CZ20002680A3 - Cyklické alkylthiopeptidy - Google Patents

Abstract

Cyklické alkylthiopeptidy obecného vzorce I jsou antioxidační sloučeniny, které chrání před oxidací aminokyselinu methionin, který je obsažen v řadě biologicky aktivních peptidů, např. v a-,trypsin inhibitoru nebo amyloidním β-peptidu. Tyto sloučeniny mají funkci lapačů radikálů a mohou oxidaci methioninu blokovat a/nebo zcela eliminovat a zachovat biologicky aktivnímu peptidů jeho původní aktivitu; lze je použít k výrobě farmaceutických přípravků v pevných nebo tekutých dávkovačích formách k terapii různých zánětů a Alzeimerovy choroby.

Description

-1• ·

Cyklické alkylthiopeptidy

T/ - ·/£s?

Oblast techniky

Vynález se týká cyklických alkylthiopeptidů obecného

ve kterém

R^ a R₂ značí stejné nebo různé alkyly C.^ až C?, přímé nebo rozvětvené, popř. spojené chemickou vazbou, přičemž jeden z těchto substituentů, popř. oba mohou značit atom vodíku, R₂ značí fenylmetyl, 4-hydroxyfenylmetyl, fenyl, 4-hydroxyfenyl,

-guanidinopropyl, hydroxymetyl, karboxamidometyl, 2-karboxamidoetyl, £_-aminobutyl anebo metylthioetylen, je-li R₂ atom vodíku, může R₁ tvořit trimetylenový, popř. metylenthiometylenový řetězec s atomem dusíku v poloze 1, X značí atom síry nebo metylenovou skupinu, R-j značí alkylovou skupinu až C^ nebo metylenthioalkylovou skupinu C^ až C^.

Tyto nové sloučeniny mají funkci radikálového scavengeru a chrání methionin před oxidací v biologicky aktivních peptidech. Lze je použít k léčbě při různých zánětech (pankreatitidy, gingivitidy), chronických plicních onemocněních, mozkových výdutích, očních poruchách (šedý zákal), Alzheimerově chorobě, Parkinsonově chorobě, mozkové příhodě a pod.

-2Dosavadní stav techniky

Některé aminokyseliny nebo peptidy, navržené jako antioxidační sloučeniny, chrání před oxidací a zároveň i před inaktivací methionin (Met^S) _v přirozeném endogenním inhibitoru proteináz; tento tzv. trypsin inhibitor ( z^-jBI) 3^e nejúčinějším přirozeným inhibitorem serinových proteináz, např. trypsinu, chymotrypsinu, leukocytární a pankreatické elastázy. Zmíněné proteolytické enzymy jsou výraznými iniciátory různých zánětlivých onemocnění, např. pankreatitidy, revmatoidní artritidy apod. Aminokyseliny nebo peptidy, dosud navrhované jako antioxidační sloučeniny k potenciální ochraně Met·^® _v οζ-^ΡΙ, např. N-acetylcystein, methionin nebo glutathion (Agents & Action 22, 255-260 / /1987/), i když blokují oxidaci methioninu v<K-jPI, mají takové chemické struktury, které jsou relativně málo stálé, mají krátký biologický poločas a vysoký clearens.

Podstata vynálezu

S překvapením bylo zjištěno, že cyklické alkylthiopeptidy uvedeného vzorce, v němž substituenty mají výše uvedený význam> jsou enzymaticky rezistentní sloučeniny, jejichž přítomné alkylsulfidické ligandy fungují jako scavengery a brání tak oxidaci methioninu na methioninsulfoxid v celé řadě biologicky aktivních peptidů, zvláště pak (BioPactors 3» 91-96 /1991/); oxidace methioninu v biologicky aktivních peptidech souvisí s celou řadou závažných onemocnění, jak již bylo zmíněno výše.

Význam methioninu, resp. jeho důležitost se uplatňuje i u amyloidního β-peptidu, který je součástí amyloidního plaku při Alzheimero-vě chorobě. Neurotoxicita A/ipeptidu (1-40) anebo jeho fragmentu A (2(25-35) je spojená s oxidací methioninu (Met*^) γ odpovídající methioninsulfoxid. Je zde proto předpoklad, že látky, které budou mít funkci radikálového scavengeru, mohou oxidaci Met*^ blokovat anebo zcela eliminovat. Sloučeniny s takovými vlastnostmi je pak možné využít v terapii Alzheimerovy choroby.

