における内的環境（milieu）にはないことを意味して用いられ、結合パートナーの何らかの純度を示すものではない。
上述の任意のイムノアッセイにおいては、抗体の代わりにまたは抗体と組合わせて、アプタマーを用いることが可能である。アプタマーは、タンパク質、ペプチド、タンパク質およびペプチドの誘導体、無機分子、および他の非ヌクレオチド分子に対して特異的なオリゴヌクレオチドである。例えば、ＰＣＴ出願である国際公開第００／７０３２９号パンフレット、国際公開第０１／７９５６２号パンフレット、国際公開第９９／５４５０６号パンフレットと、米国特許第５，７５６，２９１号明細書とを参照。これらの全体を引用によって本明細書に援用する。これらの引用文献に記載されている方法を用いて、本発明における使用に適切なアプタマーを調製することが可能である。簡単に述べると、ランダ
ムな配列のオリゴヌクレオチドの不均一集団を合成し、本発明のマーカを、そのオリゴヌクレオチドの不均一集団と混合する。オリゴヌクレオチドの集団に存在する配列の、全てではないが幾つかを用いて、複合体が形成される。複合体を単離し、オリゴヌクレオチドは回収して増幅する（例えば、ＰＣＲ法によって）。得られたオリゴヌクレオチドの混合物を、別の回の複合化、単離、および増幅の出発材料として用いることが可能であり、典型的にはこのプロセスを、充分な特異性を有するアプタマーが得られるまでおよびコンセンサスなアプタマー配列が識別されるまでのうちの少なくとも一方まで、数回繰り返す。アプタマーに適切な標識には、色素、酵素、放射性標識などが含まれる。
さらに本発明は、生理的に許容される担体に上述の結合パートナーを含む組成物を提供する。そのような生理的に許容される担体は当業者には周知であり、例えば、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水、リンガー液などの水溶液を含む。
また本発明は、ターゲットマーカを定量するためのキットを提供する。そのようなキットには、ターゲットマーカに対して特異的な１つ以上の結合パートナー、ターゲットマーカの検出に有用な標識成分、緩衝液、希釈剤、標準物質、対照物質などを含む、本発明の方法を実行するために有用な種々の試薬が任意で含まれる。このキットには、ボトル、バイアル、チューブ、シリンジ、マイクロタイタープレートまたは他の固体支持体、使用説明書なども含まれ得る。
以下の実施例では、本発明の実施態様を示すことを意図しており、本発明を限定することは意図していない。
実施例１：胎盤虚血の診断
幾つかのジケトピペラジンの存在が母体の血漿において検出されている。特に関心のあるものは、β−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βＨＣＧ）および胎児性エリスロポエチンのＮ末端に由来するものである。これらはそれぞれ、グリシン−ロイシン・ジケトピペラジン（ＧＬ−ＤＫＰ）およびアラニン−プロリン・ジケトピペラジン（ＡＰ−ＤＫＰ）である。特にＡＰ−ＤＫＰは、ＦＧＲにおける胎児性エリスロポエチンの増大（テラモ（Teramo）ほか、アクタ・オブステトリシア・エト・ジネコロジア・スカンジナビカ（Acta Obstet. Gynecol. Scand.）、２００２年、第８３巻、第１号、ｐ．２４５−５１、ジャザエリ（Jazayeri）ほか、アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステトリクス・ジネコロジー（Am. J. Obstet. Gynecol. ）、２０００年、第１８３巻、第１号、ｐ．１８８−９０、ジャザエリ（Jazayeri）ほか、ジャーナル・オブ・ペリナトロジー（J. Perinatol. ）、１９９９年、第１９巻、第４号、ｐ．２５５−９）と、酸性条件での特異的分解（Ｎ末端アミノ酸のプロトン化（グールチャラン（Goolcharran ）およびボルヒャルト（Borchardt ）、ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・サイエンシス（J. Pharm. Sci.) 、１９９８年、第８７巻、第３号、ｐ．２８３−８）および第１のアミノ酸配列の２位のプロリンの相対的重要性）とによってＡＰ−ＤＫＰが生成するため、ＦＧＲの妊娠において増大する。
本調査の被験者は、マターナル−フィータル・メディシン（Maternal-Fetal Medicine ）（ＭＦＭ）の合併症を伴う妊娠をしている患者に該当する患者から選択した。本調査の基準を満たすのは、超音波診断によって胎齢に対して１０パーセンタイル未満の出生体重と推定されることに加えて、
・羊水指数（ＡＦＩ）＜８、または、
・パルス波ドップラー法を用いて測定された臍動脈における収縮・拡張（Ｓ／Ｄ）間の血流速度比＞３、または、
・標準の臨床的な基準によって、子癇前症と確定されること、である。
本調査群には、単生児妊娠１１例および双生児妊娠１例を含む１２例の患者が存在した。対照群には、双生児妊娠１例を含む５例の患者が存在した。調査群における出産時の胎齢は２６．３〜３８週の間、平均胎齢は３０．２週であったのに対して、対照群では３８週であった。調査群における平均出生体重は１０１６グラムであったのに対して、対照群では３１１４グラムであった。平均すると、調査群における出生体重パーセンテージは１０％未満であったのに対して、対照群では４３％であった。調査群の患者１２例のうち１０例で臍動脈のドップラー血流調査が得られたが、その全てが異常であり、２例の患者では拡張終期に逆流があり、６例では拡張終期に血流が欠如しており、２例ではＳ／Ｄ比が３．０より大きかった。調査群の患者１２例のうち９例は子癇前症であった。調査群の患者１２例のうち２例はＨＥＬＬＰ症候群であった。
組換えβＨＣＧ（シグマ（Sigma ））は、０．１モル／リットル、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中で、６０℃、１２時間、インキュベートし、ＧＬ−ＤＫＰ（分子量 １７０．２１）の存在下で、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびそれに続くＥＳＩ＋質量分析計（ＥＳＩ＋／ＭＳ）によって分析した。結果を図１に示す。
同様に、組換えエリスロポエチン（アムジェン（Amgen ））を、０．１モル／リットル、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中で、６０℃、１２時間、インキュベートし、ＡＰ−ＤＫＰ（分子量 １６８．１８）の存在下で、ＬＣおよびＥＳＩ−／ＭＳによって分析した。結果を図３に示す。
調査群の患者および対照群の患者から採取した血漿試料は、ＬＣおよびそれに続くＥＳＩ／ＭＳによって処理した。ある調査群の患者（患者４）における結果を図２および４に示す。そこに見られるように、ＧＬ−ＤＫＰ（βＨＣＧ由来）およびＡＰ−ＤＫＰ（胎児性エリスロポエチン由来）が検出されている。
実施例２：液体クロマトグラフィー−質量分析計およびクラスタリングを用いたＭＳ患者の分類
多発性硬化症（ＭＳ）および正常な患者の両方における小試験セットの幾つかの結果にしたがって、患者のＭＳの状態を判定する新規な方法をここに示す。本方法では、正常な患者およびＭＳの患者の両方から血液試料を採集し、液体クロマトグラフィー−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）法によって分析して、ＭＳのマーカである推定される幾つかの推定マーカの濃度を測定した。それらの推定マーカの濃度と、ＭＳの存在、欠如、または状態との間に何らかの単純な関係が存在するか否かを調べるため、得られたデータを、データ内部の自然な群を発見する数学的なクラスタリング手法によって分析した。
・患者
ＭＳの患者は、一般に認められている臨床的または研究的基準によって診断した。神経学的徴候および症状、磁気共鳴映像法による脱髄の証拠、髄液中のオリゴクローナル・バンドの存在、白血球の計数、およびＩｇＧ合成速度を用いて診断を下した。活動性疾病は、急性または進行性の神経学的発現の存在において上述に基づいて確定した。
・試料調製
血液試料はヘパリン処理チューブに収集した。遠心分離によって、血液試料を血漿と赤血球に分離させた。赤血球は廃棄し、血漿は、サイズ排除フィルタ（セントリコン３（Centricon 3 ））を通過させ、３，０００ダルトンを超える成分を全て除去することによって、さらに精製した。得られた濾液は即座に分析するか、または後の分析のため冷凍した。
・ＬＣ−ＭＳ法
試料は、ＨＰＬＣ（ウォーターズ２９７５システム（Waters 2975 system））にて、種々の成分に分離させた。カラムには、アマシャム・モノ−Ｑ（Amersham mono-Q ）陰イオン交換カラムを用いた。移動相には、酢酸アンモニウムの５０ミリモル／リットル溶液（
ｐＨ６．７）を１ｍＬ／分で流通させた。この流れを４：１ポスト・カラムで分割し、得られた２５０μＬ／分の流れを、２０Ｖのコーン電圧を用いた陰イオンへのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−）モードで運転しているマイクロマスＬＣＴ（Micromass LCT ）質量分析計へ送った。流速が大きいことおよび溶媒の水分含量が多いことから、脱溶媒温度は４００℃に設定した。機器の感度の経時差を較正するために、データの各セットと共にＤＡ−ＤＫＰおよびＥＡ−ＤＫＰの標準物質を流通させた。標準の濃度には、各ＤＫＰに対して５００，１００，２０，および４ｎｇ／ｍＬを用いた。質量分析計によるＤＫＰの検出は、この濃度範囲において線形であることが見出された（ｒ２＞０．９９８）。・データ調整
以下の説明では、推定マーカのうち幾つかに対しては較正物質が存在しないが、スペクトルの全域で機器の感度は線形であり、したがって較正物質の存在しない質量は全て、５００ｎｇ／ｍＬの濃度のＤＡ−ＤＫＰに対して正規化されると仮定した。
・数学的解析
クラスタリングは、類似した対象の群を識別する分類手法であり、類似性は、データを記述する変数にのみ基づいて導かれる。この群は、理想的には、１つの群の内部では対象が互いに類似し、異なる群では対象が可能な限り類似しないように形成される。
変数が充分に尺度化されていない実験データから、未処理データのクラスタリングを試みる場合、大きさが大きな成分は如何なる計量距離（distance metric ）をも支配し、それらの変数の重み付けは不均衡になる。各変数の重要度について先験的な知見は得られていないので、各々の変数に対して均等な重みを与えて尺度化する。次元尺度法を用いると、各変数が移動および尺度化される。結果として、平均は０、分散は均等になる。
多くの場合には、実験によって、強い従属性を有し得る高次元のデータセットが生成される。自明でない分類の尤度を最大化するため、ノイズを最小化することと同時に、関連性が最大の情報をデータから抽出することによって、次元数を最小化することが望まれる。特徴抽出の方法には、ウェーブレット分解法、フーリエ変換、因子分析、および独立成分分析が含まれる。
この研究では、主成分分析（ＰＣＡ）と呼ばれる因子分析の一変形を用いて特徴抽出を行う。ＰＣＡでは、データは、データを記述する共分散行列の固有ベクトルの係数として表現される。さらに、各々の固有ベクトルの相対力（relative strengths）（主成分としても公知）は固有値によって与えられる。何らかの閾値より低い固有値に対応する固有ベクトルは、ノイズとして省略可能である場合が多い。