Vzhledem k rigidní chemické struktuře, jsou cyklické alkylthiopeptidy uvedeného obecného vzorce stabilní sloučeniny, což umožňuje jejich účelné použití v léčivech k terapii již zmíněných ft· · ·» ···· · · ···· ·· · · ♦ · • · · · · ··· • »

-3• · ··· · · · ···· ··· ·· · ·· »· onemocnění; s výhodou je lze aplikovat perorálně v pevných lékových formách, jako jsou enterosolventní tablety, tobolky nebo vodné suspenze s hodnotou pH 6 až 8, popř. i rektálně, rovněž ve formě vodné suspenze s hodnotou pH 6 až 8 nebo ve formě suspenze olejové.

Ochrana _v «^-trypsin inhibitoru ( /,-^PI) sirnými sloučeninami obecného vzorce podle vynálezu před oxidací na methioninsulfoxid byla hodnocena postupem jak je uvedeno v Agents & Action 22, 255-260 (1987) s tím rozdílem, že ke sledování inhibice C^j-PI byl použit trypsin a jeho zbytková aktivita byla stanovena chromogenním substrátem p-nitroanilidem N^-tosyl-Largininu (L-TAPA). Jako srovnávací sloučeniny byly použity N-acetyl-L-cystein (konc. 3 mg/1 ml) a oxidovaný glutathion (konc. 10 mg ve fyziologickém roztoku). Hodnoceny byly sloučeniny podle vynálezu: cyklo(Acp-Met) Ha, cyklo(Acp-Cys/Et/) líc, cyklo(Acp-Cys/Bu/) Ile; všechny v koncentraci 2 mg/1 ml MPA.

Uspořádání pokusu bylo provedeno tak, že roztok (SERVA) o konc. 10 mg/50 ml TRIS pufru o pH 7,1 byl oxidován 3% peroxidem vodíku. V pokusech, při kterých bylo dosaženo 50 % inhibice trypsinu částečně inaktivovaným (oxidovaným) X^-PI, bylo za stejných oxidačních podmínek v přítomnosti sirných sloučenin podle vynálezu, zvýšena inhibiční schopnost pC^-PI jak je uvedeno v Tabulce III

Tabulka III

Sirné sloučeniny	Zvýšení :	inhibice
N-Acetyl-L-cystein	18	%
Glutathion oxidovaný	14	%
Ha cyklo(Acp-Met)	22	%
líc cyklo(Acp-Cys/Et/)	20	%
Ile cyklo(Acp-Cys/Bu/)	14	%

fe ·

-4·· ·*·· «β ·· ··*· · · · · · · < • · · · · · · « * • ··«·· · · · · · • · ··· · · · · ···· · · · ·· « · · · ·

Všechny meziprodukty a konečné látky byly připraveny syntézou v roztoku obvyklými metodami užívaných v chemii peptidů. Tyto sloučeniny je možné také připravit syntézou v pevné fázi, popř. syntézou pomocí enzymů.

Syntetický postup přípravy sloučenin obecného vzorce podle vynálezu představuje Schéma 1. Analytická data (T.t.) meziproduktů I(a-i) a konečných látek Il(a-h) jsou uvedena v Tabulce I. resp. v Tabulce II.

Vynález cyklických alkylthiopeptidů je blíže ilustrován, ale nijak omezen, v následujících příkladech provedení:

Použité zkratky a symboly mají následující význam:

Acp = kyselina 1-amino-l-cyklopentankarboxylová

Met = methionin

Cys(Me) = S-methylcystein

Cys(Et) = S-etylcystein

Cys(Pr) = S-propylcystein

Cys(Bu) = S-butylcystein

Ala = alanin

Phe = fenylalanin

Boc = tert.butyloxykarbonyl

CDI = N,N-dicyklohexylkarbodiimid

OH-Suc = N-hydroxysukcinimid

DMPA = dimetylformamid ·» r · · · ·» »** • * * · ·« « ··«

-5• « «·· · · · • · ♦ ·> ·»· · · · » · · «

Schéma 1

Ι,ΙΙ A B tr

Acp	Met
Acp	Cys(Me)
Acp	Cys(Et)
Acp	Cys(Pr)
Acp	Cys(Bu)
Met	Ala
Phe	Met
Cys(Et)	Ala
Met	Acp

* · · · «« · · · »

-6> *· řř»· • · · ♦ » ♦ · « « «••Φ *· ·Φ Λ ·· ··

Příklady provedení

Příklad 1

Boc-Acp-Met-OMe (Ia)