分析用に１０の推定質量のセットを選択した後、コロラド州エングルウッド、ＤＭＩバイオサイエンシス社（DMI BioSciences, Inc. ）のラファエル（Raphael ）・バー−オーによって記述されたマトラボ（Matlab（登録商標））のクラスタリング・ツールセットを用いて、そのデータを解析した。他の適切なクラスタリング・ソフトウェアは商業的に利用可能である。試行錯誤的な分析によって、流出時間の早期に現れる１８５および１９９の２つの質量が、データを２つの群に分離する検出力を有することが明らかになった。一方の群は活動性ＭＳであり、他方の群は非活動性ＭＳおよび正常である。ＭＳ患者および正常な患者のサブセットにおいて、活動性ＭＳと他の全ての疾病との間で良い分離を達成するように、クラスタリング・ツールキットの設定を最適化した。この分析の設定は、表４に与えられる。
合計で３７例の患者に由来する試料を流通させた。そのうちの２４例は第１のクラスタ（正常が８例および非活動性ＭＳが１６例）に属し、１３例は第２のクラスタ（活動性ＭＳ）に属した。分類の誤りは、あるとしてもほとんど存在しないと考えられ、クラスタリング樹形図（図５）の検分によって空間が充分に分離可能であることが明らかであるが、
これは、この分離が唯の偶然の産物ではあり得ないために、クラスタ間に充分な空間が存在することを意味している。小規模のブートストラップ法（bootstrap ）（リーブ・ワン・アウト（leave-one-out ）分析）によって、この分離が実際に安定であることを確認した（ランド統計（Rand's Statistic）で９５％）。
クラスタリング手法によって見出された群を分類群として用いた。この小データセットでは、活動性ＭＳに対する感度は１００％、および特異性は８４．６％であることが見出された。
１８５および１９９の２つの質量は、それぞれ、Ａｓｐ−Ａｌａ−ＤＫＰ（ＤＡ−ＤＫＰ）およびＮ−アセチル−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＤＫＰ（ＮＡＳ−ＤＫＰ）と同定された。これらの２つのＤＫＰは２つの重要な中枢神経系タンパク質、すなわち、ベータ・アミロイドおよびミエリン塩基性タンパク質の分解生成物である（表１を参照）。
「１７５@ ８．５分」と標識されたマーカがＭＳと疑われる全ての患者に欠乏しており、アルツハイマー病患者に非常に多いと思われることが留意された。同様のパターンは「１４５@ １２．７分」と標識された別の質量でも観察された。この変数をクラスタリング分析に追加することによって分離は確実に改良されるであろうが、６分を越えるデータは、患者の小サブセットでのみ利用可能である（６分より長く流通させたのは１４例の試料のみであり、それより短い時間でも流通させたのは、そのうちの１０例のみであった）。このより小さな群の分析では、活動性および非活動性の形態を区別しないで正常な患者および非ＭＳの患者からＭＳの患者を充分正確に分離するためには、単に「１７５@ ８．５分」の濃度の閾値で充分であることが明らかとなった。この１７５のマーカが確定的であると結論付ける充分なデータは存在しないが、証拠から、上述のクラスタリング分析において２つのマーカ（１８５および１９９）を共に用いると、正常および非ＭＳ患者からＭＳ患者を正確に分離することと、さらにＭＳ患者を活動性および非活動性ＭＳにカテゴリ化することとが可能なアルゴリズムに対して、高い尤度が存在することが示唆される。
Figure 0004674317
実施例３：液体クロマトグラフィー−質量分析計を用いたＭＳ患者の分析
活動性ＭＳであるＭＳ患者から血液試料を採集し、実施例２で説明したように、ＬＣ−ＭＳによって処理および分析した。以下のＤＫＰが見出された。ＤＡ−ＤＫＰ（ベータ−アミロイドのＮ末端由来）、ＮＡＳ−ＤＫＰ（ミエリン塩基性タンパク質のＮ末端由来）、Ｎ−アセチル−Ａｌａ リン酸−Ｓｅｒ ＤＫＰ（ミエリン塩基性タンパク質のＮ末端由来）、Ｇｌｎ−Ａｓｎ ＤＫＰ（ベータ−アミロイドのＣ末端由来）、およびＡｒｇ−Ａｒｇ ＤＫＰ（ミエリン塩基性タンパク質のＣ末端由来）。
実施例４：アルツハイマー病の診断
実施例２で言及したように、「１７５@ ８．５分」と標識されたマーカが、アルツハイマー病患者の血漿中に非常に多量に存在することが見出された。このことから、このマーカがアルツハイマー病の診断に有用であることが期待される。
さらに、質量１８６．１５のマーカは、ＤＡ−ＤＫＰであるが、アルツハイマー病患者の血漿中で増大していることが見出されている。このことは、この病気の特徴症状であると思われる。
最後に、別のマーカとなり得る質量２００（実際の質量 ２０１）が見出されている。これはまだ同定されていないが、候補となり得るのはＮＡＳ−ＤＫＰである。
実施例を含み、本発明の上述の説明は、単に本発明を例証することを意図しており、本発明を限定することは意図していない。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正を行い得る。
質量分析計からのプリントアウト。試料は、液体クロマトグラフィーおよびそれに続く質量分析計によって処理した、組換えベータ−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン試料である。 質量分析計からのプリントアウト。試料は、液体クロマトグラフィーおよびそれに続く質量分析計によって処理した、妊娠女性（患者４）由来の血漿試料である。 質量分析計からのプリントアウト。試料は、液体クロマトグラフィーおよびそれに続く質量分析計によって処理した、組換えエリスロポエチンである。 質量分析計からのプリントアウト。試料は、液体クロマトグラフィーおよびそれに続く質量分析計によって処理した、妊娠女性（患者４）由来の血漿試料である。 クラスタリング樹形図。

Claims (18)

  1. 疾病または病状の存在、欠如、または状態を判定または監視するために生体試料を測定する方法において、
    （ａ） 判定または監視される患者から採取された生体試料中のマーカの量を測定するステップと、
    （ｂ） 前記生体試料中の前記マーカの量を、疾病または病状の存在、欠如、または状態を示す基準量と比較するステップとから成り、
    前記マーカは、前記疾病または病状に罹患した器官または組織に由来するタンパク質である、前記疾病または病状に関連した疾病関連タンパク質に由来する、
    （ｉ） ヒト血清アルブミン以外の、前記疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つが欠落した短縮疾病関連タンパク質、
    （ii） 前記疾病関連タンパク質のＣ末端アミノ酸２つが欠落した短縮疾病関連タンパク質、
    （iii ） 前記疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つおよびＣ末端アミノ酸２つが欠落した短縮疾病関連タンパク質、
    （iv） 前記疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つを含む、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ ジケトピペラジン（ＤＫＰ）以外のＤＫＰ、および、
    （ｖ） 前記疾病関連タンパク質のＣ末端アミノ酸２つを含むＤＫＰ、のうちのいずれかのマーカ、または、
    （vi） 上述の（ｉ）乃至（ｖ）から選択される２つ以上のマーカであり、
    前記疾病または病状は、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症、真性糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症、虚血、大脳虚血、胎盤虚血、心筋梗塞、前立腺癌、膵炎、気腫、腎臓病、癌、化学療法、異常ヘモグロビン症、貧血、または鬱血性心不全である、方法。
  2. 前記マーカはＤＫＰである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記マーカはアミノ酸ＸおよびＹから構成されるＸ−Ｙ−ＤＫＰであり、前記Ｘ−Ｙ−ＤＫＰは、
    （ａ）Ｎ−アセチル−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＤＫＰ，Ｎ−アセチル−Ａｌａ−リン酸化−Ｓｅｒ−ＤＫＰ，Ａｓｐ−Ａｌａ−ＤＫＰ，Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＤＫＰ，Ｇｌｎ−Ａｓｎ−ＤＫＰ，もしくはそれらの組合せ、
    （ｂ）Ａｓｐ−Ａｌａ−ＤＫＰ，Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＤＫＰ，Ｇｌｎ−Ａｓｎ−ＤＫＰ，Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＤＫＰ，もしくはそれらの組合せ、
    （ｃ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＤＫＰ，Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＫＰ，Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＤＫＰ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ＤＫＰ，Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＤＫＰ，Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＤＫＰ，もしくはそれらの組合せ、または、
    （ｄ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＤＫＰ，Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＤＫＰ，Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＤＫＰ，Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−ＤＫＰ，もしくはそれらの組合せ、である請求項１に記載の方法。
  4. 前記疾病または病状は多発性硬化症（ＭＳ）である請求項１に記載の方法。
  5. 前記生体試料中の
    （ｉ） Ａｓｐ−Ａｌａ−ジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ），
    （ii） Ｎ−アセチル−アラニン−セリン ジケトピペラジン（ＮＡＳ−ＤＫＰ），または
    （iii ） （ｉ）および（ii）の両方
    の量を測定するステップを含み、
    前記生体試料中のＤＡ−ＤＫＰ，ＮＡＳ−ＤＫＰ，またはその両方の量の増大は活動性ＭＳであることを示す、請求項４に記載の方法。
  6. 前記生体試料中の
    （iv） 液体クロマトグラフィーおよび質量分析計によって約１７５と測定される質量を有する化合物、
    （ｖ） 液体クロマトグラフィーおよび質量分析計によって約１４５と測定される質量を有する化合物、
    または、
    （vi） （iv）および（ｖ）の両方
    の量を測定するステップを含み、
    前記生体試料中の（iv），（ｖ），またはその両方の欠如はＭＳであることを示す、請求項５に記載の方法。
  7. 前記疾病または病状はアルツハイマー病である請求項１に記載の方法。
  8. 前記生体試料中のＡｓｐ−Ａｌａ−ＤＫＰの量を測定するステップと、
    前記生体試料中の、液体クロマトグラフィーおよび質量分析計によって約１７５と測定される質量を有する化合物の量を測定するステップと、を含む請求項７に記載の方法。
  9. 前記疾病または病状は胎盤虚血である請求項１に記載の方法。
  10. 前記生体試料中の
    （ｉ） Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＤＫＰ、
    （ii） Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＤＫＰ、または、
    （iii ） Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＤＫＰおよびＡｌａ−Ｐｒｏ−ＤＫＰの両方、
    の量を測定するステップを含む請求項９に記載の方法。
  11. 前記生体試料は体液である、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記体液は、血清、血漿、血液、尿、唾液、髄液、涙、精液、膣分泌液、羊水、または臍帯血である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記体液は、血清または血漿である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記患者は動物である、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記患者はヒトである、請求項１４に記載の方法。
  16. 疾病または病状の存在、欠如、または状態を判定または監視するための単離された結合パートナーであって、
    （ａ） 疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つが欠落した短縮疾病関連タンパク質、
    （ｂ） 疾病関連タンパク質のＣ末端アミノ酸２つが欠落した短縮疾病関連タンパク質、
    （ｃ） 疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つおよびＣ末端アミノ酸２つが欠落した短縮疾病関連タンパク質、
    （ｄ） 疾病関連タンパク質のＮ末端アミノ酸２つを含むジケトピペラジン（ＤＫＰ）、および、
    （ｅ） 疾病関連タンパク質のＣ末端アミノ酸２つを含むＤＫＰ、
    からなる群から選択されるマーカに対する特異性を有し、
    前記結合パートナーは抗体またはアプタマーであり、
    前記疾病関連タンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質、ベータ−アミロイド、リウマトイド因子、肺胞界面活性物質関連タンパク質Ａ、肺胞界面活性物質関連タンパク質Ｂ、肺胞界面活性物質関連タンパク質Ｄ、インシュリン、タウタンパク質、アルファ−シヌクレイン、Ｃ反応性タンパク質、インターロイキン８、Ｓ１００タンパク質、ベータ絨毛性性腺刺激ホルモン、胎児性エリスロポエチン、妊娠関連タンパク質Ａ、ミオグロビン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、前立腺特異抗原、アミラーゼ、リパーゼ、アルファ−アンチトリプシン、エリスロポエチン、活性化タンパク質Ｃ、シータ鎖、ゼータ鎖、アルファ鎖、ベータ鎖、デルタ鎖、イプシロン鎖、またはガンマＡＧである、結合パートナー。
  17. ＤＫＰに対する特異性を有する、請求項１６に記載の結合パートナー。
  18. 請求項１６または１７に記載の結合パートナーと、マーカを定量するための関連する試薬とを含むキット。
JP2005500360A 2002-10-02 2003-10-02 疾病の判定および監視 Expired - Fee Related JP4674317B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41590802P 2002-10-02 2002-10-02
US48903903P 2003-07-21 2003-07-21
US50318503P 2003-09-15 2003-09-15
PCT/US2003/031226 WO2004030522A2 (en) 2002-10-02 2003-10-02 Diagnosis and monitoring of diseases