K roztoku 4,6 g Boc-Acp (2o mmol) a 2,3 g OH-Suc v 50 ml DMFA ochlazeném na 0° C byl přidán 4,4 g CDI. Po 1 h míchání a chlazení při 5 °C byl přidán roztok Met-OMe ve 20 ml DMPA, uvolněného z odpovídajícího hydrochloridu (2,4 g; 20 mmol) N-etylpiperidinem (2,8 ml; 20 mmol). Po 2 h míchání za teploty místnosti byla vyloučená Ν,Ν-dicyklohexylmočovina odfiltrována, filtrát byl vakuově odpařen, odparek byl rozpuštěn v octanu etylnatém a postupně vytřepán 1% kyselinou citrónovou (3x), vodou, 5% hydrogenuhličitanem sodným (3x), vodou, vysušen bezvodým síranem sodným a odpařen. Pevný odparek byl krystalován ze směsi 30 ml octanu etylnatého a 200 ml petroleteru. Bylo získáno 6,35 g (85 % hmot.) (Ia) o t.t. 133-136 °C Obdobným postupem byly připraveny sloučeniny I(b-i) uvedené v Tabulce I.

Cyklo(Acp-Met) (Ha)

K roztoku 3,75 g Boc-Acp-Met-OMe (10 mmol) ve 20 ml led. kyselině octové bylo přidáno 17 ml roztoku HCl/ν kyselině octové (0,6 M). Po 2 h míchání reakčního roztoku za teploty místnosti, byl roztok vakuově odpařen, odparek byl rozpuštěn v 50 ml metanolu a znovu odpařen; potom byl odparek rozpuštěn ve 30 ml metanolu a deionizován na sloupci slabě bazického anexu I 150. Metanolické eluáty byly odpařeny a pak ještě odpařeny (2x) se směsí metanol - toluen (10:1) a nakonec byl odparek rozpuštěn v 25 ml octanu etylnatého a ponechán 24 h za teploty místnosti. Vyloučený krystalický produkt byl odfiltrován a promyt eterem. Bylo získáno 1,65 g (68 % hmot.)(IIa) o t.t. 243-246 °C. Obdobným postupem byly připraveny sloučeniny Il(b-h) uvedené v Tabulce II.

* v ····

-7···· 4·<

Tabulka I

I(a -	i)	Teplota tání °C
la	Boc-Acp-Met-OMe	133-136
Ib	Boc-Acp-Cys(Me)-OMe	126-128
Ic	Boc-Acp-Cys(Et)-OMe	132-134
Id	Boc-Acp-Cys(Pr)-OMe	129-131
Ie	Boc-Acp-Cys(Bu)-OMe	119-122
If	Boc-Met-Ala-OMe	84-86
lg	Boc-Phe-Met-OMe	olej
Ih	Boc-Cys(Et)-Ala-OMe	74-77
li	Boc-Met-Acp-OMe	127-129

Tabulka II
II(a - h)	Teplota tání °C
Ha	cyklo(Acp-Met)	243-246
lib	cyklo (Acp-C.ys/Me/)	237-238
líc	cyklo(Acp-Cys/Et/)	220-221
lid	cyklo(Acp-Cys/Pr/)	227-228
Ile	cyklo(Acp-Cys/Bu/)	202-204
Uf	cyklo(Met-Ala)	243-246
lig	cyklo(Phe-Met)	261-262
líh	cyklo(Cys/Et/-Ala)	233-235

-8• · ··· ··»· ···· ··· ·· · ·· · ·

Průmyslová využitelnost

Tento vynález se týká použití cyklických alkylthiopeptidů uvedeného obecného vzorce k výrobě farmaceutických přípravků, určených k ochraně methioninu před jeho oxidací na odpovídající methioninsulfoxid. Methionin je vestavěn v biologicky aktivních peptidech, např. v c(-^trypsin .inhibitoru (pozice nebo v amyloidním ^-peptidů (pozice Met^); oxidací na methioninsulfoxid dochází k ztrátě biologické aktivity. Sloučeniny podle vyná lezu lze aplikovat perorálně nebo rektálně v pevných nebo tekutých dávkovačích formách, které lze vyrábět způsoby, běžnými ve farmaceutickém průmyslu.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   Cyklické alkylthiopeptidy obecného vzorce ve kterém

   Rl a Rg značí stejné nebo různé alkyly až C?, přímé nebo rozvětvené, popř. spojené chemickou vazbou, přičemž jeden z těchto substituentů, popř. oba mohou značit atom vodíku, R2 značí fenylmetyl, 4-hydroxyfenylmetyl, fenyl, 4-hydroxyfenyl, 6~-guanidinopropyl, hydroxymetyl, karboxamidometyl, 2-karboxamidoetyl, C-aminobutyl anebo metylthioetylen, je-li R^ atom vodíku, může R^ tvořit trimetylenový,popř. metylenthiometylenový řetězec s atomem dusíku v poloze 1, Σ značí atom síry nebo metylenovou skupinu, R^ značí alkylovou skupinu až nebo metylenthioalkylovou skupinu až C2.