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2006502418A JP2006502418A (ja) 2006-01-19
JP2006502418A5 JP2006502418A5 (ja) 2006-11-24
JP4674317B2 true JP4674317B2 (ja) 2011-04-20

Family

ID=32074376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005500360A Expired - Fee Related JP4674317B2 (ja) 2002-10-02 2003-10-02 疾病の判定および監視

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7575929B2 (ja)
EP (1) EP1571970B1 (ja)
JP (1) JP4674317B2 (ja)
AT (1) ATE520981T1 (ja)
AU (1) AU2003279761B2 (ja)
CA (1) CA2500652A1 (ja)
DK (1) DK1571970T3 (ja)
NZ (1) NZ539735A (ja)
WO (1) WO2004030522A2 (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475743B1 (en) * 1998-10-02 2002-11-05 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US7297544B2 (en) 1998-10-02 2007-11-20 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US20050142613A1 (en) * 1998-10-02 2005-06-30 David Bar-Or Test for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US7449338B2 (en) 1998-10-02 2008-11-11 Ischemia Technologies, Inc. Tests for the rapid evaluation of ischemic states and kits
US7070937B1 (en) 1998-10-02 2006-07-04 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
CN101632669B (zh) 2000-08-04 2011-05-18 Dmi生物科学公司 二酮基哌嗪和包含它们的组合物的使用方法
KR20120091266A (ko) 2003-05-15 2012-08-17 디엠아이 바이오사이언시스, 인크 Ｔ-세포 매개성 질환의 치료 방법
GB0421639D0 (en) * 2004-09-29 2004-10-27 Proteome Sciences Plc Methods and compositions relating to alzheimer's disease
WO2006099377A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-21 Bg Medicine, Inc. Methods for detecting alzheimer's disease
WO2006110621A2 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Cornell Research Foundation, Inc. Multiplexed biomarkers for monitoring the alzheimer's disease state of a subject
CA2646890C (en) * 2006-03-21 2012-07-31 Metabolon, Inc. A system, method, and computer program product for analyzing spectrometry data to indentify and quantify individual components in a sample
US9000134B2 (en) * 2007-05-11 2015-04-07 Wallace B. Haigh Reagent and kit for early diagnosis of kidney disease
US7829709B1 (en) 2007-08-10 2010-11-09 Marquette University Cysteine prodrugs to treat schizophrenia and drug addiction
BRPI0906858B8 (pt) 2008-01-18 2021-07-27 Harvard College métodos in vitro para detectar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo e para identificar uma assinatura específica de tumor em um indivíduo tendo câncer.
WO2009100431A1 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Marquette University Cysteine and cystine prodrugs to treat schizophrenia and reduce drug cravings
JP5856843B2 (ja) * 2008-05-27 2016-02-10 アンピオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド ジケトピペラジンを用いた医薬組成物
TR201907804T4 (tr) * 2009-07-30 2019-06-21 Spiral Therapeutics Inc Apaf-1 inhibitör bileşikleri.
AU2011281007A1 (en) 2010-07-23 2013-02-28 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting kidney-associated diseases or conditions
TW201209171A (en) 2010-07-23 2012-03-01 Harvard College Methods of detecting diseases or conditions using phagocytic cells
EP2596353A4 (en) 2010-07-23 2014-01-15 Harvard College METHOD FOR DETECTING PRENATAL OR PREGNANT DISEASES OR SUFFERING
JP2013538565A (ja) 2010-07-23 2013-10-17 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ 体液中の疾患または症状のシグネチャを検出する方法
US20130184178A1 (en) 2010-07-23 2013-07-18 President And Fellows Of Harvard College Methods of Detecting Autoimmune or Immune-Related Diseases or Conditions
CA2810844C (en) 2010-09-07 2017-03-21 Dmi Acquisition Corp. Diketopiperazine compositions for the treatment of metabolic syndrome and related conditions
CN103108647B (zh) * 2010-09-16 2014-07-09 可尔必思株式会社 脑功能改善用组合物及改善脑功能的方法
CA2848915C (en) * 2011-09-19 2021-09-07 C2N Diagnostics Methods for the diagnosis and treatment of neurological and neurodegenerative diseases and disorders using labeled alpha syruclein
SG10201608087WA (en) 2011-10-10 2016-11-29 Ampio Pharmaceuticals Inc Implantable medical devices with increased immune tolerance, and methods for making and implanting
ES2795803T3 (es) 2011-10-10 2020-11-24 Ampio Pharmaceuticals Inc Tratamiento de artropatía degenerativa
AU2012328605B9 (en) * 2011-10-28 2017-08-03 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Treatment of rhinitis
WO2014164362A1 (en) 2013-03-09 2014-10-09 Harry Stylli Methods of detecting prostate cancer
NZ771629A (en) 2013-03-09 2022-12-23 Harry Stylli Methods of detecting cancer
EA201500943A1 (ru) 2013-03-15 2016-08-31 Ампио Фармасьютикалс, Инк. Составы для мобилизации, хоуминга, размножения и дифференцировки стволовых клеток и способы применения составов
CN103604931B (zh) * 2013-11-15 2016-01-06 陆上苏 一种人s100蛋白检测试剂及制备方法
US9956217B2 (en) 2014-08-18 2018-05-01 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Treatment of joint conditions
EP3693742B1 (en) 2014-09-11 2022-04-06 Harry Stylli Methods of detecting prostate cancer
EP3310375A4 (en) 2015-06-22 2019-02-20 Ampio Pharmaceuticals, Inc. USE OF LOW MOLECULAR WEIGHT HUMAN SERUM ALBUMIN FRACTIONS FOR TREATING DISEASES

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000020454A1 (en) * 1998-10-02 2000-04-13 Diagnostic Markers, Inc. Methods and materials for detection and measurement of free radical damage
JP2002526764A (ja) * 1998-10-02 2002-08-20 イスケミア・テクノロジーズ・インコーポレーテッド 虚血状態の迅速鑑定のための検査およびキット
JP2002527753A (ja) * 1998-10-15 2002-08-27 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ディアグノスティカ・ゲーエムベーハー 敗血症及び敗血症様全身性感染の診断及び治療のための方法及び物質
JP2004518614A (ja) * 2000-08-04 2004-06-24 ディーエムアイ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ジケトピペラジン類の使用方法とジケトピペラジン類を含む組成物

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3928330A (en) 1973-12-19 1975-12-23 Ciba Geigy Corp Substituted piperazinedione carboxylic acids and metal salts thereof
GB1459488A (en) 1974-03-19 1976-12-22 Wyeth John & Brother Ltd Piperazinedione derivatives
US4205057A (en) 1978-01-17 1980-05-27 Government Of The United States Cerebrospinal fluid protein fragments
DE2940654A1 (de) 1979-10-06 1981-04-16 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Dimeres keten der 1,2,,-triazol-3-carbonsaeure
US4331595A (en) 1980-06-23 1982-05-25 Ortho Pharmaceutical Corporation Immunoregulatory diketopiperazine compounds
US4289759A (en) 1980-06-23 1981-09-15 Ortho Pharmaceutical Corporation Immunoregulatory diketopiperazine compounds
JPS5973574A (ja) 1982-10-21 1984-04-25 Grelan Pharmaceut Co Ltd 環状ジペプチド類
US4694061A (en) 1983-10-12 1987-09-15 Ciba-Geigy Corporation Radiation-sensitive polycondensates, processes for their preparation coated material and its use
US4806538A (en) 1984-11-02 1989-02-21 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Piperazine compound as PAF-antagonist
CS254868B1 (cs) 1985-06-11 1988-02-15 Jiri Vanzura Způsob výroby cyklických dipeptidů
US4661500A (en) 1985-08-29 1987-04-28 Roman Rozencwaig Method of medical treatment with serotonin antagonists
US4771056A (en) 1985-08-29 1988-09-13 Roman Rozencwaig Method of medical treatment with serotonin antagonists
US5047401A (en) 1985-09-09 1991-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of dipeptide alkyl esters to treat GVHD
US4694081A (en) 1985-09-23 1987-09-15 Monsanto Company Process to prepare 2,5-diketopiperazines
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
US4992552A (en) 1988-08-31 1991-02-12 Eastman Kodak Company Process for preparation of amino acids
DE3906952A1 (de) 1989-03-04 1990-09-06 Boehringer Mannheim Gmbh (3-(c(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)6(pfeil abwaerts)-c(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)8(pfeil abwaerts))alkansulfinyl- und sulfonyl-2-methoxymethyl-propyl)-(2-trimethylammonio-ethyl) phosphate, verfahren zu deren herstellung diese verbindungen enthaltende arzneimittel
EP0422282B1 (en) 1989-10-13 1995-04-05 Phobos N.V. Process for the continuous production of high molecular weight polyester resin
US6180616B1 (en) 1990-05-10 2001-01-30 Atsuo F. Fukunaga Use of purine receptor agonists to alleviate or normalize physiopathologically excited sensory nerve function
US6331318B1 (en) 1994-09-30 2001-12-18 Emisphere Technologies Inc. Carbon-substituted diketopiperazine delivery systems
US5578323A (en) 1992-06-15 1996-11-26 Emisphere Technologies, Inc. Proteinoid carriers and methods for preparation and use thereof
US6099856A (en) 1992-06-15 2000-08-08 Emisphere Technologies, Inc. Active agent transport systems
US5693338A (en) 1994-09-29 1997-12-02 Emisphere Technologies, Inc. Diketopiperazine-based delivery systems
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
CA2095539A1 (en) * 1990-11-14 1992-05-15 Robert D. Cook Diagnosis and treatment of multiple sclerosis
US5776892A (en) 1990-12-21 1998-07-07 Curative Health Services, Inc. Anti-inflammatory peptides
JPH04234374A (ja) 1990-12-27 1992-08-24 Ajinomoto Co Inc ジケトピペラジン誘導体の製造方法
US5543503A (en) 1991-03-29 1996-08-06 Genentech Inc. Antibodies to human IL-8 type A receptor
US5538993A (en) 1991-09-12 1996-07-23 Yissum Research Development Company Certain tetrahydrocannabinol-7-oic acid derivatives
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
GB9200210D0 (en) 1992-01-07 1992-02-26 British Bio Technology Compounds
US5418218A (en) 1992-07-10 1995-05-23 The University Of Maryland At Baltimore Histidyl-proline diketopiperazine (cyclo his-pro) a cns-active pharmacologic agent
US5463083A (en) 1992-07-13 1995-10-31 Cytomed, Inc. Compounds and methods for the treatment of cardiovascular, inflammatory and immune disorders
US5648486A (en) 1992-07-13 1997-07-15 Cytomed, Inc. Compounds and methods for the treatment of inflammatory and immune disorders
US5358938A (en) 1992-07-13 1994-10-25 Cytomed, Inc. Compounds and methods for the treatment of disorders mediated by platelet activating factor or products of 5-lipoxygenase
US5434151A (en) 1992-08-24 1995-07-18 Cytomed, Inc. Compounds and methods for the treatment of disorders mediated by platelet activating factor or products of 5-lipoxygenase
GB9217331D0 (en) 1992-08-14 1992-09-30 Xenova Ltd Pharmaceutical compounds
US5728553A (en) 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
DE69333076T2 (de) * 1992-12-18 2004-04-15 Molecular Rx Inc. Test und behandlung von demyelinierenden krankheiten wie multiple sklerosis
ES2068742B1 (es) 1993-02-11 1995-11-16 Uriach & Cia Sa J Nuevos derivados de piridinio.
US6107050A (en) * 1993-05-03 2000-08-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic test for alzheimers disease
FR2717484A1 (fr) 1994-03-16 1995-09-22 Pf Medicament Nouveaux composés pseudo-bis-peptidiques analogues de la CCK, leur procédé de préparation, leur utilisation à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les comprenant .
GB9410387D0 (en) 1994-05-24 1994-07-13 Xenova Ltd Pharmaceutical compounds
US5550132A (en) 1994-06-22 1996-08-27 University Of North Carolina Hydroxyalkylammonium-pyrimidines or purines and nucleoside derivatives, useful as inhibitors of inflammatory cytokines
US5817751A (en) 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
US5990112A (en) 1996-06-18 1999-11-23 Affymax Technologies N.V. Inhibitors of metalloproteases pharmaceutical compositions comprising same and methods of their use
US5703093A (en) 1995-05-31 1997-12-30 Cytomed, Inc. Compounds and methods for the treatment of cardiovascular, inflammatory and immune disorders
US5750565A (en) 1995-05-25 1998-05-12 Cytomed, Inc. Compounds and methods for the treatment of cardiovascular, inflammatory and immune disorders
US5792776A (en) 1994-06-27 1998-08-11 Cytomed, Inc., Compounds and methods for the treatment of cardiovascular, inflammatory and immune disorders
CA2196215C (en) 1994-07-29 2000-08-15 Shigeyuki Tasaka 1,4-dihydropyridine compound and pharmaceutical composition containing the same
WO1996011009A1 (en) 1994-10-05 1996-04-18 Cari Loder Treatment of multiple sclerosis (ms) and other demyelinating conditions using lofepramine in combination with l-phenylalanine, tyrosine or tryptophan and possibly a vitamin b12 compound
WO1996016947A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-06 Toyama Chemical Co., Ltd. Nouveau derive de 2,3-dicetopiperazine ou sel de celui-ci
EP0842195A1 (en) 1995-07-06 1998-05-20 Zeneca Limited Peptide inhibitors of fibronectine
US6060452A (en) 1996-03-13 2000-05-09 Cytran, Inc. Analogs of L-Glu-L-Trp having pharmacological activity
US6541224B2 (en) 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
US5919785A (en) 1996-04-03 1999-07-06 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
EP0904072A4 (en) 1996-04-12 2003-07-30 Peptide Technology Pty Ltd METHODS FOR TREATING IMMUNOPATHOLOGIES USING POLYUNSATURATED FATTY ACIDS
DE19619478A1 (de) * 1996-05-14 1997-11-20 Sick Ag Optische Anordnung mit diffraktivem optischem Element
US5932579A (en) 1996-06-18 1999-08-03 Affymax Technologies N.V. Collagenase-1 and stromelysin-1 inhibitors, pharmaceutical compositions comprising same and methods of their use
US5985581A (en) * 1996-07-25 1999-11-16 The Mclean Hospital Corporation Use of presenilin-1 for diagnosis of alzheimers disease
EP0835660A1 (en) 1996-10-14 1998-04-15 Gaston Edmond Filomena Merckx Products containing methylcobalamin for the treatment of multiple sclerosis or other demyelinating conditions
US6441172B1 (en) 1996-11-07 2002-08-27 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Diketodiazacyclic compounds, diazacyclic compounds and combinatorial libraries thereof
US6265535B1 (en) 1997-05-30 2001-07-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptides and peptide analogues designed from binding sites of tumor necrosis factor receptor superfamily and their uses
US6222029B1 (en) 1997-08-01 2001-04-24 Genset 5′ ESTs for secreted proteins expressed in brain
US5834032A (en) 1997-08-11 1998-11-10 Song; Moon K. Compositions and methods for treating diabetes
EP0939124A3 (en) 1998-02-24 2001-03-21 Smithkline Beecham Plc MGBP1 sequences
US6461875B1 (en) 1998-10-02 2002-10-08 Ischemia Technologies, Inc. Test for rapid evaluation of ischemic states and kit
US6492179B1 (en) 1998-10-02 2002-12-10 Ischemia Techologies, Inc. Test for rapid evaluation of ischemic states and kit
US6475743B1 (en) 1998-10-02 2002-11-05 Ischemia Technologies, Inc. Marker useful for detection and measurement of free radical damage and method
US7026322B2 (en) 1998-11-12 2006-04-11 Nereus Pharmaceuticals, Inc. Phenylahistin and the phenylahistin analogs, a new class of anti-tumor compounds
US6358957B1 (en) 1998-11-12 2002-03-19 Nereus Pharmaceuticals, Inc. Phenylahistin and the phenylahistin analogs, a new class of anti-tumor compounds
US6248363B1 (en) 1999-11-23 2001-06-19 Lipocine, Inc. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
WO2000057187A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Vanderbilt University Diagnosis and treatment of multiple sclerosis
US6090780A (en) 1999-04-07 2000-07-18 Chandon Prasad Histidyl-proline diketopiperazine and method of use
US6689765B2 (en) 1999-05-04 2004-02-10 Schering Corporation Piperazine derivatives useful as CCR5 antagonists
DE19937721A1 (de) 1999-08-10 2001-02-15 Max Planck Gesellschaft Neue Diketopiperazine
AU1624801A (en) 1999-11-19 2001-05-30 Corvas International, Inc. Plasminogen activator inhibitor antagonists related applications
US20050096323A1 (en) 1999-11-30 2005-05-05 Novoscience Pharma Inc. Diketopiperazine derivatives to inhibit thrombin
US6635649B2 (en) 2000-05-09 2003-10-21 Che-Ming Teng Piperazinedione compounds
US7288545B2 (en) 2000-05-09 2007-10-30 Angiorx Corporation Piperazinedione compounds
MXPA02012054A (es) 2000-06-08 2003-06-06 Lilly Icos Llc Compuestos de dicetopiracina tetraciclica como inhibidores de la fosfodiesterasa v.
CZ20002680A3 (cs) 2000-07-21 2002-03-13 Ev®En Ing. Csc. Kasafírek Cyklické alkylthiopeptidy
CZ20002681A3 (cs) 2000-07-21 2002-03-13 Ev®En Ing. Csc. Kasafírek Cyklické tyrosinové dipeptidy
AU2001284697A1 (en) 2000-08-04 2002-02-18 Dmi Biosciences, Inc. Method of synthesizing diketopiperazines
US6815214B2 (en) * 2000-12-29 2004-11-09 Celltech R & D, Inc. Pharmaceutical uses and synthesis of diketopiperazines
US20040038865A1 (en) 2002-08-01 2004-02-26 Mannkind Corporation Cell transport compositions and uses thereof
DE10238144A1 (de) 2002-08-15 2004-02-26 Basf Ag Verwendung von Diketopiperazin-Derivaten als photostabile UV-Filter in kosmetischen und pharmazeutischen Zubereitungen
JP4641796B2 (ja) * 2002-09-03 2011-03-02 ジョージタウン ユニヴァーシティ Ａｋｔ阻害剤、医薬組成物、及びその用途
KR20120091266A (ko) 2003-05-15 2012-08-17 디엠아이 바이오사이언시스, 인크 Ｔ-세포 매개성 질환의 치료 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000020454A1 (en) * 1998-10-02 2000-04-13 Diagnostic Markers, Inc. Methods and materials for detection and measurement of free radical damage
JP2002526764A (ja) * 1998-10-02 2002-08-20 イスケミア・テクノロジーズ・インコーポレーテッド 虚血状態の迅速鑑定のための検査およびキット
JP2002527753A (ja) * 1998-10-15 2002-08-27 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ディアグノスティカ・ゲーエムベーハー 敗血症及び敗血症様全身性感染の診断及び治療のための方法及び物質
JP2004518614A (ja) * 2000-08-04 2004-06-24 ディーエムアイ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ジケトピペラジン類の使用方法とジケトピペラジン類を含む組成物

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003279761A1 (en) 2004-04-23
DK1571970T3 (da) 2011-11-28
ATE520981T1 (de) 2011-09-15
WO2004030522A3 (en) 2005-08-11
US20100120056A1 (en) 2010-05-13
US7575929B2 (en) 2009-08-18
WO2004030522A2 (en) 2004-04-15
AU2003279761B2 (en) 2009-11-12
JP2006502418A (ja) 2006-01-19
EP1571970B1 (en) 2011-08-17
EP1571970A2 (en) 2005-09-14
US20040209379A1 (en) 2004-10-21
EP1571970A4 (en) 2008-06-04
CA2500652A1 (en) 2004-04-15
NZ539735A (en) 2009-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4674317B2 (ja) 疾病の判定および監視
EP2657706B1 (en) Biomarker for cognitive dysfunction diseases, and method for detection of cognitive dysfunction diseases using the biomarker
US11143662B2 (en) Circulating biomarker levels for diagnosis and risk-stratification of traumatic brain injury
US11726099B2 (en) Biomarker for mental disorders including cognitive disorders, and method using said biomarker to detect mental disorders including cognitive disorders
WO2012051519A2 (en) Biomarkers of brain injury
JP2009500641A (ja) 多発性硬化症の診断方法
EP3292414B1 (en) Astrocyte traumatome and neurotrauma biomarkers
WO2022271865A2 (en) Protein biomarker indicators of neurological injury and/or disease and methods of use thereof
US20230349924A1 (en) Determination agent and determination method for tauopathy and dementia-related diseases
WO2019012667A1 (ja) 認知機能障害疾患のバイオマーカー及び該バイオマーカーを用いる認知機能障害疾患の検出方法
EP3835424A1 (en) Diagnostic drug and diagnostic method for alzheimer's disease
EP1371986A1 (en) Diagnosis of Alzheimer's disease based on the hAbeta42:hAbeta40 ratio
ES2369536T3 (es) Diagnóstico y supervisión de enfermedades.
JP2012037349A (ja) 認知機能障害疾患のバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患の検出方法
WO2023092157A1 (en) Biomarker testing for chronic persistent injury following brain trauma

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061002

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20061002

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20090604

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090616

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090901

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090908

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091216

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100615

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100630

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100803

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20100810

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20100810

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101029

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101124

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20101227

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101224

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20101227

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140204

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140204

Year of fee payment: 3

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees